CZ173695A3

CZ173695A3 - Cystatin containing oral and eatable preparations against dental decay

Info

Publication number: CZ173695A3
Application number: CZ951736A
Authority: CZ
Inventors: George Joe Revis
Original assignee: George Joe Revis
Priority date: 1992-12-30
Filing date: 1993-12-13
Publication date: 1996-03-13
Also published as: JPH08505619A; US5688766A; BR9307800A; WO1994015578A1; CA2149444A1; AU5950694A; EP0676949A1; CN1094609A; KR960700036A; HU9501949D0; HUT72469A

Description

Předkládaný vynález se týká orálních a jedlých prostředku obsahujících určité bílkoviny slin a jejich fragmenty k poskytnutí účinku proti zubnímu kazu.

Dosavadní stav techniky

Zubní kaz je stále problémem i když fluoridovaná voda a fluoridové zubní pasty snížily výskyt zubního kazu ve velmi významném stupni: Existuje tedy zájem na vývoji produktů, jež mají schopnost redukovat zubní kaz ješté více v nepřítomnosti fluoridů nebo při nízké koncentraci fluoridových iontů.

I když je zde zájem o vývoj a marketing produktů, jež redukují zubní kaz bez spoléhání se na vysokou hladinu fluoridových iontů, není mnoho takovýchto přístupů, jež by byly ohlášeny a setkaly se s úspěchem. Jedním ohlášeným přístupem je použití fosfopeptidů, jak je zveřejněno v EPO 344 832 Al, 6. prosince 1989, pro Unilever.

Předkladatelé-vynálezci překvapivě zjistili, že orální a jedlé prostředky, obsahující určité bílkoviny slin a jejich fragmenty, mohou redukovat zubní kaz u osob, jež mají tendenci k vývoji zubního kazu.

Bez snahy vázat se na teorii, účinnost cystatinů proti zubnímu kazu je možná způsobena schopností snižovat produkci kyselin, které přispívají k zubnímu kazu.

Takto je předmětem předkládaného vynálezu poskytnutí orálních a jedlých prostředků obsahujících cystatin Ξ nebo cystatin SA nebo cystatin SN nebo jejich směs nebo jejich fragment.

Předmětem tohoto vynálezu je také poskytnutí způsobů k redukci zubního kazu skrze použití takovýchto prostředků.

Tyto a další předměty budou jasnější z podrobného popisu, jenž následuje.

Všechna procenta nebo všechny poměry zde používané jsou podle hmotnosti, pokud nejsou označeny jinak. Dále: Všechna měření jsou prováděna při 25°C, pokud není uvedeno jinak.

Podstata vynálezu

Prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují účinné množství cystatínu S, cystatinu SA, cystatinu SN nebo jejich směsi nebo jejich fragment ve vhodném orálním nebo jedlém nosiči.

Předkládaný vynález dále zahrnuje použití účinného množství prostředků v něm popsaných pro boj proti zubnímu kazu.

Podrobný popis vynálezu

Orálním prostředkem, jak se zde používá, je míněn produkt, který při normálním průběhu používání není záměrně polykán za účelem systémového podávání konkrétního terapeutického činidla, ale je spíše zadržován v ústní dutině po dobu potřebnou ke kontaktu s v podstatě všemi dentálními povrchy a/nebo ústními tkáněmi za účelem orální aktivity.

Jedlým prostředkem, jak se zde používá, je míněn produkt, který se při normálním průběhu používání záměrně polyká.

Bezpečným a účinným množstvím, jak se zde používá, je míněno množství materiálu dostatečné k zajištění žádoucího přínosu, přičemž je bezpečné pro tvrdé a měkké tkáně ústní dutiny.

Výrazem zahrnující, jak se zde používá, je míněno, že v prostředku podle vynálezu se mohou společně používat různé dodatečné složky pokud vyjmenované materiály zastávají své zamýšlené funkce.

