CZ167999A3

CZ167999A3 - Nové sloučeniny a způsoby jejich použití

Info

Publication number: CZ167999A3
Application number: CZ991679A
Authority: CZ
Inventors: Philip A. Reece; Keith Geoffrey Watson; Wen-Yang Wu; Betty Jin; Guy Y. Krippner
Original assignee: Biota Scientific Management Pty. Ltd.
Priority date: 1996-11-14
Filing date: 1997-11-13
Publication date: 1999-10-13
Also published as: NZ335368A; NO992297L; US6680054B1; AU4857697A; JP3691075B2; CA2271249A1; PL333364A1; KR20000068986A; IL129762A0; HUP9904009A3; JP2001504876A; CN1238783A; EP0951480A1; EA001603B1; TR199901081T2; HUP9904009A2; EP0951480A4; AU732916C; NO992297D0; WO1998021243A1

Description

(57) Anotace:

Nové makromolekuly, způsoby jejich přípravy, farmaceutické prostředky obsahující tyto sloučeniny a jejich použití jako protichřipkových činidel. Na makromolekulám! sloučeninu podle předkládaného vynálezu Je navázána Jedna nebo více molekul /vazebných činidel pro neuraminidasu/, které se váží na aktivní místo neuraminidasy chřipkového viru, ale které nejsou štěpeny neuraminidasou. Nové diagnostické způsoby, které mohou být použity pro detekci všech typů viru chřipky A a viru chřipky B.

pr (13) Druh dokumentu: (51) lnt.Cl.⁶:

C 07 K C 07 K C 07 K C 08 B C 12 Q C 08 G C 08 F G 01 N A61 K A61 K A 61 K

»

A3

14/765

16/06

14/77

37/02

1/70

69/48

8/32

33/569

38/38

31/785

31/73

• «9		9 9		9 9	9 9	*9
* 0	9	9	9	9	9 9	9 ·
9 9	9	9	9	9 9 9	9 9	9 ·
• 9	a	9	9	9 9	9	9
9 9 9 9		99		99	«9	9 9

Ví

Nové sloučeniny a způsoby jejich použití

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nové třídy chemických sloučenin a jejich použití v medicíně. Konkrétně se vynález.týká nových makromolekul, způsobů pro jejich přípravu, farmaceutických prostředků, které je obsahují, a jejich použití proti chřipce. Vynález dále obsahuje nové dignostické způsoby, které mohou být použity pro detekci všech typů viru chřipky A a B.

Dosavadní stav techniky

Viry chřipky A a B jsou hlavní příčinou akutních respiračních onemocnění a způsobují přibližně 30 - 50 milionů infekcí za rok v samotných Spojených Státech Amerických, virus chřipky A je odpovědný za většinu epidemií, jako byla španělská.chřipka roku 1919, která způsobila smrt milionů lidí. Chřipka zůstává obtížně kontrolovatelným onemocněním, které vede k signifikantní morbiditě a mortalitě způsobené zejména sekundární infekcí u lidí vysokého věku nebo u oslabených pacientů. Vakciny se průběžně stávají zastaralými z.důvodů genetického shiftu a driftu a imunizace má asi pouze 70% účinnost v prevenci infekce.

Jedinými léky, které byly oprávněnými úřady schváleny pro léčbu chřipky, jsou amantidin a rimantidin, které jsou neúčinné proti chřipce typu B a které mají závažné nežádoucí účinky.

Mnoho bakteriálních a virových infekcí se může projevit podobnými příznaky jako chřipka. Rychlá identifikace respiračního viru umožní klinickým lékařům použití nejvhodnější terapie v začátku onemocnění. Například, časná a přesná diagnosa umožní rozhodnutí týkající se antibakteriální terapie a • * 4 * «· ···· • · 4 * · 46 · 6 4 · · • · 4 · · · · « ««···· • · · ···· « ·

49*44 ·« «* Μ « hospitalisace dětí a pacientů vysokého věku.

Laboratorní testy pro identifikaci virů v klinickém materiálu jsou značně rozšířeny a jsou dostupné různé metody detekce. Učebnice Laboratory Diagnosis. of Viral Infections, Marcel Dekker 1992, ed. E.H.Lennéte, obecně popisuje techniky použitelné pro většinu virů, včetně chřipkových virů.

Pro diagnostiku chřipky A a B existuje mnoho testů. Klasickou metodou pro identifikaci chřipkových virů bylo použití buněčné kultury, což bylo vysoce sensitivní a specifické. Naneštěstí, doba nutná pro kultivaci, izolaci a identifikaci chřipkového viru je v rozmezí od 1 do 10 dnů, což snižuje význam této techniky pro určení vhodné terapie. Jelikož infekce virem chřipky je obvykle samoomezená, musí být diagnostika rychlá, pokud má být terapie účinná.

Kromě technik na buněčné kultuře pro detekci chřipkových virů še v současnosti staly dostupnými jiné rychlé testy, které jsou specifické pro chřipku A. Byl popsán monoklonální imunofluorescenční test (IFA) (Spada, B. et al., J. Virol.

Method, 1991: 3:305, a je dostupný alespoň jeden rychlý enzymový imunotest (EIA) (Ryan-Poirier, K.A. et al., J. Clin. Microbiol. 1992, 30: 1072). V literatuře bylo popsáno mnoho srovnání těchto rychlých detekčních metod pro chřipku A, viz například Leonardi,

G.P. et al., J. Clin. Microb. 1994, 32: 70, který doporučuje, aby přímé testování vzorku bylo kombinováno s izolací v kultuře tak, aby byla provedena jak identifikace viru v době určování terapie, tak kontrolní vyšetření infekce, a aby bylo provedeno monitorování antigenního složení chřipkových kmenů prevalentních v populaci.

Je popsáno, žé IFA metoda je pracná a vyžaduje značné

technické vybavení a výsledky jsou často obtížně interpretovatelné. Na druhé straně, EIA (Directigen flu-A; Becton-Dickinson Microbiology Systems) metoda má vysokou hodnotu falešně pozitivních výsledků a je doporučeno, aby byl test v laboratořích používán pouze spolu s nebo místo přímých imunofluorescenčních testů (Waner, J.L. et al., J. Clin.

Microbiol. 1991, 29: 479).

Stejně jako problémy uvedené výše týkající se v současnosti dostupných rychlých testů pro chřipku, existují v některých těchto metodách základní nedostatky. Za prvé, žádný z dostupných testů nemůže detekovat chřipku B, což znamená, že i negativní výsledek testu neurčuje lékaři, který typ terapie by měl být použit. Za druhé, pokud metoda rychlého testu spočívá v použití protilátek k jednomu z protinů viní chřipky A, mohou nastat vážné obtíže při detekci nových kmenů viru, u kterých proběhl drift nebo shift ve struktuře antigenních proteinů. 0 viru chřipky A je známo, že často podléhá takovým změnám.

Jiný typ rychlých testů pro chřipkové viry byl popsán v sérii patentových přihlášek {viz například Liav, A: et al., PCT patentová přihláška č. 92/12256). Metoda obsahuje použití chromogenního substrátu pro enzym neuraminidasu chřipkového viru. Jinými slovy, test je založen na vizualizačním barvivu, které se tvoří při Štěpení speciální molekuly kyseliny sialové konjugované s barvivém prostřednictvím neuraminidasy. Zdá se, že tato technika má omezenou specificitu, protože nemůže rozlišit mezi přítomností virové neuraminidasy a jiných forem enzymu, zejména bakteriální neuraminidasy. Může mít také nízkou sensitivitu z důvodů relativně pomalé aktivity virové neuraminidasy.

Viry chřipky A a B mají dva hlavní povrchové glykoproteiny, hemaglutinin (HA) a enzym neuraminidasu (NA), které jsou oba h ₄ nezbytné pro infikování. Soudí se, že HA je nutný pro připojení viru na buňky, zatímco NA je nutná pro uvolnění viru z povrchu buněk. Na povrchu každé virové částice je obvykle přítomno přibližně 600 trimerických HA a přibližně 50 kopií NA tetramerických jednotek. Jak HA, tak NA jsou proto přitažlivými cíly pro vývoj protichřipkových léčiv, ale dosud není v klinické praxi dostupný žádný lék proti chřipce, který by působil v obou těchto místech.

Hemaglutinin viru chřipky se váže na glykoproteiny a glykolípidy obsahující kyselinu sialovou, což navozuje připojení viru na buňku a následující infekci. Síla vazby virové částice na buněčnou membránou patrně závisí na interakci mnoha kopií chřipkového HA se skupinami sialové kyseliny na buněčném povrchu.

Za použití tohoto konceptu polyvalentní interakce popsalo několik výzkumníků syntézu makromolekul obsahujících dva nebo více derivátů kyseliny sialové, které účinkují jako inhibitory hemaglutininu. Ačkoliv byly objeveny některé silné inhibitory HA, nebylo prokázáno, že by některá z těchto makromolekul bránila chřipkové infekci in vivo. Nedávná práce od Whitesides a spol.

(J. Amer. Chem. Soc. 1996, 118: 3789 - 3800; J. Medicinal Chem., 1995, 38: 4179 - 4190) shrnula různé snahy využívající tento přístup při vývoji inhibitorů chřipkového hemaglutininu.

Existuje několik známých inhibitorů NA, z nichž většina je blízkými analogy kyseliny neuraminové, přirozeného substrátu pro enzym, jako je například 2-deoxy-2,3-didehydro-N-acetylneuraminová kyselina (DANA) (Meindl et al., Virology,

1974, 58: 457 - 63). Mezinárodní patentová přihláška č. WO 91/16320 popisuje analogy DANA, které jsou velmi aktivní, jak in vitro, tak in vivo, proti neuraminidase chřipkových virů A a B. Jedna z těchto sloučenin (sloučenina I, označená GG167 nebo ('

4-guanidino-Neu5Ac2en) je klinickém pokusu a jeví se slibnou pro léčbu chřipky {Hayden, F.G. et al., J. Amer. Med. Assoc. 1996, 275: 95).

Sloučenina (I) GG167

Nověji byly popsány aromatické sloučeniny s inhibiční aktivitou pro neuraminidasu v U.S. patentu č. 5453533, Luo et al., a U.S: patentu č. 5512596, Gilead Sciences, lne., a v Mezinárodní patentové přihlášce č. WO 96/26933, Gilead Sciences, lne., a C. Klm et al., J. Amer. Chem. Soc. 1997, 119: 681, byly popsány analogy sloučenin (I), konkrétně sloučeniny, kde je vedlejší řetězec na uhlíku 6 vázán etherovou vazbou.

Několik výzkumných skupin se pokusilo nalézt jednodušší a učinější analogy sloučeniny (I), ale doposud publikované zprávy {například Bamford M.J., J. Chem. Soc. Perkin. Trans. I, 1995, 1181) naznačují, že jakékoliv změny ve struktuře sloučeniny (I), zejména v jejím glycerolovém vedlejším pravděpodobně redukují vazebné schopnosti pro neuraminidasu. Kromě toho, oproti situace týkající se HA, neexistují jakékoliv makromolekulární nebo polymerické inhibitory neuraminidasy. Polymery obsahující’ kyselinu sialovou byly popsány v U.S. patentu č. 5192661, Roy et al., a v U.S. patentu č. 5571836, Bovin et al., ale tyto sloučeniny byly syntetické polysialosidy pro použití jako antigeny nebo jako vazebná činidla pro hemaglutinin.

