CZ166796A3 - Encoded dna for an enzyme, bacterium of escherichia coli strain and process for preparing l-lysine - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká kódové DNA pro enzym dihydrodipikolinát systetázu, bakterií z rodu Escherichia ccii a způsobu výroby L-lysinu fermentací.

Dosavadní stav techniky

V případě, že se L-lysin vyrábí fermentativními postupy, užívají se mikrobiální kmeny, izolované z přírodního prostředí nebo také mutované kmeny, získané z takových přirozených kmenů ke zvýšení produktivity postupu. Je známo velké množství umělých mutovaných kmenů, produkujících L-lysin. Většina z nich jsou mutované kmeny, odolné prodi působení S-2-aminoethylcysteinu, AEC a náležejí dc rodů Srevibacterium, Corynebacterium, Bacillus nebo Escherichia. Mimoto byly pro zvýšení produkce aminokyselin navrženy různé postupy, například s použitím transformovaných kmenů s užitím rekombinantní DNA, například podle US 4 278 765.

Pokud jde o bakterie, které je možno řadit do rodu Escherichia, popisuje například zveřejněná japonská patentová přihláška č. 56-18596, US č. 4 346 170 a publikace Applied Microbiology and Biotechnology, 15, 227 - 231, 1982 způsob produkce L-lysinu při použití bakteriálního kmene se zvýšeným množstvím dihydrodipikolinátsyntetázy (enzym se někdy označuje zkratkou DDPS). Avšak DDPS, použitá v těchto případech je divokého typu a postup proto trpí inhibici produkce L-lysinu v důsledku zpětné vazby. Nebylo proto možno dosáhnout dostatečné produktivity pro produkci L-lysinu. Publikace Applied Microbiology and Biotechnology, 15, 227 - 231,

1982 popisuje výrobu L-lysinu, při níž je možno získat 3 g/1 L-lysinhydrochloridu z 75 g/1 glukosy, přičemž koeficient spotřeby (počet gramů L-lysinu, získaný z 1 g cukru) je 0,04 nebo 4 %.

Na druhé straně zveřejněná korejská patentová přihláš ka č. 92-8382 popisuje způsob výroby L-lysinu při použití bakterie z rodu Escherichia, současně se vsak užije DDPS z bakterií, náležejících do rodu Corynebacterium, u tohoto rodu totiž nedochází k inhibici produkce L-lysinu na základě zpětné vazby (koeficient spotřeby je 17 %). Avšak horní hranice teploty, při níž ještě mohou růst bakterie z rodu Corynebacterium, je přibližně c 10 °C nižší než horní hranice teploty, při níž mohou růst bakterie z rodu Escherichia. To znamená, že kultivaci by bylo zapotřebí uskutečnit při nižší teplotě v případě, že se do mikroorganismu z rodu Escherichia zavádí kodová DNA pro DDPS z bakterie z rodu Coryr.ebacterium, má-li být tento mikroorganismus využit pro výrobu L-lysinu. Lze tedy přepokládat, že bude obtížné využít výhody bakterií rodu Escherichia při jejich testování při vyšší teplotě, při níž je růst těchto bakterií rychlý a rychlost produkce L-lysinu je proto také vysoká. Obvykle v případě, že dochází k expresi genu z heterologního organismu, může docházet k rozkladu produktu této exprese proteázou a ke tvorbě nerozpustného inkuzního tělíska. Obecně to znamená, že je zapotřebí počítat s většími obtížemi než v případě exprese homologního genu. Mimoto v případě, že se kodová DNA pro DDPS z bakterií rodu Corynebacterium přenese do bakterií rodu Escherichia za účelem průmyslové produkce L-lysinu, je zapotřebí dodržet přísnější předpisy než při použití homolog ního genu, tak jak to odpovídá obecným předpisům pro použití DNA, získané rekombinací.

Dihydrodipikolinátsyntetáza, DDPS je enzym, který dehydratuje a kondenzuje semialdehyd kyseliny asparagové a kyseliny pyrohroznové za vzniku kyseliny dohydrodipikolinové. Tato reakce tedy probíhá na počátku systému pro biosyntézu L-lysinu ve skupině kyseliny asparagové. Je známo, že uvedený enzym má své důležité místo jako aspartokináza v bakteriích z rodu Escherichia.

Pro DDPS je kódovým řetězcem gel, označovaný dapA v Escherichia coli. Tento gen byl klonován a byl také stanoven · jeho nukleotidový řetězec, který byl popsán v Richaud F. a další, J. Bacteriol., 297, 1986. »

Aspartakináza (někdy se uvádí zkratkou AK) je enzym, který katalyzuje reakci, při níž dochází k přeměně kyseliny asparagové na kyselinu beta-fosfoasparagovou, která je hlavním řídícím enzymem v biosyntetickém systému aminokyselin ze skupiny kyseliny asparagové. E. coli obsahuje tři typy tohoto enzymu, AKI, AKII a AKIII, dva z těchto enzymů jsou komplexní enzymy s homoserindehydrogenázou, HD. Jeden z těchto enzymů je AKI-HDI, kódem pro tento enzym je gen thrA, druhým z těchto enzymů je AKII-HDII a kódovým řetězcem je gen metLM. AKI je potlačena threonir.em a isoleucinem a k její inhibicí může dojít působením threoninu, kdežto k potlačení AKII může dojít v přítomnosti methioniny.

Je známe, že pouze AKIII je enzymem s jedinou funkcí.

Jde o produkt genu, označovaného jako LysC a k potlačení a zpětné inhibicí L-lysinem může ve většině případů docházet.

Poměr nitrobuněčné účinnosti uvedených enzymů je přibližně AKI:AKII:AKIII =5:1:4.

Jak již bylo uvedeno, DDPS z bakterií, náležejících k rodu Corynebacterium nepodléhá inhibicí L-lysinem v důsledku zpětné vazby. Avšak v případě, že se kódový řetězec'pro tento enzym uloží do bakterií, náležejících k rodu Escherichia za účelem využití pro výrobu L-lysinu, vzniká problém, týkající se teploty při kultivaci získaného mikroorganismu.

Je možno ocekavat, ze L — lysin je možno ucmne produkovat fermentací při využití bakterií z rodu Escherichia v případě, že by bylo možno získat mutovaný enzym DDPS nebo AKIII, který by pocházel z bakterie rodu Escherichia, nepodléhající inhibici L-lysinem v důsledku zpětné vazby. Takový mutovaný enzym však v případě DDPS ještě nebyl v literatuře popsán a přestože existuje jeden literární údaj, týkající se mutovaného enzymu AKIII v publikaci Boy E. a další, J. Bacteriol., 112, 84, 1972, dosud není znám žádný příklad, potvrzující, že by takovým mutovaným enzymem bylo možno zlepšit produktivitu výroby L-lysinu.

Podstata vynálezu

Na základě svrchu uvedených úvah byly vyvíjeny snahy získat DDPS a AKIII z bakterií rodu Escherichia s dostatečnou desensitizací inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby a tak dosáhnout při výrobě L-lysinu fermentací zvýšené produktivity ve srovnání se známými postupy.

V důsledku pracných a opakovaných zkoušek bylo nakonec možno získat kódovou DNA pro DDPS z bakterie z rodu Escherichia s dostatečnou desenzitizaci inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby. Kódová DNA pro DDPS z Escherichia coli s desenzitizací inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby se někdy označuje jako mutanta dapA nebo dapA .

Dále byla získána bakterie z rodu Escherichia, obsahující uvedenou mutantu dapA a aspartokinázu se svrchu uvedenými vlastnostmi, pokud jde o inhibici L-lysinem. Kódová DNA pro aspartokinázu z Escherichia coli, v níž je rovněž zpětná inhibice L-lysinem dostatečně odstraněna se někdy uvádí jako mutanta lysC nebo lysC*.

Dále byla získána bakterie z rodu Escherichia, obsahující mutantu dapA i mutantu lysC. Bylo prokázáno, že pěstování takové bakterie ve výhodném živném prostředí je možno produkovat a v živném prostředí nahromadit velmi značné množství L-lysir.u.

Mimoto bylo prokázáno, že produktivitu při výrobě L-lysinu uvedenými postupy je možno ještě dále zlepšit zařazením dalších genů do systému pro biosyntézu L-lysinu v bakteriích z rodu Escherichia, které již obsahují mutantu dapA i mutantu lysC.

Podstatu vynálezu tedy tvoří kodová DNA pro enzym dihydrodipikolinátsyntetázu z bakterie, náležející do rodu Escherichia s muzací, při níž dochází k desenzitizaci inhibice produkce L-lysinu v důsledku zpětné vazby. Jako příklad mutace z této skupiny je možno uvést mutaci, při níž je nahrazen zbytek alaninu v poloze 81 zbytkem valinu, mutace, při níž je nahrazen zbytek histidinu v poloze 118 zbytkem tyrosinu a mutace, při níž je zbytek alaninu v poloze 81 nahrazen zbytkem valinu a současně je zbytek histidinu v poloze 118 nahrazen zbytku tyrosinu, počítáno od N-terminálního konce řetězce aminokyselin pro enzym dihydrodipikolinátsyntetázu, tak jak je dále uveden jako řetězec č. 4.

Podstatu vynálezu tvoří také bakterie z rodu Escherichia, transformovaná kódovou DNA pro enzym dihydrodipikolinátsyntetázu z bakterie rodu Escherichia a obsahující mutaci, která způsobuje desenzitizaci innibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby. Tato mutace může být například mutace, při níž dochází k náhradě alaninového zbytku v poloze 81 zbytkem valinu, mutace, při níž dochází k náhradě zbytku histidinu v poloze 118 zbytkem tyrosinu a mutace, při níž je zbytek alaninu v poloze 81 nahrazen zbytkem valinu a současně je zbytek zbytkem cyrosinu, počítáno aminokyselin pro uvedený enřetězců zařazen jako řetězec histidinu v poloze 118 nahrazen od N-terminálního konce řetězce zym, který bude dále v seznamu č . 4.

Součást podstaty vynálezu tvoří také bakterie z rodu Escherichia, produkující enzym asparokinázu, rovněž odolný proti inhibici L-lysinem v důsledku zpětné vazby. Aby produkovala bakterie z rodu Escherichia aspartokinázu s uvedenými vlastnostmi, je nutno uložit do buněk takového mikroorganismu kódovou DNA pro aspartokinázu III z bakterií rodu Escherichia s mutací, která způsobuje desenzicizaci inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby.

Mutace asparcokinázy III k dosažení svrchu uvedeného účelu spočívá například v náhradě glycinového zbytku v poloze 323 zbytkem kyseliny asparagové nebo může být zbytek glycinu v poloze 323 nahrazen zbytkem kyseliny asparagové a současně může být zbytek glycinu v poloze 408 nahrazen rovněž zbytkem kyseliny asparagové, další možná mutace s požadovaným výsledkem spočívá v náhradě zbytku argininu v poloze 34 zbytkem cysteinu a současně v náhradě zbytku glycinu v poloze 323 zbytkem kyseliny asparagové, další vhodnou mutací je náhrada zbytku leucinu v poloze 325 zbytkem fenylalaninu nebo je možno nahradit zbytek methioninu v poloze 318 zbytkem isoleucinu, další mutací s požadovaným výsledkem je náhrada methioninového zbytku v poloze 318 zbytkem isoleucinu a současně náhrada zbytku valinu v poloze 349 zbytkem methioninu, dále je možno uskutečnit mutaci, při níž je zbytek šeřinu v poloze 345 nahrazen zbytkem leucinu, mutaci, při níž je zbytek valinu v poloze 347 nahrazen zbytkem methioninu, mutaci, při níž je zbytek threoninu v poloze 352 nahrazen zbytkem iso leucinu, mutaci, při níž je zbytek threoninu v poloze 352 nahrazen zbytkem isoleucinu a současně je zbytek šeřinu v poloze 369 nahrazen zbytkem fenylalaninu, mutaci, při níž je zbytek kyseliny glutamové v poloze 164 nahrazen zbytkem lysinu nebo mutaci, při níž je zbytek methioninu v poloze 417 nahrazen zbytkem isoleucinu a současně je zbytek cysteinu v poloze 419 nahrazen zbytkem tyrosinu, počítáno vždy od N-terminálního konce řetězce aminokyselin pro aspartpkinázu III, tak jak je definován řetězcem č. 8 v seznamu řetězců.

Kódovou DNA pro dihydrodipikolinátsyntetázu z bakterií z rodu Escherichia s mutací, způsobující desenzitizaci inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby a kódovou DNA pro aspartokinázu III, mutovanou za týmž účelem je možno uložit na chromosom bakterie z rodu Escherichia nebo do buněk při použití jediného plasmidu nebo oddělených plasmidů pro DNA pro každý z uvedených enzymů. Je také možno uložit jednu z uvedených DNA na chromosom a druhou DNA ve formě plasmidu.

Součást.! řešení je rovněž získání bakterií z rodu Escherichia s výhodným uložením genu pro dihydrodipikolinát reduktázu. Zvýhodnění tohoto genu je možno dosáhnout tak, že se k transformaci užije rekombinantní DNA, konstruovaná vazbou genu pro dihydrodipikolináthydrolázu na vektor s autonomní možností replikace v buňkách bakterií, náležejících do rodu Escherichia.

Součástí podstaty vynálezu jsou také bakterie z rodu Escherichia s výhodně uloženým genem pro diaminopimelátdehydrogenázu z coryneformních bakterií, například z 3revibacterium lactofermentum. Výhodné uložení genu pro diaminopimelátdyhydrogenázu ze svrchu uvedených bakterií je možno uskutečnit tak, že se k transformaci užije rekombinantní DNA, získaná vazbou genu na vektor s autonomní možností replikace v bakteriích, náležejících k rodu Escherichia. Z coryneformních bakterií je možno uvést některé divoké kmeny, produkující kyselinu glutamovou a mutované kmeny, produkující jiné aminokyseliny a náležející do rodu Corynebacterium nebo do rodu Brevibacterium. Jako příklad bakterií, použitelných pro účely vynálezu je možno uvést Brevibacterium flavum, Brevibacterium divaricatum, Corynebacterium glutamicum a Corynebacterium lilium a také Brevibaccerium lactofermentum.

Součást podstaty vynálezu tvoří také bakterie z rodu Escherichia s obsahem výhodně uloženého genu pro sukcinyldiaminopineláttransamilázu a genu pro sukcinyldiaminopimelátdeacylázu místo svrchu uvedeného genu pro diaminopimelátdehydrogenázu. Výhodného uložení je možno dosáhnout tak, že se k transformaci užije jediná rekombinantní DNA nebo dvě takové DNA, zkonstruované vazbou uvedených genů na stejné nebo odlišné vektory s možností autonomní replikace v bakteriích z rodu Escherichia.

Podstatu vynálezu tvoří také způsob výroby L-lysinu, při němž se pěszuje kterákoliv ze svrchu popsaných bakterií z rodu Escherichia ve vhodném živném prostředí do nahromadění L-lysinu v kultuře s následnou izolací L-lysinu z fermentační kultury.

V průběhu přihlášky bude kodová DNA pro DDPS nebo AKIII nebo DNA s obsahem promotoru někdy označována jako DDPS gen nebo AKIII gen. Mimoto může být mutovaný enzym s desenzitizovanou inhibicí L-lysinem v důsledku zpětné vazby označován jako mutovaný enzym a kódová DNA pro tento enzym nebo DNA, navíc obsahující promotor může být označována jako mutovaný gen. Pokud jde o desenzitízaci, znamená to pouze, že inhibice byla dostatečně odstraněna, pro účely vynálezu není nezbytné, aby byla odstraněna úplně.

V dalších odstavcích budou podrobněji popsány jednotlivá výhodná provedení vynálezu.

1- Kódová DNA pro mutantu dihydrodipikolinátsyntetázy,

DDPS podle vynálezu

Kódová DNA pro mutovanou DDPS podle vynálezu obsahuje mutace, způsobující desenzitizaci inhibice DDPS L-lysinem v důsledku zpětné vazby. Jde o DDPS z bakterií z rodu Escherichia, zvláště o DDPS z Escherichia coli. Jako mutace DDPS ke svrchu uvedené mu účelu je možno uvést:

1) Mutaci, při níž je zbytek alaninu v poloze 81 nahrazen zbytkem valinu,

2) mutaci, při níž je zbytek histidinu v poloze 118 nahrazen zbytkem tyrosinu a

3) mutaci, při níž je zbytek alaninu v poloze 81 nahrazen zbytkem valinu a mimoto je zbytek histidinu v poloze 118 nahrazen zbytkem tyrosinu, počítáno od M-terminálního konce DDPS v řetězci aminokyselin pro tento enzym, který bude dále v seznamu řetězců uveden jako řetězec č. 4.

Výběr kódové DNA pro divoký typ DDPS není nijak zvláště omezen za předpokladu, že běží o kódový řetězec pro DDPS z bakterie, která náleží do rodu Escherichia, takový řetězec je například uveden jako řetězec č. 4a dále konkrétně definován řetězcem baží č. 272 až 1147 v řetězci baží, který bude dále uveden jako řetězec č. 3. V těchto řetězcích jsou řetězce podle vynálezu takové řetězce, které v nukleotidovém řetězci obsahují mutaci, způsobující náhradu zbytků aminokyselin ve svrchu uvedeném smyslu za vzniku mutovaného enzymu podle vynálezu. Je možno užít jakýkoliv kodon, odpovídající zbytku aminokyseliny, který má být do řetězce uložen, jediným předpokladem je, aby šlo o kód pro uvedený zbytek aminokyselin.

Mimoto je možno předpokládat, že se jednotlivé řetězce DDPS budou od sebe poněkud lišit v závislosti na rozdílech mezi jednotlivými čeleděmi a rody bakterií, avšak takové řetězce, které obsahují vypuštěné nebo přidané zbytky aminokyselin v polohách, na nichž účinnost enzymu nezávisí, jsou rovněž zahrnuty do rozsahu vynálezu.

Mutovaný gen je možno získat následujícím způsobem. Nejprve se uskuteční mutace kodové DNA pro divoký typ DDPS nebo se vytvoří gen s příslušnou mutací in vitro a získaný řetězec DNA s příslušnou mutací se pak uloží do vektoru, vhodného pro zvoleného hostitele a takto připravená DNA se užije k transformaci hostitelského mikroorganismu za vzniku transformovaných bakterií. Z transformantu se izolují ty kolonie, u nichž dochází k expresi mutované DDPS, což je důkazem, že transfcrmant obsahuje mutovaný gen. Je také možno postupovat tak, že se uloží do vektoru, vhodného pro zvoleného hostitele DNA s obsahem divokého typu DDPS nebo genu pro DDPS s jinou mutací. Tato DNA se pak podrobí mutaci in vitno a získaná mutovaná DNA se pak použije pro transformaci hostitel ského mikroorganismu za vzniku transformantu. Z těhcot transformantů se pak izoluje kolonie, u níž dochází k expresi mutovaného genu pro DDPS, což je důkazem, že mikroorganismus obsahuje mutovaný gen.

Je také možno postupovat tak, že se mutaci podrobí přímo mikroorganismus, produkující enzym divokého typu za vzniku mutovaného kmene, produkujícího mutovaný enzym a z tohoto mutovaného kmene je pak možno získat mutovaný gen.

Je také možno připravit transformanty, do nichž byla uložena rekombinantní DNA, navázaná na gen divokého typu a pak vytvořit mutovaný kmen, produkující mutovaný enzym. Pak je možno z tohoto kmene rekombinantní DNA izolovat a tak získat mutovaný gen.

Činidlo, užité pro uskutečnění mutace DNA in vitno je například hydroxylamin a podobné látky. Hydroxylamin je chemická látka, kterou je možno vyvolat mutaci z cytosinu na thi„ . 4 min tak, ze se cytosin premeni na N -hyoroxycytosin. V případě, že se má vyvolat mutace přímo u mikroorganismu, je možno použít ultrafialového světla nebo je možno volit chemickou látku, obvykle užívanou pro tyto účely, jako je N-methyl-N -nitro-N-nitroscguanidin, NTG nebo kyselina dusitá.

Jako dárce DNA s obsahem divokého typu genu pro DDPS, popřípadě s další mutací, tak jak bylo svrchu popsáno, je možno užít jakýkoliv mikroorganismus za předpokladu, že náleží dc rodu Escherichía. Je například možno použít mikroorganismy, popsané v publikaci Neidhardt F. C. a další, Escnericnia coli a Salmoneila typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1208, tabulka 1. Jako příklad je možno uvést kmeny Ξ. coli JMloí a MC1061. V případě, že se jako dárce DNA užije mikroorganismus, obsahující gen pro DDPS, je možno získat gen pro divoký typ DDPS,

1) Příprava divokého genu DDPS

Dále bude popsán příklad získání DNA s obsahem genu pro DDPS. Nejprve se pěstuje E. coli s obsahem divokého typu dapA, například kmen MC1061. V případě tohoto pěstování je možno mikroorganismus pěstovat na pevném živném prostředí, avšak s výhodou se mikroorganismus pěstuje v kapalném živném prostředí vzhledem k vyšší účinnosti a možnosti získat větší množství baketerií. Je možno použít živné prostředí, obsahující jeden nebo větší počet zdrojů dusíku, jako extrakt z vasnic, pepton, extrakt z masa, kukuřičný výluh nebo výluh ze sóji nebo pšenice, mimoto má živné prostředí obsahovat anorganické soli, jako dihydrogenfosforečnan draselný, hydrogenfosforečnan draselný, síran hořečnatý, chlorid sodný, chlorid hořečnatý, chlorid železitý, síran železitý nebo síran manganatý a další soli a popřípadě ještě cukry, vitamíny a podobně. Počáteční pH živného prostředí se upraví na hodnotu 6 až 8. Mikroorganismus se pěstuje 4 až 24 hodin při teplo tě 30 až 42, s výhodou 37 °C za provzdušnění a míchání, může jít i třepací kulturu, stacionární kulturu a podobně.