Výrazem nosič, jak se zde používá, je míněn vhodný vehikl, jenž může být použit k aplikaci prostředku v ústní dutině a po použití se bud dostává do trávicího traktu nebo je vyplivován.

Cystatin S, cystatin SA nebo cystatin SN

Cystatin S má délku 121 zbytků a molekulovou hmotnost 14 190. Gen zodpovědný za syntézu cystatinu S má tři exony, I, II, a III, jež kódují následující tři posloupnosti aminokyselin:

Exon I:

Ser

Lys

Glu

Asn

Arg

Ile

Pro

Gly

Ile

Tyr

Asp

Ala

Asp

Leu

Asn

5

10

15

20

Asp

Glu

Trp

Val

Gin

Arg

Ala

Leu

His

Phe

Ala

Ile

Ser

Glu

Tyr

Asn

Lys

Ala

Thr

Glu

25

30

35

40

Asp

Glu

Tyr

Arg

Pro

Leu

Gin

Val

Leu

Arg

Ala

Arg

Glu

Gin

45

50

55

Exon II:

Thr Phe Gly Gly Val Asn Tyr Phe Phe Asp Val Glu Val Gly Arg Thr Ile Cys Thr Lys

10 15 20

Ser Gin Pro Asn Leu Asp Thr Cys Ala Phe His Glu Gin Pro Glu Leu Gin Lys

30 35

Exon III:

Lys Gin Leu Cys Ser Phe Glu Ile Tyr Tyr Glu Val Pro Trp Glu Asp Arg Met Ser Leu 5 10 15 20

Val Asp Ser Arg Cys Gin Glu Ala 25

Cystatin SA má délku též 121 zbytků a molekulovou hmotnost 14 347. Gen zodpovědný za syntézu cystatinu SA má též

tři exony, posloupnosti	I, ami	Hz nokysel	a in:	III,	jež	kóduj	í nás]	Ledující tři
Exon I:
Trp Ser Pro Gin	Glu	Glu Asp Arg	Ile Ile	Glu	Gly Gly	Ile Tyr Asp Ala Asp Leu Asn
	5			10			15	20
Asp Glu Arg Val	Gin Arg Ala	Leu	His Phe	Val	Ile Ser	Glu Tyr	Asn Lys Ala Thr Glu
	25			30			35	40
Asp Glu Tyr Tyr Arg Arg Leu	Leu	Arg Val	Leu	Arg Ala	Arg Glu	Gin
	45			50			55
Exon II:
Ile Val Gly Gly	Val	Asn Tyr	Phe	Phe Asp	Ile	Glu Val	Gly Arg	Thr Ile Cys Thr Lys
	5			10			15	20
Ser Gin Pro Asn	Leu	Asp Thr	Cys	Ala Phe	His	Glu Gin	Pro Glu	Leu Gin Lys
	25			30			35
Exon III
Lys Gin Leu Cys	Ser	Phe Gin	Ile	Tyr Glu	Val	Pro Trp Glu Asp	Arg Met Ser Leu Val
	5			10			15	20
Asn Ser Arg Cys	Gin	Glu Ala
	25
Cystatin	ΞΝ	má délku	121 z	bytků a molekulovou hmotnost

311, Gen zodpovědný za syntézu cystatinu SA má tři exony, I, II, a III, jež kódují následující tři posloupnosti aminokyselin:

Exon I :

Trp

Ser

Pro

Lys

Glu

Asp

Arg

Ile

Pro

Gly

Ile

Tyr

Asn

Ala

Asp

Leu

Asn

5

10

15

20

Asp

Glu

Trp

Val

Gin

Arg

Ala

Leu

His

Phe

Val

Ile

Ser

Glu

Tyr

Asn

Lys

Ala

Thr

Lys

25

30

35

40

Asp

Tyr

Arg

Pro

Leu

Arg

Val

Leu

Arg

Ala

Arg

Gin

45

50

55

E:

xon

II:

Thr

Val

Gly

Val

Asn

Tyr

Phe

Asp

Val

Glu

Val

Gly

Arg

Thr

Ile

Cys

Thr

Lys

5

10

15

20

Ser

Gin

Pro

Asn

Leu

Asp

Thr

Cys

Ala

Phe

His

Glu

Gin

Pro

Glu

Leu

Gin

Lys

25

30

35

Exon

III

Lys

Gin

Leu

Cys

Ser

Phe

Glu

Ile

Tyr

Glu

Val

Pro

Trp

Glu

Asn

Arg

Ser

Leu

Val

5	10	15 20
Lys Ser Arg Cys Gin Glu Ser
25
Fragment cystatinu,	jak je zde	tento výraz používán,

zahrnuje jakýkoli lineární, cyklický nebo blokovaný polypeptidový fragment vetší než nebo rovný třem zbytkům, co do délky, nebo jakýkoli modifikovaný polypeptidový fragment cystatinu S, SA nebo ΞΝ mající přinejmenším 75 %-ní homologií s původním fragmentem cystatinu. Příklady řečených fragmentů jsou:

A - Trp Ser Pro Lys Glu Glu Asp Arg Ile Ile

Lys Ala Thr Lys Asp Asp Tyr Tyr Arg Arg Pro Leu Arg Val Leu Arg Ala Arg Gin Gin

C =

Ala Leu His Phe Ala Ile Ser Glu Tyr Asn Lys Ala Thr Lys Asp Asp Tyr Tyr Arg Arg

Pro Leu Arg Val Leu Arg Ala Arg Gin Gin

D =

Ala Asp Leu Asn Asp Glu Trp Val Gin Arg Ala Leu His Phe Ala Ile Ser Glu Tyr Asn

Lys Ala Thr Lys Asp Asp Tyr Tyr Arg Arg Pro Leu Arg Val Leu Arg Ala Arg Gin Gin

Příklady modifikovaných fragmentů cystatinu s modifikací v závorkách jsou:

E = Trp Ser Pro [Arg]

F = Ser Ser Ser Lys Glu Glu [Arg] Arg Ile [Glu]

Cystatiny nebo jejich fragmenty jsou používány v předkládaných prostředcích v jakékoli účinné hladině. Hladiny jsou obecně v rozmezí 0,001 % až 5 %, výhodněji

0,005 % až 1 % a nej výhodněji 0,01 % až 0,5 %.

Přijatelný nosič

Výhodnými prostředky s nosičem pro aktivní složku(y) i

podle vynálezu jsou orální prostředky. Takovéto prostředky zahrnují zubní pasty, ústní vody, tekuté prostředky k čištění zubů, pastilky, žvýkačky a jiné vehikly vhodné k použití v ústní dutině. Výhodnými systémy jsou zubní pasty a ústní vody.

Brusný čistící materiál očekávaný pro použití v prostředcích zubních past podle předkládaného vynálezu může být jakýkoli materiál, jenž neobrušuje nadměrně dentin. V to jsou zahrnuty například včetně silikagely a sraženiny kyseliny křemičité. uhličitan vápenatý, dihydrát ortofosforečnanu dvojvápenatého, pyrofosforečnan vápenatý, fosforečnan troj vápenatý, polymetafosforeónan vápenatý, nerozpustný polymetafosforečnan sodný, hydratovaná alumina a pryskyřičné brusné materiály jako je částicový kondenzační produkt močoviny a formaldehydu, a jiné jak jsou zveřejněny Cooleym at al. v U.S. patentu 3 070 510, 25. prosince 1962, zahrnuto zde odkazem. Směsi brusných materiálů se mohou také používat.

Křemičité zubní brusné materiály různých typů mohou poskytovat jedinečný přínos svým výjimečně účinným čištěním zubů bez nevhodného obrušování skloviny nebo dentinu. Z těchto důvodů jsou výhodné pro použití.