*i>: ., ή¹

Íí · · 9 9 9 • 99 99 99 99

Podstata vynálezu

V prvním aspektu vynález obsahuje makromolekulární sloučeniny, které na sebe mají navázánou jednu nebo více molekul, které se váží na aktivní místo neuraminidasy chřipkového viru; tyto molekuly jsou zde označovány jako vazebná činidla pro neuraminidasu. Výhodně je vyzebné činidlo pro neuraminidasu navázáno na molekulu prostřednictvím mezimolekulové spojovací nebo vazebné skupiny tak, že vazebné činidlo pro neuraminidasu není stericky narušeno skeletem makromolekuly. Vazebným činidlem pro neuraminidasu může být jakékoliv činidlo, které se váže na aktivní místo neuraminidasy chřipkového viru, s podmínkou, že není štěpeno enzymem. Vazba nemusí být ireversibilní, ale vazebná skupina by měla mít vysokou vazebnou afinitu, výhodně IC_so IQ“⁶M nebo nižší.

Vynález se konkrétně týká nové třídy chemických sloučenin a jejich použití jako terapeutických a diagnostických činidel pro léčbu a detekci chřipkových virů A a B. Přesněji se vynález týká makromolekul, na které jsou navázány deriváty kyseliny neuraminové (kyseliny sialové), které.se váží na neuraminidasu viru chřipky A nebo B, a které případně mají funkci, která umožňuje vazbu sloučeniny na povrch, nebo která může být použita jako detekovatelný markér.

Překvapivě jsme zjistili, že když je sloučenina (I) funkcionalizována v 7-pozici struktury kyseliny sialové, může být navázána na velké syntetické nebo přirozené polymery za vzniku komplexů, které inhibují neuraminidasu chřipkových virů A a B a může být použita pro prevenci nebo inhibici chřipkové infekce. Vazebné charakteristiky pro vazbu neuraminidasy nejsou významným způsobem redukovány, pokud je více těchto a podobných sloučenin navázáno přes jejich 7-pozici za použití vhodné mezimolekulové spojovací skupiny na různé makromolekuly, takže ani průměrná vazba na skupinu kyseliny sialové není redukována. Protože navázaná neuraminidasa na makromolekule je pevně vázaná na virus, a patrně z důvodů velikosti a sterického uspořádání komplexů, je redukována infekčnost chřipkových virionů. Takové makromolekulám! sloučeniny mohou být také použity pro detekci chřipkových virů A a B díky jejich schopnosti selektivní vazby chřipkového viru a zároveň díky povrchovým nebo detekovatelným skupinám.

Biologická aktivita makromolekulárních sloučenin podle předkládaného vynálezu a diagnostických způsobů podle předkládaného vynálezu je založena na použití ligandů na makromolekulách, které se specificky váží na aktivní místo neuraminidasy chřipkového viru, nebo na použití funkčních derivátů takových sloučenin, jako vazebných a/nebo detekčních činidel pro identifikaci chřipkových virů v klinických vzorcích. Termín vazebná činidla pro neuraminidasu označuje tyto sloučeniny a jejich funkční deriváty. Způsoby a sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být účinné bud' za přítomnosti, nebo za absence sloučenin, které se nespecificky váží na neuraminidasu chřipkového viru.

Ve výhodném provedení obsahuje předkládaný vynález sloučeninu vzorce (II):

(X-Y) -M-(Z) (II) n m kde X je derivát kyseliny 2,3-dehydro-sialové (2) s vazebnou schopností pro neuraminidasu, který je navázán v 7-pozici prostřednictvím spojovací skupiny Y na makromolekulu M, a Z je volitelný extra-substituent na makromolekule.

Vazebná skupina X pro neuraminidasu je derivát kyseliny sialové vzorce (2)

ve které spojovací skupina Y zprostředkuje vazbu na W skupinu a kde R představuje azido-skupinu, nesubstituovanou nebo substituovanou guanidinovou skupinu, nebo nesubstituovanou nebo substituovanou amino-skupinu;

R² je vybrán ze skupiny zahrnující COCH₃, COCF₃, SO₂CH₃ nebo SO CF ;

W je vybrán ze skupiny zahrnující O(C=O)NH, O(C=S)NH,

NH{C=O)NH nebo NH(C=S)NH a je připojen prostřednictvím NH na skupinu Y;

m je celé číslo vybrané z 0 až 1000; a n je celé číslo vybrané z 0 až 1000.

Mezimolekulová spojovací skupina Y je volitelně substituovaný řetězec o až 1000 atomech vybraných z uhlíku, dusíku, kyslíku a síry.

Makromolekula M je syntetický nebo přirozený polymer, protein, protilátka nebo enzym o molekulové hmotnosti od IQ^4, do 10⁷.

Skupina Y je obvykle vázána na makromolekulu M kovalentní vazbou, ale může být také navázána nekovalentní vazbou, například tehdy, je-li M avidin a Y má koncovou biotinovou skupinu.

Druhý a volitelný substituent Z může být skupina, která váže hemaglutinin, jako 2-vázaný derivát kyseliny sialové, nebo )

• ··♦ *·· skupina, která je detekovatelným markérem, jako je biotin nebo fluorescenční molekula, nebo to může být vazebný hapten pro protilátku. Volitelný substituent Z může být také enzym jako je křenová peroxidasa (HRP) nebo alkalická fosfatasa (AP), který může být použit pro detekci.chřipkového viru. Alternativně může být skupina Z skupina s koncovou funkcí, která je vhodná pro vazbu makromolekuly na povrch, jako je NH^, SH, CO^H, CHO nebo CH=CH .

Ve jiném výhodném provedení obsahuje předkládaný vynález vazebné činidlo pro neuraminidasu vzorce (IIA):

(X'-Y) -M-(Z, (IIA) n m kde X’ je cyklohexenylový derivát s vazebnou schopností pro neuraminidasu vzorce (2a) γ

Ř (2a) který je vázán přes etherový postraní řetězec, kde R, R², Y, n a m jsou stejné, jak jsou definovány pro vzorec (2), a

R¹ a W' jsou lipofilní C_x-C_i2 alkylová nebo alkylenová skupina, která je volitelně substituovaná jedním nebo více atomy halogenu nebo alkoxy, halogenalkoxy nebo volitelně substituovanou arylovou'skupinou.

Vhodné mezimolekulové spojovací skupiny Y zahrnují, ale nejsou

AAAA AAA · · A .· • A A · A Α·Α A · · A

A · A AAAA · , * A A A A A A AA A A AA omezeny na, aminoalkylové skupiny, (póly)aminokyseliny, lineární peptidy, oligosacharidy a pólysacharidy, polyethylenglykolové jednotky a amino-dialkylmoCoviny, které mohou být použity samostatně nebo v kombinaci. Obvykle má mezimolekulová spojovací skupina Y terminální aminoskupinu, která je použita pro tvorbu amidové vazby nebo vazby přes Schiffovu bázi na makromolekulu M.

Výhodné substituenty guanidinové nebo amino skupiny R zahrnují methyl, ethyl, allyl, amino, kyan nebo nitro skupiny.

Vhodné makromolekuly M zahrnují proteiny, enzymy, protilátky, syntetické polymery rozpustné ve vodě jako jsou polyakrylové kyseliny a polyakrylamidy, polysacharidy a polyaminokyseliny.. Makromolekuly, které jsou zejména výhodné pro použití v diagnostických aplikacích zahrnují hovězí sérový albumin (BSA), křenovou peroxidasu (HRP), avidin a příbuzné proteiny jako je streptavidin nebo neutravidin a imunoglobuliny.

Makromolekuly, které jsou zejména vhodné pro použití ve sloučeninách podle předkládaného vynálezu, které mají být použity pro léčbu chřipky, zahrnují polysacharidy, syntetické polymery jako jsou polyakrylamidy, polyethylenglykoly, polymočoviny, polykyseliny, polyestery, polyamidy a různé ko-polymery jako je N-(2-hydroxy-propyl)methakrylamid (HMPA), o kterých je známo, ze jsou bezpečné při podání u lidí. Odborníkům v oboru budou známé další farmaceuticky přijatelné polymery.

Jedna výhodná skupina sloučenin podle předkládaného vynálezu obsahuje sloučeniny (II), kde X je derivát GG167 vzorce (2), kde

R je guanidin, R² je acetyl, W je skupina O(=CO)NH a mezimolekulová spojka Y je řetězec obsahující 6 až 60 atomů uhlíku, dusíku a kyslíku.

* ♦ ·	1«	• B	B *	··
• Β B ·	•	B	B	B	B
• · ·	• ·	IH	Β B	•	B
Β Β B	• ·	Β B	B·		B.
BBB ··	II	Β B	« B	Β B

Makromolekuly vzorce (II) jsou inhibitory neuraminidasy chřipkových virů A a B a mají protichřipkovou aktivitu. Tak ve druhém aspektu vynález obsahuje farmaceutický prostředek pro léčbu infekce chřipkovým virem A nebo B, který obsahuje sloučeninu podle předkládaného vynálezu, výhodně sloučeninu vzorce (II) nebo vzorce (IIA), spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Ve třetím aspektu vynález obsahuje způsob léčby infekcí chřipkovým virem u savců, včetně lidí, který obsahuje krok podání účinného množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu, výhodně sloučeniny vzorce (II) nebo vzorce (IIA), nebo jejich farmaceuticky přijatelných derivátů, savcům, kteří potřebují uvedenou léčbu.

Ve čtvrtém aspektu obsahuje předkládaný vynález použití sloučeniny podle předkládaného vynálezu, výhodně sloučeniny vzorce (II) nebo vzorce (IIA), pro výrobu léku pro léčbu infekcí způsobených chřipkovým virem.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být také použity v kombinaci s jinými terapeutickými činidly, například spolu s jinými protiinfekČními činidly, zejména s jinými antivirovými činidly. Vynález tak obsahuje v dalším aspektu farmaceutický prostředek obsahující sloučeniny podle předkládaného vynálezu, výhodně sloučeniny vzorce (II) nebo vzorce (IIA), nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli nebo deriváty, spolu s jedním nebo více dalšími terapeutickými činidly, zejména antivirovými činidly, a farmaceuticky přijatelným nosičem.

V dalším aspektu vynález obsahuje způsob pro. detekci chřipkových virů, kde uvedený způsob obsahuje vystavení vzorku podezřelého z přítomnosti uvedeného viru sloučenině podle ·♦ · · ♦ · · · · · • · · · · · · '* ♦ · « • · · · ♦· · ··-· • Μ ·* »· ·· ·· ·♦ předkládaného vynálezu, která je schopná specifické vazby na aktivní místo neuraminidasy chřipkového viru.

Způsob podle předkládaného vynálezu je použitelný pro všechny typy chřipky A a chřipky B.

Pro detekci chřipkového viru mohou být sloučeniny podle vzorce (II) navázány na povrch, buď kovalentní vazbou nebo nespecifickou vazbou. Mezimolekulová spojovací skupina Y by měla být dostatečně dlouhá, aby mohly být vazebné jednotky X pro neuraminidasu vystaveny na povrchu makromolekuly M a aby byly dostupné pro virovou částici.

Pro detekci chřipky může způsob podle předkládaného vynálezu využívat selektivního zachycení viru sloučeninou vzorce (II) a jeho koncentrování, po kterém následuje detekce viru za použití jakékoliv vhodné běžné techniky; detekční metoda nemusí mít vlastní sensitivitu. Například, vazebné činidlo (II) může být . navázáno na nosič, jako je membrána nebo polymer tak, že virové částice budou selektivě zachyceny a koncentrovány při průchodu vzorku přes nosič. Proto je v jednom provedení vynálezu skupina Z zakončena funkcí, která je schopná vazby na povrch. V oboru je známo mnoho takových funkčních skupin.