Získaná kultura se odstředí, například při 3000 ot/min po dobu 5 minut, čímž se získá usazenina kmene Ξ. coli MC1061. DNA z chromoso.mů je možno z této usazeniny získat například způsobem podle publikace Saito a Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 519, 1953 nebo způsobem podle publikace K.·

S. Kirby, Biochem. J., 54, 405, 1956.

Aby bylo možnozískat z takto připravené chromosomální DNA gen pro DDPS, připraví se banka chromosomální DNA. Nejprve se tato DNA částečně rozštěpí vhodným restrikčním enzymem za vzniku směsi různých fragmentů. Je možno použít širokou škálu restrikčních enzymů v případě, že je stupeň štěpení řízen dobou štěpení a podobně. Například enzym Sau3AI se nechá reagovat s chromosomální DNA při teplotě nejméně 30, s výhodou 37 °C při obsahu enzymu 1 až 10 jednotek/ml po různou dobu v rozmezí 1 minuta až 2 hodiny.

Pak se získané fragmenty DNA uloží do vektoru, schopného autonomní replikace v bakteriích rodu Escherichia, čímž se připraví rekombinantní DNA. Restrikční enzym, vytvářející na terminální nukleotidové sekvenci zakončení, komplementární k zakončením, která byla vytvořena restrikčním enzymem Sau3AI, použitým k rozštěpení chromosomální DNA, například BamHI se nechá působit na DNA vektoru při teplotě nejméně 30 °C a při koncentraci enzymu 1 až 100 jednotek/ml po dobu nejméně 1 hodina, s výhodou 1 až 3 hodiny k úplnému rozštěpen

Pak se směs fragmentů chromosomální DNA smísí s rozštěpenou DNA vektoru a působí se DNA-ligázou, s výhodou T4 DNA-ligázou při teplotě 4 až 16 °C při koncentraci enzymu 1 až 100 jednotek/ml po dobu nejméně 1 hodiny, s výhodou 6 až 24 hodin, čímž se získá rekombinantní DNA.

Takto získaná DNA se užije k transformaci mikroorganismu z rodu Escherichia, například mutovaného kmene, který neprodukuje DDPS, jako Escherichia coli kmen K-12, s výhodou kmen JE7627 (ponB704, dacB12, pfv⁺, tonA2, dapA, lysA, str, malA38, metBl, ilvH611, leuA371, proA3, lac-3, tsx-76) k získání banky chromosomální DNA. Transformaci je možno uskutečnit například způsobem podle publikace D. M. Monrison, Methods in Enzymology, 68, 326, 1979 nebo postupem, při němž se na transformované bakteriální buňky působí chloridem vápenatým pro zvýšení permeability pro DNA podle publikace Mandel M. a Higa A., J. Mol. Biol., 53, 159, 1970. Kmen JE7627 je možno získat z National Institute of Genetics, Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japonsko.

Bakteriální kmen, obsahující rekombinantní DNA genu pro DDPS se získá z kmenů se zvýšenou účinností DDPS nebo z kmenů, u nichž byl chybějící gen pro DDPS doplněn z banky chromosomální DNA. Mutovaný kmen, jemuž chybí DDPS například vyžaduje kyselinu diaminopimelávou. To znamená, že v případě, že se takto mutovaný kmen užije jako hostitelský mikroorganismus, je možno fragment DNA s obsahem genu pro DDPS získat izolací bakteriálního kmene, který se stane schopným růstu na prostředí, které neobsahuje kyselinu diaminopimelovou a z tohoto bakteriálního kmene je pak možno izolovat příslušnou rekombinantní DNA.

Skutečnost, zda určitý kmen s obsahem rekombinantní DNA, obsahující gen pro DDPS skutečně obsahuje rekombinantní

DNA s klonovaným genem pro DDPS, je možno ověřit tak, že se připraví buněčný extrakt z tohoto kmene a z tohoto extrakzu roztok enzymu tak, aby bylo možno potvrdit nebo vyloučit zvýšení účinnosti DDPS. Účinnost tohoto enzymu je možno měřit způsobem podle publikace Yugari Y. a Gilvarg C., J. Biol. Chem., 240, 4710, 1962.

Rekombinantní DNA s obsahem genu pro DDPS je možno izolovat z DNA vektoru ve svrchu uvedeném bakteriálním kmenu, například způsobem podle publikace P. Guerry a další, J. Bacteriol., 116, 1064, 1973 nebo podle publikace D. B. Clewell,

J. Bacteriol., 110, 667, 1972.

Gen pro DDPS divokého typu je možno získat také tak, že se připraví chromosomální DNA z kmene, v němž se gen pro DDPS nachází na chromosomu, postupuje se způsobem podle publikace Saito a Miura nebo podobně a gen pro DDPS se amplifikuje pomocí PCR-reakce podle publikace White T. J. a další, Trends Genet., 5, 185, 1989. Primery DNA pro použití při amplifikační reakci jsou primery, komplementární k oběma 3 -zakončením DNA s dvojitým řetězcem s obsahem celé oblasti nebo části genu pro DDPS. V případě, že se amplifikuje pouze část genu pro DDPS, je zapotřebí použít takové fragmenty DNA jako primery, aby bylo možno uskutečnit sériové zkoušky s fragmentem DNA, obsahujícím celou oblast z banky chromosomální DNA. V případě, že se amplifikuje celá oblast genu pro DDPS, podrobí se roztok po uskutečnění PCR-reakce včetně fragmentů DNA s obsahem amplifikovaného genu pro DDPS elektroforese na agarosovém gelu a příslušný fragment DNA se extrahuje. Tímto způsobem je možno izolovat fragment DNA, který obsahuje gen pro DDPS.

DNA primery je možno připravit na bázi sekvence, známé pro Escherichia coli podle Richaud F. a další, J. Bacteriol., 297, 1986. Výhodné jsou zejména primery, s jejichž použitím je možno amplifikovat kočovou oblast genu DDPS, obsahující 1150 baží a dva typy primerů, které budou dále uvedeny v seznamu řetězců jako řetězce č. 1 a 2. Tyto příměry je možno syntetizovat běžnými postupy, například fosfoamiditovou metodou podle Tetrahedron Lettens, 22, 1859, 1981 při použití běžně dodávaného syntetizátonu DNA (například Model 380B, Applied Biosystems lne.). Mimoto je možno PCR-reakci provést při použití běžně dodávaného zařízení (například DNA Thermal Cyclen Model PJ2000, Takara Shuzo Co., Ltd.), při použití Taq DNA, polymerázy (Takara Shuzo Co., Ltd.) podle pokynů výrobce.

Při použití genu DDPS, ampiifikovaného pomocí PCR se stávají různé manipulace, například zavedení mutace snadnými v případě, že je tento gen uložen do vektoru, schopného autonomní replikace v bakteriích z rodu Escherichia a vektor je užit k transformaci bakterií z tohoto rodu. Při tomto postupu je možno použít tentýž vektor, způsob transformace i ověření přítomnosti genu pro DDPS jako svrchu.

2) Zavedení mutace do genu pro DDPS

Způsobem, vhodným pro zavedení mutace, například náhrady, zařazení nebo vyjmutí zbytku aminokyseliny je například PCR podle publikace Higuchi R., 61, PCR Technology, Enlich H. A., Eds., Stockton Press, 1989 a cílená mutace podle publikací Kramer W. a Frits H. J., Meth. in Enzymol·., 154, 350, 1987, a Kunkel T. A. a další, Meth. in Enzymol., 154, 367, 1987. Tímto způsobem je možno uskutečnit jakoukoliv určitou mutaci v předem stanoveném místě.

Při chemické syntéze určitého genu je možné zavést náhodnou mutaci do určitého místa.

- LQ Mimoto je možno na gen pro DDPS na chromosomu nebo v plasmidú přímo působit hydroxylaminem podle publikace Hashimoto T. a Sekiguchi M. J., Bacteriol., 159, 1039, 1984. Je také možno použít postupu, při němž se bakterie z rodu Escherichia, obsahující ger. pro DDPS ozařují ultrafialovým světlem nebo je možno užít postup, založený na působení chemických látek, jako N-methyl-iT-nitrosoguanidinu nebo kyseliny dusité. Pomocí těchto postupů je možno zavést náhodné mutace.

Pokud jde o selekci bakterií s mutovaným genem, postupuje se tak, že se nejprve rekombinantní DNA s obsahem fragmentu DNA z genu pro DDPS a DNA vektoru nejprve podrobí vyvolání mutace působením hydroxylaminu a podobně a pak se tato DNA užije například k transformaci E. coli, kmene W3110. Transformované geny se pěstují na minimálním živném prostředí například M9 s obsahem 5-2-aminoethylcysteinu, AEC, jako analogu L-lysinu.Kmeny, obsahující rekombinantní DNA s divokým genem pro DDPS nemohou syntetizovat L-lysin a kyselinu diaminopimelovou DAP a jejich růst je potlačen vzhledem k tomu, že DDPS je po expresi z rekombinantní DNA inhibována působením AEC. Na druhé straně kmen, který obsahuje rekombinantní DNA s obsahem genu pro DDPS, v němž byla innibice L-lysinem desenzitizována produkuje mutovaný enzym, pro nějž je kódem gen pro DDPS ve svrchu uvedené rekombinantní DNA, v tomto případě k inhioici působením AEC nedochází. To znamená, že tyto klony jsou schopné růst na minimálním živném prostředí s obsahem AEC. Tento jev je možno využít k selekci kmenů, které rostou i na prostředí s obsahem AEC jako analogu L-lysinu, což je důkazem přítomnosti mutovaného genu pro DDPS, v němž došlo k desenzitizaci inhibice.

Takto získaný mutovaný gen je pak možno uložit ve formě rekombinantní DNA do vhodného hostitelského mikroorganismu a dosáhnout jeho exprese. Je tedy možno získat mikroorganismus, který obsahuje gen pro DDPS s desenzitizaci inhibice v důsledku zpětné vazby. Hostitelským kmenem je s výhodou mikroorganismus, který náleží do rodu escherichia, jako příklad je možno uvést E. coli.

Je také možno postupovat tak, že se mutovaný fragment genu pro DDPS vyjme z rekombinantní DNA a uloží do jiného vektoru pro další použití. DNA vektoru pro použití pro účely vynálezu je s výhodou DNA plasmidu, jako příklady je možno uvést plasmidy pUC19, pUC13, pBR322, pHSS-299 , pHSG298, pHSG399 , PHSG398, RSF1O1G, pMW119, pMW118, pMW219 a pMW218. Mimoto je možno užít také DNA fágu.

Aby bylo možno dosáhnout účinné exprese mutovaného genu pro DDPS, je možno zařadit proti směru exprese genu od kódového řetězce DNA pro mutovaný DDPS další promotor, který je možno uplatníš v mikroorganismu, jako lac , trp nebo PL nebo je možno použít promotor, obsažený v genu DDPS jako takový nebo je možno promotor amplifikovat.

Mimoto, jak již bylo popsáno svrchu, je možno mutovaný gen uložit do DNA vektoru, schopného autonomní replikace v hostiteli a uložit tento vektor mimo chromosomy, například ve formě plasmidu. Mutovaný gen je možno také integrovat do chromosomu hostitelského mikroorganismu při použití transdukce nebo transposonu podle publikace Berg D. E. a Berg C. M., Biol/Technol., 1, 417, 1983, fágu Mu podle zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 2-109985 nebo při použití homologní rekombinace podle publikace Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor La., 1972.

2. Kódová DNA pro mutantu aspatokinázy III, AKIII

Kódová DNA pro mutantu AKIII podle vynálezu obsahuje mutaci, způsobující desenzitizaci inhibice L-lysinem v důsledků zpětné vazby, tak jak k ní dochází v AKIII divokého typu. Mutace se svrchu uvedeným účinkem zahrnují například následující mutace:

a) mutace, při níž se zbytek glycinu v poloze 323 na hradí zbytkem kyseliny asparagové,

b) mutace, při níž se zbytek glycinu v poloze 323 na hradí zbytkem kyseliny asparagové a zbytek glycinu v poloze 408 se nahradí zbytkem kyseliny asparagové,

c) mutace, pří níž se zbytek argininu v poloze 3^ na hradí zbytkem cysteinu a zbytek glycinu v poloze 323 se nahradí zbytkem kyseliny asparagové,

d) mutace, při níž se zbytek leucinu v poloze 325 na hradí zbytkem fenylalaninu,

e) mutace, při níž se zbytek methicninu v poloze 318 nahradí zbytkem isoleucinu,

f) mutace, při níž se zbytek methicninu v poloze 318 nahradí zbytkem isoleucinu a zbytek valinu v poloze 349 se nahradí zbytkem methioninu,

g) mutace, při níž se zbytek šeřinu v poloze 345 nahradí zbytkem leucinu,

h) mutace, při níž se zbytek valinu v poloze 347 nahradí zbytkem methioninu,

i) mutace, při níž se zbytek threoninu v poloze 352 nahradí zbytkem isoleucinu,

j) mutace, při níž se zbytek threoninu v poloze 352 nahradí zbytkem isoleucinu a zbytek šeřinu v poloze 369 se nahradí zbytkem fenylalaninu,

k) mutace, při níž se zbytek kyseliny glutamové v po loze 164 nahradí zbytkem lysinu a

l) mutace, při níž se zbytek methioninu v poloze 417 nahradí zbytkem isoleucinu a zbytek cysteinu v poloze 419 se nahradí zbytkem tyros inu, počítáno vždy od N-terminálního konce AKIII v řetězci aminokyselin. pro AKIII, tak jak je dále v seznamu řetězců definován řetězcem č. 8.

Kódový řetězec DNA pro AKIII divokého typu není nijak zvláště omezen v případě, že kódová DNA má svůj původ v bakterii, náležející do rodu Escherichia, například E. coli. Konkrétně je možno uvést kódovou DNA pro řetězec aminokyselin, který je definován následujícím řetězcem č. 8, uvedeným v seznamu řetězců a řetězec, odpovídající bažím 584 až 1930 v sekvenci baží, která je uvedena jako řetězec č. 7. Kočovým řetězcem pro AKIII z E. coli je gen lysC.

Ve svrchu uvedených řetězcích jsou kočovými sekvencemi DNA pro mutovaný enzym AKIII podle vynálezu ty sekvence, které obsahují v sekvenci baží takovou mutaci, která způsobí náhradu svrchu uvedených zbytků aminokyselin svrchu uvedenými určitými zbytky. Jakýkoliv kodon, který odpovídá zbytku aminokyseliny, která má být použita jako náhradní aminokyselina, je možno užít bez ohledu na jeho typ za předpokladu, že jde o kód pro uvedený zbytek aminokyseliny. Mimoto existují řetězce, v nichž se zbytky aminokyselin poněkud odlišují oč řetězce divokého typu AKIII v závislosti na rozdílech u různých čeledí nebo kmenů bakterií. Použít je možno takové řetězce, které obsahují jiné aminokyseliny nebo aminokyseliny navíc nebo vypuštěné aminokyseliny v polohách, na nichž není závislá enzymatická účinnost enzymu. Tyto řetězce rovněž spadají do rozsahu vynálezu. Například sekvence baží genu lysC divokého typu, která bude dále popsána v příkladu 2 (řetězec č. 7) se liší od zveřejněného řetězce pro lysC pro kmen E. coli K-12 JC411 v šesti polohách podle publikace Cassan M., Parsot C., Cohen G. N. a Patte J. C., J. Biol.

Chem. 261, 1052, 1986. Zbytky aminokyselin se odlišují ve dvou místech, v lysC kmene JC411 je zbytek glycinu v poloze nahrazen zbytkem cysteinu a zbytek giycinu v poloze 401 je nahrazen zbytkem aianinu, počítáno od N-terminálního konce v řetězci aminokyselin lysC, tak jak je definován řetězcem č.8. Je možno očekávat, že kteroukoliv ze svrchu uvedených mutací a) až 1) je možno dosáhnout desenzitizace inhibice L-lysinem i v řecězci lysC kmene E. coli K-12 JC411.

Kódovou DNA pro mutantu AKIII s desenzitizací inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby je možno připravit následujucím způsobem, nejorve se DNA, která obsahuje gen pro AKIII *

divokého typu nebo gen pro AKIII s jinou mutací, podrobí in vitno za vedení mutace a po uskutečnění této mutace se DNA uloží do vektoru, vhodného pro zvoleného hostitele za vzniku rekombinantní DNA. Takto připravená DNA se pak uloží do hostitelského mikroorganismu za vzniku transformantů. Z oěchto transformantů se pak izoluje transformat, u nějž dochází k expresi genu pro mutantu AKIII, což znamená, že je obsažen mutovaný gen. Je také možno postupovat tak, že se DNA, která obsahuje gen pro AKIII divokého typu, nebo gen pno AKIII s jinou mutací uloží do DNA vektoru, vhodného pno předpokládaného hostitele za vzniku rekombinantní DNA. Tato DNA se pak podrobí tvorbě mutace in vitno a po uskutečnění mutace se DNA uloží do hostitelského mikroorganismu, čímž vzniknou transformanty. Jeden z nich, u nějž dochází k expresi genu pro mutantu AKIII se izoluje, tento transformant obsahuje mutovaný gen.

Je také možno postupovat tak, že se mikroorganismus, který produkuje enzym divokého typu podrobí tvorbě mutace, čímž se vytvoří mutovaný kmen, u nějž dochází k produkci mutovaného enzymu a pak se z tohoto kmenu izoluje mutovaný gen. Jako příklad činidla pro tvorbu přímé mutace DNA je možno uvést hydroxylamin a podobné látky. Hydroxyiamin je látka, užívaná pno tvorbu mutací chemickým působením a vyvolává „ „ , 4 mutaci z cytosinu na thymin tak, ze se cytosin meni na N -hydroxycytosin. V případě, že se mutace provádí přímo na mikroorganismu, je možno tento mikroorganismus ozářit ultrafialovým světlem nebo na něj působit chemickou látkou, obvykle užívanou pro tvorbu mutací, jako je například N-methyl-N*-nitro-N-nitrosoguanidin, NTG.

Jako mikroorganismus pro izolaci DNA s obsahem genu pro ΑΚΣΣΣ divokého typu nebo genu pro ΑΚΣΣΣ s jinou mutací, tak jak bylo svrchu popsáno, je možno užít jakýkoliv organismus za předpokladu, že náleží do rodu Escherichia. Zvláště je možno užít mikroorganismy, popsané v publikaci Neidhardt

F. F. a další, Escherichia coli and Salmoneila typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1208, tabulka 1. Jako příklad je možno uvést kmeny E. coli JM109 a MClOci. V případě, že se gen pno ΑΚΣΣΣ izoluje z těchto kmenů, je možno připravit DNA z chromosomů, banku z této DNA a podobně stejným způsobem jako DNA pno gen pno DDPS, tak jak již bylo svrchu popsáno. Jako kmen bakterií pro přípravu banky je výhodné použít kmen, jemuž zcela chybí ΑΚΣ , ΣΣ a ΣΣΣ, například kmen Ξ. coli GT3, který je možno získat z E. coli Genetic Stock Center, Connecticut, US.

Ze získané banky chromosomální DNA se získá bakteriální kmen s rekombinantní DNA genu pro ΑΚΣΣΣ jako kmen, v němž je účinnost ΑΚΙΣΣ zvýšena, nebo jako kmen, v němž byla doplněna auxotrofie. Z těchto kmenů se připraví buněčné extrakty a surové roztoky enzymu tak, aby bylo možno potvrdit účinnost ΑΚΣΣΣ. Měření účinnosti enzymu ΑΚΙΣΣ je možno uskutečnit způsobem podle publikace Stadtman E. R., Cohen G. N., LeBras

G. a Robichon-Szulmajster Η., J. Biol. Chen., 236, 2033, 1961.

Například v případě, že se jako hostitelský kmen užije mutovaný kmen, jemuž zcela chybí enzymy typu AK, je možno připravit fragment DNA, obsahující gen pro AKIII izolací transformovaného kmene, který se stane schopným růst na živném prostředí, které neobsahuje L-lysin, L-threonin, L-methio nin nebo kyselinu diaminopimeiovou nebo na prostředí, které neobsahuje homoserin a kyselinu diaminopimeiovou a z tohoto bakteriálního kmene se pak izoluje rekombinantní DNA.

V případě, že se gen pro AKIII amplifikuje z chromosomální DNA při použití metody PCR, je možno primery DNA, které mají být použity pro PCR-reakci připravit například na bázi sekvence, známé pro E. coii podle publikace Cassan M., Parsot C., Cohen G. N. a Patte J. C., J. Biol. Chem., 251, 1052, 1986, Primery, schopné amplifikovat oblast, obsahující 1348 baží kódového řetězce genu lysC je rovněž možno použít a vhodné jsou například dva primery, jejichž sekvence budou uvedeny dále jako řerězce č. 5 a 6.

Postup pro tvorbu mutace, jako náhradu, zařazení nebo vypuštění zbytku aminokyseliny v genu pro AKIII je možno usku teč.nit například pomocí PCR, cílenou tvorbou mutace a podobně obdobným způsobem, jakým byly získány mutace genu pro DDPS, tak jak bylo popsáno svrchu.

V průběhu chemické syntézy určitého genu je také možno zařadit mutace nebo jakékoliv náhodné mutace do předem určeného místa.

Mimoto je možno také postupovat tak, že se DNA genu pro AKIII na chromosomu nebo extrachromosomální rekombinantní DNA přímo působí hydroxylaminem podle publikace Hashimoto T. a Sekiguchi M., J. Bacteriol., 159, 1039, 1984. Mimoto je možno také použít poszup, při němž se bakterie, náležející do rodu Escherichia a obsahující gen pro AKIII na chromosomu nebo obsahující extrachromosomální rekombinantní DNA ozařují ultrafialovým světlem nebo se na tyto bakterie působ?! k vyvolání mutace chemickou látkou, například N-methyl-N 23

-nitrosoguanidir.em nebo kyselinou dusitou.

