CZ168296A3 - Spermatic antigen corresponding to auto-antigenic epitope of spermatic bond protein - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Předkládaný vynález zahrnuje DNA kódující savčí Sp 17 protein, zvláště lidský Sp 17 protein, nebo antigenní peptidy, které jsou jeho fragmenty spolu s těmito antigenními fragmenty. Tyto proteiny a peptidy jsou použitelné jako imunokontraceptivní prostředky a/nebo k diagnóze autoimunitní neplodnosti. Popsány jsou zde také avirulentní hostitelské buňky, které exprimují antigenní proteiny nebo peptidy a které jsou použitelné jako imunokontraceptivní prostředky.

I ίΊ j 1 Ί ί —____

Spermatický antigen odpovídající ýi^dc^^^rinÍRpu epiropn—spermatického vazebného proteinu

o a

Co.

co.

<r>

M

IC

Tento vynález byl uskutečněn za podpory vlaciy,'T5ískugi^sántu / U54 HD29009, grant poskytly Národní insníuiy zdraví (National institutes of Health). Víáda má na tento vynález určitá práva.

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká antigenu, které odpovídají autoantigenním epitopům spermatického vazebného proteinu na jasné zóně (zóna pellucida), a terapeutických a diagnostických způsobů využívajících tyto antigeny.

D osa v a d ní stav techni ky

Autoantigeny jsou tkáňové složky organismu, na které organismus směřuje imunitní odpověď. Stav. který vyplývá z takové samořízené imunitní odpovědi, je znám jako autoímunita (nebo autoalergie). Spermatické proteiny jsou známy jako potentní autoarvligony a věří se. že autoímunita lakových proteinů je signifikantní příčinou neplodnosti.

R, Shabanowitz a M. O'Rand, Ann. NY Acad. Sci. 541, 621 632 (1988), obi. 7, popisují rúzrné lidské prak·,‘iny kloio mají afinitu k lidské jasné zóna

M. CYRand a Η Widgron, U.S. Pálení Na. 5 175 148, popisují spermatický antigen. kíerý odpovídej auíoaniigennímu epilogu králičího spermatického membránového autoantigenu (RSA). Nyní je známo, že RSA je rodina čtyř nízkomolekulárních glykoproteinů (RSA-1,2,3,4; 14K, ΙόΚ, 17K, 18K), které fungují jako vysokoatinitní vazebné proteiny zóny. Klonování králičího RSA 3 (také nazývaného Sp1 7) je popsáno R. Richardsonen i a M. C/Randem, Mol. Biol. Cell. 3, 15a (1992).

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález zahrnuje DNA kódující savčí Spi 7 protein, zvláště lidský Spi7 protein, nebo antigenní peptidy, které jsou jeho fragmenty. Tyto proteiny a peptidy jsou použitelné jako imunokontraceptivni prostředky a/nebo l< diagnóze autoimunitní neplodnosti. Popsány jsou zde taká avirulentní hostitelské buňky, které exprimují antigenní proteiny nebo peptidy a které jsou použitelné jako imunokontraceptivni prostředky.

Shrnutí obsahu vynálezu

Prvním aspektem předkládaného vynálezu je izolovaná DNA kódující lidský Spi7 protein nebo antigenní peptidy, které jsou jeho fragmenty vybrané ze skupiny sestávající /;

a) izolované DNA (např. DNA mající 51.Q ID NO:1), která kóduje lidský Spi 7 protein mající aminokyselinovou sekvenci zde uvedenou jako SEQ ID NOC;

b) izolované DNA, která hybridizuie s izolovanou DNA (a) uvedenou viz výše a která kóduje lidsky Sp 17 protein;

c) izolované DNA lišící se od izolovaných DNA (a) a (b) uvedených viz výše v nukleotidové sekvenci v důsledku degradace genetického kódu a která kóduje lidský Spi 7 protein; a

d) fragmentů předchozích DNA, které kódují antigenní peptidy (tj. peptidy, které vážou protilátky, které se vážou na lidský Spi7 protein, ial< je popsáno dále, typicky peptidy o délce od 6 do 25 aminokyselin). Tyto proteiny a peptidy jsou dále někdy nazvány jako antigen a jsou použitelné jako imunokontraceptivní činidla a/nebo k diagnóze autoimunitní neplodnosti, jak je uvedeno viz níže.

Druhým aspektem předkládaného vynálezu je sekvence rekombinantní DNA zahrnující vektorovou DNA a DNA uvedenou viz výše.

Třetím aspektem podle předkládaného vynálezu je hostitelská buňka obsahující sekvenci rekombinantní DNA , jak bylo uvedeno viz výše, a schopnou exprimovat kódovaný Sp i 7 protein nebo jeho antigenní peptidický fragmen i.

Čtvrtým aspektem předkládaného vynálezu jsou antigenní peptidy (viz níže použito také označení antigen nebo antigeny) použitelné jako imunokontraceptivní činidlo nebo k diagnóze autoimunitní neplodnosti, vybrané ze skupiny sestávající z:

1) antigenních fragmentů savčího Spi 7 proteinu, jejichž délka činí od ó do 25 aminokyselin a

2) jejich antigenních ekvivaleniů. přičemž antigenními ekvivalenty jsou:

a) modifikovaný fragment zahrnující antigenní fragment modifikovaný nahrazením jedné nebo více aminokyselin jeho sekvence; nebo

b) delší peptid, který zahrnuje sekvenci antigenního fragmentu a který má (i) až čtyři další aminokyselinové zbytky připojené na C-konec této sekvence, (ii) až čiyri další aminokyselinové zbytky propojené na N-konec této sekvence nebo (iii) až čtyři další aminokyselinové zbytky připojené na C-konec této sekvence a až čtyři další aminokyselinové zbytky připojené na N-konec této sekvence; kde uvedené antigenní ekvivalenty vážou protilátky proti uvedeným antigenním fragmentům savčího Spi 7 proteinu. Antigenní fragmenty savčího Sp 17 proteinu, jsou vybrány ze skupiny sestávající z (i) fragmentů o 4 až 28 aminokyselinách, (ii) fragmentů o 34 až 49 aminokyselinách, (iii) fragmentů o 55 až 82 aminokyselinách, (iv) fragmentů o 117 až 137 aminokyselinách a (v) fragmentů (i) až (iv) majících délku nejméně 6 aminokyselin.

Pátým aspektem předkládaného vynálezu je imunokontraceptivní způsob, který zahrnuje administraci antigenu subjektu (např. ženě) popsaného viz výše v množství účinně snižujícím plodnost subjektu.

Šestým aspektem předkládaného vynálezu je imunokontraceptivní vakcínový prostředek zahrnující antigen uvedený viz výše v množství účinné snižujícím plodnost subjektu; v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Sedmým aspektem předkládaného vynálezu je způsob screeriingu autoimunitní neplodnosii subjektu (např. muže) zahrnující detekci přítomnosti protilátek v subjektu, které se vážou na antigen uvedený viz výše, a přítomnosti těchto protilátek indikující, že subjekt je postižený autoimunitní neplodností.

Osmým aspektem předkládaného vynálezu je avirulentní hostitelská buňka (např. mikrobiální hostitelská buňka) obsahující sekvenci rekombinantní DNA kódující antigen uvedený viz výše a schopnou exprimovat kódovaný antigen.

Devátým aspektem předkládaného vynálezu je imunokontraceptivní vakcínový prostředek zahrnující avirulentní hostitelskou buňku popsanou viz výše v množství účinně snižujícím plodnost subjektu v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Ve výhodném provedení výše uvedeného prostředku postrádá avirulentní mikroorganismus funkční nativní chromozomální gen kódující β-asparíátsemialdehyddehydrogenázu (asd) a dále zahrnuje rekombinantní gen kódující funkční asd polypeptid. Rekombinantní gen je připojen na jeden nebo více genů kódujících jeden nebo více antigenu uvedených viz výše. Avirulentní mikroorganismus může také zahrnovat mutovaný cyg gen, takže je pak neschopný produkovat funkční adenyiátcyklázu, a/nebo mutovaný crp gen způsobující, že mikroorganismus není schopen produkovat funkční cyklický AMR receptorový protein,

Předkládaný vynález je detailněji vysvětlen na obrázcích zde uvedených a ve specifikacích uvedených viz níže.

Popis obrázků

Obr. 1 ukazuje vazbu antíséra ze samce králíka indikovaného jeho vlastním spermatem na králičí Sp 17 sekvenčního dekapeptidu majícího aminokyselinové sekvence popsané zde jako SEQ ID NO:3 až SEQIDNOM9. Na tomto obrázku je SLQIDNO pro každý dekapeptid vložena na jeho levou a/nebo pravou stranu.

Obr. 2 ukazuje vazbu směsného séra ze čtyř vázektomizovaných mužů o vysokém titru antispermatických protilátek testovaných proti králičím Spi 7 sekvenčním dekapeptidum užitých na obr. 1. Všechny vrcholy na tomto grafu reprezentují lidské autoantigenní epitcpy B-buněk.

Obr. 3	ukazuje vazbu	imunilního séra ze	samice králíka
imunizované	králičím Sp	>17 rekombínantním	antigenem
na sekvenční	'dokapepfidy po	psané na obr, 1.
Obr. 4	ukazuje vazbu	imunitního séra ze	san	íice králíka
imunizované!	ίο syntetickým	peptidom G22C	na	sekvenční
dekapepiidy	popsané na obr	i
Obr. 5	ukazuje vazbu	imunitního séra ze	samice králíka
imunizované	syntetickým	peptidem G22C	na	sekvenční

dekapepiidy popsané na obr. I.

Obr. 6 znázorňuje účinek imunizace myší rekombínantním Sp 17 (fúznírn proteinem) na plodnost. Scestí myším byl podán lidský Spi7. Adjuvantním kontrolám (n· 12) bylo podáno pouze ΊΊΤΙ-Ι2ΜΑΧ^ΙΜ adjuvans (dostupné u Sigma Co., Sl· Louis). Sesli myším nebyly podány žádné injekce. Myši imunizované lidským Spi/ rekombínantním proteinem vykazovaly 42% pokles otěhotněni.