Alternativně může být použit selektivní detekční přístup; virová Částice ve vzorku může být například zachycena nespecificky a potom může být vystavena makromolekulovému činidlu s vazebnou schopností pro neuraminidasu (II), které obsahuje detekovatelný markér z, za podmínek, které umožní selektivní vazbu činidla na chřipkovou neuraminidasu na povrchu virových částic. Detekovatelný markér je potom detekován za použití jakýchkoliv běžných metod. Pro některé detekční systémy je výhodné lokalizovat vzorek do omezených oblastí, například skvrn

•	44	4 4	4«	44	44
44 «	4	4	•	4	4 4	4	4
4 4	4	4	4	4 44	4 4	4	4
• 4	4	4	4	4 4	4		4
44 4	4 4		« 4	44	• 4	4*

nebo drah na povrchu.Tohoto může být dosaženo za použití mnoha metod, například může být vzorek suspendován nebo neselektivně zachycen na filtru nebo na jiném nosiči a potom může být vystaven působení značeného vazebného činidla, jak je popsáno výše.

V jiném alternativní aspektu vynálezu může být použito kombinace selektivního zachycení a selektivní detekce, Čímž se získá jednoduchý a sensitivní dvoustupňový způsob pro detekci chřipkového viru. Tento přístup využívá skutečnosti, že částice chřipkového viru typicky obsahuje přibližně 100 molekul neuraminidasy na svém sférickém povrchu (White, D.O. Current Top. Microbiol. Immunol. 1974, 63: 1-48) a proto může být zároveň navázána na více než jedno vazebné činidlo.

Tak může být vazebné činidlo pro neuraminidasu vzorce (II) navázáno na nosič, například jako úzký proužek na pórovité membráně. Testovaný vzorek je aplikován na jednu stranu membrány a nechá se proudit přes proužek navázané sloučeniny. Jakákoliv částice chřipkového viru v testovaném vzorku bude zachycena membránou s navázanou sloučeninou (II) a tak bude zachycena v úzkém proužku. Ve druhém stadiu testu se nechá detekovatelný markér navázaný na jiné vazebné Činidlo pro neuraminidasu (II) proudit přes membránu přes proužek s navázanými částicemi chřipkového viru. Přítomnost chřipkového viru se potom projeví pozorovatelnou změnou na membráně v místě navázané sloučeniny. Předpokládá se, že metody a sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou. vhodné pro platformu Biostar Optical Immunoassay (OAI), která je popsána mimo jiné v US patentu č. 5418135, Miller et al..

V oboru je znám velký počet vhodných detekčních systémů, například systém biotin-streptavidin, enzymové systémy jako je křenová peroxidasa nebo alkalická fosfatasa, fluorescenční ♦ · · · > · · • · » · · · · * • · · · · I · · • · · ' · · · ♦ ·* · ·· ·· ·« systémy, chemiluminiscenční systémy, koloídní zlato, radioaktivní markéry a aglutinační systémy. Předpokládá se, že koloidní zlato potažené sloučeninou podle předkládaného vynálezu (II) bude zejména vhodným detekovatelným markérem. Podobně, sloučeniny podle předkládaného vynálezu, kde makromolekulou M je křenová peroxidasa, budou ideální pro snadnou detekci chřipkového viru.

* Odborníci v oboru budou schopni vybrat vhodný detekční systém, za použití normálních pokusů.

í·

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu vzorce (II) a jejich farmaceuticky přijatelné soli a deriváty mohou být připraveny různými metodami, které zahrnují metody popsané dále. Způsoby přípravy uvedené dále tvoří další aspekt předkládaného vynálezu.

Vynález bude nyní podrobněji popsán v následujících příkladech, které jej nijak neomezují.

Příklady sloučenin podle předkládaného vynálezu zahrnují sloučeniny vzorce (3), kde M je protein, jak jsou uvedeny v tabulce 1, dále.

(3) * · t *4 *4 ·» · · ««»· · · · · * 4 4 « · « · · »·* · · « · »·· · · · » · * ··« B« ♦ * *· Β» ··

Tabulka 1

SlOUČ e.	Mezimolekulová spojka Y	Protein M	n	Substituent Z	Počet m
3a	(CH ) NHCOÍCH ) CHCO(cS f CO-	BSA	30	Biotinamido- kaproyl	8
3b	(CH ) NHCOÍCH ) NHCO(cš₂f₆co-	ovězí IgG	60	Biotinamido- kaproyl	18
3c	(CH ) NH[CO(CH ) NH] CO(cS T nhco(ch²)⁵co ³ 2 S 2tí	BSA	6	-	-
3d	(CH ) NH[CO(CH ) NH] CO<cS T nhcoíchVco ³ 2 5 2 5	BSA	12	-	-
3e	(CH ) NH[CO(CH ) NH] CO(c8 J_snhco(ch₂)³co ³	HRP	3	-	-
3f	(CH,) NH[CO(CH ) NH],CO(Cft f NH- 2 5	HRP	2	-	-
3g	(CH ) NH[CO(CH ) NH] CO- 2tí 2 5 4	Hovězí . IgG	42	-	-
3h	(CH ) NH[CO(CH ) NH] CO(cBXnh- ’ “	Hovězí igG	12	-	-
3h	(CH ) NH[CO(CH ) NH] CO<cgJ_eNH- ^{25 4}	Hovězí igG	24	-	-
3j	(CH ) NHCO [CH CH 0) - ch₂c§₂nhc6(ch₂)_ečo-	Hovězí IgG	20	-	-

	«	4	4 4	4	4 4	4 4
	4	•	»	4	444	4 4	4 4
	4	•	4	4	» 4	4
• 4	4*		4 λ	• 4	4 4	4 4

Další příklady sloučenin podle předkládaného vynálezu zahrnují sloučeniny vzorce (4) , kde M je protein avidin, který se nekovalentně váže na skupinu X-Y a také se kovalentně váže na ligandy Z, jak jsou uvedeny v tabulce 2, dále.

Tabulka 2

Sl. v· c.	Mezimolekulová spojka Y	n	Substituent Z	m
4a	(CH ) NH(COCH NH) COCH NH-biotin2 6 2 2 2	4	-	-
4b	(CH ) NH(COCH NH) COCH NH-biotin2 6 2 2 2	4	biotinamidokaproyl	5
4c	(CH ) NH(COCH NH) COCH NH-biotin2 6 2 2 2	4	biotinamidokaproyl	,10
4d	(CH ) NH(CO(CH ) NH) CO(CH ) NH- 2 6 2 5 3 2 5 -biotin-	4	biotinamidokaproyl	10
4e	(CH ) NHCO(CH ) NHCOCH (OCH - 2 _ 6 25,,,. 2 2 CH ) NH-biotin- 2 X6	4	biotinamidokaproyl	8

Další příklady sloučenin podle předkládaného vynálezu, kde M je syntetický polymer, zahrnují sloučeniny vzorce (5), jak jsou uvedeny v tabulce 3, dále, kde substituenty na skupině sialové kyseliny (2) jsou R² = Ac, R = guanidin a W je OCONH.

'i t

	»9	9«	• 9	99	99
• 9	9	9	•	9	9 9	9 9
• 9	9	•	9	99·	• 9	9 9
• 9	9	•	9	9 ·	9	• '·
* 4	«9	9*	>9	99	99

r η η				ch₂—	H _ p—
UH2 t*		CH? CH ⁴ 1		v \|
1 co		co I			co t
(2)-^_γ_-ΝΗ	n	nh₂	P.	-	NH-Z	m

(5)

Tabulka 3

Sl. č.	Mezimolekulová spojka Y	n	P	Substituent Z
5a	(CH₂).	1	13	-
5b	(CH )	7	7	-
5c	2 6 (CH ) NHCONH(CH ) 2 6 2 6	1	9	-
5d	(CH₂)₆NH[CO(CH_a)_sNH] ₃C0 (CH₂) _s	1	8	-
5e	CH CH OCH CH OCH CH 2 2 2 2 2 2	1	8	-
5f	(CHJ,	1	500	-
	(CH ) NH[CO(CH ) - 2 6 2 S NH]₃CO(CH₂)₅	1	20
5h	(CH₂)₆NH[CO(CH_a)_s- NH]₃CO(CH₂)_s	1	50	-
5i	(CH ) NH[CO(CH ) - 2 6 2 O NH]₃CO(CH₂)_s	1	45	benzyl
5j	W₆	1	50	-
5k	(CH₂)_e	1	45'	benzyl
51	<^CH2>₆	2	40	bexyl-biotin
5m .	<^CIU₆	2	40	hexy 1-f1uore s cein
5n	<^CÍÍ2>₆	1	20	CH CH SH 2 2

* A A • · ·	«' · A A	• ·»«	« A A A	• . · A ·
• · ·	• A	« A	•	♦
A· ··	A A	a s	A A	A A

Další příklady sloučenin podle předkládaného vynálezu, kde M je dextranový skelet (molekulová hmotnost 500000), zahrnují sloučeniny vzorce (6), jak jsou uvedeny v tabulce 4, dále, kde substituenty na vazebné skupině pro neuraminidasu (2) jsou R² = Ac, R = guanidin a W je OCONH. Celá čísla n, m a p ve vzorci (6) udávají procento glukosových jednotek v dextranovém skeletu, které jsou substituované určitými skupinami, t.j. pokud nedosahuje součet n, m a p 100, tak je zbývající dextranový skelet tvořen nesubstituovanými glukosovými jednotkami. Mělo by být také jasné, že existují tři možná místa pro připojení různých ligandů navázaných na každou jednotku dextranového skeletu.

(6)

Tabulka 4

S1. Mezimolekulové	n%	vazba V	Substituent i Z		V	p%
č	spojka Y
6a		4	C=0	benzyl	17	H	-
6b	<^CÍVe	3	CH₂C0	benzyl	17	CH CO H 2 2	20
6c	(CH₂CH_aO)₌CH_aCH₌	4	CH CO 2	benzyl	16	CH CO H 2 2	20
6d	(CH ) NHCO (CH CH 2 6 2-2 2 0) CH CH 70 2 2	7	CH CO 2	benzyl	16	CH CO H 2 2	17
6e		4	C=0	benzyl	16	H	-
6f	(CH ) 2'6	3	CH CO 2	benzyl	10	CH CO H 2 2	27
6g	(CHJ ₆NH [CO (CH₂) ₅nh]	*’2	c=o	-	-	H
6h		1	c=o	NH(CH ) S-2-	5	H	-
6i		0	c=o	kys. sialové benzyl	16	H
6j	-	0	CH CO 2	benzyl	16	CH CO H 2 2	24

Další příklady sloučenin podle předkládaného vynálezu zahrnují ty sloučeniny, kde makromolekula M je dextranový skelet nebo skelet.obsahující polyakrylovou kyselinu, a kde substituenty na skupině sialové kyseliny (2) jsou R² = Ac, R = guanidin a W je OCONH, a kde je substituent Z například benzyl, molekula biotinu nebo skupina obsahující fluorescein.

Odborníkům by být jasné, že termín léčba zahrnuje jak profylaxi, tak léčbu rozvinuté infekce nebo příznaků. Léčba je výhodně zahájena před dobou infekce nebo v době infekce a pokračuje do té doby, dokud není virus nadále přítomen v respiračním traktu. Obecně bude vhodná dávka sloučeniny podle předkládaného vynálezu v rozmezí od 0,1 do 100 mg/kg/den, výhodně v rozmezí od 0,2 do 20 mg/kg/den.