Pokud jde o způsob selekce mutovaného genu pro AKIII, postupuje se tak, že se nejprve kmen, jemuž zcela chybí AK, například kmen Ξ. coli GT3 transformuje při použití rekombinantní DNA, která obsahuje gen pro AKIII po zavedení mutace. Pak se takto transformované kmeny pěstují na minimálním živném prostředí, například M9 , obsahujícím větší množství L-lysinu. Kmeny, které obsahují rekombinantní DNA s genem AKIII divokého typu nejsou schopné syntetizovat L-threonin, L-isoleucin, L-methionin a kyselinu diaminopimelovou, DAP a jejich růst je potlačen vzhledem k tomu, že pouze jeden typ AK je inhibován L-lysinem. Na druhé straně kmen, který obsahuje rekombinantní DNA s mutovaným genem pro AKIII s desenzitizací inhibice působením L-lysinu by měl růst na minimálním živném prostředí, obsahující větší množství L-lysinu. Tuto skutečnost je možno využít k selekci kmenů, jejich růst je odolný proti působení L-lysinu nebo AEC jako analogu L-lysinu, jde tedy o kmen, obsahující DNA s mutovaným genem pro AKIII s mutací ve svrchu uvedeném smyslu.

Takto získaný mutovaný gen je možno uložit ve formě rekombinantní DNA do vhodného hostitelského mikroorganismu a dosáhnout jeho exprese. Tímto způsobem je tedy možno získat mikroorganismus, který obsahuje gen pro AKIII s desenzitizací inhibice v důsledku zpětné vazby.

Hostitelem je s výhodou mikroorganismus z rodu Escherichia, jako příklad je možno uvést E. coli.

Je také možno postupovat tak, že se vyjme z rekombinantní DNA fragment mutovaného genu pro AKIII a tento fragment se uloží dc jiného vektoru pro další použití. DNA, kterou je možno pro účely vynálezu použít je s výhodou DNA plasmidu, jako příklady je možno uvést plasmidy pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG39S, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219 a pMW213, Mimoto je k uvedenému účelu možno použít také DNA fágu.

Aby bylo možno dosáhnout účinné exprese genu pro mutovanou AKIII, je možno proti směru exprese od kódového řetězce DNA pro mutovaný enzym zařadit další promotor, vhodný pro zvolený mikroorganismus, například lac, trp a PL nebo promotor, obsahující gen pro AKIII může být použit jako takový nebo po amplifikaci.

Mimoto, jak již bylo svrchu uvedeno, je možno mutovaný gen uložit do vektoru, schopného autonomní replikace a uložit do hostitele jako extrachromosomální DNA, například ve formě plasmidů. Dále je možno mutovaný gen integrovat do chromosomu hostitelského mikroorganismu s použitím trar.sdukce, transposo mu podle publikace Berg D. E. a Berg C. M., Bio/Technol·., I, 417, 1983, fágu Mu podle zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 2-109985 nebo je možno použít hcmologní rekombinaci podle publikace Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Eab., 1972.

3. Výroba L-lysinu

L-lysin je možno účinně připravovat tak, že se v živném prostředí s výhodným složením pěstuje bakterie, transformovaná uložením mutovaného genu pro DDPS, získaného svrchu uvedeným způsobem a produkující AK, desenzitizovanou proti inhibicí L-lysinem v důsledku zpětné vazby. Dojde k produkci a nahromadění L-lysinu v živném prostředí a L-lysin je pak možno izolovat. Zejména je možno dosáhnout účinné produkce této aminokyseliny tak, že se připraví bakterie z rodu Escherichia, produkující oba mutované anzymy, jak mutovanou DDPS, tak mutovanou AKIII.

Bakterie, náležející do rodu Escherichia a obsahující gen pro svrchu uvedeným způsobem mutované enzymy jsou bakterie, transformované tak, že do jejich DNA chromosomů byla integrována kódová DNA pro AKIII s mutací, způsobující desenzitizaci inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby, nebo transformované tak, že se do buněk uloží rekombinantní DNA, konstruovaná vazbou DNA na DNA vektoru, schopného autonomní replikace v buňkách bakterií z rodu Escherichia. Mimoto může být enzym, v němž byla desenzitizována inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby enzym divokého typu nebo je možno gen pro takový enzym uložit do bakterií rodu Escherichia svrchu uvedeným způsobem. Dále je přijatelný také mutovaný kmen bakterií z rodu Escherichia, který byl přímo mutován zpracováním buněk tak, že produkuje mutovaný enzym AKIII.

Na druhé straně je možno k dosažení transformace mutovaným genem pro DDPS přímo integrovat v bakteriích rodu Escherichia gen pro mutovanou DDPS do chromosomální DNA nebo je možno transformace dosáhnout tak, že se do buněk uloží rekombinantní DNA, zkonstruovaná navázáním mutovaného genu pro DDPS a DNA vektoru, schopného autonomní replikace v buňkách bakterií z rodu Escherichia.

V případe, že se do bakterie z rodu Escherichia uloží jak gen pro mutovanou DDPS, tak gen pro mutovaný enzym AKIII, mohou být oba nutované geny integrovány do chromosomální DNA bakterií z rodu Escherichia, nebo mohou být uloženy oba geny do stejného plasmidu nebo do různých plasmidů jako extrachromosomální DNA. 7 případě, že se pro každý gen užije jiný plasmid, je výhodné použít plasmidy se stálým mechanismem distribude tak, aby došlo k jejich kompatibilnímu uložení do buněk. Mimoto je možno jeden z mutovaných genů integrovat do chromosomální DNA a druhý uložit do buněk ve formě plasmidu jako extrachromosomální DNA. V případě, že se do bakterií z rodu Escherichia uloží mutovaný gen pro DDPS a mutovaný gen pro enzym AKIII, je uvedené geny možno do bakterií uložit v jakémkoliv pořadí.

Produktivitu výroby L-lysinu je možno dále zlepšit tak, že se vytvoří příznivé podmínky pro gen pro dihydrodipikolinát reduktázu v bakterii z rodu Escherichia, do níž byl uložen mutovaný gen pro DDPS a mutovaný gen pro AKIII. Produktivitu výroby L-lysinu je pak možno ještě dále zvýšit tak, že se do bakterie, náležející do rodu Escherichia, do níž byl za výhodných pomínek uložen gen pro dihydrodipikolinát reduktázu, uloží ještě gen pro diaminopimelátdihydrogenázu, pocházející z koryneformní bakterie. Tento gen pro diaminopimelátdehydrogenázu by měl být rovněž výhodně uložen. Mimoto je produktivitu výroby L-lysinu možno zlepšit podobným způsobem také tak, že se místo genu pro diaminopimelátdihydro genázu za výhodných podmínek uloží gen pro sukcinyldiaminopimeláttransaminázu a gen pro sukeinyldiaminopimelátdeacylázu

Zesílení působení genu, uloženého za výhodných podmínek se týká zvýšení účinnosti enzymu, který je produktem exprese tohoto genu v buněčném materiálu. Muže jít o zvýšení počtu kopií genů v buňkách, o zvýšení exprese genu při použití promotoru s vysokou účinností pro expresi a k zavedení mutace, zvyšující účinnost enzymu. Aby bylo možno zvýšit počet kopií genu v buňce, uloží se gen do vektoru, schopného autonomní replikace v bakteriích rodu Escherichia a bakterie se tímto vektorem transformují. S výhodou jde o plasmid ve větším počtu kopií. Počet kopií je však možno zvýšit také amplifikací DNA, integrované do chromosomální DNA při použití fágu Mu a podobně. Pokud jde o použití plasmidu, v případě uklá dání mutovaného genu pro DDPS a mutovaného genu pro AKIII se s výhodou užijí plasmidy se stabilním distribučním mechanismem. Uvedené geny je možno do buněk ukládat v jakémkoliv zvoleném pořadí.

Dále bude popsán mechanismus, jímž je možno zvýšit produktivitu výroby L-lysinu postupně zesílením působení genů v systému pro biosyntézu této aminokyseliny. Biosyntetický systém, který je tvořen celou řadou reakcí je možno přirovnat ke kapalině, která protéká potrubím, tvořeným řadou trubic s různým průsvitem, zařazených do série. Každá trubice odpovídá jednotlivému enzymu a její průsvit odpovídá rychlosti enzymatické reakce. Aby bylo možno zvýšit množství protékající kapaliny, je velmi účinné zvýšit průsvit nejužší trubice. Požadovaného účinku není možno dosáhnout tím, že se ještě zvětší průsvit trubice s velkým průsvitem. Aby bylo dále možno zvýšt průtok, je pak zapotřebí zvýšit průsvit druhé nejužší trubice. Na základě takového hlediska byly činěny pokusy o zlepšení systému pro biosyntézu L-lysinu. K comuto účelu byl osvětlen systém pro biosyntézu L-lysinu tak, aby byla stanovena reakční rychlost v jednotlivých stupních, jak je uvedeno v příkladu 6. Postup spočíval v tom, že do Ξ. coli byly postupně ukládány geny, jejichž produkty se účastní biosyntézy lysinu, byly použity geny z E. coli.

Pak byly postupně nahrazeny čtyři geny, dapC (gen pro tetrahydrodipikolinácsukcinylázu), dapD (gen pro sukeinyidiaminopimeláttransaminázu), dapE (gen pro sukeinyldiaminopimelátdeacylázu) a dacr (gen pro diaminopimelátepimerázu) v průběhu biosyntézy genem pro DDH (diaminopimelátdehydrogenázu) z Brevibacterium lactofermentum, enzym katalyzuje reakce, jíž se účastní produkty těchto genů. Dále budou uvedeny uložené geny pro enzymy biosyntetického systému pro výrobu L-lysinu a odpovídající enzymy.

ppc: karboxyláza kyseliny fosfoenolpyrohroznové aspC: aspartátaminotransferáza lysC: aspartokináza III lysC*: aspartakináza III s desensitizovanou inhibicí asd: aspartát semialdehyddehydrogenáza dapA: dihydrodipikolinátsyntetáza dapA*: dihydrodipikolinátsyntetáza s desensitizovanou inhibicí dapB: dihydrodipikolinátreduktáza

DDH: diaminopimelátdehydrogenáza, získaná z Brevibacterium lactofermentum lysA: diaminopimelátdekarboxyláza.

V důsledku ukládání jednotlivých genů do Escherichia coli bylo možno prokázat produkci L-lysinu u kmenů, do nichž byly uloženy geny lasC , dapA nebo dapA , přičemž kmen, obsahující dapA* produkoval nejvyšší množství L-lysinu. Na základě těchto výsledků bylo zjištěno, že reakce, katalyzovaná enzymem dapA má pro rychlost produkce zásadní význam. V případě, že každý ze svrchu uvedených genů pro systém biosyntézy L-lysinu, byl ukládán do kmene, který již obsahoval dapA , měl gen lysC* největší účinek na zvýšení produktivity výroby L-* -lysinu. Je tedy zřejmé, že reakce, katalyzovaná produktem genu lysC, byla další určující reakce. Stejným způsobem bylo prokázáno, že reakce, katalyzovaná produktem genu dapB něla třetí pořadí důležitosti, přičemž čtvrté pořadí náleželo reakci, katalyzovaná DDH. Mimoto bylo v důsledku zjištění reakční rychlosti v jednotlivých stupních u reakcí, katalyzovaných dapC, dapD, dapE a dapF po jejich nahrazení DDH prokázán, že dapD a dapE určují rychlost produkce.

Dále budou uvedeny příklady získání genů ze systému pro biosyntézu L-lysinu z E. coli a genu pro DDH z Brevibacterium lactofermentum.

Gen ppc je možno získat z plasmidu pS2, který byl popsán v Sabe H. a další, Gene, 31, 279, 1984 nebo z plasmidu pT2, který tento gen obsahuje. Fragment DNA, obsahující gen ppc se získá rozštěpením plasmidu pS2 působením enzymů AatlI a AflII. Fragmer.c DMA s obsahem genu ppc je možno získat také rozštěpením píasmidu pT2 enzymy Smál a Seal. Kmen E. coli F15, AJ12873, obsahující plasmid pT2 byl uložen do mezinárodní sbírky kultur National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology, poštovní kód 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko, pod číslem FERM BP-4732 na základě Budapešťské úmluvy.

Gen aspC je možno získat z plasmidu pLF4, popsaného v Inokuchi K. a další, Nucleic Acids Res., 10, 6957, 1982, který ter.zo gen obsahuje. Fragment DNA s obsahem tohoto genu je možno získat rozštěpením plasmidu pLF4 působením enzymů PvuII a S~ul.

Gen asd je možno získat z plasmidu pAD20 z publikace Haziza C. a další, EM30, 1, 379, 1982, který tento gen obsahuje. Fragment DNA s obsahem uvedeného genu je možno získat rozštěpením plasmidu pAD20 enzymy Asel a Cial.

Gen dapB je možno získat amplifikaci chromosomální DNA E. coli při použití metody PCR a dvou typů oligonukleotidovýoh primerů, tak jak jsou uvedeny například řetězcem č. 9 a 10 v seznamu řetězců. Tyto primery byly připraveny na bázi nukleotidové sekvence známého genu dapB, tak jak byla uvedena v Bouvier J. a další, J. Biol. Chem., 259, 1^829, 1984.

Gen pro DDH je možno získat amplifikaci chromosomální DNA z Brevibacterium lactofermentum při použití PCR a dvou typů oligonukleotidových primerů, například s řetězci 11 a 12 z básledujícího seznamu řetězců, primery byly připraveny na základě známé nukleotidové sekvence uvedeného genu z Corynebacterium glutamicum podle Ishibo S. a další, Nucleic Acids Res., 15, 3917, 1987.

Gen lysA je možno získat amplifikací chromosomální DNA z E. coli při použití metody PCR a dvou typů oligonukleotidových pnimenů, například s řetězcem č. 13 a 14 z dále uvedeného seznamu, primery se připraví na bázi nukleotidové sekvence známého genu lysA podle Stragier P. a další, J. Mol. Biol., 168, 321, 1983.

Gen dapD je možno připravit amplifikací chromosomální DNA z kmene E. coli W3110 při použití metody PCR a dvou typů oligonukleotidových primerů, například s řetězcem č. 15 a 16 z následujícího seznamu řetězců, primery se připraví na bázi známé nukleotidové sekvence genu dapD podle Richaud C. a další, J. Biol. Chem., 259, 14824, 1984.

Gen dapE se získá amplifikací DNA z Ξ. coli při použití metody PCR a dvou typů oligonukleotidových primerů, například s řetězcem č. 17 a 18, primery byly připraveny na bázi nukleotidové sekvence známého genu dapE podle Bouvier J. a další, J. Bacteriol·., 174, 5265, 1992.

Gen dapE je možno připravit amplifikací chromosomální DNA z E. coli při použití metody PCR a dvou typů oligonukleotidových primerů, například s řetězcem č. 19 a 20 z dále uvedeného seznamu řetězců, primery se připraví na bázi nukleotidové sekvence známého genu dapF podle Richaud C. a další, Nucleic Acids Rea., 16, 10367, 1988.

Při provádění způsobu podle vynálezu je jako hostitele možno použít jakoukoliv bakterii, náležející do rodu Escherichia za předpokladu, že se do plasmidu jako extrachromosomální DNA uloží promotor mutovaného genu pro DDPS, mutovaného genu pro AKIII nebo jiného genu ze systému pro biosyntézu L-lysinu nebo jiný promotor, který umožní expresi funkce uvedených genů v buněčném materiálu a také počátek replikace DNA vektoru, který má být uložen do buněk tak, aby došlo k replikaci po uložení mutovaného genu pro DDPS, mutovaného genu pro AKIII nebo jiného genu ze systému pro biosyntézu L-lysinu do buněk.

Například je možno uvést mutovaný kmen E. coli, produkující L-lysin a současně odolný proti analogům L-lysinu. Analogem lysinu se rozumí sloučenina, která způsobuje inhibici prolyferace bakterií, náležejících do rodu Escherichia, avšak v těchto případech je toto potlačení zcela nebo částečně desenzitizováno v případě, že se současně v prostředí nachází L-lysin. Z analogů je možno uvést například oxalysin, lysinhydroxamát, AEC, gamma-methyllysin, alfa-chlorkaproláktam a podobně. Mutované kmeny s odolností proti analogům lysinu je možno připravit tak, že se mikroorganismus z rodu Escherichia zpracuje vyvoláním běžné umělé mutace. Jako bakteriální kmen, vhodný pro použití při výrobě L-lysinu je možno uvést kmen Ξ. coli AJ11442, uložený do sbírky FERM pod číslem 3P-1543 a do sbírky NRRL pod číslem B-12185, kmeny jsou uvedeny ve zveřejněné japonské patentové přihlášce č. 156-18596 a v US patentovém spisu č. 4 346 170. V případě aspartokinázy ze svrchu uvedených mikroorganismů je desenzitizováno inhibice L-lysinem na základě zpětné vazby.

Jako příklad je však možno uvést také mikroorganismy, které produkují L-threonin vzhledem k tomu, že inhibice jejich aspartakir.ázy působením L-lysinu je obvykle také desenzitizována. Jako bakterie, produkující L-threonin a náležející k Ξ. coli, je možno uvést kmen B-3996 jako kmen s dosud nejvyšší známou produktivitou. Tento kmen byl uložen ve veřejné sbírce kultur Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding pod číslem RIA 1867.

Živným prostředím, které je možno užít pro pěstování transformovaného mikroorganismu s mutovaným genem podle vynálezu, je běžné prostředí s obsahem zdroje uhlíku, zdroje dusíku, organických iontů a popřípadě dalších složek.

Jako zdroj uhlíku je možno použít cukry, například glukosu, laktosu, galaktosu, fruktosu nebo hydrolyzát škrobu, alkoholy, například glycerol nebo sorbitol nebo organické kyseliny, například kyselinu fumarovou, citrónovou nebo jantarovou.

Jako zdroje dusíku je možno použít anorganické amonné soli, například síran amonný, chlorid amonný nebo fosforečnan amonný, organické zdroje dusíku, jako hydrolyzát sojových bobů, plynný amoniak nebo vodný amoniak.

Živné prostředí by mělo obsahovat také další žádoucí složky, jako vitamin B^, L-isoleucin nebo extrakt z kvasnic, tyto složky se však obvykle vyskytují v příslušných množstvích jako stopové složky jiných organických materiálů.

V případě potřeby je možno přidat malá množství fosforečnanu draselného, síranu hořečnatého a látek, obsahujících ionty železa, manganu a podobně.

Mikroorganismy se s výhodou pěstují za aerobních podmínek po dobu 16 až 72 hodin. Teplota při kultivaci se má pohybovat v rozmezí 25 až 45 °C, pH se v průběhu pěstování udržuje v rozmezí 5 až 8. K úpravě pH je možno použít anorganických nebo organických kyselých nebo alkalických sloučenin, je však možno také použít plynný amoniak a podobně .

L-lysin se po skončené fermentací obvykle izoluje kombinací různých postupů, například při použití iontoměničové pryskyřice, srážení a jiných známých postupů.

Vynález bude dále popsán v souvislosti s přiloženými výkresy.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněno schéma přípravy plasmidů s obsahem genů dapAl a dapA2, jde o plasmidy pdapAl a pdapA2.

Na obr DDPS divokého je znázorněna inhibice L-lysinem v případě typu a v případě mutovaných enzymů.

Na obr. 3 je znázorněn způsob přípravy plasmidů pdapAS824 s dvojitou mutaci typu genu dapA .

Na obr. 4 je znázorněna příprava plasmidů pLASCl a

PLYSC2.

Na obr. 5 je znázorněn poměr vzhledu a mutace u trans formantů po působení hydnoxyiaminem.

Na obr. 6 je znázorněna inhibice L-lysinem pro divoký typ a pro mutantu AKIII.

Na obr. 7 je znázorněna příprava plasmidů RSF24P z plasmidů RSF1O1O s obsahem dapA^Jt24.

Na obr. 8 je znázorněna příprava plasmidů pLLC 80.

Na obr. 9 je znázorněna příprava plasmidů RSFD80 z plasmidů RSF1010 s obsahem dapA*24 a lysC*80.

Na obr. 10 je znázorněna struktura plasmidů pdapA a

Η X pdapS s obsahem dapA nebo dapA .

Na obr. 11 je znázorněna struktura plasmidů plysC a plysC s obsahem lysC nebo lysC 80.

Na obr. obsahem ppc.	12	je	znázorněna	struktura	plasmidu	pppc s
Na obr. s obsahem aspC.	13	je	znázorněna	struktura	plasmidu	paspC
Na obr. obsahem asd.	14	je	znázorněna	struktura	plasmidu	pasd s
Na obr. s obsahem dapB.	15	je	znázorněna	struktura	plasmidu	pdapB
Na obr. obsahem DDH.	15	je	znázorněna	struktura	plasmidu	pDDH s
Na obr.	-t -“7 _ /	je	znázorněna	struktura	plasmidu	plyšA s

obsahem lysA.

Na obr. 13 je znázorněn způsob výroby plasidu pCA31 z RSF1O1O s obsahem dapA^K24, lysC*80 a dapB.

Na obr. 19 je znázorněn způsob výroby plasmidu pCABD2 z RSF1O1C s obsahem dapA*24, lysC^H80, dapB a DDH.

Na obr.	20	je	znázorněna	struktura	plasmidu	pdapD
s obsahem dapD	•
Na obr.	21	je	znázorněna	struktura	plasmidu	pdapE s
obsahem dapE.
Na obr.	22	je	znázorněna	struktura	plasmidu	pdapF
s obsahem dapF	•
Na obr.	23	je	znázorněn	způsob přípravy plasmidu

pMWdapDEl s obsahem dapD a dapE.

Na obr. 24 je znázorněn způsob přípravy plasmidú pCABDEl, který obsahuje dapA*24, lysC^eO, dapB, dapD a dapE.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava mutovaného genu pro DDPS

1. Klonování genu dapA divokého typu

Nukleotidcvá sekvence genu dapA z E. coli již byla popsána v publikaci Richaud F. a další, J. Bacteriol., 297,

1986 a je známe, že otevřený čtecí rámec ORF tohoto genu obsahuje 876 párů baží a kóduje bílkovinu, obsahující 292 zbytků aminokyselin. Vzhledem k tomu, že není zmámo, jak je gen dapA řízen, byla amplifikována pouze oblast, obsahující sekvenci SD a CPE s výjimkou promotorové oblasti při použití metody PCR a tato oblast byla klonována.