Křemičité čistící zubní brusné materiály, zde vhodné, jakož i další brusné materiály, mají obecně průměrnou velikost částic v rozmezí mezi asi 0,1 a 30 mikronů, s výhodou 5 a 15 mikronů. Křemičité brusné materiály mohou být sraženiny kyseliny křemičité nebo silikagely. jako jsou silikaxerogely popsané v Pader et al., U.S. patent 3 538 230, vydaném 2. března 1970, a v DiGiulio et al., U.S. patent 3 862 307, 21. června 1975, oba zahrnuty zde odkazem. Výhodné jsou silikaxerogely prodávané pod obchodní názvem Syloid firmou W. R. Grace & Company, Davison Chemical Division. Výhodné sražené křemičité materiály zahrnují ty, co jsou prodávány firmou J. M. Huber Corporation pod obchodním názvem Zeodent, obzvláště materiály nesoucí označení Zeodent 119”. Tyto křemičítanové brusné materiály jsou popsány v U.S. patentu 4 340 583, 29. července 1982, zahrnuto zde odkazem.

Brusný materiál v prostředcích zubních past popsaných zde je přítomen v hladině od 6 % do 70 %, s výhodou od 15 % do 25 %.

Do prostředků zubních past mohou být přidávána též příchuťová činidla. Vhodná příchuťová činidla zahrnují olej libavky položené, olej máty peprné, olej máty zelené, olej kasty lékařské a hřebíčkový olej. Sladící činidla, jež se mohou používat, zahrnují aspartam, acesulfam, sacharin, dextrózu, levulózu a cyklamát sodný. Příchuťová a sladící činidla se v zubních pastách používají obecně v hladinách od 0,005 % do 2 % hmotnosti.

Zubní pasty mohou též obsahovat emulgační činidla. Vhodná emulgační činidla jsou ta, jež jsou přiměřené stabilní a pění v širokém rozsahu pH, včetně nemýdlových anionických, neionických, kationických, zwitterioníckých, amfoterických organických syntetických povrchově aktivních látek. Výhodnými povrchově aktivními látkami jsou ty, jež nejsou anionické, pro možnou tvorbu komplexů cystatinů (které jsou zwitterionické) s povrchově aktivními látkami. Mnohé s těchto vhodných povrchové aktivních látek jsou zveřejněny Gieskem et al. v U.S. patentu 4 051 234, 27. září 1977, zahrnuto zde odkazem. Emulgační činidla jsou přítomná v hladině od 0,5 % do 2,0 %.

Voda je také přítomná v zubních pastách podle vynálezu. Voda použitá v přípravě komerčně vhodných zubních past by měla s výhodou být deionizovaná a prostá organických nečistot. Voda obecně zahrnuje od asi 10 % do 50 %, s výhodou od 30 % do 50 % hmotnosti prostředků zubních past. Tato množství vody zahrnují volnou vodu, jež se přidává, plus tu, jež se zavede s jinými materiály, jako se sorbitolem.

Při přípravě zubních past je potřebné přidávat některé zahustovací materiály k zajištění žádoucí konzistence. Výhodnými zahuštovacími činidly jsou karboxyvinylové polymery, karaginan, hydroxyethylcelulóza a sodná sůl karboxymethyl hydroxyethyl celulózy. Mohou se použít též přírodní gumy, jako guma karaya, xanthanová guma, arabská guma, a guma tragakanth. K dalšímu zlepšení textury se mohou jako část zahuštovaciho činidla použít křemičitan hlinito-hořečnatý nebo jemně dělená silika. Zahustovací činidla se mohou používat v množstvích od 0,2 % do 5,0 % hmotnosti celkového prostředku.

Je rovněž žádoucí zahrnout do zubní pasty určitý zvlhčovači materiál, aby ji udržoval před zatvrdnutím. Vhodné zvlhčovači materiály zahrnují glycerin, sorbitol, a jiné jedlé polyhydroxylové alkoholy při hladinách od asi 15 % do asi 70 %.