•· · *· • · v · · a · ..... ·♦-----* *·· ·· ·» « ·«

Vhodná léčba je podávána 1 - 4-krát denně a pokračuje po dobu

3-7 dní po infekci. Požadovaná dávka může být podána jako jediná dávka, nebo může rozdělena do několika dávek ve. vhodných intervalech.

Ačkoliv je možné, aby byla sloučenina podle předkládaného vynálezu podána jako surová chemická sloučenina, je obyčejně výhodné, aby byla podána jako aktivní složka farmaceutického prostředku. Vynález tak obsahuje farmaceutický prostředek obsahující sloučeniny vzorce (II) nebo jejich přijatelné soli nebo deriváty, spolu s jedním nebo více jejich farmaceuticky přijatelnými nosiči a volitelně jinými terapeutickými a/nebo profylaktickými činidly. Farmaceutické prostředky zahrnují prostředky pro orální, nasální nebo lokální podání nebo ve formě vhodné pro inhalaci nebo insuflaci do respiračního traktu. Prostředky mohou být, pokud je to vhodné, připraveny v jednotlivých dávkových jednotkách a mohou být připraveny jakýmkoliv způsobem známým ve farmacii.

Obecně mohou být sloučeniny podle předkládaného vynálezu podány ve formě roztoku nebo suspenze nebo suchého prášku. Pro podání do respiračního traktu způsobem podle předkládaného vynálezu inhibitor neuraminidasy podán jakýmkoliv způsobem a ve formě jakéhokoliv prostředku, který je v oboru používán pro podání do respiračního traktu.

Roztoky a suspenze budou obyčejně vodné a budou připraveny například z vody samotné nebo z vody a fyziologicky přijatelného spolurozpouštědla (například ethanolu, propylenglykolu, polyethylenglykolů jako je PEG 400). Takové roztoky nebo suspenze mohou dále obsahovat další přísady, jako například konzervační činidla (jako je například benzalkoniumchlorid), solubilizační činidla/surfaktanty jako jsou polysorbaty (například Tween 80), • · · »· 66 · · · · ·* · · * * · · * · * pufrovací činidla, činidla upravující izotonicitu (například chlorid sodný), zesilovače absorpce a zesilovače viskozity. Suspenze mohou dále obsahovat suspendační činidla (například mikrokrystalickou celulosu, karboxymethylcelulosu sodnou).

Roztoky nebo suspenze se aplikují do dutiny nosní běžnými prostředky, například kapátkem, pipetou nebo ve spreji.

Prostředky mohou být vyrobeny ve formě jedné dávky nebo ve formě obsahující více dávek. Sprej může být vyroben například za použití atomizační sprejové pumpy s měřitelným dávkováním. Podání do respiračního traktu může být také provedeno za použití aerosolového prostředku, ve které je sloučenina ve vhodné tlakové nádobě s pohoným plynem jako je chlorfluoruhlovodík (CFC) nebo jiný vhodný plyn.

Alternativně může být sloučenina ve formě suchého prášku, například jako prášková směs sloučeniny ve vhodné bázi jako je laktosa, škrob, deriváty škrobu a polyvinylpyrrolidin. Po aplikaci bude prášek tvořit gel v nosní dutině. V prostředcích pro podání do respiračního traktu včetně intranasálních prostředků bude mít sloučenina obyčejně malou velikost částic, například 5 mikronů nebo menší. Částice takové velikosti mohou být získány známými prostředky.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou připraveny v několika stupních, kde první částí je obecně syntéza derivátu kyseliny sialové s vazebnou schopností pro neuraminidasu vzorce X-Y, kde X a Y jsou definovány výše.

Způsoby pro syntézu derivátů kyseliny sialové (2) s vhodnou funkcí v 7-pozici jsou popsány v Britské patentové přihlášce č.

9516276.4 a v Mezinárodní patentové přihlášce č. PCT/AU97/00190.

Příklady vhodných X-Y derivátů kyseliny sialové jsou uvedeny v tabulce 5, dále, kde substituenty R2, R a W jsou substituenty na skupině X, jak je popsáno výše.

Tabulka 5

SlouČ. č.	R²	R	W	Mezimolekulová spojka Y
23	Ac	Guanidin	OCONH	{CH ) NH 2 6 2
2b	Ac	Guanidin	OCONH	{CH ) NHCOÍCH ) NH
2c	Ac	Guanidin	OCONH	(CH) NH(CO(CH ) NH) CO(CH ) NH 2 6 2 5 J 252
2d	Ac	Guanidin	OCONH	{CH CH 0) CH CH NH 2 2 2 2 2 2
2e	Ac	Guanidin	OCONH	(CH ) NH(CO(CH ) NH) CO(CH ) NH-biotin . 2 6 2 5 3 2 5
2f	Ac	Guanidin	OCONH	{CH ) NHC0NH(CH ) NH 2 6 2 S 2
29	Ac	Guanidin	OCONH	{CH ) NHCO [CH CH 0] CH CH NH 2 6 2 2 2 70 2 2 2

Druhá část přípravy sloučenin podle předkládaného vynálezu obsahuje navázání X-Y vazebných jednotek pro neuraminidasu na makromolekulu M. Pro kovalentní vazbu jednotek X-Y na makromolekuly M proteinového typu může být konjugace obecně provedena pomocí standardních technik zkřížené vazby, které jsou dobře známé (například S.S. Wong Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, ORC Press, 1991; G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academia Press, 1996).

V případě syntetických polymerů mohou být jednotky X-Y přidány k předem vytvořenému polymerovému skeletu, který má vhodně aktivované substituenty. Například, pokud má skupina Y koncovou amino funkci, pak může reagovat s aktivovanými esterovými substituenty na polyakrylatovém skeletu. Alternativně, jednotky X-Y s vhodně polymerizovatelnými koncovými substituenty, jako je

terminální olefin, mohou být polymerizovány nebo výhodě spolupolymerizovány s jiným olefinem za vzniku makromolekulového skeletu. Viz například R. Roy, Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 1996, 8: 79 - 99; N.V. Bovin and H.J. Gabius,

Chem. Soc. Reviews., 1995; 413).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava konjugatu GG167-hovězí sérový albumin-biotin (3a) (a) Příprava 5-acetamido-7-(6¹ -(6' '-aminokaproyl)aminohexyl)-karbamoyloxy-4-guanidino-2,3,4,5-tetradeoxy-D-glycero-D-galakto-non-2-enopyranosové kyseliny (2b) (7-(6-aminokaproyl)amino-hexylkarbamoy1oxy-GGl67)

6- (t-butylkarbonylamino)kaproová kyselina (34 mg, 147 μπιοί) se rozpustí ve směsi acetonu (2,5 ml), vody (100 μΐ),

N-methylmorfolinu (4 μΐ, 36 μπιοί) a triethylaminu (21 μΐ, 147 μπιοί). Roztok se ochladí na -12 °c a přidá se isobutylchlorformiat (21 μΐ, 161 μπιοί) . Roztok se mísí po dobu 12 minut.

Methyl-5-acetamido-7- (6' -aminohexyl) -karbamoyloxy-4-guanidino-8,9-monokarbonyldioxy-2,3,4,5-tetradeoxy-D-glycero-D-galakto-non-2-enopyranosonat, sůl kyseliny trifluoroctové (79 mg, 92 μιτιοί) se rozpustí ve směsi voda/aceton (1:1, 2 ml) obsahující triethylamin (4 μΐ, 187 μπιοί) . Tento alkalický roztok se ochladí na 0 °C a přidá se v jedné dávce do předchozí reakční směsi. Směs se nechá ohřát na pokojovou teplotu a mísí se po dobu 4 hodin.

Rozpouštědla se odstraní za redukovaného tlaku. Surový produkt se odebere ve směsi methanol/voda (1:1, 4 ml) a potom se přidá • * · · 9 · · · β · · • · · · >··· V · · · • · · «··· < * «*»·· ·· ·· ·« ·« triethylamin (1 ml) . Tento roztok se mísí přes noc v atmosféře argonu. Rozpouštědla se odstraní na rotační odparce a zbytek se rozpustí v methanolu a adsorbuje se na silikagel (115g). Při chromatografii na silikagelu (10 g) s elucí ethylacetat/ isopropanol/voda (100/75/25)'se získá požadovaná sloučenina (53 mg, 77 μνηοΐ, 84%) .

¹H NMR (CD₃D, 200 MHy) 6 5,67 (d, J 2,6 Hz, IH), 1,03 (m, IH) , 4,62 (m, IH), 4,49 (m, IH), 4,23 (m, IH) , 4,12 (m, IH), 3,77 (m, IH) , 3,62 (m, IH), 3,12 (m, 6H) , 2,22 (t, J 8 Hz, 2H), 2,0 (s,

3H), 1,5 (m, 23 H).

t-Boc chráněný cukr se rozpustí ve směsi ethylacetat/toluen a odpaří se do sucha. Materiál se rozpustí v kyselině trifluoroctové (3 ml) a mísí se při pokojové teplotě pod atmosférou argonu po dobu 1 hodiny. Rozpouštědlo se odstraní za redukovaného tlaku a zbývající kyselina trifluoroctová se odstraní současným odpařením nejprve dichlormethanem, potom 3 díly směsi voda/methanol. Vzorek se potom rozpustí ve vodě, filtruje se a lyofilizuje se za zisku požadované sloučeniny (141 mg, 152 /zmol) jako tris TFA soli.

Hmotnostní spektrum (FAB): 588 (M+l) ^H NMR (CD₃D, 300 MHy) Ó 5,92 (d, J 2,6 Hz, IH), 5,01 (m,

IH) , 4,62 (πί, IH) , 4,60 (dd, J 10,3 Hz, IH) , 4,44 (dd, 9,3 Hz,

IH), 4,23 (m, IH), 4,05 (m, IH), 3,67 (dd, 13,4 Hz, IH), 3,52 (dd, 13,7 Hz, IH), 3,16 (m, 5H) , 2,96 (t, 8Hz, 2H), 2,25 (t, 8

Hz, 2H), 2,00 (s, 3H), 1,7 - 1,3 (m, 13 H).

(b) Příprava konjugatu mezi derivátem GG167 (2b) a hovězím sérovým albuminem-(6-aminokaproyl-biotin)

Proteinový vazebný pufr: 0,1 N NaHCO₃/0,2 M NaCl.

Dialyzační pufr; 20 mM KH_aP0₄/0,15 M NaCl, pH 6,5

BSA-(kaproyl-biotin) (3 mg, 43 nmol, Pierce) se rozpustí ve vazebném pufru (7,5 ml) a provede se jemné míšení po dobu 30 minut.

Bis-(N-hydroxy-sulfosukcinimid)suberat (12 mg, 21 /imol,

Pierce) se rozpustí ve vazebném pufru (1 ml) a přidá se přímo do alkalického roztoku sloučeniny (2b) z příkladu 1(a) (19,5 mg, 21 pmol) ve vazebném pufru (1,5 ml). Reakce se mísí po dobu 7,5 minut. Roztok BSA-biotinu se potom po kapkách přidá do roztoku derivátizováného GG167 a směs se nechá při pokojové teplotě po dobu 1,5 hodiny. Roztok se lyofilizuje, rozpustí se ve vodě (3,0 ml) a dialyzuje se proti dialyzačnímu pufru (3 x 1,5 1, celulosové trubice, hraniční MW 12000}.