Celá DNA genomu kmene E. coli K-12 MC1O61 byla extrahována způsobem podle publikace Saito a Miura, Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, 1963. Byly připraveny dva typy primerů s řetězci, které budou dále znázorněny jako řetězce č.

a 2 a tyto příměry byly použity k provedení PCR-reakce podle publikace Erlich a další, PCR Technology, Stockton Press, 1989 a cílová DNA byla amplifikována. Získaná DNA pak byla uložena do běžně dodávaného vektoru pCRlOOO pro klonování PCR-fragmentů (Invitrogen, Ltd., Kalifornia, USA).

- JO Piasmid pCRlOOO obsahuje promotor lacZ (Placz) a běžně se dodává, rozštěpený v místě proti směru exprese od promotoru lacZ. V případě, že se do E. coli uloží rekombinantní DNA, získaná navázáním PCR-fragmentů mezi oběma rozštěpenými konci pCRlOOO, dojde k transkripci tohoto PCR-fragmentů pod řízením promotoru lacZ. Po vazbě PCR-fragmentů a PCRlOOO se získají dva typy plasmidů, z nichž jeden je označen pdapAl, jde o plasmid, navázaný v normální orientaci a o plasmid pdapA2, navázaný v obrácené orientaci, vztaženo na směr trans kripce dapA za řízení promotorem lacZ, jak je znázorněno na obr. 1.

V případě, že tyto plasmidy jsou uloženy mají kmeny s coli JE7527, jemuž chybí DDPS, mihem doplněnou auxotrofii pro Tímto způsobem bylo potvrzeno, obou plasmidech obsahují kodový do kmene E uloženým plaskyselinu diaminopimeiovou. že fragmenty DNA, uložené v gen dapA pro účinný enzym.

Transformovaný kmen, získaný uložením plasmidů pdapAl do kmene divokého typu E. coli W311C (National Institute of Genetics, Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japonsko) byl· označen WSllO/pdapAl a transformovaný kmen, získaný uložením pdapA2 do kmene E. coli W3110, byl označen W3110/pdapA2. Tyto dva transformované kmeny byly pěstovány v minimálním živném prostředí M9 se složením, které bude dále uvedeno, mimoto byl přidán AEC jako analog lysinu. Mimoto byl jako kontrola pěstován kmen W311C bez jakéhokoliv uloženého plasmidů ve stejném živném prostředí. Oba transformované kmeny i kmen W3110 bez plasmidů zbrzdily svůj růst v přítomnosti ARC, avšak tato inhibice byla potlačena přidáním L-lysinu.

Minimální živné prostředí M9

A: (20 x MS'

Na2HP04 .	. 12H20	303	g/i
kh2po4		60	g/i
NaCl		10	gA
nh4ci		20	h/1

Β: 1 M MgSC_z1

C: 50% glukosa

D: thiamin 1/1

Roztoky A, 3, C a D byly odděleně sterilizovány a pak byly smíseny v poměru A : 3 : C : D : voda =5 : 0,1 : 1 : 0,1:95

2. Příprava mutovaného genu DDPS (dapA )

Bylo předpokládáno, že kmen s uloženým plasmidem, obsahujícím dapA⁵⁴ pro DDPS s desenzitizovanou inhibicí L-lysinem by měl růst na minimálním prostředí M9 se značným množstvím AEC. Kmeny, obsahující plasmid s genem dapA byly proto podrobeny selekci na odolnost proti AEC.

Aby bylo možno účinně získat dapA , byl podroben gen dapA v plasmidech pdapAl a pdapA2, připravených podle odstavce 1. tvorbě mutace.

1-2-1 Výzkum podmínek selekce pro kmen s plasmidem, obsahujícím dapA

Kmeny W3110/pdapAl a W3110/pdapA2, získané svrchu uvedeným způsobem, byly pěstovány na prostředí M9 na agarové plotně při různé koncentraci AEC. Byly sledovány koncentrace

AEC pro způsobuj íc í selekci kmenů iňhibici růstu a byly sledovány podmínky s olasmidem, obsahujícím dapA*.

různýc V této

Růst transformantů na prostředí M3 s obsahem ARC v h koncentracích je uveden v následující tabulce 1.

tabulce znamená + růst transformovaného kmene, kdežto

- znamená, ze kmen neros'

Tabulka 1

AEC koncentrace

250

125

N3110/ odaoA.l W3110 / odapA2

Směr transkripce genu dapA v plasmidu pdapAl je v souladu se směrem transkripce promotoru lacZ, jak je zřejmé z obr. 1. Bylo proto zjištěno, že gen dapA v tomto plasmidu je příčinou odolnosti proti působení AEC při vyšších koncentracích, i v tem případě, že jde o dapA divokého typu vzhledem k tomu, že exprese tohoto genu byla zvýšena promotorem lacZ. Naproti comu v případě genu dapA v plasmidu pdapA2 dochází k nižší expresi a tím může dojít k inhibicí růstu působením AEC již při nižších koncentracích vzhledem k tomu, že směr transkripce je opačný vzhledem k promotoru lacZ a vlastní promotor dapA chybí (růst byl potlačen přidáním 30 mM v případě kmene W3110/pdapAl a již při 15 mM v případě kmene W3110/pdapA2). Bylo potvrzeno, že inhibicí růstu bylo možno odstranit přidáním L-lysinu.

To znamená, že bylo možno použít plasmid pdapA2 pro zavedené mutace. K selekci kmene s obsahem plasmidů s genem dapA* bylo užito minimální prostředí M9, k němuž bylo přidáno 60 mM AEC. Toto prostředí bude dále označováno v průběhu příkladu 1 jako selekční prostředí.

1-2-2 Vyvolání mutace pdapA2 in vitro působením hydroxylaminu

Pro zavedení mutace do plasmidů pdapA2 in vitro byl použit postup, při němž se na plasmid přímo působí hydroxylaminem.

mikrogramy DNA byly zpracovávány při teplotě 75 °C po dobu 1 až 4 hodiny v 0,4 M hydroxylaminu (0,1 M KH^PO^-l mM EDTA, ph 6,0 : 100 mikrolitrů, 1 M hydroxylamin-1 mM EDTA, pH 6,0 : 80 mikrolitrů, DNA: 2 mikrogramy, celkem 200 mikrolitrů po doplnění vodou). Takto zpracovaná DNA byla čištěna pomocí skelného prášku, uložená do E. coli W3110 a byly uskutečněny nátěry mikroorganismů na úplném živném prostředí (L-bujon: 1 % Bacto tryptonu, 0,5 % extraktu z kvasnic, 0,5 % NaCl, 1,5 % agaru) a byla pozorována tvorba kolonií. Kolonie pak byly přeneseny na selekční prostředí, popsané v odstavci l_2-l a byly izolovány bakterie, vytvářející na tomto selekčním prostředí kolonie. Po dvojím opakování pokusu bylo získáno 36 kmenů s možným obsahem mutovaných plasmidů.

Uvedené kmeny byly znovu naneseny na selekční živné prostředí a byla sledována jejich odolnost proti působení AEC, pokud jde o inhibici růstu.

1-2-3 Izolace genu dapA a sledování produktu exprese tohoto genu

Mutované plasmidy pdapA2 byly izolovány ze svrchu popsaných 36 kmenů. Při použití těchto plasmidů byl pak transformován kmen JE7627, jemuž plasmid dapA chybí a také byl použit plasmid pdalA2 divokého typu. Z každého z transformovaných kmenů byly připraveny bezbuněčné extrakty a pak byla měřena účinnost DDPS.

Bezbuněčný extrakt, to znamená roztok surového enzymu byl připraven následujícím způsobem. Transformovaný kmen byl pěstován na prostředí 2 x TY (1,6 % Bacto tryptonu, 1 % extraktu z kvasnic, 0,5 % NaCl) a byl· izolován při optické hustotě přibližně 0,8 při 660 nm (ODgg^). Usazenina buněk byla promyta 0,85% roztokem chloridu sodného při teplotě 0 °C a pak byl buněčný materiál uveden do suspenze ve 20 mM pufru s fosforečnanem draselným o pH 7,5 s obsahem 400 mM KC1. Buněčný mazeriál byl rozrušen působením ultrazvuku 10 minut při 0 °C při použití 200 W. Roztok rozrušených buněk byl odstředěn 1 hodinu při teplotě 0 °C a při 33 000 ot/min za získání supernatantu, k němuž byl přidán síran amonný až do 80% nasycení. Pak byl materiál uložen přes noc při teplotě 0 °C, načež byl odstředěn. Usazenina byla rozpuštěna ve 20 mM pufru fosforečnanu draselného o pH 7,5 se 400 mM chloridu draselného.

Enzymatická účinnost DDPS byla měřena podle publikace Yugani Y. a Gilvarg C., J. Biol. Chem., 240, 4710, 1962.

Zkouška byla prováděna tak, že byla stanovena absorbance reakčního roztoku s dále uvedeným složením spektrofotometrem při teplotě 37 °G a vlnové délce 270 nm v závislosti na čase a tím bylo možno stanovit množství vytvořeného dihydrodipikolinátu. Z reakčního systému byl odstraněn pyronroznan sodný a jeho roztok byl použit jako slepá zkouška.

Složení reakčního roztoku mM imidazolhydrochlorid, pH 7,4, mM semialdehyd kyseliny L-asparagové, mM pyrohrozr.an sodný, roztok enzymu voda (zbývající množství) celkový objem 1,0 ml.

K uvedenému roztoku byly v průběhu měření enzymatické účinností DDPS přidávány různé koncentrace L-lysinu a pak byl sledován stupeň inhibice L-lysinem. Jak je zřejmé z obr.

2, v případě DDPS divokého typu docházelo k inhibici L-lysinem. Plasmidy pro mutanty připravené z transformovaných kmenů s obsahem DDPS, odolné proti inhibici L-lysinem byly srovnávány s divokým typem, byly vybrány tři z 36 možných plasmidů. Tyto plasmidy byly označeny pdapAS8, pdapAS9 a pdapAS24. Podle následujícího stanovení nukleotidové sekvence bylo zjištěno, že plasmidy pdapAS8 a pdapAS9 obsahovaly tutéž mutaci.

Stupeň desenzioizace inhibice L-lysinem se poněkud měnil u všech tří mutant DDPS, pro něž jsou kódem svrchu uvedené plasmidy, avšak desenzitizace byla inhibována u všech tří mutant. I když specifická účinnost enzymu může být ovlivněna také růstovou fází buněk a způsobem přípravy vzorků, došlo přece jen ve všech případech pouze k nepatrnému snížení účinnosti ve srovnání s enzymem divokého typu. Plasmidy je proto možno použít k vytvoření organismů, produkujících enzym, odolný proti inhibicí.

1-2-4 Stanovení nukleotidové sekvence mutovaného genu dapA

Nukleotidové sekvence mutovaných genů dapA byly stanoveny běžným způsobem při použití analyzátoru ABI Model 373A (Applied Biosyscems lne.). Bylo prokázáno, že v pdapAS8 a psapAS9 je C v poloze 487 nahrazeno Tav pdapAS24 je C v poloze 597 nahrazeno T ve srovnání se sekvencí divokého typu genu dapA, tak jak je znázorněna v řetězci č. 3. V důsledku toho v řetězci aminokyselin dochází v DDPS, pro niž je kódem pdapAS8 a pdapASS k náhradě alaninového zbytku v poloze 81 za zbytek valinu a v DDPS, pro niž je kódem pdapAS24, dochází k náhradě hiscidinového zbytku v poioze 113 za tyrosinový zbytek v řetězci aminokyselin, který je znázorněn jako řetězec č . 4 .

1-2-5 Příprava dapA s dvojitou mutací

Svrchu uvedeným způsobem byly získány dva typy mutovaných genů dapA. Aby bylo možno ověřit, zda ve výsledném enzymu dochází nebo nedochází k inhibicí, byl připraven plasmid s obsahem dapA s obojí mutací. Způsob výroby tohoto plasmidu je znázorněn na obr. 3. Získaný plasmid s dvojitou mutací byl označen pdapAS824.

Příklad 2

Příprava mutanty genu AKIII

1. Klonování divokého typu genu lysC

Nukleotiiová sekvence genu pro AKIII ílysC) z E. coii již byla popsána v publikacích Cassar. M., Parsot C., Conen G. N. a Patte J. C., J. Biol. Chem., 251, 1052, 1985 a je známo, že ve svém otevřeném čtecím rámci (ORF) obsahuje 1347 párů baží a je kódovým řetězcem pro bílkovinu, obsahující 449 zbytků aminokyselin. Tento gen obsahuje operátor a je potlačován L-lysinem. K odstranění operátorové oblasti byla amplifikována pomocí PCR pouze oblast, obsahující sekvenci SD a ORF a tato oblast pak byla klonována.

Byla připravena DNA celého genomu kmeneE. coli K-12 MC1061 způsobem podle publikace Saito a Miura, Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, 1963. Byly připraveny dva typy primerů s dále uvedeným řetězcem č. 5 ač. 6a tyto primery byly použity k uskutečnění PCR-reakce podle publikace Erlich a další, PCR Technology, Stoskton Press, 1989 a gen lysC byl ampli fikován. Získaná DNA byla rozštěpena pomocí enzymu BamHI a Asel, zakončen?! byla doplněna a materiál byl uložen do místa působení Smál vektoru pUC18. Toto místo působení enzymu Smál je uloženo proti směru exprese od promotoru lacZ v tomto vektoru a v případě, že se rekombinantní DNA, získaná uložením fragmentu DNA dc místa působení Smál plasmidu pUC18 uloží do E. coli, dojde k transkripci uložené DNA pod řízením promotoru lacZ. Po uležení ?CR-fragmentu do místa Smál v plasmidu pUC18 byly získány dva plasmidy, které byly označeny pLYSCl v případě plasmidu s uloženým fragmentem v obrácené orientaci a pLASC2 v případě plasmidu s fragmentem, uloženým v normální orientaci pro směr transkripce lysC pod řízením transkripce promotorem lacZ, jak je zřejmé z obr. 4.

Tyto plasmidy byly použity k transformaci kmene E. coli GT3 (thrAlC16b, metLM1005, lysC1004) jako kmene, jemuž zcela chybí AKI, A.KII, AKIII a byla doplněna auxotrofie GT3 pro homoserin a pro kyselinu diaminopimelovou. Bylo potvrzeno, že fragmenty DNA, uložené do obou plasmidů obsahují gen lysC s kodovým řetězcem pro účinný enzym AKIII.

Transformovaný kmen, získaný uložením pLYSCl do kmene E. coli GT3 byl označen GT3/pLAYSCl a transformovaný· kmen, získaný uložením pLYSC2 do kmene E. coli GT3 byl označen GT3/pLYSC2. K minimálnímu živnému prostředí M9 bylo přidáno větší množství L-lysinu a oba uvedené kmeny byly v tomto živném prostředí pěstovány. Oba uvedené kmeny obsahují plasmidy s obsahem lysC divokého typu, v nichž enzym AKIII, pro nějž je kódem lysC, je jediným enzymem typu AK. Divoký typl AK3 je inhibován v přítomnosti většího množství L-lysinu. To znamená, že ani jeden z uvedených kmenů nebyl schopen syntetizovat L-threonin, L-isoleucin, L-methionin a kyselinu diaminopimelovou, DA?, a jejich růst byl potlačen.

2. Příprava mutanty genu pro AKIII, lysC*

Bylo předpokládáno, že kmen, do nějž byl uložen plasmid lysC' s kodovým řetezcem pro AK s desenzitizovanou inhibici L-lysinem bude růst na minimálním živném prostředí M9 s přísadou většího množství L-lysinu. Kmen, obsahující plasmid s uloženým genem lysC byl získán selekcí kmenů, pěstovaných v přítomnosti L-lysinu a odolných proti L-lysinu nebo AEC jako analogu L-lysinu.

Aby bylo možno účinně získat mutovaný gen, byly plasmidy pLYSCl a pLYSC2, obsahující lysC a připravené v odstavci 1. podrobeny tvorbě mutace.

2-2-1 Zjištění podmínek pno selekci kmenů s plasmidem uloženým genem lysC*

Kmeny GT3/pLYSCi a GT3/pLYSC2 byly pěstovány na agarcvém prostředí M9 s obsahem různých koncentrací L-lysinu nebe AEC. Byly sledovány inhibiční koncentrace L-lysinu nebo AEG a tím byly zjištěny podmínky pro selekci kmene, obsahujícího gen lysC*.

Růst transformovaných kmenů na prostředí M9 s obsahem L-lysinu nebo AEG v různých koncentracích je uveden v následující tabulce 2. V této tabulce znamená + růst transformantu, ± znamená mírný růst a - znamená, že k růstu nedochází.

Tabulka 2

Závislost růszu na koncentraci L-lysinu — θ · - β · 4 0 3 1 . o 3. ζ_ 12 25 50 10 0 200 'πΜ)

GT3/pLYSCl +

GT3/pLY3C2 -?·--γ·γ-τ--τ7--γ-τ·-

Závislost	růstu na koncentraci	AEC
	0 0-2	0.4 0,3 1	. . 5 3	6 12. lí 50 (mM)
GT3/pLYSCl	X —	-		-
GT3/pLYSC2	X	X 4-	X X

Směr transkripce genu iysC v plasmidu pLYSC2 odpovídá směru t rsn ξ k p i p c — ood ří.zsn.í.m promotoru lucZ, jHk Je z pějme z obr. 4. Bylo tedy prokázáno, že gen IysC v tomto plasmidu může zajistit odolnost proti působení L-lysinu nebo AEC i ve vysokých koncentracích, a to i když gen IysC zůstává ve formě, odpovídající divokému typu vzhledem k tomu, že byl amplifikován promotorem lacZ, kdežto tentýž gen v plasmidu pLYSCl není uložen ve správném směru a dochází proto k jeho nižší expresi a tím i k inhibici růstu L-lysinem a AEC již v niž-* ší koncentraci, protože gen je uložen v opačném směru vzhledem k promotoru lacZ a promotor sám je rovněž deficientní.

Růst není potlačen až do 100 mM L-lysinu a až do 3 mM v případě kmene GT3/pLYSC2, kdežto k úplnému potlačení růstu dojde po přidání 0,2 mM L-lysinu nebo AEC v případě kmene GT3/pLYSCl Bylo potvrzeno, že inhibici růstu je možno potlačit současným přidáním homoseninu a kyseliny diaminopimelové.

Plasmid pLYSCl byl proto použit k uskutečnění mutace. Prostředí, připravené přidáním 10 mM L-lysinu nebo 0,2 mM AEC k minimálnímu prostředí M9 bylo použito pro selekci kmenů s plasmidem, obsahující IysC . Toto prostředí je označováno jako selekční prostředí.

2-2-2 Vyvolání mutace v plasmidu pLYSCl in vitro působením hydroxylaminu

Pro zavedení mutace do plasmidu pLYSCl byly použity dvě metody, jedna z nich byla metoda in vitro, při níž byly plasmidy přímo zpracovány působením hydroxylaminu, druhá metoda byla prováděna in vivo a mutace při tomto postupu byla prováděna tak, že buněčný materiál s obsahem plasmidu byl zpracován působením nitrosoguanidinu, NTG, s následnou extrakcí plasmidu, aby bylo možno zjistit různé mutace, zvláště byly očekávány mutace, odlišné od mutace cytosinu na thymin po působení hydroxylaminu.

Vyvolání mutace in vitno působením hydroxylaminu _ ~ o mikrogramy DNA byly podrobeny pni tepiote 75 C po dobu 1 až 4 hodiny působením 0,4 M hydroxyLaminu (0,1 M KH^PO^-l mM EDTA, pH 6,0; 100 mikrolitnů, 1 M hydroxylaminu1 mM EDTA, pH 6,0; 80 mikrolitrů, DNA: 2 mikrogramy, celkem 200 mikrolitnů po doplnění vodou). DNA po tomto působení byla čištěna s použitím skelného prášku, uložena do kmene E. coli GT3, neprodukujícího žádný enzym typu AK a naočkována na úplné živné prostředí (L-bujon: 1 % tnyptonu Bacto, 0,5 % extraktu z kvasnic, 0,5 % NaCl, 1,5 % agaru) a byla pozorována tvorba kolonií. Tyto kolonie pak byly přeneseny na selekční prostředí, popsané v odstavci 2-2-1 a byly vybrány kmeny, schopné růst na tomto prostředí. Poměr transformantů a mutací je znázorněn na obr. 5. Při působení po dobu 4 hodin byly získány mutované kmeny v podstatně vyšším poměru v rozmezí 0,5 až 0,8 %.

Vyvolání mutace in vivo působením NTG pLYSCl byl uložen do kmene E. coli MC1061 a buněčný materiál byl zpracován působením NTG. Buňky po zpracování byly pěstovány přes noc k fixaci mutace a pak byl piasmid z těchto buněk extrahován a uložen do buněk kmene E. coli GT3. Transformovaný kmen byi pěstován na živném prostředí x TY (1,6 % tryptonu Bacto, 1 % extraktu z kvasnic a 0,5 % NaCl), materiál byl izolován při optické hustotě 0D_-q přibližně 0,3, pnomyt pufnem TM, který bude dále popsán a pak uveden do suspenze v roztoku NTG (připraveném rozpuštěním NTG v koncentraci 0,2 mg/ml v pufru TM) a zpracováván při teplotě 37 °C po dobu 0 až 90 minut. Pak byl buněčný materiál promyt pufrem TM a prostředím 2 x TY a mutace byla fixována pěstováním buněk přes noc v prostředí 2 x TY. Pak byla z buněk extrahována DNA plasmidů a uložena do kmene E. coli GT3. Vyhledávání kmenů s obsahem mutace bylo prováděno stejným způsobem jako v příkladě získány mutanty s odolností prct odolností proti AEC (AEC¹).

mutace in lysinu vitro, čímž byly ys ) a mutanty s

Složení pufru TM tris kyselina maleinová síran amonný

MgS0₄.7H₂0 dusičnan vápenatý

FeS0₄.7H₂0 pH se upraví na 8,0 mM 50 mM g/1 0,1 g/1 5 mg/1 0,25 mg/ml přidáním NaOH.