Να obr. 7 jsou seřazeny králičí (PABSP17), myší (MUSSP17) a lidské (HUMSP17) Spi7 proteinové sekvence. Autoantígenní fragmenty jsou označeny rámečky. Číslování probíhá od N-konce do C-konce, podle číslování lidské sekvence, s gap sekvencemi vloženými do ostatních savčích sekvencí za účelem maximalizace seskupení autoantigenních fragmentů uvedených v rámečkách a čísla jsou vynechána tam, kde jsou vloženy gap sekvence, takže číslování autoantigenních fragmentů označených v rámečkách odpovídá fragmentům na protější straně.

Provedení vynálezu

Aminokyselinové sekvence zde popisované jsou uváděny ve směru od N-konce k C-konci, zleva doprava. Amino- a karboxyskupiny nejsou v sekvenci uvedeny.

Nukleotidové sekvence jsou zde prezentovány pouze jedním řetězcem, ve směru od 5' k 3'konci, zleva doprava. Nukleotidy a aminokyseliny jsou zde uváděny způsobem požadovaným IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission nebo (pro aminokyseliny) trojpísmenným kódem v souladu s 37 CFR §1.822 a zavedeným použitím. Viz např. Patent In User Manual, 99-102 (listopad 1990) (U.S. Patent and trademark Office, Office of the Assistant Commissioner for Patents, Washington, D.C. 20231); U.S. Patent No. 4 871 670, I ludson a led, sloupec 3, řádky 20-43 (předkladatelé zde záměrně uvádějí tyto a všechny ostatní patentové reference zde citované jako reference).

A. Molekulární biologie

DNA, které kódují lidské Spi7 proteiny, jsou-li to cDNA nebo genomové DNA, kódují protein o velikosti 17 kilodalfonů, který se váže no lidskou jasnou zónu (zóna pellucida) s vysokou afinitou navázáním sulfátováných složitých sacharidů. Tato definice zahrnuje přirozené allelické variace v DNA.

DNA kódující Spi 7 proteiny, které hybridizují s DNA kódující lidský Spi7 protein zde uvedený, mohou mít původ z různých druhů, včetně myšovitých (myš, krysa), králíka, kočky, druhů vepřů, dále včetně člověka, opice nebo paviána, ale výhodně kódují Spi7 protein savčího původu a nejvýhodněji kódují lidské Spi7 proteiny. Syntetické DNA lze připravit v souladu se známými technikami.

Hybridizační podmínky, kleré povalí ostatním DNA sekvencím, které kódují expresi Sp i 7 proteinu, hybridizovcí s DN/A sekvencí zde uvedenou, jsou obecně vysoce přesné. Např. hybridizaci takových sekvencí lze provádět za podmínek icprezenfcivaných promývacím roztokem o přesném složení jako je 0,8 M NaCl, 0,03 M citrát sodný, 0,l%SDS při teplotě 60 C nebo i 70 “C pro DNA zde uvedené (např. SEQID NO:1) při standardní in sítu hybridizační zkoušce. (Viz. J. Sambrook a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2d Ed., 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)).

Obecně DNA sekvence, které kódují Sp 17 proteiny a hybridizují se zde popsanou DN/A sekvencí kódující lidský Spi 7 protein, budou nejméně z 70%, 75%, 80%, 85%, 90% nebo až 95% homologní nebo více se zde popsanou sekvencí DNA kádi ijíeí lidský Sp i 7 protein.

Obecně DNA sekvence, které kódují lidské Sp i 7 proteiny a hybridizují s DN/A kódující zelo popsaný lidský/ Sp i 7 protein, budou z 93%, 94%, 95%, 96% nebo i 97% homologní nebo více se zde popsanou sekvencí DNA kódující lidský Sp 17 protein.

Dále DNA sekvence kódující lentýž Spi/ protein kódovaný předchozími sekvencemi, ale lišící se v sekvenci kodonu kvůli degeneraci genetického kódu, jsou íokó aspektem předkládaného vynálezu. Degenerace genetického kódu, která dovoluje různým sekvencím nukleových kyselin kódovat tentýž protein nebo peptid, je dobře známa v literatuře. Viz např. U.S. Patent No. 4 757 006, Toole a kol., sloupec 2, tabulka 1.

Produkce klonovaných genů, rekombinantní DNA, vektorů, transformovaných hostitelských buněk, proteinů a proteinových fragmentů genovým inženýrstvím je dobře známa. Viz např. U.S. Patent No. 4 761 371, Bell a kol., sloupec 6, řádek 3 až sloupec 9, řádek 65; U.S. Patent No. 4 877 729, Clark a kol , sloupec 4, řádek 38 až sloupec 7, řádek 6; U.S. Patent No. 4912 038, Schilling, sloupec 3, řádek 26 až sloupec 14, řádek 12: a U.S. Patent No. 4 879224, Wailner, sloupec 6, řádek 8 až sloupec 8. řádek 59

Vektor je replikovatelný DN/\ konstrukt. Vektory jsou zde použity buďk amplifikací DNA kódující Sp i 7 proteiny zde uvedené a/nebo k expresi DNA kódující Sp 17 proteiny zde uvedeno. L· xpresní vektor je replikovatelný DNA konstrukt, kde DNA sekvence kódující Spi7 protein je použitelně připojena na vhoclne kontrolní sekvence schopné vyvolat expresi DNA sekvence ve vhodném hostiteli. Potřeba takových kontrolních sekvencí se liší v závislosti na vybraném hosírieli o. vybraném způsobu íransíormaoe. Obecně kontrolní sekvence obsahují promotor transkripce, volitelnou sekvenci operátoru ke konlrolo transkripce, sekvenci kódující

Ιϋ vhodnou mRNA ribozomální vazebná místa a sekvence, které kontrolují ukončení transkripce a translace. Typický vektor zahrnuje, ale není na ně omezen, plazmidy, viry, tágy a integrovatelné fragmenty DNA (tj. fragmenty integrovatelné do hostitelského ge n o m u re k o rabína o í),

DNA oblasii jsou použitelně připojeny nebo použitelně asociovány, jsou-li funkčně ve vztahu jedna k druhé. Např. promotor je použitelně připojen ko kódující sekvenci, jesíiiže kontroluje transkripci sekvence; nebo ribozomální vazebné místo je použitelně připojeno ke kódující sekvenci, je-li umístěno tak, že umožňuje translaci.

Transformované hostitelské buňky jsou buňky, které byly transformovány nebo transfekovány vektory obsahujícími DNA sekvenci, která zde byla popisována, konstruovanými za použití technik rekombinantní DNA. Transformované hostitelské buňky obvykle exprimují receptor, ale hostitelské buňky transformované pro účely klonování nebo amplífíkace receptářové DNA nepotřebují exprimovat receptor.

Vhodné hostitelské buňky zahrnují prokaryotické buňky, kvasinky nebo vyšší eukaryotické buňky jako savčí buňky a hmyzí buňky. Buňky pocházející z mnohobuněčných organismů jsou zvláště vhodnými hostiteli pro syntézu rekombinantního Spi7 proteinu zvlášíě výhodné jsou savčí buňky. Propagace lakových buněk v buněčné kultuře se stala rutinní procedurou Clissue Culture,

Academie Press, editoři Kruso a Patterson, Ί973), Příklady použitelných hostitelských buněčných linií jsou V i PO a Hel. o; buňky a buněčná linie ovariálních buněk čínského křečka (CHO). Expresní

II vektory pro takové buňky obvykle zahrnují (je-li To nutné) počátek replikace, promotor umístěný ve směru 3 k 5' (upstream) od DNA kódující Sp i? protein, který má být exprimován a operativně asociován spolu s ribozomálním vazebným místem, místo RNA sestřihu (je-li použita genomová DNA obsahující intron), polyadenylačni místo a terminačnísekvenci transkripce.

Transkripční a translační kontrolní sekvence v expresních vektorech určených k použití v transformujících buňkách obratlovců jsou často poskytovány pomocí virových zdrojů. Např. běžně používané promotory pocházejí z polyomaviru, Adenoviru2 a Simian viru 40 (SV40). Viz např. U.S. Patent No. 4 599 308.

Počátek replikace je poskytován buď konstrukcí vektoru za účelem začlenění exogenního počátku, pocházejícího z SV40 nebo jiných virových zdrojů (napí. polyoma, adenovirus, VSV nebo BPV), nebo je poskytován chromozomálním replikačním mechanismem hostitelské buňky, Je-li vektor integrován do chromozomu hostitelské buňky, je íonro obvykle dostatečný.

Lepší než použití vektorů, které obsahuji virální počátky replikace, je transformace savčích buněk způsobem kotransformace se selektovatelným markérem a receptorem DNA. Příklady vhodných selektovatelných markérů jsou dihydrofolátreduktáza (DHLR) nebo thymidinkindza, tento způsob jo dále popsán v U.S. Patent No. 4 399 2 16.

Hostitelské buňky jako nrny/í buňky (např. kultivované Spodoptera frupiperda buňky) a expresní vektory jako bakulovirový expresní vektor l/e použít podle předkládaného vynálezu, jak je popsáno v U.S. Patent No. 4 745 U5I a 4 879 236, Smilh a kol.

Prokaryotické hostitelské buňky zahrnují gramnegativní nebo grampozitivní organismy, např. Escherichia coli (E. coli) nebo Bacilli.

Eukaryotioké mikroorganismy jako kvasinkové kultury lze také transformovat vektory nesoucími zde uvedené izolované DNA. Viz např. U.S. Patent No. 4 745 057. Nejbézněji používaný mezi nižšími eukaryo íickými hostitelskými organismy je Sac .eharoroyces cerevisiae, ale běžně dostupný je velký počet dalších kmenů.