Směs se lyofilizuje, odebere se ve vodě (2.5 ml) a odsolí se na PD-10 koloně (Pharmacia) a potom se lyofilizuje za zisku požadovaného produktu (3a) (2,5 mg).

Hodnocení inkorporace cukru (30 jednotek GG167 na molekulu proteinu) se provede pomocí kolorimetrického testu pro guanidinovou skupinu (Sakaguchi Reaction, viz Can. J. Chem.,

1958, 36: 1541).

Příklad 2: Příprava konjugatu hovězí sérový r-globulin (6-aminokaproyl-biotin) -(GG167-karbamat-l,6-diaminohexan-6-amid kyseliny aminokaproové - amid kyseliny korkové) (3b)

Hovězí τ-globulin (3 mg, 20 nmol, Sigma) se rozpustí ve vazebném pufru (l ml) a mísí se po dobu 30 minut.

ť n.

• « · · ··

N-hydroxy--sulfosukcinimidil-N-biotinyl-6-aminokaproat (1, 8 mM, 280 μΐ, 0,5 μπιοί) ve vazebném pufru se přidá k roztoku proteinu a reakční směs se mísí při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny.

Reakční směs se potom ředí na 7,5 μΐ vazebným pufrem a reaguje s bis(N-hydroxy-sulfosukcinimidyl)suberatem a GG167-7-karbamat-1,6-diaminohexan-6-amidem kyseliny aminokaproové z příkladu 1(a), výše, za podmínek stejných jako v příkladu l{b).

Výtěžek lyofilizovaného τ-globulinového konjugatu (3b) je 2,5 mg) .

Příklad 3: Příprava konjugatu 3f mezi sloučeninou 2c a křenovou peroxidasou (HRP)

Sloučenina 2c se naváže na HRP za použití dobře známé techniky jodistanové oxidace (viz například G.T. Hermanson,, Bioconjugate Techniques, Academie Press, 1996, 472), za zisku sloučeniny 3f.

HRP (typ IV-A, Sigma-Aldrich P6782, 5 mg, 114 nmol) se rozpustí v pufru obsahujícím octan sodný/chlorid sodný (5 mM/150 mM, pH 4,5, 500 μΐ). Do tohoto roztoku se přidá čerstvě připravený roztok jodistanu sodného (88 mM v v pufru octan sodný/chlorid sodný, 50 μΐ, 4,4 mmol) a reakční směs se nechá při pokojové teplotě v temnu po dobu 20 minut. Směs se podrobí chrornatografii na PD-10 koloně {Pharmacia Biotech, Sephadex G-25) předem uvedené do rovnováhy pufrem octanu sodného (5 mM, pH 4,5) a eluent se suší sublimací ze zmrazeného stavu.

Oxidovaná HRP se rozpustí v pufru uhličitanu sodného (0,2 M, pH 9,5, 1 ml) obsahujícím sloučeninu 2c (3,9 mg, 3,75 μτηοΐ) při 4 °C a reakční směs se nechá přes noc při 4 °C. Přidá se roztok *

• 444 *· · ♦ · • · '4 4 • 4 4 4 · · 4

4·* 44 ·· 4« kyanborohydridu sodného (5 Μ v IN NaOH, 10 μ1, 50 gmol) a reakční směs se nechá přes noc při 4 °C. Přidá se roztok ethanolaminu (1 M, pH 9,5, 50 μΐ, 50 gmol) a reakční směs se nechá odstát po dobu 30 minut při pokojové teplotě před chromatografii na PD-10 koloně, předem uvedené do rovnováhy destilovanou vodou. Eluent se suší sublimací ze zmrazeného' stavu za zisku konjugatu

HRP-sloučenina 2c jako světle hnědého prášku.

Příklad 4: Příprava konjugatu protein-GG167 3c, 3d a 3g-3j

Sloučeniny 3c, 3d a 3g-3j se připraví navázáním vhodného proteinu na sloučeninu 2c nebo 2g za použití bis(N-hydroxy-sulfosukcinimid)suberatu) a podle stejného postupu, jako je popsán v příkladu 1, části (b) .

Příklad 5: Příprava biotinylovaného komplexu (4d) mezi avidinem a konjugatem GG167-biotin (a) Příprava 5-acetamido-7-(6’-(6'¹ -(6'¹'-biotinylaminokaproyl)-triaminokaproyl)aminohexyl)-karbamoyloxy-4-guanidino-2,3,4,5-tetradeoxy-D-glycero-D-galakto-non-2-enopyranosové kyseliny (2e) se provede za použití Boc-chráněné tetra(6-aminokaproové kyseliny) a podobným způsobem, jako je popsán v příkladu 1.

(b) Avidin (3 mg, 0,0445 μπιοί) se rozpustí v roztoku sloučeniny (2e) {0,5 mg, 0,434 μπιοί) ve vodě (500 μΐ) při pokojové teplotě po dobu 2 hodin. Do tohoto výsledného roztoku se přidá sulfo-N-hydroxysukcinimido-kaproylamino-Biotin (Pierce č. 21335) (1000 μg, 1,798 μτηοΐ) a roztok hydrogenuhl iči tanu sodného (1000 μg, 11,9 μπιοί) ve vodě (240 μΐ) . Směs se nechá stát při pokojové teplotě po dobu 45 minut a potom se umístí do dialyzační trubice (hraniční molekulová hmotnost 12000). Trubice se dialyzuje postupně proti 50 mM roztoku NaHCO₃ (4 x 250 ml) a vody • » 4 4 4 » 4 4··

4 4 * 4 • 4'· 4» ·4 *4 44 (8 x 250 ml), s dobou ponoru pokaždé 45 minut. Trubice se nakonec dialyzuje proti vodě (500 ml) při pokojové teplotě přes noc. pH výsledného roztoku z dialyzační tuby se upraví na pH 6,5 - 7,0 za použití hydrogenuhličitanu sodného a potom se suší sublimací ze zmrazeného stavu za zisku titulního komplexu (4c) (3 mg, 19%·) jako bílé pevné substance. Komplex se skládá ze čtyř molekul GG167-biotin navázaných přes čtyři avidinová vazebná místa a potom z avidinového skeletu substituovaného přibližně osmi až deseti kovalentně vázanými biotinovými ligandy. Diagram komplexu je uveden na obrázku 1, kde A představuje avidin, B přadstavuje biotin a S představuje cukernou molekulu GG167.

Příklad 6: Příprava polyakrylamidů (5a) - (5e) substituovaných různými GG167-ligandy (a) Póly(N)-(akryloyloxy)sukcinimid) (pNAS) se připraví z

N-(akryloyloxy)sukcinimidu způsobem, který popsal Ferruti et al., {Polymer, 1972, 13: 462). NMR spektrum a infračervené spektrum pNAS byly souhlasné s daty uvedenými v literatuře. Vzorek šarže pNAS se přemění na polyakrylamid reakcí s koncentrovaným amoniakem po dobu několika hodin při pokojové teplotě a zjistí se pomocí viskozimetru, že molekulová hmotnost dialyzovaného polyakrylamidů je přibližně 50000.

(b) Polyakrylamidy (5a) - (5e) inkorporující různé deriváty GG167 se připraví z jedné šarže pNAS za použití obecné metody uvedené dále pro sloučeninu (5c).

Roztok pNAS (10 mg, 59 /xmol NAS) v dimethylformamidu (DMF, 0,5 ml) se přidá do roztoku sloučeniny (2f) (3,8 mg, 6,2 /xmol) v DMF (0,5 ml) při pokojové teplotě za míšení. Přidá se triethylamin (10 μΐ, 70 μπιοί) a čirý roztok se mísí přes noc při pokojové teplotě, potom se zahřeje na 65 °C na dobu 5 hodin a opět se

• A *	• A	A	A Á A A
• · A	A A	AAA	• · · A
• · A	A ·	A A	• - A
• · · *	• A	• A	A« A A

míchá přes noc při pokojové teplotě. Ředěný vodný amoniak (6 ml, 3% roztok), se přidá do reakční směsi a čirý roztok se nechá stát po dobu 24 hodin při pokojové teplotě. Reakční směs se odpaří do sucha při redukovaném tlaku a zbytek se rozpustí ve vodě {3 ml) a umístí se v dialyzační trubici (hraniční molekulová hmotnost 12000) a dialyzuje se proti vodě (500 ml, pH 6) po dobu 24 hodin. Roztok se suší sublimací ze zmrazeného stavu za zisku polyakrylamidu (5c) obsahujícího GG167 jako bílé pevné substance. ^ΧΗ NMR spektrum (300 MHz) vykazuje následující široké signály: (D₂0) δ 5,7, 4,4-4,6, 4,1, 3,3-3,7, 3,0, 2,0-2,5, 1,9, 1,1-1,8. Při srovnání integrálu pro protony kyseliny sialové (δ 5,7-3,2) s integrálem pro polymer a mezimolekulové spojovací řetězce (δ 1,0-3,2, minus N-acetyl pík při 1,9) se stanoví inkorporace GG167 jednotek jako přibližně 10%.

Příklad 7: Příprava polyakrylamidu 51, který má jak GG167 ligandy, tak biotinové ligandy

Roztok pNAS (170 mg, l mmol NAS) (molekulová hmotnost přibližně 50000) v DMF (3 ml) se mísí při pokojové teplotě a přidá se roztok sloučeniny 2a (TFA sůl, 30 mg, 50 μιηοΐ) a N-6-aminohexyl-biotinamidu (7 mg, 20 μττιοί) v DMF (2 ml) . Přidá se triethylamin (50 μΐ) a reakční směs se mísí po dobu 24 hodin při 20 °C. Do reakční směsi se přidá ředěný amoniak (20 ml, 5%) a míchání pokračuje po dalších 24 hodin. Reakční směs se odpaří do sucha a zbytek se rozpustí v 10 ml vody a dialyzuje se proti vodě po dobu 2 dnů (1x4 litry, hraniční molekulová hmotnost potrubí 12000). Při Sakaguchiho guanidinovém barvícím testu se získá pozitivní výsledek pro kapalinu zůstávající v trubicích, ale ne pro koncentrovaný vzorek poslední dialyzační vody. Kapalina z dialyzačních trubic se suší sublimací ze zmrazeného stavu za zisku 51 jako krémové drolivé pevné substance (71 mg). Hladina ligandů v polymeru byla stanovena NMR a byla zjištěna takřka

9 9 Λ 9 9 · • · « * · 9 · · 9 ··, ♦ • · · « · > « ·----♦ ·♦· ·· ·· ·· · úplná inkorporace výchozích aminů.

Příklad 8: Příprava polyakrylamidů 5i, 5k, 5m a 5n obsahujících GG167

Sloučeniny 5i, 5k, 5m a 5n se každá připraví reakcí pNAS s vhodnou směsí GG167 derivátu (2a nebo 2c) s buď benzyl aminem, N-6-aminohexyl-fluoresceinem nebo aminoethanthiolem, podle metody podobné metodě použité v příkladu 7. Pro přípravu sloučenin 5i a 5k (a také sloučenin 5h a 5j) se použije pNAS s vyšší molekulovou hmotností (>200 kDa).