Celkem 150 kmenů, získaných svrchu uvedeným způsobem, a to as kmenů pc působení hydroxylaminu a 132 kmenů po působení NTG bylo znovu naneseno na selekční prostředí, po ověření odolnosti proti AEC a L-lysinu se počet těchto kmenů snížil na 153. Vzhledem k odlišnosti nahromadění aminokyselin v živném prostředí bylo těchto 153 kmenů rozděleno do 14 skupin a účinnost AK byla měřena po selekci representativních kmenů z každé skupiny. Nebylo možno pozorovat velký rozdíl v účinnosti AK mezi kmeny, které byly získány působením hydroxylaminu a kmeny, získanými působením NTG. Proto byly provedeny následující pokusy bez rozlišování těchto kmenů.

2-2-3 Izolace kmenu lysC* a sledování produktu exprese tohoto genu

Kmeny č. 24, 43, 48, 60, 80, 117, 126, 149, 150, 156, 158, 167, 169 a 172 byly vybrány jako representativní kmeny ze svrchu uvedených 14 skupin. Ze všech těchto kmenů byly izolovány plasmidy, odvozené od původního plasmidú pLYSCl a byly označeny pLYSCl*24, pLYSCl*43, pLYSCi*48, pLYSCi*60, pLYSCi*80, pLYSCl*117, pLYSCl*126, pLYSCl*149, pLYSCl*150, pLYSCl*156, pLYSCl^K158, pLYSCl*167, pLysCl*169 a pLYSCl*172. Těmito plasmidy byl pak transformován kmen GT3, neprodukující žádný enzym typu AK, tento kmen byl rovněž transformován plasmidem divokého typu pLYSCl. Z každého transformovaného kmene byl připraven bezbuněčný extrakt a byla měřena účinnost AKIII.

Bezbuněčný extrakt (roztok surového enzymu) byl připraven následujícím způsobem. Transformované kmeny byly pěstovány na prostředí 2 x TY a buněčný materiál byl oddělen při optické hustotě ODggg přibližně 0,8. Pak byl tento materiál promyt směsí 0,02 M dihydrogenfosforečnanu draselného o pH 6,75 a 0,03 M beta-merkaptoethanolu při teplotě 0 °C a buňky byly rozrušeny ultrazvukem při teplotě 0 °C, 100 W, 4 x 30 minus. Roztok rozrušených buněk byl odstředěn při 33 000 ot/min po dobu 1 hodiny při seplotě 0 °C, k supernatantu byl pak přidán síran amonný do 80% nasycení. Po odstředění byla usazenina rozpuštěna ve směsi 0,02 M dihydrogenfosforečnanu draselného o pH 6,75 a 0,03 M beta-merkaproethanolu a roztok byl uložen přes noc při 0 °C.

Enzymatická účinnos podle publikace Stadtman E

Robicnon-Szulmajster H enzymu AKIII byla měřena způsobem

N. , LeBras G. a 236, 2033, 1961.

R. , Cohen G.

J. Biol. Chem. .

Reakční roztok s dále uvedeným složením byl inkubován při teplotě 27 °C po dobu 45 minut a pak byl k vyvolání zabarvení přidán roztok chloridu železitého (2,8 N HC1, 0,4 ml +

12% TCA, 0,4 ml + 5% PeClg.6H₂0/0,1 NHC1, 0,7 ml) a roztok byl odstředěn, načež byla měřena absorbance supernatantu při 540 nm. Účinnost byla vyjádřena v množství kyseliny hydroxamové, vytvořena za minutu (1 U = 1 mikromol/min). Molární absorpční koeficient byl 600. Z reakčního roztoku byl oddělen aspartát draselný, který byl použit jako slepá zkouška.

Složení reakčního roztoku

Reakční směs

XX roztok hydroxylaminu

0,1 M aspartát draselný, pH 7,0 roztok enzymu voda do

ml ml ml ml

M tris-HCl, pH 8,1, 9 ml + 0,3 M síran horečnatý,

0,5 ml + 0,2 M AT?, pH 7,0, 5 ml,

X X

M roztok hydroxylaminu byl neutralizován přidáním KOH těsně před použitím.

K reakčr.ímu roztoku s obsahem enzymu byly přidány různé koncentrace L-lysinu pro měření účinnosti enzymu AK a byl sledován stupeň inhibice L-lysinem. Výsledky jsou uvedeny na obr. 6 a v tabulce 3. Výsledky pro divoký typ a pno mutanty č. 24, 43, 48, 60, 80, 117 a 126 jsou znázorněny na obr. 6A, výsledky pro mutanty č. 149, 150, 156, 158, 167,

169 a 172 jsou znázorněny na obr. 6B.

Jak je z uvedených výsledků zřejmé, dochází k silné inhibici AKIII divokého typu působením L-lysinu, a to k 50% inhibici při koncentraci přibližně 0,45 mM a ke 100% inhibici při koncentraci 5 mM L-lysinu. Na druhé straně získané mu tanty AKIII byly ve všech případech desenzitizovány proti té to inhibici, i když rozsah desenzitizace byl různý. Zejména v případě mutant č. 24, 80, 117, 169 a 172 bylo možno pozoro vat inhibici pouze výjimečně i při koncentraci 100 mM L-lysi nu a 50% inhibiční koncentrace pro tyto mutanty byly nejméně 200x vyšší ve srovnání s enzymem divokého typu. Specifická účinnost na celou bílkovinu, která by mohla být ovlivněna růstovou fází buněk a způsobem přípravy vzorků byla stejná nebo vyšší než v případě enzymu divokého typu téměř ve všech případech, takže v podstatě nevzniknul problém snížení účinnosti v důsledku zavedení mutace, jak je zřejmé z tabulky 3.

Na základě těchto skutečností je možno předpokládat, že oblast pro účinnost ΑΚΣΣΣ je nezávislá na řídící oblasti, která může být nepříznivě ovlivněna L-lysinem. V tabulce 3 znamená stupeň desenzitizace inhibice v procentech účinnost enzymu AK v přítomnosti 100 mM L-lysinu ve srovnání s účinností téhož enzymu bez přítomnosti L-lysinu. Tepelná stálost v procentech je poměr zbývající účinnosti po působeni teploty 55 0 po dobu 1,5 hodiny ve srovnání s původní účinností.

Tabulka 3 specifická účinnost stupeň desenU/mg bílkoviny zitizacs v %^X tepelná . .. .,xx stálost, %

. type	0.0247	0	13
117	0.0069	120	0
24	0.0213	100	30
80	0.0244	99	36
172	0.0139	97	0
169	0.0128	96	4
150	0.0062	“7 / /	25
125	0.0250	61	39
149	0.0256	59	9
157	0.0083	43	45
43	0.0223	33	42
60	0.0144	35	9
153	0.0224	22	42
156	0.0101	13	2
43	0.0212	17	0

Účinnost AK v % v přítomnosti 100 mM L-lysinu ve srovnání s účinností céhož enzymu v nepřítomnosti L-lysinu, ^xx poměr zbývající účinnosti v % po působení teploty 55 °C po dobu 1,5 hodiny.

Bylo zapotřebí prokázat chování mutant enzymů při vyšších teplotách. V případě, že účinnost enzymu má být zvýšena, je důležité, aby vytvořený enzym zůstával stálý i v buňkách. Při měření in vitro se vyskytují některé problémy vzhledem k odlišnosti účinnosti některých proteáz uvnitř buněk a mimo ně a v důsledku vlivu pufrů na skladování enzymů in vitro. Avšak vzhledem k tomu, že tato metoda je jednoduchá, byla tepelná stálost mutant AKIII sledována také in vitro.

Z výsledků sledování inaktivace uvedených mutant při různých teplotách za různých podmínek byl nakonec jako vhodný ukazatel zvolen poměr zbývající účinnosti po působení teploty 55 °C po dobu 90 minut k původní účinnoszi. Jak je zřejmé z tabulky 3, přibližně polovina mutovaných enzymů byla stálejší než enzym divokého typu. Tato skutečnost je zajímavá vzhledem k tomu, že mutované enzymy jsou často méně stálé než enzym původní. Avšak v tomto případě byly některé mutanty AKIII velmi stálé a řada z nich bude pravděpodobně dobře prakticky použitelná pro výrobu L-lysinu.

2-2-4 Stanovení sekvence baží lysC divokého typu a mutovaného lysC

Nukleotidová sekvence genu lysC divokého typu byla stanovena běžnými postupy při použití analyzátoru ABI Model 373A (Applied Biosystems lne.). Analyzován byl řetězec č. 7. V důsledku této analýzy byly prokázány rozdíly na šesti místech (dvě místa na úrovni aminokyselin) ve srovnání s již zveřejC 'Z něnou sekvencí pro lysC z kmene Ξ. coli K-12 JC411 podle Cassan M., Rarsct C., Cohen G. . a Patte J. G., J. Bicí. chem., 251, 1052, 1986. Je pravděpodobné, že rozdíl v uvedených šesti místech je typický pro použitý odlišný bakteriální kmen.

Obdobným způsobem byla analyzována sekvence baží pro v

každou ze čtrnácti mutant pLYSCl, které jsou označeny lysC a byla určena místa, v nichž došlo k mutaci. Výsledky této. analýzy jsou uvedeny v následující tabulce 4. V této tabulce znamenají údaje, uvedené v závorkách mutace zbytků aminokyselin, k nimž došlo v důsledku mutací nukleotidů. Bylo prokázáno 12 typů mutací vzhledem k ternu, že dvě dvojice mutant, a to mutanta č. 4 a 167 a mutanta č. 24 a 80 obsahovaly tutéž mutaci. Pokud jde o způsob tvorby mutace, byly mutace č. 149, 150, 156, 153, 157, 169 a 172 získány po působení hydroxylami nu a mutace č. 24, 43, 48, 60, 30, 117 a 126 byly získány po působení NTG. Avšak pokud jde o typ mutace, šlo o mutace z cytosinu na thimin nebo o mutaci z guaninu na adenin na kódovém řetězci vzhledem k mutaci z cyzosinu na thymin v nekodové části řetězce.

Tabulka 4

Určení míst mutace v genech lysí

mutace lysC '	mutagen	místo mutace (změna
mutace č.		aminokyseliny)
126	N	GG7-GA*7	(323Giy-Asc
d **	N	GGT-GA’T	( 323Gly-As?
		GGC-GA’C	(408Gly-As?
149	r· Λ	CG7-T*GT	( 34Arg-Cys
		GGT-G.VT	(323Glv-Asc
43/157	N/H	Γ	(32SLeu-?h=
150	H	ATG-iT- *	(318Met-21e
1~2	?:	77	(tichá}
		ATG-ATA’	(318Me--:ie
		GTG-A’TG	( 349Vai-Mec
117	N	TCZ—tt*	( 345Ser-ůeu
153	H	GTG-A*TG	( 347VaI-Met
24/30	N/N	A £ Γ· 2.m * Γ1	( 352Thr-Zia
159	lt.4	923C-T	(tichá)
		ACC-AT*C	(3S2Thr-Iis'
		ni	(3S9Ser-?he:
50	N	aS9G-A	(tichá)
		GAA-A*AA	(lS4GIu-Lys:
1 3 5	K	ATG-ATA*	(417Met-Zla)
		TGT-7A*T	(419Cys-Tyr)
		2014(^-T	(tichá)

působení hydroxylaminu, N = působení NTG

Příklad 3

Výroba L-lysinu fermer.tací kmene s obsahem dapA*

Aby bylo možno vyrábět L-lysin při využití bakterií E. coli podle zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 56-18596 a také podle US č. 4 346 L70 a Applied Microbioiogy and Biotechnoiogy, 15. 227 - 231, 1982, bylo považováno za podstatné, aby hostitel, vybraný pro zlepšení účinnosti DDPS produkoval aspartokinázu, modifikovanou tak, aby u ní nedocházelo k inhibici L-Iysinem. Příkladem takového kmene mohou být bakterie, produkující L-threonin. Z těchto kmneů má kmen E. coli B-3996 dosud r.ejvyšší známou produktivitu. Z tohoto důvodu byl kmen 3-3996 použit jako hostitelský kmen pro výhod noceni dapA . Kmen B-2996 obsahuje plasmid pVIC40 extrachromo somálně jako samostatný plasmid. Podrobnosti jsou uvedeny ve zveřejněné japonské patentové přihlášce č. 3-501682 (PCT). Tento mikroorganismus je uložen ve veřejné sbírce kultur Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding pod registračním číslem RIA 1867.

Na druhé straně byl gen dapA*, obsažený v pdapAS24 (v němž je zbytek histidinu v poloze 118 nahrazen zbytkem tyrosinu) zvolen jako dapA pro uložení do Ξ. coli na základě stupně desenzitizace inhibice a specifické účinnosti enzymu. Aby bylo možno zvýšit expresi genu dapA* a současně zvýšit stálost plasmidů, byl mutovaný gen, existující v pdapAS24, který bude dále uváděn jako dapA*24 navázán proti směru exprese od promotoru genu pro odolnost proti tetracykli nu v pVIC40 a tím bylo možno získat RSF24P, jak je znázorněno na obr. 7.

Kmen, který byl získán uložením plasmidů RSF24P do kmene E. coli JM109 byl označen AJ12395 a tento kmen byl uložen 23. října 1993 do veřejné sbírky kultur National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology pod pořadovým číslem FERM P-13935 a pak byl z původního místa uložení přenesen v tomtéž místě do mezinárodní sbírky, odpovídající Budapeštské úmluvě, kde byl zařazen 1. listopadu 1994 pod pořadovým číslem FERm 3F-4853. Kmeny s uloženými plasmidy pdapAS8 a pdapAS9 nebyly uloženy. Avšak všechna místa mutací v genech dapA v každém z těchto plasmidů byla ověřena, jak již bylo svrchu popsáno. Je tedy pro odborníka snadné izolovat plasmid z uloženého mikroorganismu při použití způsobu podle publikace Sambrook J., Fritscn E. F., Maniatis T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21, 1989, a požadovaný gen je možno připravit cílenou tvorbou mutace podle téže publikace, 15.63, 1989.

Plasmid pVIC40 byl odstraněn z kmene 8-3996 běžným způsobem a tak byl získán kmen B-399, neobsahující žádný plasmid. Do tohoto kmene byl pak uložen známým způsobem plasmid RSF24P, čímž byl získán kmen B-3999/RSE24P. Pak byla vyhodnocena produktivita získaného kmene pro L-lysin.

Mimoto byl zkonstruován plasmid RSFP jako kontrolní plasmid. Velký fragment byl izolován z plasmidů pVIC40 po dvojím štěpení enzymy BamHI a Dral, jak je znázorněno na obr. 7 a konce byly vyplněny Klenowovým fragmentem DNA-polymerázy. Velký fragment s vyplněnými konci byl pak svými konci navázán za vzniku plasmidů RSFP, který byl běžným způsobem uložen do kmene 3-399 a tím byl získán kmen B-399/RSFP. I pro tento kmen byla vyhodnocena produktivita pro L-lysin.

Kmeny byly pěstovány v třepací kultuře při 114 až 116 ot/min celkem ^3 hodin při teplotě 37 °C v prostředí s následujícím složením. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 5.

Prostředí pro produkci L-lysin

A.

složka g/1 síran amonný 16 dihydrogenfosforečnan draselný 1

MgS0₄.7H,3 1

FeS0₄.7H_?0 0,01

MnS0₄.5H₂0 0,01 extrakt z kvasnic (Difco) 2

L-methior.in 0,5

L-threonin 0,1

L-isoleucin 0,05 pH se upraví na 7,0 přidáním KOH, sterilizace minut v autoklávu při 115 °C.

(objem 15/20).

B.

20% glukosa, sterilizace 10 minut v autoklávu při

115 °C (objem 4/20).

C .

Uhličitan vápenatý s čistotou podle lékopisu, sterilizace teplem v suchém stavu dva dny při teplotě 180 °C, 30 g/1.

Složky A a B se smísí v poměru 4 : 1, do 1 litru této směsi se přidá 30 g složky C, která se rozpustí a pak se přidají antibiotika, a to 100 mikrogramů/ml streptomycinu a 5 mikrogramů/ml kanamycinu.

Tabulka

Bakteriální kmen

B-399/RSF24P

B-399/RSFP produkované množství L-lysinhydrccnloridu

4,1 g/1 0,0 g/1

Příklad 4

Produkce L-lysinu fermentací při použití kmene s uloženými geny dapA⁵⁴ a lysC⁵⁴ (I)

Účinek mutanty DDPS na produkci L-lysinu byl popsán v příkladu 3. Aby bylo možno dosáhnout dalšíhc zlepšení, byl mutovaný gen pro AKIII, získaný v příkladu 2 uveden do koexistence s mutovaným genem DDPS. Mutovaný gen AKIII k tomuto účelu byl vybrán z kmene č. 80 (lysC^eO) na základě účinnosti enzymu, jeho tepelné stálosti a dalších paramecrů.

Gen lysC80 byl použit po vyjmuti z plasmidú pLLC 80 (obr. 8), který byl připraven navázáním genu lysC⁵⁴ z plasmidu pLYSCl 80 (dále bude uváeěn jako lysC 80) proti směru exprese od promotoru lacZ v plasmidú pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.), Uložení je v obráceném směru vzhledem k plasmidú pUC18, tak, aby bylo možno zvýšit expresi genu lysC⁵⁴. Plasmid pLLC^X80 je plasmid, který byl připraven k tomu účelu, aby bylo umožněno zajistit směr transkripce genu lysC^eo v normální orientaci vzhledem k promotoru lacZ a tak bylo možnc zlepšit produktivitu pro L-lysin vzhledem k tomu, že lycC^SO v plasmidú pLYSCl 80 má směr transkripce v obrácené orier.raci vzhledem k promotoru lacZ.

Z plasmidú pLLC^M80 a RSF24P, získaných v příkladu 3 byl připraven plasmid RSFD80, obsahující geny dapA⁵⁴ a lysC⁵⁴, jak je znázorněno na obr. 9. Plasmid RSFDSO obsahuje geny dapA 24 a lysC'80 v uvedeném pořadí tak, aby směr transkripce byl v normální orientaci vzhledem k tetP proti směru exprese od promotoru tetP v genu pro odolnost proti tetracyklinu.

Plasmid RSFD80 byl pak uložen do kmene E. coli JM109 a tento kmen byl označen AJ12396 a pak uložen do veřejné sbírky kultur National Institute of Bioscience and Huraan Technology of Agency of Industrial Science and Technology dne 28. října 1993 pod pořadovým číslem FERM P-13936 a pak byl 1. listopadu 1994 přenesen z původního uložení do mezinárodní sbírky, odpovídající Budapeštcké úmluvě, kde byl uložen pod pořadovým Číslem FERM BP-4859. Kmeny, obsahující mutované plasmidy 1PYSC1*24, pLYSCl*43, pLYSCl*48, pLYSCl*60, pLYSCl*117, pLYSCl*126, pLYSCl*149, pLYSCi*150, pLYSCl*156, pLYSCl*153, pLYSCl*167, pLYSCl*169 a pLYSCl*172 nebyly uloženy. Avšak všechna místa mutací v každém z uvedených plasmidů byla definována, jak již bylo svrchu uvedeno. Pro odborníka bude tedy snadné izolovat plasmid ze svrchu uloženého mikroorganismu při použití způsobu podle publikace Sambrook J., Fritsnc E. F., Maniatis T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21, 1989, a pak získat požadovaný gen při použití cílené tvorby mutace podle téže publikace, 15.63, 1989. Plasmid RSFD80 se uloží do kmene B-399 běžným způsobem, čímž vzniká kmen B-399/RSFD8O. Produktivita tohoto kmene pro L-lysin byla vyhodnocena a podobným způsobem byla vyhodnocena také produktivita kontrolního kmene B-399/RSFP.

Kmeny byly pěstovány v třepací kultuře při 114 až 116 ot/min po dobu 48 hodin při teplotě 37 °C při použití téhož živného prostředí, které bylo použito pro produkci L-lysinu v příkladu 3. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6.

Tabulka 6 bakteriální kmen produkované množství L-lysinhydrochloridu

B-399/RSFD80

B-399/RSFP

9,2 g/1

0,0 g/1

Příklad 5

Produkce L-lysinu fermentací při použití kmene s uloženými geny dapA* a lysC* (II)

V příkladu -! bylo potvrzeno, že produktivitu pro L-lysin je možno zlepšit tak, že se do bakterie z rodu Escherichia uloží mutovaný gen dapA a současně mutovaný gen lysC. Byly proto prováděny pokusy za účelem zjistit, zda se tento účinek změní v případě, že se užije jiný hostitel.

V tomto případě byl jako hostitel použit kmen Ξ. coli W3110 (tyrA). tento kmen byl podrobně popsán ve zveřejněné evropské patentové přihlášce č. 488424/92. Dále bude krátce popsán způsob získání kmene s uloženými mutovanými geny. Kmen E. coli W3110 byl získán z veřejné sbírky National Institute of Genetics (Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japonsko). Kmen byl naočkován na plotnu LB s obsahem streptomycinu a kmen, odolný proti streptomycinu byi získán vybíráním kmenů, které na tomto živném prostředí vytvářely kolonie. Zvolený kmen, odolný proti streptomyci.ru byl smísen s kmenem E. coli K-12 ME8424 a oba kmeny byly společně pěstovány na úplném živném prostředí (L-bujon: 1 % tryptonu Bacto, 0,5 % extraktu z kvasnic a 0,5 % NaCl) 15 minut při teplotě 37 °C, aby došlo ke konjugaci Kmen E. coli K-12 ME8424 má genetickou charakteristiku (HfrP045, thi, relAl, tyrA::TnlO, ung-1, nadB) a je možno jej získat ze sbírky National Institute of Genetics.

Směs pak byla naočkována na svrchu uvedené úplné živné prostředí s obsahem streptomycinu, tetracyklinu a L-tyrosinu a byly izolovány kmeny, vytvářející za těchto podmínek kolonie. Izolovaný kmen byl označen E. coli W3110 (tyrA).