B. Peptidy

Jednou skupinou příkladu antigenních fragmentů podle předkládaného vynálezu znázorněnou na obr. 1 jsou antígenní fragmenty vybrané ze skupiny sedávající z peptidů majících aminokyselinovou sekvencí:

SEQIDNO:3,	SEQ ID NO ZI.	SI-QID NOE	SEQIDNO:6,
SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NC	N9, SEQ ID NO	SIC), SEQIDNO: 1 Έ
SEQ ID NO: 14,	SEQ ID NO: 15,	SEQ ID NO: 16,	SEQ ID NO: 17,
SEQ ID NO;20,	SEQIDNOzN,	Sl m ID NO: 22,	SřQ ID NOV/·
SEQ ID NO:24,	SEQ ID NO:25,	SEQID NO:2'6,	SEQiDNO:?/.
SEQIDNO:28,	SEQIDNO:29,	SEQIDNO:34,	SEQ ID NO:40,

SEQ ID NO:41, SEQ ID NO.43, a jejich fragmentů o délce nejméně 6 aminokyselin. Zvláště výhodné jsou aniigonní íragmeníy vybrané /e skupiny sestávající z peptidů majících aminokyselinovou sekvenci:

SEQÍDNON,	SEQ ID NO:Ó,	Sl (O ID NOzi,	SEQ ID NO:9,
SEQ ID NO: 14,	SEQ ID NO: 15,	SEQIDNO: 16,	SEQIDNONO,
SEQIDNO:? 1,	SNŮ ID NO.22	SEQID NO:24.	SEQIDNON5,
SEQ ID NO:26,	SEQID NO:27,	Sl O ID NOVŮ,	SEQID ΝΟΝΕ

SEQ ID NO:43 a jejich fragmentů o dálce n-dmené 6 aminokyselin.

Jinou skupinou příkladu antigenních fragmentů podle předkládaného vynálezu znázorněnou na obr. 2 jsou antigenní fragmenty vybrané ze skupiny sestávající z peptidů majících aminokyselinovou sekvenci:

SEQIDNO	:3, SEQ ID NOA	SEOIDNO7,	SEQIDNO:8,
SEQ ID NO:9,	SEQ ID NO: 10,	SEQ ID NO: 1 1,	SEQ ID NO: 12,
SEQIDNO: 13,	SEQ ID NO: 14,	SEQIDNO: 13,	SEQ ID NO: 16,
SEQ ID NO: 17,	SEQIDNO:20,	SEQIDNO:21,	SEQIDNO:22,
SEQ ID NO:23,	SEQ ID NO:24,	SEQ ID NO:25.	SEQ ID NO:2ó,
SEQIDNO:27,	SEQIDNO.28,	SEQIDNO:29,	SEQIDNO:30,
SEQIDNO:32,	SEQIDNO:33,	SEQIDNO:34,	SEQIDNO:35,
SEQIDNO:36,	SEQIDNO:38,	SEQIDNO:39,	SEQIDNO:40,
SEQIDNO:43,	SEQIDNO:47, SEQIDNO:48, SEQIDNO:49, a jejich

fragmentů o délce nejméně ó aminokyselin. Zvláště výhodné jsou antigenní fragmenty vybrané ze skupiny sestávající z peptidů majících aminokyselinovou sekvenci:

SEQIDNO:8, SEQIDNO:9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQIDNO:21, 5EQIDNO:22, SEQIDNO:24, SEQIDNO:25, SEQIDNO:34, SEQIDNO:40, SEQIDNO:43 a jejich fragmentů o délce nejméně 6 aminokyselin.

Obecně delší pepfidy výhodně zahrnují sekvenci antigenního peptidů popsanou viz výše. Delší pepfidy poskytují antigenní sekvenci ve vyčnívajícím mísíc molekuly a neskrývají ji uvnitř molekuly, kde by byla nedostupná pro vazbu. Delší pepfidy, které nemají více než čtyři další aminokyseliny bud' na N-konci nebo C konci antigenu jsou výhodné, proioze sekvence o takové délce jsou obecně nedostatečné k poskyiování dalšího epitopu na delším peptidu, který může mít nežádoucí účinky na aktivitu anfigenu.

Peptidy, které lze použil podle předkládaného vynálezu, zahrnují jejich analoga. Taková analoga jsou sloučeniny, které ač nemají aminokyselinové sekvence it Jcniicke se sekvencemi peptiáů popsaných viz výše, mají podobnou írojrozměrnou strukturu. V molekule proleinu, která interagujo s rccoptorem, musí interakce mezi proteinem o receptorem probíhat na povrchově přístupných místech stabilní trojrozměrné molekuly. V souladu se známými technikami byly uspořádáním kriíických zbytků vazebných míst ve vhodné komformaci navrženy a syntetizovány peptidy, které napodobují esenciální povrchové znaky peptidů podle předkládaného vynálezu. Způsoby určování trojrozměrné struktury peptidu a jeho analog jsou známé o jsou někdy označované jako racionální íochniky navríiovciní léčiv. Viz např. US. Patent No. 4 833 092, Geysen; U.S, Páleni No. 4 859/65, Neder; U.S. Patent No. 4853 871, Pantoliano; U.S. Polent No. 4 863 857, Blalock; (předkladatele zamýšlejí všechny zde cil ovane rororence U S. Patentů uvést zde jako reference coby jeden celek). Viz také Waldrop, Science 247, 28029 (1990); Rossmann, Nátuře 333, 392-393 (1988); Weiss a kol., Nátuře 333, 426-431 (1988). Jsou. známé techniky konstrukce a sereeningu knihoven peptidickýeh sekvencí k identifikaci peptidu, které se specificky vážou na daný protein. Scoft a Smíth, Science 249, 386· 390 ( 1990); Devlin a kol., Science 249, 404-406 (1990). Dále tyto znalosii v oboru dovoluji io, že lze v aminokyselinových sekvencích peptidů podle předkládaného vynálezu vytvořil menší deleeo rnbo subsíiiuce bez ioho, že by měly nadměrně nepříznivý účinek no: jejich aktivitu. Takže peptidy obsahující takové delece nebo substituce jsou dalším aspektem podle předkládaného vynálezu.

V peptidech obsahujících substituce nebo záměny aminokyselin lze nahradit jednu nebo více aminokyselin peptidové sekvence jednou nebo více aminokyselinami, které neovlivňují aniigenicitu téio sekvence, takové /měny lze usměrňovat známými podobnostmi mezi aminokyselinami ve fyzikálních vlastnostech jako je nábojová hustota, hydrofobnost/hydrofilnost, velikost a konfigurace, takže aminokyseliny jsou substituovány jinými aminokyselinami majícími v zásadě stejné funkční vlastnosti. Např.:

Ala lze nahradit Val nebo Ser;

Val lze nahradit Aia, Leu, Met nebo lle, výhodně Ala nebo Leu;

Leu lze nahradit Ala, Val nebo lle, výhodně Val nebo lie;

Gly lze nahradit Pro nebo Cys, výhodně Pro;

Pro lze nahradit Gly, Cys, Ser nebo Met, výhodně Gly, Cys nebo Ser;

Cys lze nahradí I Gly, Pro, Ser nebo Met, výhodně Pro nebo Met;

Met lze nahradit Pro nebo Cys, výhodně Cys;

His lze nahradit Phe nebo Gin, výhodně Phe;

Phe lze nahradit I tis, tyr nebo I rp. výhodně His nebo tyr;

Tyr lze nahradit His, Phe nebo I rp, výhodně Phe Μα I rp;

Trp lze nahradit I ’he nebo tyr, výhodně Tyr;

Asn lze nahradit Gin nebo Sei, výl rádně Gin;

Gin lze nahradit His, Lys, Glu, Asn nebo Ser;, výhodně Asn nebo

Ser;

Ser lze nahradit Gin, Ihr, Pro, i rys neboAla;

Thr lze nahradit Gin nebo Ser, výhodně Ser;

Lys lze nahradit Gin nebo Arg;

Arg lze nahradit Lys, Asp nebo Glu, výhodně Lys nebo Asp;

Asp lze nahradit Lys, Arg ebo Glu, výhodně Arg nebo Glu; a

Giu lze nahradit Arg nebo A.sp, výhodně Asp.

Jednou provedené změny lze rutinně screenovat, aby se určily jejich účinky na antigenicitu protilátek, které se vážou na antigen.

Zde použitý termín antigenní ekvivalenty se týká proteinu nebo peptidů, které se vážou na protein nebo peptid, u kterého byla nalezena stálá ekvivalence. Protilátky, které se používají k výběru takových antigenních ekvivalentů, jsou zde nazvány selekční protilátky. Antigenní ekvivalenty lze vytvořit modifikací reaktivních skupin s přirozenou sekvencí nebo modifikací N-koncové amino- a/nebo C-koncove karboxylové skupiny, takové ekvivalenty zahrnují soli vzniklé reakcí s kyselinami a/nebo bázemi, zvláště s fyziologicky přijatelnými anorganickými a organickými kyselinami a bázemi. Další ekvivalenty zahrnuli modifikované karboxylové a/nebo aminoskupiny na antigenu, tj. estery nebo amidy, nebo chránící skupiny aminokyselin jako je N-t-butoxykarbonyl. Výhodné modifikace jsou takové, které poskytují stabilnější aktivní peptid, který bude méně náchylný k enzymatické degradaci in vivo.

C. Imunokontraceptivní způsoby

Jak již bylo zmíněno výše, poskytuje předkládaný vynález imunokontraceptivní způsob zahrnující adiminisiraci antigenu popsaného viz výše živočišnému subjektu v množství účinně snižujícím plodnost tohoto subjektu. Částečná snížení plodnosti (tj.

účinky, které se jeví jako snížení plodnosti v populaci subjektů) jsou v souladu s rozsahem předkládaného vynálezu.