Příklad 9: Příprava dextranu (molekulová hmotnost 500 kDa) s více GG167 (7-oxykarbamoylhexylamino-karbonyloxy-4-guanidino-Neu5Ac2en) (3,5 mol£) a

N-benzylkarbamoyloxy (16,8 mol%) substituenty

• 9	·♦ •	9	99 9	• 9 9	9 9 9	9» 9	9
• 9	•	9	•	»99	9 ·	9	9
a »	•	9	9	9 9		-· v.	9
• ·	• ·		• 9	99	9 9	99

Do roztoku dextranu (molekulová hmotnost 500000) (100 mg,

0,617 mmol (podle jednotky o molekulové hmotnosti 162)) v DMSO (5 ml) se přidá p-nitrofenylchlorformiat (510 mg, 2,53 mmol) a 4-dimethylaminopyriďin (309 mg, 2,53 mmol). Směs se mísí pod atmosférou argonu, nejprve při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny a potom při 35 - 40 °C po dobu 3 hodin. Výsledný roztok se kombinuje s roztokem benzylaminu (12,5 mg, 0,117 mmol) a 4-dimethylaminopyridinu (40 mg, 0,327 mmol) v pyridinu (5 ml). Reakční směs se třepe po atmosférou argonu při pokojové teplotě po dobu 16 hodin před tím, než se odpaří do sucha ve vysokém vakuu. Zbytek se míchá ve 2% roztoku uhličitanu draselného (25 ml) při 0 °C po dobu 3 hodin za vzniku čirého roztoku, jehož pH se upraví za použití 3M HCI na pH 7. Výsledný roztok se dialyzuje proti vodě při pokojové teplotě po dobu 3 dnů, suší se sublimací ze zmrazeného stavu za zisku benzylovaného dextranu (95 mg, 83,

4) jako bílé pevné substance obsahující 16,8 mol.% oxykarbamoy1-methylenbenzenu, jak je zjištěno ^XH-NMR (D₂0).

Do roztoku benzylovaného dextranu (5,mg, 0,027 mmol) v DMSO (0,25 ml) se přidá p-nitrofenylchlorformiat (12,8 mg, 0,063 mmol) a 4-dimethyl-aminopyridin (7,8 mg, 0,063 mmol). Roztok se míchá v argonové atmosféře po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě a potom při 35 - 0 °C po dobu 3 hodin. Potom se kombinuje s roztokem sloučeniny 2a (0,5 mg, 0,00105 mmol) ve směsi pyridinu (0,25 ml) a DMSO (0,25 ml). Reakční směs se míchá při pokojové teplotě po dobu 16 hodin, před odpařením do'sucha ve vysokém vakuu. Zbytek se důkladně promísí v 1% roztoku uhličitanu draselného (5 ml) po dobu 4,5 hodiny za vzniku čirého roztoku. pH roztoku se upraví na pH 7,5 za použití 3M HCI, roztok se dialyzuje proti vodě při pokojové teplotě po dobu 24 hodin a nakonec se lyofilizuje za zisku titulního polymeru (4,5 mg, 82%) »

jako bílé pevné substance. Pomocí ^H-NMR se stanoví, že polymer obsahuje 16,8 molekul benzylaminu a 3,5 molekuly sloučeniny 2a na • 4 4 4 «

4» 4 • · 444 _ _ _ _r -.- _ _ .

• · 4 -4 44 * - -4---4··· ·· «4 44 «4 4 4.

100 glukosových jednotek nosiče. Molekulová hmotnost polymeru je stanovena na 623 kDa a průměrná molekulová hmotnost pro jednotku

7-aminohexylaminokarbonyloxy-4-guanidino-Neu5Ac2enu je 5770.

Příklad 10: Příprava multivalentního GG167 (7-oxyacetamidohexylaminokarbonyloxy-4-guanidino-Neu5Ac2en) (3 mol%) , N-benzylacetamido-2-oxy {17 ml%) a 2-oxyacetatu (20%) na dextranu /500 kDa

OH

1\ ' 0H\|__|

OH

COOH •» « I *· · · ·« • · · · * * · · · • · · * · · · ·«·*♦» ι ». · ···»« «· · · »· ··

Do roztoku dextranu (molekulová hmotnost 500000) (50 mg, 0,308 mmol) (podle jednotky o molekulové hmotnosti.132)) ve vodě (0,3 ml) v ledové lázni se přidá hydroxid draselný (138 mg, 2,4 mmol) ve vodě (0,1 ml). Směs se mísí při 0 - 5 °C po dobu 20 minut a potom se přidá kyselina chloroctová (102 mg, 1,07 mmol). Výsledná směs se mísí při 70 - 80 °C po dobu 20 minuť’a potom při pokojové teplotě po do 2 hodin. Reakční směs se ředí methanolem (25 ml) , bílá sraženina se získá filtrací, důkladně se promyje čerstvým methanolem (25 ml) a suší se. Celý postup se jedenkrát opakuje za zisku produktu jako bílé pevné substance obsahující přibližně 40 mol% draselné soli oxyacetatu, jak je určeno titrací (52 mg,

84%) .

Do roztoku polymeru kyseliny octové (1 mg, 0,05 mmol) ve vodě (0,4 ml) se přidá l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid, hydrochloridová sůl (16 mg, 0,08 mmol) a sulfo-N-hydroxysukcinimid (17,4 mg, 0,08 mmol). Směs se mísí při pokojové teplotě po dobu 20 minut a potom se.kombinuje s roztokem benzylaminu (12,8 mg, 0,118 mmol) v methanolu (0,2 ml). Výsledná směs se mísí při pokojové teplotě po dobu 3 hodin a koncentruje se ve vakuu do sucha. Zbytek se míchá ve vodě (10 ml) obsahující NaHCO₃ (50 mg) při 5 °C za vzniku čirého roztoku, který se dialyzuje proti vodě po dobu 3 dnů, lyofilizuje se za zisku požadované sloučeniny (9 mg, 86%) jako bílé pevné substance obsahující 17 mol% óxyacetamidomethylenbenzenu, jak je stanoveno ^-1H-ŇMR.

Do roztoku polymeru (5 mg, 0,0239 mmol) ve vodě (0,2 ml) se přidá l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid, hydrochloridová sůl (8 mg, 0,04 mmol) a sulfo-N-hydroxysukcinimid (8,7 mg, 0,004 mmol). Směs se míchá při pokojové teplotě po dobu 20 minut, potom se kombinuje s roztokem sloučeniny 2a (1 mg, 0,0021 mmol) a 4-dimethylaminopyridinem (3 mg, 0,024 mmol) v

	66		44	•	• a	• 4
* «	6	•	•	V	4 ·	4 4
4 ·	6	•	•	« ··	4 4	4 4
• 6	•	6	4	4 6	* ·	«
• »	• 4		• ·	• 6	a a	ta

pyridinu (0,1 ml). Reakční směs. se třepe při pokojové teplotě po dobu 3 hodin a odpaří se do sucha. Zbytek se smísí s 1¾ roztokem NaHCO₃ (5 ml) za vzniku čirého roztoku. Po dialýze ve vodě po dobu 24 hodin se roztok lyofilizuje za zisku titulního polymeru jako bílé pevné substance (4,5 g, 84%).

Titrací kyselinou a ^H-NMR (D₂0) se stanooví, še polymer obsahuje 17 mol% benzylaminu, 3 mol% GG167 ((7-oxyacetamidohexylaminokarbonyloxy-4-guanidino-Neu5Ac2en) a 20 mol% ace.tatu na 100 glukosových jednotek nosiče. Molekulová hmotnost polymeru byla stanovena na 683 kDa a průměrná molekulová hmotnost pro polymerický (7-amino-hexylaminokarbonyloxy-4-guanidino-Neu5Ac2en na 7420.

Příklad 11: Příprava polymerického multivalentního 7-(6^(6^[6 ' ' ¹ (6'''' (6'''¹'-aminokaproyl)-aminokaproyl)-aminokaproyl]-aminokaproyl}-aminohexyl}-karbamoyloxy-4-guanidino-Neu5Ac2enu (14 mol%) na oxidovaném dextranu/500 kDa

Do roztoku dextranu (molekulová hmotnost 500000) (20 mg, 0,123 mmol) (podle jednotky o molekulové hmotnosti 162)) ve vodě (0,4 ml) v ledové lázni se po kapkách přidá jodistan sodný (15,6 mg, 0,073 mmol) ve vodě (0,4 ml). Reakční směs se mísí při 5 °C po dobu 2 hodin, potom se mísí při pokojové teplotě po dobu 2 hdin. Výsledná'směs se ředí vodou (1,2 ml) a nechá se projít přes Sephadex G-25 kolonu (10 ml). Kolona se eluuje vodou (3 ml).

Eluat se suší sublimací ze zmrazeného stavu za zisku Částečně oxidovaného dextranu (18 mg, 90%) jako bílé pevné substance.

Do roztoku výše oxidovaného dextranu (3 mg, 0,018 mmol) ve vodě (0,6 ml) se přidá hydrogenuhličitan sodný (15 mg, 0,178 mmol) a sloučenina 2c ve formě TFA soli (6 mg, 0,0057 mmol). Směs

A « • 4	II	* •	• 4 » · • »	• « • «44	• 4	• » « ♦ 4 >
• 4	4 •
A ·		•	• i	• 4		*	- 4
B	··		4 A	94	44		4 4

se mísí při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny, potom se mísí při teplotě ledové lázně. Do této chladné směsi se po částech přidá kyanborohydrid sodný (100 mg, 1,59 mmol). Reakční směs se mísí při teplotě ledové lázně po dobu 1 hodiny, nechá se stát při teplotě 5 °C po dobu 16 hodin a potom reaguje s větším množstvím kyanborohydridu sodného (100 mg, 1,59 mmol) a mísí se při 5 °C po dobu 1 hodiny, potom při pokojové teplotě po dobu 2 hodin a nakonec se dialyzuje proti vodě po dobu 24 hodin a lyofilizuje se za zisku titulního polymeru (3 mg) jako bílé pevné substance.

Pomocí ^H-NMR (D^O) se stanoví, že polymer obsahuje přibližně 430 molekul 7-{6¹ -{6''-[6¹’'(6'¹'¹ (6¹'''' -aminokaproyl)-aminokaproyl)-aminokaproyl] -aminokaproyl} -aminohexyl} -karbamoyloxy-4-guanidino-Neu5Ac2enu (sloučeniny 2c) na molekulu Částečně oxidovaného dextranu. Proto se určí molekulová hmotnost polymeru na 860 kDa a průměrná molekulová hmotnost pro každou jednotku

4-guanidino-Neu5Ac2enu na 2000.

Příklad 12: Příprava polymerického-multivalentního 7-suberamoy1-hexyl-karbamoyloxy-4-guanidino-Neu5Ac2enu (5 mol%) na polylysinu/

-^ÍJ 70-150 kLDa

Roztok 7-aminohexyl-karbamoyloxy-4-guanidino~Neu5Ac2enu (sloučenina 2a, 6,4 mg, 0,0135 mmol) a disukcinimidylsuberatu (5 mg, 0,0135 mmol) ve směsi pyridinu (0,1 ml) a DMF (0,1 ml) se mísí při 30 °C po dobu 3 hodin a potom se odpaří do sucha ve vysokém vakuu. Zbytek se odebere v etheru (10 ml x 3) a suší se za zisku aktivovaného esteru. Tento se potom kombinuje s roztokem HBr soli polylysinu (molekulová hmotnost 70000 - 150000) (1 mg,

0,0485 mmol) ve směsi vody (0,4 ml), DMSO (0,25 μΐ) , DMF (0,6 ml) a pyridinu (0,4 ml). Výsledná směs se míchá při pokojové teplotě po dobu 10 hodin, potom se dialyzuje proti vodě po dobu 72 hodin. Dialyzát se ředí vodou (10 ml) a před filtrací se zahřeje na 50 • ·· ·· »♦ 99 ·· * · · > Β 9 9 9 • · · * · ··· · β Β • * · C* » ft Β Β · ··« ΒΒ

ΒΒΒ Β Β Β Β · ·*· ·· ·· ·Β ·Β ΒΒ °C. Filtrát se potom lyofilizuje za zisku titulního polymeru jako bílé pevné substance (5 mg).