Jiným výhodným provedením předkládaného vynálezu je prostředek ústní vody. Konvenční složky prostředku ústní vody mohou tvořit nosič pro činidla podle předkládaného vynálezu.

Ústní vody obecně obsahují od 20 : 1 do 2 : 1 roztoky voda/ ethylalkohol nebo jsou alkoholu prosté, a s výhodou zahrnují další složky jako příchuťová, sladící, zvlhčující a pěnící činidla, jaká jsou shora zmíněna pro prostředky k čištění zubů. Zvlhčovači činidla, jako glycerin a sorbitol, poskytují pocit vlhkosti v ústech. Obecně, bráno podle hmotnosti, ústní vody podle vynálezu obsahují 0 % až 60 % (s výhodou 5 % až 20 %) ethylakoholu, 0 % až 20 % (s výhodou 5 % až 20 %) zvlhčovacího činidla, 0 % až 2 % (s výhodou 0,01 % až 1,0 %) emulgačního činidla, 0 % až 0,5 % (s výhodou 0,005 % až 0, 06 %) sladícího činidla jako je sacharin nebo přirozeného sladidla jako je stevrosíd, 0 % až 0,3 % (s výhodou 0,03 % až 0,3 %) příchuťového činidla a balanční vodu. Jiné případné složky podle výběru, popsané dříve pro použití ve výrobcích zubních past, jsou též prospěšné v prostředcích ústních vod.

Další případnou složkou podle výběru pro použití v těchto prostředcích je zdroj rozpustných fluoridových iontů. Takovéto zdroje zahrnují fluorid sodný, fluorid cínatý, monofluorfosfát sodný, a používají se v množstvích dostatečných k zajištění 10 až 3500 ppm F^-.

Ještě další případná složka podle výběru zahrnuje rozpustné pyrofosfáty nebo fosfonáty nebo karboxylové polymery, jako je kyselina polyakrylová, a methylethylether anhydridu kyseliny maleinové jako protikoagulační činidlo. Také užitečná jsou činidla proti zubnímu povlaku/gingivitidě, jako jsou katíonické materiály, jako je chlorhexidin a cetylpyridinium chlorid, činidla jako cimetin, a neionické materiály, jako jsou triclosan a triclosan monofosfát. Tato činidla jsou popsána v následujících U.S. patentech, zahrnutých zde v jejich úplnosti odkazem: 4 515 772, 7. května 1985; 4 627 977, 9. prosince 1986; a 5 032 386, 16. června 1991. pH předkládaných prostředků a/nebo pH v ústech může být jakékoli pH, jež je bezpečné pro tvrdé a měkké tkáně úst. Takováto pH jsou obecné asi od 3 do 10, s výhodou od 4 do 8.

Jiné přijatelné orální nosiče zahrnují žvýkací gumy, pastilky jakož i jiné formy. Takovéto vhodné formy jsou zveřejněny v U.S. patentu 4 083 955, 11. dubna 1978, pro Grabenstettera et al., zahrnutém zde v jeho úplnosti odkazem.

Jedlé prostředky jsou též vhodné pro použití jako nosiče v odpovídajících prostředcích. Jedlé prostředky zahrnují mnoho typů tuhých jakož i kapalných prostředků. Takovéto prostředky zahrnují například nealkoholické nápoje, citrusové nápoje, sušenky, koláčky, pečivo, mezi mnohými jinými. Takovéto prostředky mohou obsahovat cukr nebo jiné sladidlo, vodu, mouku, tuk, jiné vlákniny jako pšeničné, kukuřičné, ječmenné, žitné, ovesné, prosné a jejich směsi.

Způsoby přípravy

Způsob přípravy cystatinů a jejich fragmentů, jakož i přípravy finálních prostředků je publikován níže.