Ve zveřejněné evropské patentové přihlášce č. 488424/92 se popisuje celá řada kmenů, získaných uložením různých piasmidů do kmene W3110 (tyrA). Například kmen, který byl získán uložením plasmidú pHATerm byl označen jako kmen E. coli W3110 (tyrA)/pHATerm a byl uložen do veřejné sbírky kultur National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology, pod pořadovým číslem FERM BP-3653. Kmen W3110 (tyrA) je možno připravit také úpravou kmene E. coli W3110 (tyrA)/pHATerm tak, že se z tohoto kmene vyjme plasmid pHATerm. Toto vyjmutí je možno uskutečnit některým z běžných postupů.

X

Plasmid RSFD8O, který obsahuje mutované geny dapA“ a lysC , získaný podle přikladu 4, byl uložen do svrchu popsaného kmene W3110 (tyrA), čímž byl získán kmen W3110 (tyrA)/ /RSFD8O. Pro tento kmen pak byla vyhodnocena produktivita při produkci L-lysinu. K vytvoření kontrolního kmene byl plasmid RSFP uložen rovněž do kmene W3110 (tyrA) běžným způsobem, čímž byl vytvořen kmen W3110 (tyrA)/RSFP. Také pro tento kontrolní kmen byla vyhodnocena jeho produktivita při produkci L-lysinu.

Oba kmeny byly pěstovány v třepací kultuře při 114 až 116 ot/min po dobu 48 hodin při teplotě 37 °C a při použití svrchu uvedeného živného prostředí pro produkci L-lysinu. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 7.

Tabulka 7 bakteriální kmen produkované množství L-lysinhydrochloridu

W3110 (tyrA)/RSFD80 8,9 g/1

W3110 (tyrA)/RSF? 0,0 g/1

Příklad 6

Analýza systému, produkujícího biosynteticky L-lysin a zlepšení produktivity pro L-lysin u bakterií z rodu Escherichia produkující L-lysin

Při zlepšování produktivity L-lysinu je zapotřebí analyzovat systém pro biosyntézu L-lysinu z E. coli a geny pro enzymy, které katalyzují jednotlivé stupně produkce L-lysinu těmito kmeny fermentací.

1. Identifikace prvořadých určujících stupňů

6-1-1 Příprava genů pro systém biosyntézy L-lysinu

V tomto stupni byly izolovány různé geny v systému pro biosyntézu L-lysinu, tyto geny byly uloženy do E. coli a byly sledovány účinky těchto genů na produktivitu těchto kmenů pro L-lysin. Uložené geny pro enzymy z tohoto sytému a enzymy, pro něž byly uložené geny kódovými řetězci, budou dále uvedeny.

ppc: fosfoenolpyruvátkarboxyláza aspC: aspartátaminotransferáza lysC: aspartokináza III lysC 80: aspartakináza III, desenzitizovaná proti inhibicí asd: aspartátsemialdehyddehydrogenáza dapA: dihydrodipikolinátsyntetáza dapA 24: dihydrodipikolinátsyntetáza, desenzitizovaná proti inhibicí dapB: dihydrodipikolinátreduktáza

DDH: diaminopimelátdehydrogenáza, pocházející z Brevibacterium lactofermentum lysA: diaminopimelátdekarboxyláza.

Svrchu uvedenými geny je možno zcela pokrýt biosyntézu L-lysinu od kyseliny fosfoenolpyrohroznové až k L-lysinu.

Geny dapC, dapD, dapE a dapF jsou geny ze systému pro biosyntézu L-lysinu, původně obsažené v E. coli. Tyto geny byly nahrazeny genem DDH s kódovým řetězcem pro enzym DDH, diaminopimelátdehydrogenázu z Brevibacterium lactofermentum, tento enzym může katalyzovat reakce, týkající se produktů tohoto genu. Jako hosticelský kmen pro uložení uvedených genů byl vybrán kmen W3110 (tyrA) ze skupiny E. coli K-12.

Geny dapA a dapA 24 byly získány izolací z plasmidů pdapA2 a pdapAS24 (příklad 1) při použití štěpení enzymy EcoRI a KpnI, jak je znázorněno na obr. 1G. Uvedené geny byly uloženy do plasmidu pMW118, rozštěpeného enzymy EcoRI a KpnI, čímž byly získány plasmidy pdapA a pdapA*. Geny LysC a lysC 80 byly získány rozštěpením plasmidů pLYSCl a pLLC 80 (příklad 2) enzymy EcoRI a SpHI. Pak byly tyto geny uloženy do plasmidu pMW119, rozštěpeného enzymy EcoRI a Sphl za vzniku

O ?€ X \x plasmidu plysC a plysC' , jak je znázorněno na obr. 11.

Gen ppc byl získán z plasmidu pT2, který tento gen obsahuje. Plasmid pT2 byl rozštěpen enzymy Smál a Seal, zakončení byla vyplněna a pak byl gen uložen do místa štěpení enzymem Smál v plasmidů pMWHS za vzniku plasmidů pppc, jak je zřejmé z obr. 12. Kmen Ξ. coli F15 (AJL2873), obsahující piasmid pT2, byl uložen do veřejné sbírky National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology pod pořadovým číslem FERM BP-4732.

Gen aspC byl získán z plasmidů pLF4, popsaného v Inokuchi K. a další, Nucleic Acids Res., 10, 6957, 1982, který tento gen obsahuje, jak je zřejmé z obr. 13. Piasmid pLF4 byl rozštěpen enzymy PvuII a Stul, zakončení byla vyplněna a gen byl uložen do místa štěpení enzymem Smál v plasmidu pMW119, čímž byl získán piasmid paspC.

Gen asd byl získán z plasmidů pAD2G, který tento gen obsahuje a byl· popsán v Haziza C. a další, ΞΜΒ0, 1, 379, 1982 Piasmid pAD20 byl rozštěpen enzymy Asel a Clal, konce byly vyplněny a gen pak byl uložen do místa štěpení enzymem Smál v plasmidů pMW118 za vzniku plasmidů pasd, který je znázorněn na obr. 14.

Gen dapB byl získán amplifikací genu dapB z chnomosomální DNA kmene E. coli W3110 metodou PCR při použití dvou typů oligonukleotidových primerů s řetězci č. 9 a 10, přímeny byly připraveny na bázi nukleotidové sekvence známého genu dapB, popsaného v Bouvier J. a další, J. biol. Chem., 259, 14829, 1984 a znázorněného na obr.'15. Získaný ampiifikovaný fragment DNA byl rozštěpen působením enzymů Asel a Dral, zakončení byla vyplněna a gen byl uložen do místa působení enzymu Smál v plasmidů pMW119, čímž vznikl piasmid pdapB.

Gen DDH byl získán amplifikací genu DDH z chromosomální DNA mikroorganismu Bnevibacterium lactofermentum ATCC 13869 pomocí PCR při použití dvou typů oligonukleotidových primerů s řetězci č. 11 a 12, připravených na bázi známé nukleotidové sekvence genu DDH z Corynebacterium glutamicum podle Ishino S. a další, Nucleic Acides res., 15, 3917, 1987. Získaný amplifikovaný fragment DNA. byl rozštěpen enzymy Eco T221 a Aval, konce byly vyplněny a gen byl uložen do místa štěpení enzymem Smál v plasmidu pMW119, čímž byl získán plasmid pDDH, znázorněný na obr. 16.

Gen lysA byl získán amplifikací genu lysA z chromosomální DNA kmene E. coli W3110 pomccí PCR při použití dvou typů oligonukleotidových primerů s řetězci č. 13 a 14, připravených na bázi nukleotidové sekvence známého genu lysA podle Stragier ?. a další, J. Mol. Biol., 168, 321, 1983. Získaný amplifikovaný fragment DNA byl rozštěpen enzymy SplI a Bell, konce byly vyplněny a gen byl uložen do místa štěpení enzymem Smál v plasmidu pMW118, čímž byl získán plasmid plysA, znázorněný na obr. 17.

Potvrzení skutečnosti, že každý ze svrchu uvedených genů byl klonován, bylo provedeno rozštěpením těchto genů působením restrikčních enzymů, znázorněných na výkresech. Vektory pMW118 a pMW119 (Nippon Gene), použité pro klonování uvedených genů byly vybrány z toho důvodu, že tyto plasmidy mohou existovat současně v buňkách Escherichia coli spolu s RSF1O1O jako vektorem, užitým pro přípravu plasmidů pro výrobu lysinu, mimoto mají tyto vektory stabilní distribuční mechanismus.

6-1-2 Produktivita Escherichia coli s uloženými geny biosyntetického syszému pro výrobu L-lysinu

Kmen E. coli W3I10 (tyrA) byl transformován každým z plasmidů, obsahujících svrchu popsané geny biosyntetického systému L-lysinu a získané transformované kmeny byly pěstovány k dosažení produkce L-lysinu. Kmeny byly pěstovány 30 hodin při teplotě 37 °G v třepací kultuře při 114 až 116 ot/min při použití následujícího prostředí. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 8.

Složení živného prostředí složka g/1 glukosa 40

MgS0₄.7H_?0 1 síran amonný 16 dihydrogenfosforečnan draselný 1 síran žeieznatý . 7H,-,Q 0,01 síran manganatý . δΗ^Ο 0,01 extrakt z kvasnic (difco) 2,0

L-tyrosin 0,1

Hodnota pH byla upravena na 7,0 přidáním KOH a pak bylo prostředí sterilizováno 10 minut v autoklávu při teplotě 115 °C. Glukosa a síran hořečnatý byly sterilizovány odděleně .

Uhličitan vápenatý s čistotou, odpovídající Lékopisu v množství 25 g/1 byl v suchém stavu sterilizován teplem dva dny, použitá teplota byla 180 °C.

Mimoto byla přidávána antibiotika v závislosti na typu použitého plasmidů, a to 20 mg/1 střeptomycinu nebo 50 mg/1 ampicilinu.

Tabulka 8

bakteriální kmen produkované množství L-lysinhydrochloridu g/i	výtěžek v závislosti na cukru v %
W3110(tyrA)	0.08	0.2
W3110(tyrA)/pope	0.03	0.2
W3110(tyrA)/paspC	0.12	0.3
W3110(tyrA)/plysC	0.08	0.2
W3110(tyrA)/plysC*	2.27	5.57
W3110(tyrA)/pasd	0.12	0.3
W3110(tyrA)/pdapA	2.32	5.70
W2110 (tyrA) /pdapA.*	3.63	3.90
W31L0(tyrA)/pdapB	0.08	0.2
W3110(tyrA)/pDDH	0.08	0.2
W3110(tyrA)/plysA	0.12	0.3

Kmen E. coli W3110 (tyrA) produkuje L-lysin po uložení plasmidů plysC , pdapA nebo pdapA . Vzhledem k tomu, ze u produktů genů lysC a dapA je možno pozorovat inhibicí L-lysinem vzhledem ke zpětné vazbě je možno předpokládat, že tyto enzymy jsou hlavními látkami, řídícími biosyntézu L-lysinu. Reakce, katalyzovaná produktem genu dapA je reakcí, v níž se biosyntetický systém větví na výrobu L-threoninu, L-methioninu a L-isoleucinu a biosyntetický systém pro výrobu L-lysinu a jde tedy o první stupeň biosyntetického systému, vlastního pro produkci L-lysinu. Bylo již uvedeno, že E. coli začíná produkovat L-lysin také po amplifikaci genu dapA divokého typu podle Eur. J. Appl. Microbiol. 3iotechnol., 15, 227, 1982, což také potvrzují svrchu uvedené výsledky. Na druhé straně byl opět potvrzen výsledek příkladu 3, že zotiž výtěžek L-lysinu je možno dále zvýšit v případě, že se do E. coli uloží mutovaný gen dapA*, jehož produkt je deserzitizován proti inhibici zpětnou vazbou.

Surové roztoky enzymu byly připraveny z kmenů W3110 (tyrA), W3110 (tyrA)/pdapA a W3110 (tyrA)/pdapA* stejným způsobem jako v příkladu 1 a pak byla měřena účinnost dihydro dipikolinátsystetázy, DDPS a stupeň inhibice této účinnosti

působením L-lysinu.	Výsledky jsou uvedeny	v tabulce 9.
	Tabulka 9
bakteriální kmen	spec if ická	stupeň desenzi
	, ~ . , X ucinnost	X X inhibice
W3110(tyrA)	0,0423	50
W3110 (tyrA/pdapA	0,2754	22,9
W3110 (tyrA)/pdapA*	0,1440	76,5

mikromoly/min/mg bílkoviny

XX Z Z V Z poměr účinnosti v %, zbývající v přítomnosti 5 mM L-lysinu.

Produkt genu dapA*, desenzitizovaný proti inhibici má pravděpodobně velký účinek na produkci L-lysinu vzhledem k vysokému stupni desenzitizace inhibice, přestože má nižší specifickou účinnost než enzym divokého typu, přibližně o jednu polovinu. Nutnost desenzitizace inhibice produktu dapA byla prokázána na produkci L-lysinu.

Mimoto je znejme, ze lysC má vliv na produkci L-lysinu také z následujcích skutečností. Prvořadým určujícím stupněm je stupeň, v němž se HD (homoserindehydrogenáza, produkt thrA nebo metLM) dostává do kcmpetice s DDPS (produkt dapA) o ASA, aspartát-beta-semialdebyd jako substrát v místě rozvětvení biosyntetického systému, takže v případě, že gen dapA je zvýhodněn svrchu uvedeným způsobem, probíhá reakce ve směru biosyntézy L-lysinu. Na druhé straně je pravděpodobné, že v případě, že se zvýší přiváděné množství AS?, zvýhodněním genu IysC, ktený se účastní reakce dále od genu dapA, je kterákoliv z reakcí, jíž se účastní HD a DDPS rovněž usnadněna a produkce L-lysinu se rovněž zvyšuje. Avšak tohoto výsledku je jen zřídka možno dosáhnout pouze zvýhodněním genu IysC divokého typu. Příčina spočívá pravděpodobně v tom, že inhibice divokého typu AKIII (produktu IysC) působením L-lysinu je pravděpodobně více vyjádřena než inhibice divokého typu DDPS (AKIII a DDPS jsou innibovány přibližně na 100 % a 80 % v přítomnosti 5 mM L-lysinu).

Vzhledem ke svrchu uvedeným skutečnostem je velmi pravděpodobné, že reakce DDPS má vyšší účinek a je tedy prvořadým určujícím stupněm a reakce AKIII je dalším, druhořadým určujícím stupněm.

2. Identifikace druhořadého určujícího stupně

Tato reakce byla analyzována zvýhodněním různých genů systému pro biosyntézu L-lysinu při použití kmenů s uložením genu dapA*. Aby byly ostatní plasmidy stabilně uloženy po uložení do E. coli,-'byl plasmid, obsahující gen dapA přenesen z pdapA do RSF1010, čímž byl získán RSF24P, jak je znázorněno na obr. ⁷. Plasmidem RSF24P s obsahem genu dapA* byl pak transformován kmen E. coli W3110 (tyrA).

Plasmidy s obsahem genů pro biosyntézu L-lysinu byly uloženy do kmene Ξ. coli W3110 (tyrA)/RSF24P. Byly použity dva typy plasmidu, a to RSF24P a plasmid, obsahující jiný gen pro biosyntézu L-lysinu, přičemž každý z transformovaných organismů obsahoval oba geny. Pak byla zkoumána produktivita těchto, kmenů pro L-lysin stejně jako v odstavci 6-1-2. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 10

Tabulka 10

bakteriální kmen produkované množství L-lysinhydrochloridu	výtěžek v závislosri na cukru v %
	g/1
W3 i i 0 (~ yrA) / RS 72 4 ?	3 . 63	3.9
W3110(tyrA)/RS~24?-opcc	3.67	9.0
W3110(tyrA)/RS724?-paspC	3.59	S .3
W3110(tyrA)/RS724?+pIvsC	3.42	8.4
W3110(tyrA)/RS?24?+plysC*	9.17	22.5
W3110 (tyrA) /R5P24?n?asd	3.75	9.2
W3110(tyrA)/RSP24?^pdapA	3.55	3 . 7
W3110(tyrA)/RSF24?+pdapA*	3.46	3.3
W3110(tyrA)/RS?24?+pdap3	4.08	10.0
W3110(tyrA)/R2P24?+?DDH	3.67	9.0
W3110 (tyrA) /3.272 4P^plysA	3.55	8.7

Jak je zřejmé, bylo dosaženo význačného zlepšení proa duktivity pro L-lysin pouze v případě uloženi genu lysC.

Gen lysC divokého typu byl zcela bez účinku. Příčina spočívá pravděpodobně v příliš silné inhibici L-lysinem, jak jiz bylo svrchu popsáno. Tím bylo potvrzeno, že reakce, jíž se účastní produkt lysC'* má druhořadý význam.

- 71 Gen lysC byl integrován do plasmidu RSF24P za vzniku plasmidu RSFD8G. znázorněného na obr. 9. Stejným způsobem byl také gen lysC integrován do plasmidu RSF24P a získaný plasmid byl označen RSFD1. Oba plasmidy pak byly uloženy do kmene E. coli W3I10 (tyrA), byly připraveny roztoky surového enzymu a byla měřena účinnost enzym AK a stupeň inhibice tété účinnosti působením L-lysinu stejným způsobem jako v odstavci 6-1-2. Výsledky jsou uvedeny v tabulce II.

Tabulka 11 bakteriální kmen specifická , - . . x uc mnost stupeň desenzitizace

..... XX mnibice

W3110	(tyrA)/RSF24P	0,94	42.9
W3110	(typA/RSFCI	18,55	7,2
W3110	(typA)/RS?D80	33,36	98,3

nmol/min/mg bílkoviny xx poměr zbývá cí účinnosti v % v přítomnosti 5 mM L-lysinu.

Specifická účinnost enzymu AK z kmenů, v nichž jsou uloženy plasmidy, byla zvýšena integrací genů LysC a LysC do plasmidu RSF24P 20 až 30x. E. coli obsahuje tři typy enzymů AK, přičemž gen lysC je kódem pro AKIII. Ve svrchu uvedených pokusech však byla měřena celková účinnost všech tří enzymů AK. Je pravděpodobné, že inhibice L-lysinem je vysoká také u kmenů s plasmidem RSED1 s obsahem lysC divokého typu vzhledem k tomu, že podíl AKIII je v tomto případě vyšší než AKI a AKII ve srovnání s kontrolním kmenem W3110(tyrA/RSF24P, protože v tomto případě není možno pozorovat zvýšení produkti72 vity pro L-lysin. Na druhé straně bylo prokázáno, že innibi oe byla desenzitizována na přibližně 100 % pro AKIII u kmen s plasmidem RSED80 a tato skutečnost byla příčinou zvýšení produkce L-lysinu.

3. Identifikace určujícího stupně třetího řádu

Do kmene E. coli W3110(tyrA)/RSFD80 byly uloženy ruz né plasmidy ze systému pro biosyntézu L-lysinu a pak byly · tyto kmeny pěstovány k dosažení produkce L-iysinu. Výsledky této kultivace jsou uvedeny v tabulce 12.

Tabulka 12

bakteriální kmen produkované množství	výtěžek v závisloszi na cukru v %
L-lysinhyd σ / i	rochloridu
NOHO (tyrA) /RSED30	9.17	22.5
W3II0(tyrA)/RSeD80+?ppc	3.97	22.0
W3110 (tyrA) /RSFD80-*-?aspC	9.05	22.2
W3I10(tyrA)/RSeD80+plysC	3.56	21.0
W3110(tyrA)/RSFD80+plysC*	3.15	20.0
W3110(tyrA)/RSED80^pasd	3.35	20.5
W3110 (tyrA) /RS?D8 0-r?dapA	3.56	21.0
W3110(tyrA)/RSED80-?dapA’	3.15	20.0
W31I0(tyrA)/RSED80+pdapS	10.30	25.5
W3110(tyrA)/R3ED30-pDDH	3.56	21.0
W311Q(tyrA)/RScD80+plysA	3.43	20.3

Zlepšující účinek na produktivitu L-lysinu bylo možno pozorovat pouze v případě dapB a byLo prokázáno, že reakce, jíž se účastní produkt genu dapB, je určujícím stupněm třetího řádu. Z tohcso důvodu byl gen dapB uložen do plasmidu RSFD80, čímž vznikl plasmid pCABl, znázorněný na obr. 18. Tento plasmid pak byl uložen do kmene E. coli W3110(TyrA) a byl připraven roztok surového enzymu, pak byla měřena enzymatická účinnoso dihydrodipikolinátreduktázy, DDPR, způsobem podle publikace Tamir H. a Gilvarg C., J. Biol. Chem., · 249, 3034, 1974. Stejným způsobem byly připraveny roztoky surového enzymu z kmene, obsahujícího pouze plasmid RSFD80 a z kmene, obsahujícího oba plasmidy, RSFD3C i pdapB a byla měřena účinnost BDPR. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 13.

Tabulka 13 bakteriální kmen specifická účinnost /umci/min/mg bílkoviny

W3110(tyrA)/RSFD80 0,027 W3110(tyrA)/RSFD80+pdapB 0,092 W3110(tyrA)/pCABl 0,178

Účinnost DDPR byla zvýšena přibližně třikrát u kmene, obsahujícího plasmidy RSFD80 a pdapB a přibližně 6,5x byla zvýšena u kmene obsahujícího plasmid pCABl, v němž je gen dapB uložen do plasmidu RSFD80, ve srovnání s kontrolním kmenem, obsahujícím pouze plasmid RSFD80. Vzhledem k tomu, že kmeny W3110(tyrA)/RSFD80+pdapB a W3110(tyrA)/pCABl měly ekvivalentní akumulaci L-lysinu 10,8 g/1 je zřejmé, že gen dapB byl přítomen v množství, dostatečném pro produkci L-lysinu, a určující stupeň byl přesunut do následujícího stupně.

4.

Identifikace ureu líc stupně čtvrtého řádu

Tato reakce byla identifikována při použití plasmidů pCABI s geny lysC'”', dapA* a dac3. Do kmene 3. coli W3110(tyrA)/pCABI byly uloženy různé plasmidy biosyntetického systému pro produkci L-lysinu a pak byly kmeny pěstovány k dosažení této produkce. Výsledky kultivace jsou shrnuty v následující tabulce 14.