Pomocí ^H-NMR (D^O) se stanoví, že polymer obsahuje 5 molekul 7-suberamoyl-hexyl-karbamoyloxy-4-guanidino-Neu5Ac2enu na 100 lysinových jednotek nosiče. Proto se stanoví průměrná molekulová hmotnost pro jeden polymerický 4-guanidino-Neu5Ac2en na 5140.

Příklad 13; Příprava polymerického-multivalentního 7-{2'-[2''- (2'¹'-aminoethoxy)-ethoxy]/ethyl}-karbamoyloxy-4-guanidino-Neu5Ac2enu (3,2 mol%) na polyglutamové kyselině/ ⁷ ' 50 -* 1OO kDa

Do roztoku sodné soli polyglutamové kyseliny (molekulová hmotnost 50000 - 100000) (10 mg, 0,0657 mmol) ve voodě (0,6 ml) se přidá 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimid, hydrochloridová sůl (9,6 mg, 0,050 mmol) a

N-hydroxysulfo-sukcinimid (10,9 mg, 0,050 mmol). Směs se mísí při pokojové teplotě po dobu 25 minut, potom se kombinuje s roztokem TFA soli 7-{2' - [2 ’ ' - (2'''-aminoethoxy)-ethoxy]/ethyl}-karbamoylóxy-4-guanidino-Neu5Ac2enu (sloučenina 2d, 4,1 mg, 0,0081 mmol) ve vodě (0,1 ml) a pyridinu (0,1 ml) . Výsledná směs se mísí při pokojové teplotě po dobu 2 hodin, potom se dialyzuje proti vodě po dobu 3 dní a nakonec se lyofilizuje. za zisku titulního polymeru (9,5 mg) jako bílé pevné substance.

Pomocí (D^O) se stanoví, že polymer obsahuje 3,2 molekuly 7-{2 ¹ - [2 ’ ’- (2¹''-aminoethoxy)-ethoxy]/ethyl}-karbamoyloxy-4-guanidino-Neu5Ac2enu na 100 jednotek kyseliny glutamové nosiče. Proto se stanoví průměrná molekulová hmotnost pro jeden polymerický 4-guanidino-Neu5Ac2en na 5250.

Příklad 14: Příprava N-hydroxyethylpolyakry1amidu konjugovaného se sloučeninou 2c a křenovou peroxidasou . TFA sůl sloučeniny 2c (6 mg, 0,0057 mmol) se přidá do roztoku pNAS /viz příklad 6, část h) (20 mg, 0,118 mmol NAS) v DMF (1. ml). Do čirého roztoku se přidá triethylamin (20 μΐ) a roztok se mísí při pokojové teplotě po dobu 3 dnů. Polovina výše uvedené reakční směsi se přidá do roztoku křenové peroxidasy (17 mg) ve vodě (4 ml) a směs se nechá poo dobu několika dní při teplotě 4 °C. Do směsi se přidá ethanolamin (0,5 ml 10% roztoku ve vodě) pro utlumení zbývajících polyakrylatových aktivovaných esterů. Po dvou hodinách se reakční směs dialyzuje proti vodě po dobu 3 dní a potom se ďialyzat suší sublimací ze zmrazeného stavu za zisku polymerického konjugatu jako sypkého světle hnědého prášku.

Příklad 15: Určení vazby sloučenin podle předkládaného vynálezu na neuraminidasu chřipkových virů

Dva viry chřipky A a jeden virus chřipky B se použijí pro testování schopnosti vazby sloučenin na úplnou neuraminidasu chřipkových virů. Viry chřipky A jsou A/NWS/34-tern/Australia/ G700/75(H1N9) nebo A/NWS/Tokyo/3/67/HlN2 a virus chřipky B je kmen B/Victoria/02/87. Neuraminidasový test se provede podle postupu uvedeného v literatuře (Potier, M. et al., Anal. Biochem. 1979, 94: 287) a změřené inhibiční konstanty (IC ) jsou uvedeny v tabulce 6.

Inhibiční konstanty pro makromolekuly byly vypočítány podle molekulové hmotnosti na jednotku navázaného GG167 derivátu, například pro polyakrylamid 5c, který má molekulu odvozenou od

GG167 navázanou na 10% akry1amidových jednotek, byla stanovena molekulová hmotnost 1293.

• 4 ·	4 4	4 4	4 4	44
* · 4	4	4	4	4	4- 4	4 4
® 4	4	4	4	4 4 4	4 4	4 4
4 ·	4	4	4	4 4	- 4	4
• M 44			4 4	4 4	4 4'	'4 4

Tabulka 6: Vazebné konstanty pro sloučeniny podle předkládaného vynálezu k neuraminidase chřipkového viru

Slouč.č.	NWS/Tokyo	NWS/G70C	B/Vic/02/87
3a	1 x 10“®	7 x.10“⁹	2 x 10®
3b	2 x 10⁹	2 x 10“⁹	-
3d	1 x 10®	1 x 10“®	-
4a	1 x 10“®	9 x IQ’⁹	2 x 10“®
4b	5 x 10“®	3 x 10“®	1 x 10“⁷
4c	1 x 10“⁷	7 x 10’®	-
4d	1 x 10⁷	1 x 10’⁷	-
5a	3 x 10“®	3 x 10“⁸	-
5b	1 x 10’®	2 x 10“®	-
5c	1 x 10“®	2 x 10“®	-
5d	4 x 10’®	4 x 10“®	-
5e	2 x 10“®	3 x 10“®	-
GG167(I)	1 x 10“⁹	1 x 10“⁹	1 x 10“®
DANA	6 x 10”⁶	6 x io;⁶	-

Příklad 16: Detekce chřipkových virů na ELISA plotnách pomocí sloučeniny č. 4d

Roztok viru (50 μΐ) o přibližně 1 x 10® pfu/ml viru chřipky A ŇWŠ/G70C ve fosfátem puf rovanéni saliňičkém roztoku (PBS) sé přidá přímo do jamek 96-jamkové ELISA (Dynatech) plotny a virus se naváže inkubací přes noc při 4 °C. Po promytí se plotny, blokují PBS-Tween 20 podle běžných postupů a potom se do jedné řady ELISA plotny přidají sériová ředění sloučeniny č. 4d, od 1‘μΜ koncentrace GG167 jednotek do 10^-1° M. Pro kontrolu se sériová ředění biotinylované monoklonální protilátky proti neuraminidase NC10 (L.C. Gruen, J. Immunologicál Methods, 1994, 168: 91) «· A · « · · · v A A • A A * A A · A « A .A A ·«···« * A • II · * A A AA A· A A přidají do jiné řady ELISA plotny. Po inkubaci po dobu 1 hodiny se plotny promyjí pro odstranění nenavázané sloučeniny a potom se virus detekuje za použití Streptavidin-HRPO (Boehringer

Mannheim), za použití ABTS (Sigma) jako chromogenního substrátu a při přibližně 30 minutové inkubaci.

Koncentrace sloučeniny č. 4d vyšší.než 10“⁹ umožňují detekci viru a silnější signál je pozorován při zvyšující se koncentraci sloučeniny. Tak může být přibližně 5 x 10^e virových částic na jamku snadno detekováno za použití sloučeniny č. 4d. Při použití kontrolní biotinylované protilátky se získá stejná hladina signálu.

Příklad 17: Zachycení a detekce komplexu mezi virem chřipky a sloučeninou č. 3a

Pro potažení virových částic derivátem GG167-biotinem se 10 μΐ viru chřipky A NWS/G70C (1 x l0^s pfu/ml) předem inkubuje po dobu 1 hodiny s různými koncentracemi sloučeniny 3a v jamkách jednotlivých řad ELISA plotny. Použijí se poloviční log_:LO ředění sloučeniny 3a, odo koncentrace 1 μΜ GG167 jednotek do 0,00001 μΜ. Komplexy virus-sloučenina se potom přenesou na ELISA plotnu, která je předem potažena avidinem a provede se inkubace po dobu 1 hodiny pro zachycení. Plotny se promyjí v PBS-Tween 20 a zachycený virus se detekuje pomocí polyklonální králičí protilátky proti virovému hemaglutininu za použití běžných technik.

Nej lepší výsledky byly stanoveny pro 0,1 μΜ koncentraci sloučeniny č. 3a, která jasně umožňovala detekci viru při 10^e pfu. Při vyšších koncentracích sloučeniny byl signál slabší, pravděpodobně z důvodů blokování některých avidinových míst volnou sloučeninou č. 3a, zatímco při nižších koncentracích (<

0,001 μΜ) byl detekční signál také slabší, pravděpodobně z důvodů nemožnosti vazby sloučeniny na všechny virová Částice.

Příklad 18: Přímá detekce konjugatu virus chřipky - GG167 protein - biotin pomocí Streptavidinu - křenové peroxidasy

Při použití stejného postupu, jako je popsán v příkladu 17, výše, a za použití sloučeniny 4d, je také pozorována přímá detekce navázaného viru za použití streptavidinu-křenové peroxidasy, místo protilátky proti hemagglutininu.

Příklad 19: Inhibice hemaglutinace způsobené chřipkovým virem pomocí makromolekul podle předkládaného vynálezu

Sloučeniny podle předkládaného vynálezuse testují na schopnost inhibovat hemaglutinaci (HAI) kmenů chřipky X-31 (H3N2), G70C a Tokyo A, za použití standardních metod popsaných v literatuře (viz například J. Amer. Chem. Soc. 1997, 119: 7103 a odkazy zde citované). HAI test se provede za použití roztoků polymerických GG167 konjugatů v PBS, které se dvakrát sériově ředí ve 12 jamkách mikrotitrační plotny. Suspenze viru, ředěná na 4 HA jednotky v PBS, se přidá do jamek. Po dvou hodinách při 4 °C se do každé jamky přidá 0,5% suspenze kuřecích erytrocytů. Po jedné hodině při 4 °C se určí nejnižší koncentrace inhibitoru, která brání aglutinači erytrocytů. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 7.

Tabulka Ί

Sloučenina Č.	Nejnižší koncentrace (μΜ GG167 jednotek), která inhibuje aglutinaci
	G70C	Tokyo	X-31
Polyakrylamid (předpokl.	187,5	187,5	93,75
molekulová hmotnost
20000, nesubstituovaný)
5f	7,8	7,8	7,8
5g	11,7	31,25	23,4
6c	2,93	--	3,91
Fetuin (kontrola)	0,73	5,86	<0,48

Příklad 20: Inhibice replikace chřipkových virů makromolekulami podle předkládaného vynálezu

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu se testují na schopnost inhibovat replikaci viru A chřipky za použití standartní metody, která byla popsána v literatuře (viz například Watanabe et al., J. Virological Methods, 1994, 48: 257). Test se provede za použití MDCK buněk a výsledky jsou uvedeny v tabulce 8, dále. Výsledky jsou uvedeny jako minimální koncentrace sloučeniny, která inhibuje cytopatický efekt o 50% (ID_so ^g/ml)) , jak byly určeny za použití programu regresní analýzy pro semilogaritmickou křivku. Výsledky ukazují, že všechny makromolekuly, které mají na sebe navázané deriváty GG167, jsou aktivnější proti chřipkovému viru než nesubstituované skelety samotné. Výsledky také ukazují, že mnohé polymerické sloučeniny jsou aktivnější než jednoduché monomerické ligandy (sloučenina 2c), zejména je-li výpočet proveden na základě molární

4	4 4		44	44	4« 44
*4 4	4	•	«	*	4 * ·
• 4	4	4	4	4 44	4 4 4
' * ·	4		•	4 4	...
44 4	• 4		• 4	4 4	‘ 44 ·*

koncentrace GG167 jednotek. Terapeutický index pro každou sloučeninu se vypočítá dělení minimální cytotoxické koncentrace léku (MTC) ID_so.