Preparace cystatinů ΞΝ, S a SA

Čerstvé lidské podčelistní/podjazykové sliny od jednotlivců resistentních k zubnímu kazu jsou odebírány na led, 0 °C. Odebrané sliny jsou upraveny na 50 mM Tris-HCl pH 7,5 + 0,1 M NaCl a míchány na ledu (0 °C) po 2 hodiny. Vzorky jsou centrifugovány při 100 000 x g po 20 - 24 hodin při 4 °C k odstranění mucinů. Výsledný supernatant je před frakcionací amonium sulfátem extenzívně dialyzován proti H₂O při 7 °C. Precipítát po 0 - 30 % amonium sulfátu je vyhozen, a precipitát po 0 - 30 % amonium sulfátu je peletován centrifugací při 10 000 x g po 15-20 minut. Výsledná peleta je extenzívně dialyzována proti H₂O při 7 °C. Rozpuštěná peleta je zlyofilizována, vzata do 50 mM MES pH 6,0 a nanášena na kolonu BioRad Prep High S Cation Exchange Support (1 cm x 21 cm) při. průtoku 0,5 ml/min. Výtok z kolony je sledován při 280 nm a kolona je promývána 50 mM MES pH 6,0 dokud jsou vymývány procházející bílkoviny a základní čára se vrátí k normálu. K eluci bílkovin z kolony se používá gradient 0 až

0,5 M NaCl v 50 ϊΐΜ MES pH 6,0 s průtokem 0,5 ml/min po 30 min. Jednotlivé frakce vycházející z kolony jsou extenzívně dialyzovány proti H₂O při 7 °C a před další purifikací zlyofilizovány.

Spojené frakce z eluce S kolony obsahují cystatin S + SA s pouze menší kontaminací amylázou podle obrazu vybarveného SDS-PAGE gelu. Celková čistota je dále ověřena HPLC chromatografií s reverzní fází.

Protože frakce z eluce S kolony obsahující cystatin SN obsahují také významná množství prolinem bohatých bílkovin, cystatin SN je dále čištěn vsádkovým postupem s hydroxyapatitem. BDH hydroxyapatit je hydratován v 25 mM Tris-HCl pH 3,0 + 0,1 mM NaH₂PO₄ přes noc a jsou z něj extenzívně odstraňovány jemné podíly. Lyofilizovaná(é) frakce z gradientově eluce S kolony, obsahující SN, je (jsou) vzata(y) do 25 mM Tris-HCl pH 3,0 + 0,1 mM NaH₂PO₄a přidána(y) k hydroxyapatitu. Směsí se jemně kývá při pokojové teplotě po 30 minut a pak se centrifuguje při 200 x g po 10 minut. Supernatant obsahující cystatin SN je odebrán a hydroxyapatit je promyt ještě dvakrát stejným pufrem a supernatanty jsou spojeny s prvním. Spojené frakce odebrané nad hydroxyapatitem jsou extenzívně dialyzovány proti H₂O při 7 °C a zlyofilizovány.

Ověření purifikačního postupu se provádí separací alikvotů kolonových frakcí s použitím Laemmeliho SDS-PAGE gelové elektroforézy. Gely se barví 0,04

R-250 a odbarvuji 10 %-ní kyselinou bohatých prolinem.

%-ní Commassie Blue detekci ověření octovou k Pro další basických bílkovin čistoty se používá fází. Lyofilizované alikvoty vzorků pufru B a 6 p,g je injikováno s reverzní fází. (Pufr A = 0,1 také kolonová chromatografie s reverzní jsou rozpuštěny v 5 %-ním na kolonu Vvdac 218TP54 % kyseliny trifluoroctové kyseliny trifluoroctové v H₂O; Pufr B = 0,08 % v acetonitrilu). Použije se lineární gradient od 5 % do

100 % B pří průtoku 1,0 ml/min po 30 minut. Absorpční profil se sleduje při 214 nm.