Tabulka 14

bakteriální kmen	produkované mneřství L-lysinhydrochic ridu	výtěže) z a v i s 1! na cuk:
W3110(tyrA)/pCABI	10.8 0	25.5
W3110(tyrA)/pCA31+?ppc	11.00	27.0
W3110(tyrA) /pCABUpaspC	10.38	25.7
W3110 (tyrA) /pCA31+piysC	10.60	26.0
W3110 (tyrA) /pCA31+plysC*	10.39	25.5
W3110 (tyrA) /pCA31+pasd	10.19	25.0
W3110 (tyrA) /pCA31epda?A	10.72	25.3
W3110 (tyrA.) /pCASl+pdapA*	10.30	26.5
W3110(tyrA)/pCA31+?dapB	10.92	26.8
W3110(tyrA)/pCABl-pDDK	12.23	30.0
W31I0(tyrA)/pCABl+plysA	10.60	26.0

Zlepšení produktivity pro L-lysin bylo možno pozorovat pouze v případě DDH a bylo prokázáno, že reakce, katalyzovaná DDH je určujícím stupněm čtvrtého řádu. Mimoto kyselina N-sukcinyl-L,L-alfa,eta-diaminopimelová, SDAP, kterou je možno prokázat v živném prostředí kmene bez produkce DDH nebyla prokázána v živném prostředí kmene, produkujícího DDH. Detekce SDAP byla provedena pomocí TLC, jako syscém rozpouštědel byla užita směs methanolu, vody, ION HC1 a pyridinu v poměru 80 : 17,5 :

: 2,5 : 10, postup byl prováděn podle publikace Bouvier J. Richaud C., Higgins W., Bogler 0. a Stragier P., J. Bacteriol., 174, 5265, 1992. Mimoto byla barva živného prostředí hnědá v případě kmene, neprodukujícího DDH a žlutá v případě kmene, produkujícího DDH. Gen DDH byl integrován do plasmidú pCABl za vzniku plasmidú pCABD2, znázorněného na obr. 19 a byla měřena účinnost DDH pro kmen E. coli W3110(tyrA), transformovaný tímto plasmidem. Účinnost enzymu DDH byla měřena podle publikace Azizono, Haruo, Eermentation and Industry, 45, 964, 1987. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 15.

Tabulka 15 bakteriální kmen specifická účinnost /Umol/min/mg bílkoviny

W3110(tyrA)/pCABl 0,000 W3110(tyrA)/pCA31 + pDDH 0,799 W3110(tyrA)/pCA3D2 2,214

Účinnost DDH nebylo možno prokázat u kontrolního kmene E3110(tyrA)/pCABl vzhledem k tomu, že DDH se původně v E. coli nenachází. Specifická účinnost DDH u kmene s obsahem plasmidú pCABD2, E3110(tyrA)/pCA3D2 byla přibližně 2,5x vyšší než účinnost kmene s obsahem pDDH, W3110(tyrA)/pCABl+pDDH, avšak u obou kmenů bylo prokázáno ekvivalentní hromadění L-lysinu, 12,23 g/1. Js proto zřejmé, že u pCABD2 dochází k dostatečné expresi DDH.

5. Analýza určujícího stupně v případě dapC, dapD, dapE a dapF

Aby bylo možno sledovat určující stupně v případě genů dapC, dapD, dapE a dapF, nahrazených při svrchu uvedené analýze DDH, byly tyto geny nejprve klonovány. Gen dapC nebyl klonován vzhledem k tomu, že neexistují žádné zprávy o jeho sekvenci baží, tři zbývající geny však byly klonovány obvyklým způsobem při použizí PCR.

Gen dapD byl získán amplifikaci genu dapD z chromosomální DNA kmene E. coli W3110 při použití PCR a dvou typů oligonukleotidových primerů s řetězcem č. 15 a č. 16, připravených na bázi nukleotidové sekvence známého genu dapD, který byl popsán v publikaci Richaud C. a další, J. Biol. Chem., 259, 15824, 1984. Získaný amplifikovaný fragment DNA byl rozštěpen enzymy Eco0109I a Sací, zakončení byla doplněna a frag ment byl uložen do místa štěpení anzymem Smál v plasmidú pMW118 za vzniku plasmidú pdapD, znázorněného na obr. 20.

Gen dapE byl získán amplifikaci genu dapE z chromosomální DNA kmene Ξ. coli W3110 pomocí PCR při použití dvou typů oligonukleotidových primerů s řetězcem č. 17 ač. 18, které byly připraveny na bázi nukleotidové sekvence známého genu dapE, popsaného v publikaci Bouvier J. a další, J. Bacteriol. 174, 5265, 1992. Získaný amplifikovaný fragment DNA byl rozštěpen enzymy MunI a BglII, vzniklá zakončení byla vyplněna a pak byl získaný fragment uložen do místa působení enzymu Smál v plasmidú pMWllS za získání plasmidú pdapE z obr. 21.

Gen dapF byl· získán amplifikací genu dapF z chromosomální DNA kmene E. coli W3110 při použití metody PCR a dvou typů oligonukleotidových primerů č. 19 ač. 20, připravených na bázi nukleotidové sekvence známého genu dapF, popsaného v publikaci Richaud C. a další, Nucleic Acids Res., 16, 10367, 1988. Takto získaný amplifikovaný fragmenz DNA byl rozštěpen působením enzymu Pstl, zakončení byla vyplněna a fragment byl uložen do místa působení enzymu Smál v plasmidu pMW118, čímž byl získán plasmid pdapF z obr. 22.

Každý z plasmidů, získaných svrchu uvedeným způsobem byl uložen do kmene W3110(tyrA)/pCABl a kmen byl pěstován k dosažení produkce L-lysinu. V předchozím pokusu bylo možno pozorovat změny, pokud jde o barvu živného prostředí a také pokud jde o přízomnosz nebo nepřítomnosz meziproduktu SDAP kromě produkce L-lysinu před zavedením a po uložení DDH. Analýza určujícího stupně byla proto provedena také při použití těchto ukazatelů. Výsledky pokusů jsou shrnuty v následující tabulce 15.

	T a b u 1	k a 16
bakteriální kmen	produkce L-lysin. HC1 g/1	výtěžek ve vztahu k cukru,%	barva živného prostředí	tvorba SDAP
W3110(tyrA)/pCABl	10,80	26,5	hnědá	-f-
W3110(tyrA)/pCABl+ +pdapD	11,08	27,2	žlutá
W3110(tyrA)/pCABl+ +pdapE	11,12	27,3	hnědá	-
W3110(tyrA)/pCABl+ +pdapF	10,96	26,9	hnědá	+
W3110(tyrA)/pCABD2	12,23	30,0	žlutá	-

Množství produkovaného L-lysinu se poněkud zvýší při výhodném uložení dapD nebo dapE, avšak nepřevyšuje množství při použití DDH. Mimoto bylo prokázáno, že změna barvy živného prostředí a hromadění SDAP jako meziproduktu, které byly pozorovány po uložení genu DDH, jsou navzájem nezávislé jevy. Změna barvy živného prostředí je důsledkem dapD a vymizení SDAP je důsledkem přítomnosti dapE. Vztah mezi přítomností dapE a přítomností SDAP je možno předpokládat na základě způsobu biosyntézy L-lysinu. Výhodné uložení dapF nemělo žádný vliv na zvýšení produkce L-lysinu.

Gen dapE byl štěpením vyjmut z plasmidu pdapE a byl uložen do plasmidu pdapD za vzniku plasmidu pMWdapDEl, který obsahuje oba geny, dapE i dapD, jak je zřejmé z obr. 23. Mimoto byl štěpením vyjmut z plasmidu pMWdapDEl fragment, obsahující oba uvedené geny a tento fragment byl uložen do plasmidu pCAEl za vzniku plasmidu pCABDEl, který je znázorněn na obr. 24. Kmeny s uloženými plasmidy pCABl, pCABDEl nebo pCABD2 a kmen, v němž jsou uloženy plasmidy pCA3DEl i pdapF pak byly použity po uložení do mikroorganismů pro produkci L-lysinu získanými kmeny. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 17.

Tabulka	17
bakteriální kmen	produkce L-lysin. HC1 g/1	výtěžek ve vztahu k cukru,%	barva tvorba živného SDAP prostředí
W3110(tyrA)/pCA31	10,80	26,5	hnědá +
W3110(tyrA)/pCABDEl	12,23	30,0	žlutá
W3110(tyrA)/pCA3DEl+ -ι-pdapF	11,82	29,0	žlutá
E3110(tyrA)/pCA3D2	12,23	30,0	žlutá

Bylo zjištěno, že množství produkovaného L-lysinu, zbarvení živného prostředí a přítomnost nebo nepřítomnost SDAP jsou v podstatě ekvivalentní parametrům, které bylo možno pozorovat v případě produkce DDH při výhodném uložení kombinace genů dapD a dapE. Mimoto bylo prokázáno, že další zvýhodnění dapF již nezlepší množství produkovaného L-lysinu a reakce, jíž se účastní produkt genu dapF neomezuje produkované množství. Tyto výsledky je možno vysvětlit následujícím způsobem.

Po uložení plasmidů pCABl se hromadí meziprodukty ve dvou stupních, a to kyselina N-sukcinyl-eta-keto-L-alfa-aminopimelová, SKAP a mimoto SDAP. Z těchto meziproduktů je možno prokázat SDAP mimo buňky v živném prostředí. Přestože nebylo možno prokázat přícomnost SKA.P, je pravděpodobné, že se hromadí uvnitř bakteriálních buněk. Důvod pro tento předpoklad spočívá ve zbarvení živného prostředí. Barva tohoto prostředí je žlutá v případě divokého kmene W3110(tyrA) nebo kmene, který neprodukuje L-lysin. Avšak barva živného prostředí se mění na hnědou, pravděpodobně v důsledku bakteniolýzy v případě většího zatížení buněk. Je pravděpodobné, že SDAP znamená malé zatížení růstu buněk vzhledem k tomu, že se vylučuje ven z buněk do okolního prostředí a z tohoto důvodu má živné prostředí žlutou barvu, přestože se množství SDAP zvyšuje v případě, že se SKAP metabolizuje výhodným uložením genu dapD. Avšak i když je gen dapD uložen za výhodných podmínek, nedochází k nahromadění L-lysinu, pokud nedojde k desenzitizaci genu dapE a tím se neodstraní omezení produkce L-lysinu.

6. Závěry

Na základě svrchu uvedených výsledků bylo prokázáno, že produktivita pro L-lysin může být zvýšena postupně pomocí následujících opatření; 1) uložením genu dapA , 2) uložením genu lysC*, 3) výhodné uložení genu dapB a 4) výhodné uložení genu DDH nebo dapD a dapE a bakteriích rodu Escherichia. Byly získány bakterie E. coli s postupně zlepšenou produktivitou pro L-lysin.

7. Analýza určujícího stupně biosyntetického systému pro L-lysin u kmene E. coli C

Aby bylo možno zjistit, zda bude proveditelné aplikovat svrchu uvedené závěry také na jiné kmeny než na kmeny ze skupiny E. coli K-12, byl stejným způsobem jako svrchu analyzován biosyntetický systém pro produkci L-lysinu u kmene E. coli C, IFO 13891 tak, aby bylo možno prokázat určující stupně biosyntézy. Podmínky pěstování tohoto kmene byly stejné jako v případě kmene W3I10(tyrA), avšak k živnému prostředí nebyl přidáván L-tyroisn.

1) Identifikace prvního určujícího stupně

Kmen E. coli C, IFO 13891 byl transformován uložením plasmidů s obsahem genů z biosyntetického systému pno produkci L-lysinu a pak byl pěstován na živném prostředí, vhodném pno produkci L-lysinu a bylo sledováno produkované množství L-lysinhydrochloridu. Výsledky tohoto sledování jsou shrnuty v následující tabulce 18.

Tabulka 18

bakteriální kmen	produkované množství L-lys inhydrochloridu σ / 1	vý t ě ž e k v závislosti na cukru, 1
C	0.08	0.2
C/pppc	0.08	0.2
C/paspC	0.12	0.3
C/plvsC	0.08	0.2
C/?-ysC*	0.12	0.3
C/pasd	0.08	0.2
C/pdapA	0.32	0.3
C/pdapA'r	0.71
C/pdap3	0.12	0.3
C/pDDH	0.08	0.2
C/plysA	0.03	0.2

Stejně jako v případě kmene W3110(tyrA), byl L-lysin produkován v živném prostředí kmenem C po uložení genu dapA divokého typu a genu dapA*, dese.nzitizovaného proti inhibici. Gen lysC* neměl žádný vliv na úroveň produkce L-lysinu.

2) Identifikace určujícího stupně druhého řádu

Plasmid RSF24P, obsahující gen dapA* byl uložen do kmene Ξ. coli C a dále byly do tohoto kmene uloženy také plasmidy, obsahující další geny biosyntetického systému pro L-lysin. Získané transformované bakterie byly pěstovány v živném prostředí, vhodném pro produkci L-lysinu a bylo měřeno množství produkovaného L-lysinhydrochioriau shrnuty v tabulce 19.

Výsledky jsou

Tabulka

bakteriální kmen	produkované množství L-lysinhydrochloridu σ/ i	výměšek v závis los mi na cuknu, -á
C/RSF24?	0.71	·. - -
C/RS Ξ2 4?-pppc	0.71	1. “4
C/RST24?-pas?C	0 . 59	1.70
C/RS?24?-piysC	0 . 55	1.50
C/RSF24?^plysCT	1.52	4.30
C/RSF24?-pasd	0.70	1.73
C/RSF24?+-pdap?.	0.71	1.73
C/RS ?24?^-pdapA’	0.59	1.70
C/RSF24?^pdap3	0.99	2.43
C/RSF24?-pDDH	0.73	1.30
C/RSF24?^plvsA	0.59	1.70

3ylo prokázáno, že gen IysC“ má vliv na zlepšeni pro duktivity pro L-lysin i v případě kmene C, transformovaného genem dapA' a reakce, jíž se účastní produkt genu IysC je tedy určujícím stupněm druhého řádu při produkci této amino kyseliny.

3) Identifikace určujícího stupně třetího řádu

Plasmid P.3FD80, obsahující geny dapA a lysC* byl uložen do kmene Ξ. coli C a dále byly uloženy různé plasmidy s obsahem genů biosyntetického systému pro produkci L-lysinu. Získané transformanty byly pěstovány v živném prostředí, vhodném prc produkci L-lysinu a bylo měřeno získané množ ství L-lysinhydrochloridu. Výsledky jsou shrnuty v následují cí tabulce 20.

Tabulka 20

bakteriální kmen	produkované množství L-lysinhydrochloridu g/i	výtěžek v závislosti na cukru, %
C/RSFD30	1.32	4.5
C/RSF380+pppc	1.74	4 . 3
C/RSFD30+paspC	1.32	4.5
C/RSFD80+plysC	1.91	4.7
C/RSFD80+plysC*	1.74	4.3
C/RSFD80+pasd	1.32	4.5
C/RSFD80+pdapA	1.95	4.3
C/RSFD80+pdapA’	1.91	4.7
C/RSFD80+pdapB	2.31	5.7
C/RS2D8O+DDDE	2.15	5.3
C/RSFD80+plysA	1.95	4.3

Stejně jako v případě kmene W3I10 měl pouze gen dapB účinek na zvýšení produktivity pro L-lysin a jde tedy o určující stupeň třetího řádu.

4) Identifikace určujícího stupně čtvrtého rádu

Plasmid pCA31, obsahující geny dapA*, lysC* a dapB byl uložen do kmene Ξ. coli C a dále byly uloženy plasmidy, obsahující geny biosyntetického systému l-lysinu. Získané transformované bakterie byly pěstovány na produkčním živném prostředí pro L-lysin a bylo měřeno množství produkovaného L-lysinhydrochloridu. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 21.

Tabulka 21

bakteriální kmen	produkované množství L-lysinhydrochloridu σ / 1 O ‘ *	výměšek v závisloszi r.a cukru, %
C/pCASl	2.31	5.7
C/pCA31-rpppc	2.23	5.5
C/pCA31-í-paspC	2.35	5.3
C/pCABU?lysC	2.27	5.5
C/pCA31t?IysC*	2.19	5.4
C/pCASl-rpasd	2.23	5.5
C/pCAS1+pdapA	2.31	5.7
C/pCASl+pdapA’	2.27	5. o
C/pCABlŤ-pdap3	2.23	5.5
C/pCABl-řpDDH	2.59	6.4
C/pCABl+plysA	2.19	5.4

Stejně jako v případě kmene W3110 měl pouze gen DDH vliv na zlepšení produktivity pro lysin a jde tedy o určující stupeň čtvrtého řádu.

b) Analýza určujících stupňů při použirí genů dapC, dapD, dapE a dapF

Místo genu DDH byly do kmene Escherichia coli C uloženy geny dapD, dapE nebo dapF, pro uložení byl použit kmen,

který již obsahoval byla měřena produkce dující tabulce 22.	plasmid pCABl a pak	byl jsou	kmen pěstován a shrnuty v násle-
L-lysiu.	Výsledky
T	a b u 1 k	a 22
bakteriální kmen	produkce	výtěžek		barva tvorba
	L-lysin.	ve vztahu	živného SDAP
	HC1, g/1	k cukru	7/ ?	prostředí
C/pCABl	2,31	5,7		hnědá +
C/pCABl+pdapD	2,43	5,0		žlutá +
C/pCABl+pdapE	2,35	5 , S		hnědá
C/pCA31+pdapF	2,23	5,5		hnědá +
C/pCABDEl	2,59	6,4		žlutá
C/pCABDEl+pdapF	2,43	6,0		žlutá
C/pCA3D2	2,59	6,4		žlutá

Bylo prokázáno, že dva stupně, jichž se účastní produkty genů dapD a dapE jsou v případě kmene C rovněž určující stejně jako v případě kmene W311C.

Jak již bylo svrchu uvedeno, bylo možno pro kmeny K-12 a C, které patří k rozdílným skupinám Ξ. coli prokázat totéž pořadí určujících stupňů. Je proto možno se domnívat, že je celou čeleď E. coli možno použít pro zlepšení produkce

L-lysinu postupně ném uložení a zesí a dapE) v uvedeném _z , _o & při ukládáni genu dapA‘ leném působení genů dapS pořadí.

a lysC⁵⁴ při výhoda DDH (nebo dapD

Průmyslová využitelnost

Vynález popisuje získání mutovaného genu DDPS, pocházejícího z bakterií, náležejících do rodu Escherichia, dosahuje se dostatčné desenzitizace inhibice L-lysinem. Tímto způsobem byla získána bakterie s větším zlepšením, než jakého bylo možno dosáhnout v případě známých bakterií. Toho bylo dosaženo uložením genu s kodovým řetězcem pro aspartokinázu s desenzitizovanou inhibicí L-lysinem v důsledku zpětné vazby.

Dále je možno produktivitu pro L-lysin postupně ještě zlepšit výhodným uložením a zesílením genů dapB a DDH (nebo dapD a dapE) do svrchu uvedeného bakteriálního kmene, produkujícího L-lysin v uvedeném pořadí.

Informace o řetězcích

I) Obecné informace:

i)	přihlašovatel:	Ajinomoto CO.,	lne .
ii)	název vynálezu:	: Kódová DNA pro	enzym, bakterie
	z rodu Ξ. coli	a způsob výroby	L-lysinu
iii)	počet řetězců:	20

2) Informace o řetězci č. 1:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce ě. 1:

CCGCAACTAC TGACATGACG 20

2) Informace o řetězci č. 2: i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

3) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 2:

AGTAAGCOAT CAAATCTCCC 20

2) Informace o řetězci č. 3: i) vlastnosci řetězce:

A) délka: 1197

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: dvojitý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: DNA genomu vi) původní zdroj:

A) organismus: Escherichia coli

B) kmen: MC1061 ix) vlastnost:

název/kiíč: prim transcript uložení: 248 identifikační metoda: Ξ ix) vlastnost:

název/klíč: CDS uložení: 272 až 1150 identifikační metoda: E ix)vlastnost:

název/klíč: primer bind uložení: 27 až 46 identifikační metoda: E ix) v1astnesz:

název/klíč: primer bind uložení: 1156 až 1175 identifikační metoda: Ξ ix) vlastnost:

název/klíč: RBS uložení: 261 až 255 identifikační metoda: S xi) popis řetězce Č. 3:

CCAGGCGAC7 G7C77CAA7A 77ACAGCCGC AAC7AC7GAC A7GACGGG7G A7GG7G77CA 60 CAA77CCACG GCGATCGGCA CCCAACGCAG 7GA7CACCAG A7AA7G7G77 GCGA7GACAG 120 7G7CAAAC7G G77A77CC“ 7AAGGGG7GA G77G77C77A AGGAAAGCA7 AAAAAAAACA 180 7GCA7ACAAC AA7CAGAACG GT7C7G7C7G C77GC7777A A7GCCA7ACC AAACG7ACCA 240 77GAGACAC7 7G777GCACA GAGGA7GGCC C A7G 77C ACG GGA AG7 A77 G7C 292

Met Phe 7hr Gly Ser Ile Val 1 5

GCG

A77

G77

AC7

CCG

A7G

GA7

GAA

AAA

GG7

AA7

G7C

7G7

CGG

GC7

AGC

340

Ala

Ile

Val

7hr

Pro

Met

Asp

Glu

Lys

Gly

Asn

Val

Cys

Arg

Ala

Ser

10

15

20

388

77G

AAA

.AAA

C7G

A77

GA7

7A7

CA7

G7C

GCC

AGC

GG7

AC7

7CG

GCG

A7C

Leu

Lys

Lys

Leu

Ile

Asp

7yr

His

Val

Ala

Ser

Gly

7hr

Ser

Ala

Ile

25

30

35

436

G77

7C7

G77

GGC

ACC

AC7

GGC

GAG

7CC

GC7

ACC

77A

AA7

CA7

GAC

GAA

Val

Ser

Val

Gly

7hr

7hr

Gly

Glu

Ser

Ala

7hr

Leu

Asn

His

Asp

Glu

40

45

50

55

484

CA7

GC7

GA7

G7G

G7G

A7G

A7G

ACG

C7G

GA7

C7G

GC7

GA1

GGG

CGC

A77

His

Ala

Asp

Val

Val

Met

Met

7hr

Leu

Asp

Leu

Ala

Asp

Gly

Arg

Ile

60

65

70

532

CCG

G i A

A77

GCC

GGG

ACC

GGC

GC7

AAC

GC7

AC7

GCG

GAA

GCC

AT7

AGC

Pro

Val

Ile

Ala

Gly

7hr

Gly

Ala

Asn

Ala

7hr

Ala

Glu

Ala

Ile

Ser

75

80

85

CTG

ACG

CAG

lyPU

TTC

AAT

uAC

AGT

GGT

ATC

GTC

GGC

TGC

CTG

ACv

GTA

530

Leu

-»*» inr

Gin

Arg

Phe

Asn

Asp

Ser

Gly

lie

Val

Gly

Cvs

Leu

Tnr

Val

90

95

100

ACC

CCT

TAC

TAC

.AAT

CGT

rrr

TCG

CAA

GAA

r·'!* b<Ji

TTG

TAT

CAG

CAT

TTC

623

'hr

Pro

Tyr

Tyr

Asn

Arg

Pro

Ser

Gin

Glu

Gly

Leu

Tyr

Gin

His

Phe

105

110

115

AAA

GCC

ATC

0 z·*-»» bk/ i

GAG

CAT

ACT

GAC

CTG

CCG

CAA

ATT

CTG

TAT

AAT

GTG

676

.,ys

Ala

Ile

Ala

Glu

His

Thr

Asp

Leu

Pro

Gin

Ile

Leu

Tyr

As n

Val

.20

125

130

135

CCG

TCC

CGT

ACT

GGC

TGC

GAT

CTG

CTC

CCG

GAA

ACG

GTG

CGT

CTG

724

Pro

Ser

Arg

Thr

Gly

Cys

Asp

Leu

Leu

Pro

Glu

Thr

Val

Gly

.Ar?