» » • · · * · «·· ···

Tabulka 8

Sloučenina {molekulová hmotnost na GG167 jednotku)	ID_so (jxg/ml)	MTC	Terapeutický index
GG167 (332)	<0,32	>100	>312,5
2c (1040)	3,00	>100	>32,8
3d (10000)	1,24	>100	>80,9
5a (1451)	<0,32	>100	>312,5
5g (2400)	1,48	>100	>67,4
5h (4500)	1,22	>100	>81, 8
5i (5000)	1,11	>100	>89,6
5j (4000)	3,20	>100	>31,2
5k (4500)	0,46	>100	>215,6
Polyakrylamid	94,70	>100	>1,06
(ne subs t i tuováný)
6a (5770)	26,70	>100	>3,75
6c (5700)	0,31	>100	>322,3
6d (6800)	3,00	>100	33,3
6e (8480)	21,90	>100	4,56
6f (7270)	7,20	>100	>13,9
6g (11750)	43,60	>100	>2,29
6h (17850)	23,60	>100	>4,24
6i (nesubstituovaný	>100	>100	-
benzyldextran)
6j (nesubstituovaný	>100	>100	-
benzyldextran)
Příklad 11 (1980)	<0,32	>100	>312,5
Příklad 12 (5140)	0,45	100	221,1
Příklad 13 (5250)	0,39	>100	>258,7
Ribavirin	1,0 - 2,6	>32	>12,22 - 31,98

• ··· • *

Odborníkům v oboru bude jasné, že vynález byl popsán podrobně pro upřesnění a pochopení a že mohou být provedeny různé modifikace a alterace zde popsaných provedení a způsobů bez narušení rozsahu předkládaného vynálezu.

Odkazy zde citované jsou uvedeny na následujících stranách a jsou do předkládané přihlášky zahrnuty jako odkazy.

Claims

Patentové n ěv o Tr y

1. Makromolekulární sloučenina, na kterou jsou navázány jedna nebo více molekul (vazebných činidel pro neuraminidasu), které se vážou na aktivní místo neuraminidasy chřipkového viru, ale které nejsou štěpeny neuraminidasou.
2. Makromolekulární sloučenina podle nároku l, ve které je vazebné činidlo pro neuraminidasu navázáno na molekulu prostřednictvím mezimolekulové spojovací nebo vazebné skupiny tak,. že vazebné činidlo pro neuraminidasu není stericky narušeno skeletem makromolekuly.
3. Makromolekulární sloučenina podle nároku 1 nebo nároku 2, kde vazebné Činidlo pro neuraminidasu má IC 1O^_G M nebo nižší .
4. Makromolekulární sloučenina podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3, kde vazebné činidlo pro neuraminidasu je derivát kyseliny sialové.
5. Makromolekulární kyseliny sialové je sloučenina podle nároku 4, kde. sloučenina sloučenina (I)

Sloučenina (I) GG167 která je funkcionalizováná v 7-pozici struktury kyseliny sialové.
6. Makromolekulární sloučenina podle jakéhokoliv z nároků l až 5 vzorce (II):

• ·

9· * * * · » « · ··· • · · «· ·· ♦ · ·* • · · ·

Φ · .· **· Φ · Φ . - · . ·

Φ· · (Χ-Υ) -Μ-(Ζ) (II) η τη kde X je derivát kyseliny 2,3-dehydro-sialové (2) s vazebnou schopností pro neuraminidasu, (2) který je navázán v 7-pozici prostřednictvím mezimolekulové spojovací skupiny Y na makromolekulu M, a Z je volitelný extra-substituent na makromolekule, kde mezimolekulová spojka Y zprostředkuje vazbu na W skupinu, kde R představuje azido-skupinu, nesubstituovanou nebo substituovanou guanidinovou skupinu, nebo nesubstituovanou nebo substituovanou amino-skupinu;

R^a je vybrán ze skupiny zahrnující COCH₃, COCF_a, SO₂CH₃ nebo SO CF ;

W je vybrán ze skupiny zahrnující O(C=O)NH, O(C=S)NH,

NH(C=O)NH nebo NH(C=S)NH a je připojen prostřednictvím NH na skupinu Y;

m je celé číslo vybrané z 0 až 1000; a n je celé číslo vybrané z 0 až 1000.

mezimolekulová spojovací skupina Y je volitelně substituovaný řetězec o až 1000 atomech vybraných z uhlíku, dusíku, kyslíku a síry,, a makromolekula M je syntetický nebo přirozený polymer, protein, protilátka nebo enzym o molekulové hmotnosti od 10⁴ do 10⁷, který je kovalentně nebo nekovalentně navázán na spojovací skupinu Y.
7. Makromolekulární sloučenina podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3

«9 9 9 9« • 9 9 9 • · 9 • 9 • 9 9 9 9 • * 9 9 • • 99 9 9 9 « 9 9 9 9 • 9 . 9 9 9 9 9 9 99 99 99 9»

vzorce (IIA) (X’-Y) -M-(Z) (IIA) n m kde X' je cyklohexenylový derivát s vazebnou schopností pro neuraminidasu vzorce (2a) který je navázán přes etherový postraní řetězec, kde R, R², Y, n a m jsou stejné, jak jsou definovány v nároku

6, a

R¹ a W' jsou lipofilní C₁-C_X2 alkylové nebo alkylenové skupiny, které jsou volitelně substituované jedním nebo více atomy halogenu nebo alkoxy, halogenalkoxy nebo volitelně substituovanou arylovou skupinou.
8. Makromolekulám! sloučenina podle nároku 6 nebo 7, ve které je Z skupina, která váže hemagglutinin.
9. Makromolekulám! sloučenina podle nároku 6 nebo 7, ve které je Z skupina, která může být detekovatelnou značkou.
10. Makromolekulám! sloučenina podle nároku 7, ve které je Z biotin nebo fluorescentní molekula.
11. Makromolekulám! sloučenina podle nároku 6 nebo 7, ve které je Z enzym vhodný pro použití v detekčním testu.
12. Makromolekulami sloučenina podle nároku 6 nebo 7, ve které je Z skupina s koncovou funkcí, která je vhodná pro vazbu makromolekuly na povrch.
13. Makromolekulární sloučenina podle nároku 12, ve které je Z NH , SH, CO H, CHO nebo CH=CH .
14. Makromolekulami sloučenina podle jakéhokoliv z nároků 6 až 13, ve které je mezimolekulová spojovací, skupina Y vybrána ze skupiny zahrnující aminoalkylové skupiny, (póly)aminokyseliny, lineární peptidy, oligosacharidy a polysacharidy, polyethylenglykolové jednotky a aminodialkylmočoviny, z nichž může být jakákoliv skupina použita samostatně, nebo v kombinaci.
15. Makromolekulární sloučenina podle nároku 14, kde Y má koncovou amino skupinu.
16. Makromolekulární sloučenina podle jakéhokoliv z nároků 6 až 15, ve které je makromolekula M vybrána ze skupiny zahrnující , proteiny, enzymy, protilátky, syntetické polymery rozpustné ve , vodě, polysacharidy a polyaminokyseliny.
17. Makromolekulární sloučenina podle jakéhokoliv z nároků 6 až 15, ve které je makromolekula M vybrána ze skupiny skládající se ze sérového albuminu (BSA), křenové peroxidasy CHRP), avídinu, streptavidinu nebo neutravidinu a imunoglobulinů.
18. Makromolekulární sloučenina podle jakéhokoliv z nároků 6 až 15, ve které je makromolekula M vybrána ze skupiny skládající se z polysacharidů, polyakrylamidů, pólyethylenglykolů, polymočovin, polykyselin, polyesterů, polyamidů a N-(2-hydroxy-propyl)methakrylamidu (HMPA), kde uvedená makromolekula je farmaceuticky přijatelná.

o •» · o · · · « · « · · »·» «·· · · · · · «·« *» »* · ·
19. Makromolekulám! sloučenina podle jakéhokoliv z nároků 6 až 18, kde R je guanidino- nebo amino- skupina substituovaná skupinou vybranou z methyl, ethyl, allyl, amino, kyano nebo nitro skupiny.

í’
20. Makromolekulám! sloučenina podle nároku 6, ve které je X sloučenina vzorce (2), kde

R je guanidín, R² je acetyl, W je skupina O(=CO)NH a spojka Y je řetězec tvořený 6 až 60 atomy uhlíku, dusíku a kyslíku.
21. Způsob pro detekci chřipkového viru vyznačuj ící setím, že obsahuje krok reakce vzorku, který je podezřelý z toho, že obsahuje uvedený virus, se sloučeninou podle jakéhokoliv z nároků 1 az 20, která je schopná specifické vazby na aktivní místo neuraminidasy chřipkového viru.
22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že sloučenina je navázána na povrch kovalentní vazbou nebo nespecifickou vazbou a že mezimolekulová spojovací skupina Y je . dostatečně dlouhá pro to, aby byly vazebné jednotky pro neuraminidasu vystaveny na povrchu makromolekuly M a byly přístupné pro virovou částici.
23. Způsob podle nároku 21 nebo 22 vyznačující se tím, že jím je selektivní záchytný test, selektivní detekční test, nebo kombinovaný selektivní záchytný - selektivní detekční test.
24. Farmaceutický prostředek pro léčbu chřipky A nebo chřipky B vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle předkládaného vynálezu, výhodně sloučeninu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 7, 13, 14 a 18 až 20, nebo její farmaceuticky přijatelný derivát, spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem, ve .1 ,Γ ·0 •» • ··· ·· · • « « · ··· ·· · « ·* ·· 9 9 · 9 ·· ·'·· ««« 99 ·· ** <· ·· kterém má sloučenina ID___o pro neuraminidasu menší než 5 Mg/ml.
25. Prostředek podle nároku 24 vyznačující se tím, že sloučenina je sloouČenina podle nároku 6 nebo 7.
26. Prostředek podle nároku 24 nebo 25 vyznačující se tím, že dále obsahuje jedno nebo více jiných terapeuticky aktivních činidel.
27. Prostředek podle nároku 26 vyznačující se tím, že jiným terapeuticky aktivním činidlem je anti-virové činidlo.
28. Způsob pro léčbu chřipkové infekce u savců, včetně lidí, vyznačuj ícísetím, že obsahuje krok podání účinného množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu, výhodně sloučeniny podle jakéhokoliv z nároků 1 až 7, 13, 14 a 18 až 20, nebo jejího farmaceuticky přijatelného derivátu, savců, kteří potřebují takovou léčbu, kde sloučenina sloučenina má ID_so pro neuraminidasu menší než 5 Mg/ml. . .
29. Použití sloučeniny podle jakéhokoliv z nároků 1 až 7, 13, 14 a 18 až 20 pro výrobu prostředku pro léčbu infekce chřipkovými viry, kde sloučenina má ID_so pro neuraminidasu menší než 5 μ$/να1.