Jakýkoliv živočich může býi podroben imunokontraceptivnímu způsobu podle předkládaného vynálezu, včetně ptáků i savců, Příklady savců zahrnují myši, králíky, psy, kočky, krávy, vepře, ovce, koně a lidi. Výhodní jsou savci. Subjektem může býi samec nebo samička. Antigen lze administroval subjektu jakýmkoliv vhodným způsobem, např. niírosvalovou injekcí, subkuiánní injekcí, nitrožiiní injekcí, intraperitoneální injekcí, orální administrací a nosním sprejem.

Množství administrovaného antigenu závisí na faktorech jako je způsob administrace, látka a použití podpůrné administrace. Obecně lze použít dávkování od 0,1 do 100 pg na 454 g (1 libru) tělesné hmotnosti subjektu, výhodněji I jig na 454 g.

Imunokontraceptivní způsob podle předkládaného vynálezu počítá s léčbou lidí i zvířat a antiqeny podle předkládaného vynálezu lze připravit jako lidské i veterinární vakcinové prostředky. Vakcínové prostředky podle předkládaného vynálezu zahrnují antigen ve farmaceuticky přijatelném nosiči. Antigen je včleněn v nosiči v množství účinně snižujícím plodnost subjektu, který má být podroben léčbě. Farmaceuticky přijatelným nosičem je výhodně kapalina, zvlášíě vodná, a nosíce j< íko fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem sodným. Vakcínový prostředek lze uchovávat ve sterilním skleněném kontejneru opatřeném gumovým uzávěrem, přes který lze injikovai kapalinu a injekční síříkačkou nabíral prostředky.

Vakcínové prostředky podle předkládaného vynálezu mohou volitelně obsahovat jedno nebo více adjuvans. Lze použít jakékoliv vhodné adjuvans, např. hydroxid hlinilý, fosforečnan hlinitý, rostlinné a živočišné tuky a podobně, v množství závislém na povaze použitého ao'ji ivano Dálo mohei i v iknín< své prostředky obsahovat jeden nebo více sfabilizaioru např. sacharidy iako je sorbiiol, mannitol, škrob, sacharoza, dexirin a glukóza, proteiny jako je albumin nebo kasoin a pufry jal« > je íosíoročrιαη alkalického kovu a podobně.

D. Diagnostické způsoby

Diagnostické způsoby podle předkládaného vynálezu poskylují způsob diagnostiky auioimunitní neplodnosti u samců i samic, termín autoimunitní je zde použit v generickém smyslu, jako je imurlita u samic prou oxogennimu spermoiu

Při provádění diagnostického sianovení podle predkládanéřio vynálezu lze použít jakýkoliv božný způsob detekce protiláiek. včetně agiutinačnich o preeipitaěních reakcí, radioímunostanovení, enzymových stanovení (např. U.S. Pařeni No. 3 654 090) jako je ELISA-test, heterogenní fluorescentní stanovení (např. U.S. Patent No. 4 201 763; 4 171 311; a 3 99? 631) a homogenní (bez separace) imunostanovení. Viz obecně basic and Clinioal Immunoiogy, 864-878 (J. Eudcnberg o kel., cmtítorp 3. vydání, 1980), výhodný je Li ISA iosi.

Ve výhodném provedení jo lidské sérum určené k diagnóze l<(vniabíevuno s aníppncm, jak je pepx< >n< > viz výše, iak/e proiiloiky v séru reagují v rozioku s anliganom /aiímco auiigon se výhodně váže na pevný nosič, je-li k detekci protilátek použito homogenní (bez separace) imunostanovení, není pevný nosič nutný.

Sérum lze získat z člověka obecně píchnutím do prstu a získáním čisté krve (jejíž je sérum složkou). Ovšem krev lze zpracovávat k získání pouze séra nebo částí plazmy z. čisté krve před kontaktem séra svázanými antigeny. Lze použit i jiný způsob získáni séra nebo plazmy od pacienta a to tak dlouho, dokud si protilátky v něm obsažené uchovávají svoji schopnost vázat se na antigen.

Antigeny se mohou vázal na pevné nosiče známými technikami. K připojení antigenu na pevný nosič lze např. použít bifunkční organickou molekulu. Pevná látka může být z materiálu jako je plastik (např. povrch ctná jamky v míkrotitrační misce), skleněné vlákno, acetát celulózy a nitroceluloza (např. disky). Pa navázání nebo adhezí na pevný nosič lze antigeny, je-li ío požadováno, z esífo vat.

Krok kontaktování pevného nosiče s detegovalelnou protilátkou se provádí tak, /o detegovateiná protilátka je ponechána interagoval s antigenem vázaným na pevný nosič. Detegovateiná protilátka je taková, která je schopná vazby na lidskou protilátku získanou ze séra pacienta, a která byla vázána na puntíkovaný antigen, přičemž detegovateiná protilátka je schopná být detegováno. Detegovateiná protilátka může být navíc arvti-lidský imunoglobulin, který je konjugován so skupinou jako je enzym, která je detegovateiná v přítomnosti substrátu. Výhodné jsou kozí nebo králičí anti-lidské protilátky konjugované s enzymem, které byly afinitně purifikovány. Obecně delegovat olnou skupinou, která je konjugována s detegovalelnou protilátkou, může být jakýkoliv enzym nebo jiné detegovatelné species vyvinuté pro imunostanovení. Lze použít např. enzymy, fluorescenční skupiny, radioaktivní skupiny o další. Zvlášye výhodný je enzym peroxidáza. Je-li peroxidáza detegovatelnou skupinou konjugovanou s detegovatelnou protilátkou, lze jako substrát pro detekci detegovaíelné pro!ilail<y použít 3,3 , 3,3 dairameiylbenzidin nebo o-fenylendiamin.

Krok detekce detegovatelné protilátky, která reagovala s lidskými protilátkami, zahrnuje působeni na nebo zpracováni detegovatelné skupiny, která je konjugována s detegovatelnou protilátkou, aby se určila její přítomnost. Např. je-li nějaký enzym jako peroxidáza konjugován s protilátkou, měi by detekční krok zahrnovat přídavek substrátu peroxidázy l< vázané protilátce a pozorování barevné změny, jak peroxL Lůza kofalyzuje přeměnu substrátu na barevnou látku. V případě jinýoč enzymu jako je alkalická fosfatáza a f.L qalaktosidáza lze použít jiné substráty. Substrát by měl být vybrán tak, že poté, co enzym kolalyzuje chemickou přeměnu substrátu na produkt, by se měla projevit změna pozorovatelná pro osobu provádějící tento fest. Jako substráty lze použíi 3,3b 5,5' tetramotylbonzidin, p-nitrofenylfosfát nebo 3,3-diaminbenzídin. S protilátkou lze; konjugovai iol<a další d e t e g o v a t e I n é s k u p i n y.

Lze zastavit sadu obsahující požadované složky l< provádění diagnostického testu založeného na doiekci sérových proíilátek. Sada zahrnuje balení obsahující pidílkovaný antigen pokrytý pevným nosičem nebo na pevnem nosiči iako je; dno janíky v mikrotřírační misce nebo disky acetniu celulo/y a nitrocelulozy, a nádobku s konjugátem detegovatelné protilátky schopné vazby protilátky ze séra pacienta a je vázána na antigen. ELISA-test je nejvýhodnější pro takovou sadu, protože je vhodný ke snadno detegovatelné pozitivní nebo negoiivní diagnóze. Takže sada by měla také obsahovat nádobku so substrátem, který je reaktivní s enzymem, který je konjugován deiogovatelnou protilátkou, přičemž substrát je snadno deteg<ovatelný po reakci s enzymem. Antigen použitý v diagnostické sade je výhodně podstatně nebo zcela prostý jiných enzymů.

E. Avirulentní nosičové buňky

Jak bylo již zmíněno výše, jsou avirulentní nosičové buňky jako mikroorganismy použity k administraci antigenú podle předkládaného vynálezu. Tento způsob ie zvláště vhodný, protože odpovídající nosičové mikroorganismy mohou stimuloval produkci sigA pro antigeny, které exprimují. Vhodné avirulentní nosičové buňky včetně rostlinných nosičových buněk a mikroorganismů jsou popsány v R. Curtiss, Vaccines Obtained from Antigenic Gene Products of Recombinant Genes, U.S. Patent No. 4 888 170, R. Curtiss and G. Cardineau, Oral Immunization by Transgenic Piants, PCT Application WO 90/02484 a R. Curtiss, Recombinant Avirulent Salmonello Antiferíility Vaccines, PCI Application WO 92/09684, které jsou zde uvedeny jako reference.

Obecně Izo rekombinantní pla/midy obsahující jeden nebo více genů pro aniigeny specifické pro gamety vložit do jednoho nebo více avirulenfníoh bakteriálních kmenů obsahujících mutace pro geny nutné pro dlouhodobé přibiti v cílové hostitelské buňce. Použitelné avirulentní mikroorganismy zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, mutanty odvozené ze Salmonelly a hybridy E. coli-Salmonella. Výhodné mikroorganismy jsou členy rodu Salmoneila jako je S. typhimurium, S.typhi, S. parathypi,

S. gallinarium, 8. pullorum, S. eníeriiidis, S. choleraesius, S. arizona nebo S. dublin, Avirulentní mikroorganismy odvozené z S. typhimurium a S. enteritidis nacházejí široké použití mezi mnoha hostiteli. Avirulentní mikroorganismy odvozené z S. gallinarium,

S. typhi a S. poralhypi jsou výhodné k použití u lidí. S. choleraesuis je výhodně používáno k imunizaci vepřů, zatímco S. dublin je využívána u skóru.