Příprava Trp Ser Pro Lys Glu Glu Asp Arg Ile Ile

Shora uvedený peptid byl sytetizován s použitím FastMoc chemie (Fmoc chránění, HBTU/HOBt aktivace) na syntetizátoru peptidů Applied Biosystems model 430A. Při preparaci shora uvedeného peptidu se použila HMP pryskyřice spolu s 1 mmol každé aminokyseliny. Cykly na syntetizátoru bly standardní FastMoc/NMP cykly.

Po syntéze byl peptid odštěpen od pryskyřice s použitím směsi TFA:EDT:H20:fenol:thioanisol [10 : 0,25 : 0,5 : 0,75 : 0,5] po 1,5 hodiny při pokojové teplotě. Směs peptidu, pryskřice a TFA směsi byla odfiltrována přes filtr střední porozity a objem filtrátu zmenšen na 2 ml rotačním odpařením. Ten byl zředěn na 20 ml s ^0 a promyt třikrát stejným objemem Et2O. Vodná vrstva byla lyofilizována přes noc.

Surový peptid byl analyzován HPLC s reverzní fází (Beckman) na koloně Vydac (C₁₈ 5m 300 A, 4,6 x 250 mm) s následujícím gradientem 0 - 40 % B po 40 minut (A = 0,1 % TFA; B = 99,9 % CH^CN, 0,1 % TFA) při 1 ml za minutu. Po charakterizaci (viz níže) byl surový produkt zpracován na koloně Vydac (C₁₈ lOm 300 A, 25 x 250 mm) se shora uvedeným gradientem při průtoku 10 ml za minutu.

Jak surový, tak HPLC čištěný peptid byl charakterizován LCMS technikou na SCIEX MS a v obou případech byla stanovena patřičná molekulová hmotnost. Výsledný peptid je podle HPLC z > 95 % čistý.

Definice

Fmoc: 9-fluorenylmethyloxykarbonyl; HBTU: (2-(H-benzotriazol-l-yl)-l, 1, 3, 3-tetramethyluronium hexafluorfosfát; HOBt: l-hydroxybenzotriazol hydrát; HMP: p-hydroxymethylfenoxymethyl polystyren; NMP: N-methylpyrrolidon; TFA: kyselina trifluoroctová; EDT: 1,2-ethandithiol.

Průmyslová využitelnost:

Prostředky podle předkládaného vynálezu se používají konvenčním způsobem.

Následující příklady dále popisují a předvádějí výhodná provedení v rámci předkládaného vynálezu. Příklady jsou dány pouze pro účely objasnění a nemají být vykládány jako omezení tohoto vynálezu. Mnoho variací je možných bez odklonu od ducha a rozsahu vynálezu.

Navíc ke hladinám a kombinacím složek ukázaným v těchto příkladech se mohou používat i další, jež jsou konzistentní s vynálezem, jak je zde zveřejněn.

Příklad 1

Toto je ústní voda, jež je reprezentativní pro předkládaný vynález.

Složka:	Hmot. %
Cystatin SA	0,05
Ethanol (95 % hmot.)	5,500
Glycerin	5,000
Příchuť	0,070
POE(20) sorbitan monoisostearát	0,050
Sacharin, sodná sůl	0,050
Destilovaná voda	qs 100,000

Příklad 1

Následující je zubní pasta, jež je reprezentativní pro předkládaný vynález.

Složka:	Hmot. %
Sražený křemičitý brusný materiál	35,0
Cystatin SN	0,25
Glycerin	5,0
Roztok sorbitolu (70 %)	20,0
Karboxymethylcelulóza (0,7 D.S.)	0,5
Dihydrogenortofosfát sodný
monohydrát, (NaH₂P0₄ H₂O)	0,3
Hydrogenortofosfát dvoj sodný
dihydrát, (Na₂HP0₄ 2H₂O)	0,3
Neionická povrchové aktivní látka	2,3
Příchuť	0,9
Sacharin, sodná sůl	0,2
Kysličník titaničitý (TiO₂)	0,2
Značení	0,5
Destilovaná voda	q. s
Celkem	100,0