Zvláště výhodné jsou jedno, dvě nebo všechny tři mutanty cya, cjp. a gsd, které jsou zásadně neschopné produkovat v hostiteli odpovídající funkční protein, takže je zhoršen růst. Podle předkládaného vynálezu však mají použití také další avirulentní mikroorganismy, Tyto avirulentní mikroorganismy zahrnují mikroorganismy s mutantami aroA, aroD, galE, phpP, odf, ompR a htrA. Jsou-li použity mutanty asd, příslušný antigen je vnesen do nosičového mikroorganismu za pomoci vektoru kódujícího tento antigen i asd. Takže jen takové nosičové mikroorganismy obsahující požadovaný antigen specifický pro gamety přežijí a budou vybrány k dalšímu použití. Exprese rekombinantního genu kódujícího požadovaný antigen může zá\/isc->1 na kontrolní sekvenci napojené na gsd gen. foto spojení může vyplýval z orientace dvou genů ve vektoru, takže oba geny by mohly mít např. kontrolu stejných kontrolních prvku, tj. stejného promoíoru a operátoru.

Mutanty cya o/nebo crp Izo dále mutovat, výhodně delecí, v genu sousedícím s crp genem, který řídí virulenci Salmonelly.

Mutace v tomto genu, edt genu, zmenšuje schopnost bakterie účinně kolonizovat hlouběji uložené tkáně, např. slezinu. Je-li plazmid mající crp¹ gen vložen do kmene nesoucího A(crp-cdt), zachová si svoji avirulenei a imunogenicitu, takže má íenotyp podobný mutantám cya a erp. Mutanty s A(crp-edt) mutací obsahující crp' gen vpla/midu si uchovávají normální schopnost kolonizoval intesiináini trakt o GAI.....I. mic? mají sníženou schopnost kolonizovat hlouběji uložené tkáně.

Za účelem stimulace výhodné imunitní odpovědi je výhodné vnesení mikroorganismu nebo produktu genu přímo do střev nebo průdušek, a to orální administrací, intranazální administrací, žaludeční intubací nebo ve formě aerosolu, stejně jako inokulací vzdušných váčků (pouze u ptáků a inlratracheální inokulací. Další vhodné způsoby zahrnují administraci přes spojivky k obohacení Harderovy žlázy a inokulací do prsou. Další způsoby administrace vakcíny, jako je infravcnáziui, intramuskulární nebo subkutánní injikace, jsou také možné a používají se principiálně ke stimulaci sekundární imunitní odpovědi, jak |c popsáno vi/ níže.

Obecně jsou-Τι nosičové mikroorganismy exprimující antigeny administrovány lidem nebo jiným savcům, jsou předkládány ve farmaceuticky přijatelném nosiči. N< isioové mikroorganismy mohou Cýt např. vhodné obalené slřevni mikroorganismy neon zapouzdřené s vhodnou látkou iypu želatiny, jak je známo v technice (Cryz and Gluck, 1990, v G.Woodmw (rnd Mr. I. ovine, NewGenerationVaccines, Marcel Dekker, New York, str. 92 i 932).

Jakmile ’ je jednou nosičovy mikroorganismus přítomný v živočichovi, antigen se musí stát dasíupným pra imunitní systém živočicha. Toho lze dosáhnout tím, že nosičový mikroorganismus umírá a tím se uvolňují molekuly antigenu. Použití propustných (□virulentních mutant, které uvolňují obsah periplazmy bez lýzy, je samozřejmě také možné. Alternativně lze vybral gen, který kontroluje produkcí antigenu, který bude díky nosičové buňce dostupný pro vnější okolí ještě před úmrtím buňky.

Antígeny Ι/e také adminisirovat jako aerosoly nebo intranazálně. Intranazální prostředky určené pro lidsko pacienty obvykle zahrnují nosiče, které nezpůsobují ani podráždění nosní sliznice ani nenarušují ciliární funkci. bodle předkládaného vynálezu lze použít k ředění vodu, vodný fyziologický roztok nebo další známé látky. Nazální prostředky také obsahují konzervační prostředky jako chiorbuianol a ben/alkoniumchloriud, tile nejsou na ně omezeny. K zesílení absorpce uvedených proteinů nosní sliznicí jo vhodná p říf o m nost su. rfa ktantů.

Injikace antigenu specifického pro gamety Izo provési také ve spojení s předchozí orální, intranazální, žaludeční nebo aerosolovou imunizací. Taková paření erální imunizace funguje jako pomoc k zesílení exprese sekreční imunitní odpovědi už po předem připraveném sekrečním imunitním systému proti genu specifickému pro gamety, což bylo provodně imunizací nosičovým mikroorganismem exprimujíoím produkt genu specifického pro gamety, tato zesílená odpověď je známá jako sekundární, zesílená nebo anamnézní odpověď a vodo l< prodloužené imunitní ochraně hostitele. Zesílené Imunizace lze s výhodnými výsledky mnohokrát opakovat.

Jsou-li vakcíny připraveny jako injikovatelné a zesilovací, ize je připravit buď jako kapalné ro/ioky nebo suspenze; lze připravit i pevné formy vhodné k rozpuštění nebo přípravě suspenze v kapalných nosičích před ínjikací. Prostředek lze také emulzifikovat nebo aktivní ingredienci ζαροι izdrii do lipozomových nosičů. Aktivní imunogenní ingredience je často smísena s nosiči obsahujícími excipienty, které jsou farmaoei .iticky přijatelné a kompatibilní s aktivní ingrediencí. Vhodným nosičem je např. voda, fyziologický roztok, dextroza, glycerol, etanol apod. a jejich kombinace. Je-li to vyžadováno, může nosič obsahovat navíc i minoritní množství pomocných látek jako jsou zvlhěující nebo emulzifikační činidla, činidla udržující pH nebo adjuvans, která zesilují účinnost vakcíny. Adjuvans zahrnuji např. muramyidipeptidy, avridin, hydroxid hlinitý, oleje, saponiny a další látky známé v technice. Aktuální způsoby přípravy takových dávkových forem jsou známé nebo zřejmé osobám oiaezndmenýrn s (iL>orem. Viz např. Remingtonů; Pharmaceufioai Sciences, IVlack Publishing Company, tasfon, PA,

15. edice, 1975. Prostředek určený k administraci obsahuje v každém případě množství proteinu odpovídající dosaženi požadovaného stavu imunizace podle individuální léčby.

Množství antigenu určeného k administraci závisí na léčeném subjektu, kapacitě imunitního systému subjektu syntetizovat protilátky a stupni požadované ochrany. Účinné dávky lze snadno určit jednoduchým způsobem známým v oboru pomocí rutinních zkoušek určujících křivky odpovědi na donou dávku. Subjekt ic imunizován administrací určitého antigenu nebo jeho fragmentu či analoga alespoň v jedné dávoo. lypieké dávky využívající nosičové mikroorganismy se pohybují v řádu Ix ÍC/’ až Ix 10¹⁰ rekombinantní avirulentní bakterie/imunizovaný subjekt. Subjekt lze administrovat zvyšujícími se množstvími nebo mnohonásobnými dávkami, podle požadavku na udržení stavu imunity proti antigenu specifickému pro gamety

Muže být požadováno adminisrravat simultánně nebo postupně více než jeden antigen. To lze provést bud¹ administrací avirulentního nosičového mikroorganismu obsahujícího geny kódující více než jeden antigen specifický pro gamety nebo administrací různých nosičových organismů.

Předkládaný vynález je vysvětlen viz níže na následujících příkladech, které ho však nijak neomezují.

Příklady

Příklad 1

Klonování a sekvenování lidského spermatického vazebného proteinu Spi7

Máme již dříve publikovaná data o klonování a sekvenaci králičího Spl7 (Richardson a CáRand, Mol. Biol. Cell 3, 15a (1992)). Tento protein je členem rodiny králičích spermafických antigenů (RSA) králičích festikulái níeh/spcrmatkských autoantigenů a ie také známo, že je exprimován v myši. Další výzkum lidského analoga tohoto proleinu byl zahájen screeningem lidské testikulární cDNA knihovny za použití pioioinu kódujícího oblusí králičího Spi/ genu jako próby. Jeden klon obsahoval sekvenci 128/ párů baží, který byl z 71% identický s králičím Spi 7 genem na nukleotidové úrovni, obsahoval otevřený čtecí rámec o velikosti 455 páru baží a měl sekvenci uvedenou zde jako SEQ ID NO: 1. Tento klon kódovat protein o velikosti Ί5Ί aminokyselin mající sekvenci uvedenou zde jako SEQIDNC):2 o vypočtené mlekutové hmotnosti 17 543 Da a z 76,7% identickou se sekvencí králičího Spi7 a z 71,8% identickou se sekvencí myšího pu >í<cínu Sp i 7. Zvláště prvních 44 aminokyselin je kompletně identických s myší, králičí a lidskou sekvencí a má 43% identity s místem intorokoo regulačního áimeru podjednotky lidské testikulární cAMP-dependeniní pioteinkináxy typu 11«,. Je zajímavé srovnání králičích, myších a lidskýclo aminokyselinových sekvencí, které ukázalo, že lidsky Sp i 7 posil óda jednoduchý cysteinový zbytek ve středu molekuly, který ostatní sekvence mají. Northern blotovací analýzo série myších, paviáních a lidských tkání poskytla vysoce omezený proíii pěnově exprese omezené na teslis. Dále v lidské testikulární sekvenci vykázalo Northern analýzo existenci 2 distinldních transkripčních míst o velikosii 1,3 kb a 0,9 kb. Za účelem demonstrace apredominaniního imunoreaktivrťího proteinu o velikosti 29 kDa bylo připraveno antisérum proti Spí/ rekombinantnímu proteinu (rSpl 7) a použito při Western blotování lyzátů lidského spermatu. Antigen byl lokalizován pomocí imunofluorescence lidského spermatu s anti-rSp'17. ELISA -test ukázal, že se rS»p 17 váže no tukoidan se sol úroční kinetikou. Sérum vózektomizovanýcíi mužů, kteří moli litry antispermaíické protilátky, také vykázalo reaktivitu no rSp!7, aož indikuje, že lidský Sp 17 je lidským spernsoliokým < s Joantiqenem.

Příklad 2

Produkce sekvenčních dekapeptídů a imunostanovení

Série čtyřicetisedmi na N-konci acetylovaných sekvenčních dekapeptídů odpovídajících fragmentům králičího Spi7 proteinu byly syntetizovány v souladu se známými technikami; tyto dekapepfidy jsou zde uvedeny jako SEQ ID NO:3 až SEQ ID NO:49.

ELISA-test byl prováděn v souladu se známými postupy (viz např. M. O'Rand a kol., Dev. Biol. J29, 231 (1988)), adaptován na systém MULTIPIN^rM, v souladu s výrobními specifikacemi. (Chiron Mimotopes Pty. Ltd., Clayton, Victoria, 3168 Australia.) Kontrolní hodnoty optické hustoty (O.D.) IgG z normálního kontrolního subjektu byly odečteny z experimentálních hodnot na ukázce ELISA hodnot viz níže, v souladu se standardními technikami.

Příklad 3

Produkce protilátek proti peptidu G22C

Peplid G22C, který odpovídá fragmentu králičího Spi7 v rozsahu 61 aminokyselin až 82 aminokyselin (a má sekvenci; GAKVDDRFYNNHAFQEHESEKC) byl syntetizován v Salk Institutu ve spolupráci NO1-HD-O-2906 s NIH v souladu se standardními technikami.

Samci a samice králíků byli imunizováni peptidem G22C, který byl konjugován s hemocyaninem ústřice (Ki.H) a to s C-koncovou aminokyselinou Cys peptidu G22C. Konjugace byla provedena s Ellmanovým činidlem 5,5'-dithio-bis~(2-nitrobenzoovou) kyselinou od Pierce Scientific ve formě ímunogenní konjugační sady IMJEC'7. Každý králík obdržel subkutánní injekci 300 gg konjugátu v kompletním Freundově adjuvans následovanou dalšími 200 pg konjugátu v nekompletním Freundově adjuvans o tři týdny později a nakonec 100 pg konjugátu v nekompletním Freundově adjuvans o tři týdny později. Konjugái byl podáván v množství lOOpt vodou zředěného 1:1 adjuvans.

Příklad 4

Vazba králičího autoimunitního séra na králičí Sp í7 sekvenční dekapeptidy

Samec králíka byl injikován svým vlastním spermatem za účelem produkce autoimunitního séra. Přesněji byly 2 mg spermatu třikrát promyly v PBS, resuspendovány v 5 ml PBS, zředěny 1:1 (objemově) Freundovým kompletním adjuvans a subkutánně injikovány. První zesílení bylo zaznamenáno jeden měsíc poté, druhé zesílení po dalších dvou týdnech, třetí zesílení po dalších dvou týdnech a čtvrté zesílení po ještě dalších ířech měsících. Imunitní sérum bylo testováno pomocí Pt.ISA testu, jak je popsáno víz výše, se sekvenčními dekapeptidy popsanými viz výše. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 1. Za povšimnutí stojí shlukování potenciálních auloan tigenních epitopů.

Příklad 5

Vazba spojeného lidkdfio autoimuniíního séra na králičí Spl7 sekvenční dekapeptidy

Obr. 2 ukazuje vazbu spojených ekvivalentních objemů sér od čtyř vázekiomizovuných mužů s vysokým mrem antispermatických protilátek testovaných proti sekvenčním dekapeptidúm popsaným viz výše pomocí ELISA-testu, jakje posáno viz výše.

Za povšimnutí stojí všechny vrcholy na obr. 2 představující lidské autoantigenní epitopy B-buněk.

Příklad 6

Vazba králičího séra imuni/avanoho Sp i7 na králičí Spi7 sekvenční dekapeptidy

Vazba imunitního séra za samic králíka imunizovaných rekombinantním králičím Spi7 fúznim proteinem na sekvenční dekapeptidy Jak je popsáno viz výše Je ukázáno na obr. 3.

Rekombinantní luzní protein byl získán pomocí PCR (polymerázové řetězové reakce) za použití následujících primerů: pro plus vlákno 5' -CGCGGATCCAIG1CGATTCCATTT7CC-3J který obsahuje Baml-il místa, a. antisense primer 5' -CGGGGTACCGCCAGTGCC-Cl C/V\ l 1 Gí-3 J kíerý obsahuje Kpnl místo. Produkt PC :R byl přímo klonován do oblosti polyiinkeru pQE-30, sekvenován za účelem ověření integrity inzertu a bakteriálně exprimován v souladu s protokolem poskytnutým Qiagen inc. (Chatsworth, CA). Při použití tohoto sytému je rekombinantní králičí Spi7 protein (rSPI/) exprimován bez prvních 11 N-koncovýcBi aminokyselin, ale s N-koncem obsahujícím sekvenci Arg-Gly-Ser následovanou sesli histidiny a glycinem, který předchází aminokyselinám Sp i7. I ú/ní protein byl puntíkován z. bakteriálního lyzátu afinitní ohroma iografií za použití cheláiového adsorbentu s kovem, nikl· MTA·agare/v (Oiagen, Inc.). I-ú/ní protein byl eluován 8M močovinou, (JIM íoslorečnanem sodným (jednosytným), 0,01 M Tris, pH 5,9 a dialyzován proti třem změnám PBS. Subkutánně byío administrováno 200 gg proteinu v 5 ml PBS s 1 mg ADJUPRIME^IM adjuvans (Pieroe Chemical Co., Rockford, Illinois,USA). První zesílení 200 gg v íemže objemu bylo zaznamenáno tři týdny poté

Příklad 7

Vazba králičího séra imunizovaného G22C na králičí Spi7 sekvenční dekapeptidy

Vazba imunitního séra ze samců králíka imunizovaných syntetickým peptidem G22C, jak je popsáno v příkladu 3, na sekvenční dekapeptidy popsané viz výše pomoci ELISA-testu popaného viz výše, je ukázáno na obr. 4, a vazbo imunitního séra ze samic králíka imunizovaných syntetickým peptidem G22C, jak je popsáno v péklaéu 3, na sekvenční dekapeptidy popsané viz. výše pomocí ELISA-leslu popaného viz výše, je ukázáno na obr. 5.

Příklad 8

Vazba lidského Spi7 králičího imunitního séra na králičí Spi7 sekvenční dekapeptidy

Obr. 7 znázorňuje účinek imunizace myši rekombinantním lidským Spi 7 (fúzním proteinem) na plodnost. Sesí myší obdrželo pouze myší Spi7, šest myší obdrželo myší, a pak králičí Spi7, šest obdrželo pouze lidský Spi7. Adjuvaniní kontroly (ml?) obdržely pouze TITERMAX^IM adjuvans (dostupné od Sigma Co., St. Louis). Šest myší neobdrželo žádné injekce. Myši imunizované lidským Spi 7 rekombinantním proteinem vykazovalo 4?7o pokles oiěhotnění.

Rekombinantní lidský Spi? byl připraven jako tužní protein v zásadě stejným postupem popsaným viz výše pro rekombinantní králičí Spi 7, vyjma toho, že ve výsledném produktu nebyly deleíovány žádné N· koncové Ί 7 aminokyseliny

Balb/c myši byly imunizovaný 5 Lig íuzního proíoinu ve vodě zředěným Id l-reundovým kompleíním adjuvans, Čtyři týdny po první imunizaci Imyly irikrái každé dva íýdny podány injekce fúzního proteinu v nekompletním adjuvans.

Příklad 9

Seřazení savčích Sp 17

Obr. 8 uvádí seřazení králičích (RABSPI7), myších (MUSSP17) a lidských (HUMSP17) Spi? proteinových sekvenci. Autoantigenní fragmenty jsou označeny v rámečkách. Číslování probíhá od N-konce k Ckonoí vzhledem k číslování lidské sekvence, s gap sekvencí vloženou do odolních sacích sekvencí k maximalizování seřazení auloantigenních fragmentů v rámečkách a čísla jsou přeskočena lam, kde jsou vloženy gap-sekvence, takže číslování autoaníigenních fragmentů označuje? v rámečkách odpovídající protější látky.

Příklad IP

Vazba rekoimbinaníního Sp i 7 na lidskou jasnou zónu (zóna potluc ida)

Pomocí dCAlosíu se ukázalo, ze se bioiínylovaný lidský rekombinantní Sp i ? váže na lidskou jasnou zónu, Io je první ukázka ,53 vazby jakéhokoliv rekombinantního savčího Spi7 na jakoukoliv savčíjasnou zónu.

Předcházející příklady ilustrují předkládaný vynález a nejsou sestaveny íak, že by jei omezovaly. Předkládaný vynález je definován následujícími pal uniovými nároky s ekvivalenty nároku zahrnutými zde

Přehled sekvencí

1) Obecné informace:

i) předkladatel: O'Rand, Michael G.

Widgren, Est her E.

léchardson, Pir hard t.

Lea, Isabei ii) název vynálezu: Spermatický antigen odpovídající autoantígennímu opií opu spei matického vazebného proteinu iii) počei sekvenci :49 iv) adresy:

A) adresát: Kenneth D. Sibley

B) ulice: P.O. Box 34009

C) město: Charlotte

D) stát: Severní Karolína

E) země: USA

F) PSG· 98234

v) použita počítačová íechnika:

A) typ media: floppy disk R) počítač: IRM PC' kompatibilní

C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS

D) software: Patent In Release #1.0, Version #1.25 vi) současné údaje žádosti:

A) čísio žádosti:

B) dalum myisiraco:

C) klasifikace:

viii) informace o zplnomocněném zástupci/agentovi:

A) jméno; Sibley, Kennetl i D.