Příklad 3
Toto je další ústní voda, jež je	reprezentativn
předkládaný vynález.
Složka:	Hmot. %
Fragment A*	0,5
Ethanol (95 % hmot.)	5,500
Glycerin	5,000
Příchuť	0,070
POE(20) sorbitan monoisostearát	0,050
Sacharin, sodná sůl	0,050
Destilovaná voda	qs 100,000

* Fragment A, jak je definován Trp Ser Pro Lys Glu Glu Asp Arg Xle Ile.

na straně 5, je

Bílkoviny z Příkladů 1 a 3 byly hodnoceny v mikrobiologickém testu na stanovení jejich schopnosti snižovat produkci kyselin.

V tomto testu se rozsuspenduje 200 μ,Ι bakterií ve fyziologickém solném roztoku na optickou hustotu (O.D.) 0,175, přidá se k 200 μΐ fyziologického solného roztoku obsahujícího bílkovinu (nebo polypeptid) a třepe se po 6 minut při 81/2 cyklech/minutu, při 37 °C. Pak se přidá 300 μΐ roztoku obsahujícího 11,2 % sacharózy, 0,9 % soli a 0,21 % tryptikázové sójové půdy bez dextrózy a vzduchotěsné zkumavky se třepou po 2,5 - 4 hodiny, kdy se odečte pH s použitím pH-mikroelektrody.

Tabulka zde níže udává koncentrace aktivních složek, při kterých nastane 50 %-ní inhibice produkce kyselin, vztaženo na negativní kontrolu.

Koncentrace poskytující 50 %-ní snížení produkce kyselin:

Cystatin SA 6 x 10^-7 M

Fragment A 1 x 10^-5 M

ΡΑΤΒΜΤβϊΒΤ»

Praha a.e.

Claims

1. Orální nebo jedlé prostředky vyznačující se tím, že obsahují orální nebo jedlý nosič a účinné množství cystatinu S, SA, SN nebo jeho fragmentu nebo jejich směs.

2. Orální nebo jedlý vyznačuj ící orální prostředek.

3. Orální nebo jedlý prostředek podle kteréhokoli z Nároku 1 nebo 2vyznačující se tím, že má formu zubní pasty, ústní vody, tekutého prostředku k čistění zubů, žvýkačky nebo pastilek.

4. Orální prostředek podle Nároku 3 vyznačující se t í m , že má formu zubní pasty, která obsahuje zubní křemičitý brusný materiál.

5. Orální prostředek podle kteréhokoli z Nároku 1-4 vyznačující se tím, že navíc obsahuje zdroj rozpustných fluoridových iontů k poskytnutí od 0 do 3500 ppm F”.

6. Oráiní prostředek podle kteréhokoli z Nároku 1-5 vyznačující se tím, že navíc obsahuje od 0 % do 10 % emulgačního činidla.

7. Orální prostředek podle Nároku 3 se t í m , že navíc obsahuje od činidla zubní pasty nebo činidlo nebo činidlo proti zubnímu kameni nebo jejich směs.

8. Orální prostředek podle Nároku 3 vyznačující se t i ni , že má formu ústní vody.

9. Orální nebo jedlý prostředek podle Nároku 1 vyznačující se tím, že prostředek je ve formě citrusového nápoje, nealkoholického nápoje, sušenky, koláčku, oplatky nebo zákusku.

je vyznačuj ící 0,1 % do 1 % vázacího proti zubnímu povlaku

10. Použití cystatinu s, SA, SN nebo jeho fragmentu nebo jejich směsi vyznačující se tím, že se vyrábí prostředek vhodný k redukci zubního kazu u jednotlivců náchylných k zubnímu kazu.

11. Výroba podle Nároku llvyznačující se tím, že řečený prostředek je zubní pasta.