B) číslo registrace: 31 665

C) reference/číslo spisu:5470/73 ix) telekomunikační informace:

A) telefon: 919-881-3140

B) fax:919-881-3175

2) Informace k SEQ ID NO: 1:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 845 párů ba/i

B) typ: nukleová kyselina

C) vlákno: jednoduché)

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetická: ne iv) anli-sense: ne íx) charakteristické znaky:

A) jména/klíč: CDG

B) umístění: 32..487 xi) popis sekvence: SEQ ID NO: I:

GGAGGTTCCA TAGGCAGTTC TTACCAAGAA G ATG TCG AH CCA HC TCC AAC 52

Met Ser Ile Pro Phe Ser Asn

ACC Thr

CAC TAC CGA ΑΠ CCA

CAA Gin

1 GGA ΠΤ GGG AAT

5 CTT CTT GAA

GGG Gly

CTG Leu

100

His

Tyr . 10

Arg

Ile

Pro

Gly 15

Phe

Gly

Asn

Leu

Leu 20

Glu

ACA

CGC

GAG

ATT

CTG

AGA

GAG

CAA

CCG

GAC

AAT

ATA CCA

GCT

πτ

GCA

148

Thr

Arg

Glu

Ile

Leu

Arg

Glu

Gin

Pro

Asp

Asn

Ile

Pro

Ala

Phe

Ala

25

30

35

GCA

GCC

TAT

TTT

GAG

AGC

CTT

CTA GAG

AAA

AGA GAG

AAA

ACC

AAC

πτ

196

Ala

Ala

Tyr

Phe

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Lys Arg Glu

Lys

Thr

Asn

Phe

40

45

50

55

GAT

CCA

GCA

GAA

TGG

GGG

AGT AAG

GTA GAA GAC CGC

nc

TAT

AAC

AAT

244

Asp

Pro

Ala

Glu

Trp Gly

Ser

Lys

Val

Glu

Asp Arg

Phe

Tyr

Asn

Asn

60

65

70

CAT

GCA

rrc

GAG

GAG

CAA

GAA

CCA

CCT GAG

AAA

AGT GAT

CCT

AAA

CAA

292

His

Ala

Phe

Glu

Glu

Gin

Glu

Pro

Pro Glu

Lys

Ser Asp

Pro

Lys

Gin

75

80

85

GAA GAG

TCT

CAG

ATA

TCT

GGG

AAG

GAG

GAA GAG

ACA TCA

GTC

ACC

ATC

340

Glu

Glu

Ser

Gin

Ile

Ser

Gly

Lys

Glu

Glu

Glu

Thr

Ser

Val

Thr

Ile

90

95

100

TTA

GAC

TCT

TCT GAG

GAA

GAT AAG

GAA

AAA

GAA

GAG

GH

GCT

GCT

GTC

388

Leu

Asp

Ser

Ser Glu

Glu

Asp

Lys

Glu

Lys

Glu

Glu

Val

Ala

Ala

Val

105

no

115

AAA

ATC

CAA

GCT GCC

TTC

CGG

GGA

CAC

ATA

GCC

AGA GAG

GAG

GCA AAG

436

Lys

Ile

Gin

Ala

Ala

Phe

Arg

Gly

His

Ile

Ala

Arg

Glu

Glu

Ala

Lys

120

125

130

135

AAA

ATG

AAA

ACA AAT

AGT

CTT

CAA

AAT

GAG

GAA

AAA

GAG

GAA

AAC

AAG

484

Lys

Met

Lys

Thr Asn

Ser

Leu

Gin

Asn

Glu

Glu

Lys

Glu

Glu

Asn

Lys

140

145

150

TGAGGACACT GGTTTTACCT CCAGGAAACA TGAAAAATAA TCCAAATCCA TCCATCAACC 544 nCHAHAA TGTCATTTCT CCHGAGGAA GGAAGATTTG ATGKGTGAA ATAACATTCG 604 HACTGRGT GAAAATCTGT CATGAGCAH TGTTTAATAA GCATACCAH GAAACATGCC 664

ACTTGAAGAT TTCTCTGAGA TCATGAGITT GTHACACH GTCTCAAGCC TATCTATAGA 724 GAGCCTTGGA TTTAGAAKA TAGAACTAAA GTATCTGAGA HACAGAGAT CTCAGAGGH 784 ATGTGKCTA ACTATTATCA AATGAATAAA TCCTCTCTAT CACATCCCCC AAAAAAAAAA 844

AAAAAAAAAA

854

2) Informace k SEQ ID NO:2:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 151 aminokyselina

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: protein xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

Met 1

Ser

Ile

Pro

Phe 5

Ser Asn Thr His

Tyr Arg Ile Pro Gin Gly Phe

10

15

Gly

Asn

Leu

Leu

Glu

Gly

Leu

Thr

Arg

Glu

Ile

Leu

Arg

Glu

Gin

Pro

20

25

30

Asp

Asn

Ile

Pro

Ala

Phe

Ala

Ala

Ala

Tyr

Phe

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

35

40

45

Lys

Arg

Glu

Lys

Thr

Asn

Phe

Asp

Pro

Ala

Glu

Trp Gly

Ser

Lys

Val

50

55

60

Glu

Asp Arg

Phe

Tyr

Asn

Asn

His

Ala

Phe

Glu

Glu Gin

Glu

Pro

Pro

65

70

75

80

Glu

Lys

Ser

Asp

Pro

Lys

Gin

Glu

Glu

Ser

Gin

Ile

Ser

Gly

Lys

Glu

85

90

95

Glu

Glu

Thr

Ser

Val

Thr

Ile

Leu

Asp

Ser

Ser

Glu

Glu

Asp Lys

Glu

100

105

110

Lys

Glu

Glu

Val

Ala

Ala

Val

Lys

Ile

Gin

Ala

Ala

Phe

Arg Gly

Hi S

115

120

125

Ile

Ala

Arg

Glu

Glu

Ala

Lys

Lys

Met

Lys

Thr

Asn

Ser

Leu Gin

Asn

130 135 140

Glu Glu Lys Glu Glu Asn Lys

145 150

2) Informace k SEQ ID NO;3;

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: pepfid iii) hypotetická: ne xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 3: Met Ser lle Pro Phe Ser Asn Thrm His Tyr 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO:4:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

Pro Phe Ser Asn Thr His Tyr Arg lle Pro 1 5 10

2) Informace l< SEQ ID MO:5:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: nukleová kyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne xi) popis sekvence: SEQ ID NO: b:

Asn Thr His Tyr Arg Ile Pro Gin Gly Phe 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO:6:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

Tyr Arg Ile Pro Gin Gly Phe Gly Asn Leu

5 10

2) Informace k SEQ ID NO;7:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) viákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

Pro Gin Gly Phe Gly Asn Leu Leu Glu Gly 1 5 10

2) Informace l< SEQ ID NO:8:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

Phe Gly Asn Leu Leu Glu Giy Leu Thr Arg 1 5 10

2) informace k SEQ ID NO: 9:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

Leu Leu Glu Gly 1 eu Thr Arg Glu Ile Leu

2) Informace k SEQ ID NO: 10:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

Gly Leu Thr Arg Glu lle Leu Arg Glu Gin 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO:11:

i) charakteristiky sekvence;

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ; aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: pepfid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

Arg Glu lle Leu Arg Glu Gin Pro Asp Asn 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO: 12: i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

Leu Arg Glu Gin Pro Asp Asn Ile Pro Ala '1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO: 13:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 13: Gin Pro Asp Asn Ile Pro Ala Phe Ala Ala 1 5 10

2) Iníormace k SfQ ID NO: 14:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) iyp: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 14

Asn Ile Pro Ala Phe Ala Ala Ala tyr Phe I 5 10

2) Informace k SEQ ID NO: 15:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

Ala Phe Ala Ala Ala Tyr Phe Glu Asn Leu 1 5 '10

2) informace k SEQ ID NO: 1 ó:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

Ala Ala Tyr Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO: 17: i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Arg Glu Lys

5 10

2) Informace k SEQ ID NO: 18:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 18:

Leu Leu Glu Lys Arg Glu Lys Thr Asn Phe 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO: 19:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) viákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

Lys Arg Glu Lys Thr Asn Phe Asp Pro Ala 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO:20: i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jcánoáucí A

D) topologie: lineární íi) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 20:

Lys Thr Asn Phe Asp Pro Ala Glu Trp Gly 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO:21:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 21:

Phe Asp Pro Ala Glu Trp Gly Ala Lys Val 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO:22: i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 22:

Ala Olu Trp Gly Ala Lys Val Asp Asp Arg

5 10

2) Informace k SEQ ID NO:23:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SkO ID NO: 23:

Gly Ala Lys Val Asp Asp Arg Phe tyr Asn 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO:24:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 24:

Val Asp Asp Arg Phe tyr Asn Asn llis Ala 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO:25:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: '10 aminokyselin

B) typ: aminokyselino.

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineami ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 25:

Arg Phe Tyr Asn Asn His Ala Phe Gin Glu 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO:26:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché 10) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne xi) popis sekvence: SFO ID NO: 26:

Asn Asn His Ala Phe Gin Olu I lis Glu Ser 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO·?/:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoducho

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 27:

Ala Phe Gin Glu His Glu Ser Glu Lys Cyr 1 5 (0

2) Informace k SEQ ID NO:28:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: o m i nokyse I i na

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 28:

Glu His Glu Ser Glu Lys Cys Glu Ala Glu I b 10

2) informace k SEQ ID NO:29:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché I’)) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 29:

Ser Glu Lys Cys Glu Αία Glu Glu I ys Ser 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO.30·

i) charaki erisíiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 30:

Cys Glu Ala Glu Glu Lys Ser Gin Ser Val 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO:31:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SFQ ID NO: 3 I:

Glu Glu I ys Ser Gin Ser Val I l ir Glu Git i I S 10

2) Informace k SEQ ID NO:32:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 32:

Ser Gin Ser Val Thr Glu Glu Glu Thr Pro 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO:33:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyseiin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 33:

Val Thr Glu Glu Glu Thr Pro Val Leu Thr 1 5 '10

2) Informace k SEQ ID NO:34: i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 34:

Glu Glu 1’hr Pro Val Leu thr Ile Asp Ser '1 5 10

2) Inlormace k SEQ ID NO:35:

i) charakteristiky sekvence:

A) déika: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly; peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 35: Pro Val Leu Thr Ile Asp Ser Glu Asp Asp 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO:36:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: popiid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 36: thr Ile Asp Ser Glu Asp Asp Lys Asp Lys 1 i) 10

2) Informace k SEQ ID NO:37:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ? molekuly: pepvíid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 3/:

Ser Glu Asp Asp Lys Asp Lys Glu Glu Met 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO:38:

i) charakteristiky sekvence;

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 38:

Asp Lys Asp Lys Glu Glu Met Ala Ala Leu 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO:39: i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákna: íednodi iché b?

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 39:

Lys Olu Olu Met Ala Ala Leu Lys lle Gin b 10

2) Informace k SEQ ID NO:40:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 40:

Met Ala Ala Leu Lys lle Gin Ala Ala Phe 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO:41:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID N(): 4 I: Leu Lys He Gin Ala Ala Phe Arg Gly I lis 1 5

2) Informace k SEQ ID NO:42:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoducho

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 42:

Gin Ala Ala Phe Arg Gly His Leu Ala Arg 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO:43:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SFQ ID NO: 43:

Phe Arg Gly His Leu Ala Arg Glu Asp Val 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO:44:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché :/1

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 44: His Leu Ala Arg Glu Asp Val Lys Lys Ile I 5 10

2) informace k SLQ ID NO:45:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) v I á kn o: j eá n o d u c 4 n é

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence; SLO ID NO: 4b; Arg Glu Asp Val Lys Lys Ile Arg Thr Asn 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO:4ó:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina O) vlákno, jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvenre: SLQ ID NO: 46: Val Lys Lys Ile Ary ííir Asn I ys Ala C 4u 1 6 10

2) Informace k SEQ ID NO:47:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 47:

Ile Arg Thr Asn Lys Aía Glu Glu Glu Thr 1 5 10

2) Informace k SEQ ID NO:48:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin 13) typ: aminokyselina

C) viákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 48: Asn Lys Ala Glu GLu GLu íhr Glu Glu As 1 5 10

2) Iniormace k SEQ ID NO:49: i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 10 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) vlákno: jednoduché

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid xi) popis sekvence: SLQ ID NO: /19:

Lys Ala Olu Olu Olu Thr Olu Olu Asn Asn 1 5 10

Průmyslová využitelnost

Předkládaný vynález zahrnuje DNA kódující savčí Sp i 7 protein, zvláště lidský Spi7 protein, nebo antigenní peptidy, které jsou jeho fragmenty. Tyto proteiny a peptidy jsou použitelné jako imunokontraceptivní prostředky a/nebo k diagnóze autoimunitní neplodnosti. Popsány jsou zde také avirulentní hostitelské buňky, které exprimují antigenní proteiny nebo peptidy a které jsou použitelné jako imunokontraceptivní prostředky.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (4)

1. izolovaná DNA kódující protein Sp i 7 vybraný ze skupiny obsahující

a) izolovanou DNA obsahující zásadně DNA, které kódují lidský Spi7 protein mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako SEQIDNO:2;

b) izolovanou DNA, která hybridizuje s izolovanou DNA (a) uvedenou viz výše za podmínek reprezentovaných promývacím roztokem o přesném složení jako je 0,3 M NaCl, 0,03 M citrát sodný a 0,1% SDS při teplotě 60 °C a která kóduje lidský Sp 17 protein;

c) izolovanou DNA lišící se od izolovaných DN/A (a) a (b) uvedených viz výše v nukleotidové sekvenci v důsledku degradace genetického kódu a která kóduje fidský Sp 17 protein; a

d) fragmenty předchozích DNA, kleré kódují antigenní peptidy, které vážou protilátky, které se vážou na lidský Sp 17 protein.

2. Izolovaná DNA podle nároku 1 obsahující zásadně DNA, které kódují lidský Spi 7 protein uvedený zde jako SEQ ID NO;2.

3. Izolovaná DNA podle nároku 1 obsahující zásadně izolovanou DNA mající sekvenci uvedenou zde jako SLQ ID NO: 1.

4. Sekvence rekombinantní DNA obsahující vck í arovou DN/A a DNA podle nároku 1.

kte ré s o v ά ž. o i1—ee—pro! oir i—majmí sekvenci—uvedenou zde jako

SEQ1DNO2.

12. Aviruler viní hostitelská buňka obsahující sekvenci rekombinantní DNA podle nároku 4, která je schopná exprirnovat kódovaný protein nebo peptid.

13. Avirulentní hostitelská buňka podle nároku 12, kde hostitelskou buňkou je mikroorganismus.

14. Imunokontraceptivní vakcínový prostředek, v y z n a č u j íc í s e t í m, ž e zahrnuje avirulentní hostitelskou buňku podle nároku 12 v množství účinně snižujícím plodnost subjektu v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

15. Antigenní peptid, v y z n a č u jící s e t í m, ž e je použitelný jako imunokontraceptivní činidlo nebe; l< diagnóze autoimunitní neplodnosti, vybraný ze skupiny obsahující antigenní fragmenty savčího Spi7 proteinu, jejichž délka činí od 6 do 25 aminokyselin a jejich ant igenní ekvivalenty, přičemž antigennírn ekvivalentem je

a) modifikovaný fragment zahrnující antigenní fragment modifikovaný nahrazením jedné nelna více aminokyselin jeho sekvence; nebo

b) delší peptid, který zahrnuje sekvenci dekapeptidu nebo modifikovaného dekapeptidu a klený má (i) až čtyři další aminokyselinové zbytky připojené na C -konec této sekvence, (ii) až čtyři další aminokyselinové zbytky připojené na N-konec této sekvence nebo (iii) až čtyři další aminokyselinové zbytky připojené na C-konec této sekvence a až čtyři další aminokyselinové zbytky připojené na N-konec této sekvence;

kde uvedené antigenní ekvivalenty vážou protilátky, které vážou uvedené antigenní fragmenty savčího Sp 1 / proteinu;

a kde antigenní fragmenty savčího Sp 17 proteinu jsou vybrány ze skupiny obsahující (i) fragmenty o 4 až 78 aminokyselinách, (ii) fragmenty o 34 až 49 aminokyselinách, (iii) fragmenty o 55 až 82 aminokyselinách, (iv) fragmenty o 117 až 137 aminokyselinách a (v) fragmenty (i) až (iv) mající délku nejméně 6 aminokyselin.

ló. Antigenní peptid podle nároku 15, v y z n a č u j í c í s e t í m, ž e savčí Sp 17 protein je vybrán ze skupiny obsahující králičí, myší, lidský, paviání a opičí Sp 17 protein.

17. Antigenní peptid podle nároku 15, vyznačující se tím,že antigenní fragment je vybrán ze skupiny obsahující peptidy mající sekvence aminokyselin

SEQIDNO:3,

SEQIDNO:4,

SEQIDNO:9,

SEQ ID NO: 15

SEQIDNO:21

SEQIDNO:25

SEQIDNOD9

SEQ ID NO:43

SEQ1DNO:5, SEQIDNO:6, SEQ ID NO:7, SEQiDNO:8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: I I, SEQ ID NO: 14, SFQ ID NO: 16. SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:20,

SEQ ID NO-72, SIO ID NO:73, SI C) ID NO:24,

SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28,

SEQ ID NO:34, Sl· O ID NO:40, SEQ ID NO:4t, a jejich fragmenty a délc« nejméně 6 aminokyselin.

18. Antigenní peptid podle nároku 15, vyznačující se t i rvi,že antigenní íiaymoní je vybrán ze skupiny obsahující peptidy mající sekvence aminokyselin: SEQ ID NO:5, SEQIDNO:6, SEQIDNO:8, SEQIDNO:9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID 140:20, SEQ ID NO.2 I, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID 140:25, SEQ ID 140:26, SEQ ID NO:27, SEQIDNO:40, SEQIDMO:4I, SEQ ID 140:43 a jejich fragmenty o délce nejméně 6 aminokyselin.

19. Antigenní peptid podle nároku 15, vyznačují cíše tí m, ž e antigenní fragment je vybrán ze skupiny obsahující peptidy mající sekvence aminokyselin: SEQ ID NO:3, SEQIDNO:6, SEOIDMO:7, SFQ ID 410:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10,

SEQ ID NO: 11, SEQIDNO42, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NQ:20, SEQIDNO:21, SEQ ID 140:22, SI QIDNO:23, SEQ ID NO:24, SEQIDNO:25, SEQ ID NO:2ó, SEQ ID 140:27, SEQIDNO:28, SEQIDNO:29, SEQ ID NO:30, SEQIDNO:32, SEQIDNO:33, SEQIDNO:34, SEQ ID 140:35, SI. O ID NO:3ó, SEQIDNO:38, SEQIDNO:39, SEQIDNO:40, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:47,

SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, a jejich fragmenty o délce nejméně 6 aminokyselin.

20. Antigenní peplid podle nároku 15, vy z n a č u j íc í s e r ím, z o antigenní liagmoní je: vybrán ze: skupiny obsahující peptidy mající sekvence erminokyselin: SEQ ID (40:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 14, SI O ID NO: 15, SFO ID NO: 16,

SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO=24, SEQ ID NO^:25,

SEQ ID NO:34, SEQ ID N0^;40, SEQ ID NO:43 a jejich fragmenty o délce nejméně 6 aminokyselin.

21. Imunokontraceptivní způsob .vyznačující se tím, že zahrnuje administraci peptidů subjektu podle nároku 12 v množství účinně snižujícím plodnost subjektu.

22. Imunokontraceptivní vyznačující se způsob pod1e tím, že subjektem nároku j e sam i ce

21,

23.

Imunokontracept i vn í vakclnový prostředek, vyznačuj ící t 1 m, že zahrnuje peptid podle nároku 15 v množství účinně snižujícím plodnost subjektu v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

24. Způsob vyznač př í tomnost i určeného ke podle nároku indikuje, že