Leu

140

145

150

GCG

AAA

GTA

.AAA

AAT

ATT

ATC

GGA

ATC

AAA

GAG

GCA

ACA

GGG

AAC

TTA

772

Ala

Lys

Val

Lys

Asn

Ile

Ile

Gly

Ile

Lys

Glu

Ala

Thr

Gly

Asn

Leu

L55

160

165

ACG

CGT

GTA

AAC

CAG

ATC

.AAA

GAG

CTG

GTT

TCA

GAT

GAT

TTT

GTT

CTG

320

Thr

Arg

Val

Asn

Gin

Ile

Lys

Glu

Leu

Val

Ser

Asp

Asp

Phe

Val

Leu

170

173

180

1TG

AGC

GGC

GAT

GAT

GCG

AGC

PiG

GAC

TTC

ATG

CAA

TTG

GGC

GGT

863

.eu

Ser

Gly

Aso

Asp

Ala

Ser

Ala

Leu

Asp

Phe

Me:

Gin

Lsu

G’· ·,·

Gly

135

190

195

:at

GGv

Gl i

Τ'1”*

TCC

GTT

ACG

ACT

.AAC

GTC

GCA

GCG

CGT

GAT

A i P

bbb

916

lis

Gly

Val

L Le

Ser

Val

Thr

Thr

Asn

Val

Ala

Ala

.Arg

Asp

Me:

Ala

200

205

210

215

^AG

ATG

TGC

AAA

CTG

GCA

GCA

GAA

GAA

CAT

TTT

Pup

GAG

GCA

CGC

GTT

964

Gin

Met

Cys

Lys

Leu

Ala

Ala

Glu

Glu

His

Phe

Ala

Glu

Ala

•Arg

Val

220

225

230

ATT

AAT

CAG

CGT

CTG

ATG

CCA

TTA

CAC

AAC

AAA

CTA

TTT

GTC

GAA

CCC

1012

Ile

Asn

Gin

.Arg

Leu

Met

Pro

Leu

His

Asn

Lys

Leu

Phe

Val

Glu

Pro

225

240

245

AAT

CCA

ATC

CCG

GTG

AAA

TGG

GCA

TGT

.AAG

GAA

CTG

GGT

CTT

GTG

GCG

1060

Asn

Pro

Ile

Pro

Val

Lys

Trp

Ala

Cys

Lys

Glu

Leu

Gly

Leu

Val

Ala

250

255

260

ACC

GAT

ACG

CTG

CGC

CTG

CCA

AiG

ACA

CCA

ATC

ACC

GAC

AG i

bbl

CGT

1108

Thr

Aso

Thr

Leu

Arg

Leu

Pro

Me:

Thr

Pro

Ile

Thr

Asp

Ser

Gly

Arg

265

270

275

GAG

ACG

GTC

AGA

GCG

bvb

CTT

AAG

CAT

GCC

GGT

TTG

CTG

T AAAGT'

ITAGG

1153

GLu

Thr

Val

•Arg

Ala

Ala

Leu

Lys

His

Ala

Gly

Leu

Leu

280

285

290

GAG,

ATTT<

GAT (

GGCTT.ACTí

CT G'

CAAAAGT CGCGCC'

?GG

1L97

2) Informace o řetězci S. 4:

i) vlastnosti řetězce;

A) délka: 292 3) typ: aminokyseliny D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid

xí:

) pc

>pis

ře

tězc

:e č

. 4

Met

Phe

Thr

Gly

Ser

Ile

Val

Ala

Ile

Val

Thr

Pro

Met

Asp

Glu

Lys

1

5

10

15

Gly

Asn

Val

Cys

Arg

Ala

Ser

Leu

Lys

Lys

Leu

Ile

Asp

Tyr

His

Val

20

25

30

Ala

Ser

Gly

»TM inr

Ser

Ala

Ile

Val

Ser

Val

Gly

Thr

Thr

Gly

Glu

Ser

35

40

45

Ala

Thr

Leu

Asn

His

Asp

Glu

His

Ala

Asp

Val

Val

Met

Met

Thr

Leu

50

55

60

Asp

Leu

Ala

Asp

Gly

Arg

Ile

Pro

Val

Ile

Ala

Gly

Thr

Gly

Ala

Asn

65

70

75

80

Ala

Thr

Ala

Glu

Ala

Ile

Ser

Leu

Thr

Gin

Arg

Phe

Asn

Asp

Ser

Gly

85

90

95

Ile

Val

Gly

Cvs

Leu

Thr

Val

Thr

Pro

Tyr

Tyr

Asn

Arg

Pro

Ser

Gin

100

105

110

Glu

Gly

Leu

Tyr

Gin

His

Phe

Lys

Ala

Ile

Ala

Glu

His

Thr

Asp

Leu

115

120

125

Pro

Gin

Ile

Leu

Tyr

Asn

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

Gly

Cys

Asp

Leu

Leu

130

135

14Ó

Pro

Glu

Thr

Val

Gly

Arg

Leu

Ala

Lys

Val

Lys

Asn

Ile

Ile

Gly

í IΘ

145

150

L 55

160

Lys

Glu

Ala

Thr

Gly

Asn

Leu

Thr

Arg

Val

Asn

Gin

Ile

Lys

Glu

Leu

165

170

175

Vad

Ser

Asp

Aso

Phe

Val

Leu

Leu

Ser

Gly

Asp

Asp

Ala

Ser

Ala

Leu

18Ó

185

190

Asp

Phe

Met

Gin

Leu

Gly

Gly

His

Gly

Val

Ile

Ser

Val

Thr

Thr

Asn

195

200

205

Val

Ala

Ala

Arg

Asp

Met

Ala

Gin

Met

Cvs

Lys

Leu

Ala

Ala

Glu

Glu

210

215

220

His

Phe

Ala

Glu

Ala

Arg

Val

Ile

Asn

Gin

Arg

Leu

Met

Pro

Leu

His

225

230

235

240

Asn

Lys

Leu

Phe

Val

Glu

Pro

Asn

Pro

Ile

Pro

Val

Lys

Trp

Ala

Cys

245

250

255

Lys

Glu

Leu

Gly

Leu

Val

Ala

Thr

Asp

Thr

Leu

Arg

Leu

Pro

Met

Thr

260

265

270

Pro

Ile

Thr

Asp

Ser

Gly

Arg

Glu

Thr

Val

Arg

Ala

Ala

Leu

Lys

His

275

280

285

Ala

Gly

Leu

Leu

290

2) Informace o řetězci č. 5:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

3) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 5:

CTTCCCTTGT GCCAAGGCTC 20

2) Informace o řetězci c. 6:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 18

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. δ

GAATTCCTTT GCGAGCAG 18

2) Informace o řetězci č. 7: i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 2147

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: dvojitý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: DNA genomu vi) původní zdroj:

A) organismus: Escherichia coli

B) kmen: MC1061 ix) vlastnost:

název/kiíč: -35 signál uložení: 242 až 249 identifikační metoda: S ix) vlastnosz:

název/kiíč: -10 signál uložení: 255 až 273 identifikační metoda: S ix) vlastnosz:

název/kiíč: primer bind uložení: 535 až 555 identifikační metoda: E ix) vlastnosz:

název/kiíč: primer bind uložení: 2128 až 2147 identifikační metoda: E xi) vlastnosz:

název/kiíč: RBS uložení: 575 až 578 identifikační metoda: S ix) vlastncs::

název/kiíč: ODS uložení: 584 až 1933 identifikační metoda: S ix) vlastnosz:

název/kiíč: terminátor uložení: 1941 až 1958 identifikační metoda: S xi) popis řezězce č. 7:

7CGAAGTG7T TCTGTAG7GC CTGCCAGGCA AGCAATAC7C 77C7GA7777 GAGAATTGTG AAAA7G7GA7 GG7777AG7G CCG77AGCGT AGCAT77AT7 AGCTGAAC7A CTGACCGCCA CG7TGACAAC CGCCCCGCTC ACCC777A77 CAGAAGAGGC GCG77GCCCA AG7AACGG7G AGGGGGTGCA TCGCCGAGG7 GA77GAACGG 7GAA7CCCC7 GGG77G7CAC CAGAAGCG77 ACTTCTGGGT GAAAA7AG7A GCGAAG7A7C C77G7GCCAA GGC7GAAAA7 GGA7CCCC7G

GCGG7C7GCG 77GGA77GA7 G77777CA77 AC777GGAAG AiiGTAGCGC CAGiCACAGA AA7G77GAG7 G7AAACCC77 AGCGCAG7GA GGAG7GGA7G AAAAA7CCGC A7GACCCCAT 7A7AAA7G7A C7ACCTGCGC TAGCGCAGGC 77GGAGGAGC CAGTCCTGTG A7AACACC7G C7GGCCACG7 TCATCATCGG C7AAGGGGGC CGCAG7CGGG CG777CGCAA G7GG7GGAGC GC7C7GCGCC CACCCGTCT7 CCGC7C77CC ACACGAGGTA G7i A7G iCí GAA AT i

Met Ser Glu Ile

120

180

240

300

360

420

480

540

595

377 i

G7C '

7CC ,

AAA 777 (

SGC i

jol

ACC .

AGC 1

G7A <

GC7 '

GA7

777

GAC

GCC

A7G

643

,ral '

Val :

Ser

Lys 1

Phe (

Oly '

Gly

Thr

Ser

Val .

Ala

Asp

Phe

Asp

Ala

Met

5

10

15

20

.AAC

CGC

AGC

GC7

GA7

A77

G7G

C77

7C7

GA7

GCC

.AAC

G7G

CG7

77A

G77

691

Asn

Arg

Ser

Ala

Asp

Ile

Val

Leu

Ser

Asp

Ala

Asn

Val

Arg

Leu

Val

25

30

35

G7C

C7C

7CG

GC7

7C7

i

GG7

A7C

AC7

AAT

C7G

C7G

G7C

GC7

77A

GC7

739

Val

Leu

Ser

Ala

Ser

Ala

Gly

Ile

7hr

Asn

Leu

Leu

Val

Ala

Leu

Ala

40

45

50

GAA

GGA

C7G

GAA

CCT

GGC

GAG

pr 1 Lun.

77C

GAA

AAA

C7C

GAC

GC7

A7C

CGC

787

Glu

Gly

Leu

Glu

Pro

Gly

Glu

Arg

Phe

Glu

Lys

Leu

Asp

Ala

Ile

•Arg

55

60

65

AAC

A7C

CAG

777

GCC

A77

C7G

GAA

CG7

C7G

CG7

7AC

CCG

AAC

G77

A7C

835

Asn

lle

Gin

Phe

Ala

Ile

Leu

Glu

Arg

Leu

Arg

7vr

Pro

Asn

Val

Ile

70

75

30

CG7

GAA

GAG

A77

GAA

CG7

C7G

C7G

GAG

.AAC

A77

AC7

G77

C7G

GCA

GAA

883

Arg

Glu

Glu

Ile

Glu

Arg

Leu

Leu

Glu

Asn

Ile

Thr

Val

Leu

Ala

Glu

85

90

95

100

GCG

GCG

GCG

C7G

GCA

ACG

7C7

CCG

GCG

C7G

ACA

GA7

GAG

C7G

G7C

AGC

931

Ala

Ala

Ala

Leu

Ala

Thr

Ser

Pro

Ala

Leu

7hr

Asp

Glu

Leu

Val

Ser

105

110

115

CAC

GGC

GAG

C7G

A7G

7CG

ACC

C7G

C7G

777

G77

GAG

A7C

C7G

Lltv

GAA

979

His

Gly

Glu

Leu

Met

Ser

7hr

Leu

Leu

Phe

Val

Glu

Ile

Leu

Arg

Glu

120

125

130

CGC

GA7

G77

CAG

GCA

CAG

7GG

ΠΤ

GA7

G7A

CG7

AAA

G7G

A7G

CG7

ACC

1027

Arg

Asp

Val

Gin

Ala

Gin

Trp

Phe

Asp

Val

Arg

Lys

Val

Met

Arg

Thr

135

140

145

AAC

GAC

CGA

TTT

GG7

CG7

GCA

GAG

CCA

GA7

A7A

GCC

GCG

C7G

GCG

GAA

1075

Asn

Asp

Arg

Phe

Gly

Arg

Ala

Glu

Pro

Asp

Ile

Ala

Ala

Leu

Ala

Glu

150

155

160

C7G

GCC

GCG

C7G

CAG

C7G

C7C

CCA

CG7

C7C

AAT

GAA

GGC

77A

G7G

A7C

L123

Leu

Ala

Ala

Leu

Gin

Leu

Leu

Pro

Arg

Leu

Asn

Glu

Gly

Leu

Val

Ile

165

L70

175

180

ACC

CAG

GGA

πτ

A7C

ÍjV 1

AGC

GAA

AA7

AAA

GG7

CG7

ACA

ACG

ACG

C77

1171

Thr

Gin

Gly

Phe

Ile

Gly

Ser

Glu

Asn

Lys

Gly

Arg

Thr

Thr

Thr

Leu

135

190

195

GGC

CG7

GGA

GGC

AGC

GA7

7A7

ACG

GCA

GCC

77G

C7G

GCG

GAG

GC7

77A

1219

Gly

Arg

Gly

Gly

Ser

Asp

7yr

Thr

Ala

Ala

Leu

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

200

205

210

CAC

GCA

7C7

CG7

G77

GA7

A7C

7GG

ACC

GAC

G7C

CCG

GGC

A7C

7AC

ACC

1267

His

Ala

Ser

Arg

Val

Asp

Ile

Trp

Thr

Asp

Val

Pro

Gly

Ile

7yr

7hr

215 220 225

ACC

GAT

CCA

CGC

G t A

GTT

TCC

GCA

GCA

AAA

CGC

ATT

GAT

GAA

ATC

GCG

1315

Thr

Aso

Pro

Arg

Val

Val

Ser

Ala

Ala

Lys

Arg

Ile

Asp

Glu

Ile

Ala

230

235

240

TTT

GCC

GAA

GCG

GCA

GAG

ATG

GCA

ACT

p.pjp 11 i

GGT

GCA

AAA

GTA

CTG

CAT

L363

Phe

Ala

Glu

Ala

Ala

Glu

Met

Ala

Thr

Phe

Gly

Ala

Lys

Val

Leu

His

245

250

255

260

CCG

GCA

ACG

TTG

CTA

Uvu

GCA

GTA

CGC

AGC

GAT

ATC

CCG

GTC

TTT

GTC

1411

Pro

Ala

Thr

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Arg

Ser

Asp

Ile

Pro

Val

Phe

Val

265

270

275

GGC

TCC

AGC

AAA

GAC

GCA

GGT

GGT

ACG

CTG

GTG

TGC

AA i

AAA

1459

Gly

Ser

Ser

Lys

Asp

Pro

Arg

Ala

Gly

Gly

Thr

Leu

Val

Cys

Asn

Lys

280

285

290

ACT

GAA

AAT

CCG

CCG

CTG

i ÍL·

CGC

GCT

CTG

GCG

CTT

CGT

CGC

AAT

CAG

1507

Thr

Glu

Asn

Pro

Pro

Leu

Phe

Arg

Ala

Leu

Ala

Leu

Arg

Arg

Asn

Gin

295

300

305

ACT

CTG

CTC

ACT

TTG

CAC

AGC

CTG

AAT

ATG

CTG

CAT

TCT

CGC

GGT

TTC

1555

Thr

Leu

Leu

Thr

Leu

His

Ser

Leu

Asn

Met

Leu

His

Ser

Arg

Gi y

Phe

310

315

320

CTC

GCG

GAA

GTT

TTC

L-uC

ATC

CTC

GCG

CGG

CAT

AAT

ATT

TCG

G i A

GAC

1603

Leu

Ala

Glu

Val

Phe

u - v

Ile

Leu

Ala

Arg

His

Asn

Ile

Ser

Val

Aso

325

330

335

340

TTA

ATC

ACC

ACG

TCA

GAA

GTG

AGv

GTG

GCA

TTA

ACC

C 1 1

GAT

ACC

ACC

1651

Leu

Ile

Thr

Thr

Ser

Glu

Val

Ser

Val

Ala

Leu

Thr

Leu

Asp

Thr

Thr

345

350

OCŤ Juu

GGT

TCA

ACC

TCC

AC i

XR 'UUV

GAT

ACG

TTG

CTG

ACu

CAA

TCT

CTG

CTG

ATG

1699

Gly

Ser

Thr

Ser

Thr

Glv

Asd

Thr

Leu

Leu

Thr

Gin

Ser

Leu

Leu

Met

360

365

370

GAG

CTT

TCC

GCA

CTG

--«-p .LTi

CGG

GTG

GAG

GTG

GAA

GAA

GGT

CTG

GCG

CTG

1747

Glu

Leu

Ser

Ala

Leu

Cys

Arg

Val

Glu

Val

Glu

Glu

Gly

Leu

Ala

Leu

375

380

385

GTC

GCG

TTG

ATT

bÚL·

4AT

GAC

CTG

TCA

AAA

GCC

TGC

GGC

GTT

GGC

AAA

17S5

Val

Ala

Leu

Ile

Gly

Asn

Asp

Leu

Ser

Lys

Ala

Cys

Gly

Val

Gly

Lys

390

395

400

GAG

GTA

TTC

GGC

GTA

CTG

GAA

CCG

TTC

AAC

ATT

CGC

ATG

ATT

TGT

TAT

1843

Glu

Val

Phe

Gly

Val

Leu

Glu

Pro

Phe

Asn

Ile

Arg

Met

Ile

Cys

Tyr

405

410

415

420

GGC

GCA

TCC

AGC

CAT

AAC

CTG

TGC

TTC

CTG

GTG

CCC

GGC

GAA

GAT

GCC

1891

Gly

Ala

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Cys

Phe

Leu

Val

Pro

Gly

Glu

Asp

Ala

425

430

435

GAG

CAG

GTG

GTG

CAA

AAA

CTG

CAT

AGT

AAT

TTG

TTT

GAG

TAAATACTGT

1940

Glu

Gin

Val

Val

Gin

Lys

Leu

His

Ser

Asn

Leu

Phe

Glu

440 445

ATGGCCTGGA AGCTATATTT CGGGCCGTAT ACGAGCCTGT ACTCTGTTAA CCAGCGTCTT ATCTGCATCT CTAATTAATT ATCGAAAGAG TTATCAGTTC TGCTCGCAAA GGAATTC

TGATTTTCTT GTCACTATGC TCATCAATAA TATCGGAGAA TAATTGCCTT TAATTTTTTT ATAAATAGTT AAGAGAAGGC AAAATGAATA

2000

2060

2120

2147

2) Informace o řetězci č. 8:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka:

3) typ: aminokyselina D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid

xi)

popis

řet;

ezce

i č .

8 :

Met

Ser

Glu

Ile

Val

Val

Ser

Lys

Phe

Gly

Gly

Thr

Ser

Val Ala

Asp

l

5

10

15

Phe

Asp

Ala

Met

Asn

Arg

Ser

Ala

Asn

Ile

Val

Leu

Ser

Asn Ala

Asn

20

25

30

Val

Arg

Leu

Val

Val

Leu

Ser

Ala

Ser

Ala

Gly

Ile

Thr

Asn Leu

Leu

40

45

Val

Ala

Leu

Ala

Glu

Gly

Leu

G i u

Pro

Gly

Glu

Arg

Phe

Giu tys

Leu

50

00

60

Asp

Ala

Ile

Arg

Asn

Ile

Gin

Phe

Ala

Ile

Leu

Glu

Arg

Leu .Arg

Tyr

65

70

75

30

Pro

Asn

Val

Ile

Arg

Glu

Glu

Ile

Glu

Arg

Leu

Leu

Glu

Asn Ile

Thr

85

90

95

Val

Leu

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

Leu

Ala

Thr

Ser

Pro

Ala

Leu Thr

Asp

100

105

L10

Glu

Leu

Val

Ser

His

Gly

Glu

Leu

Met

Ser

Thr

Leu

Leu

Phe Val

Glu

115

L20

125

Ile

Leu

.Arg

Glu

Arg

Asp

Val

Gin

Ala

Gin

Trp

Phe

Asp

Val Arg

Lys

130

135

140

Val

Met

Arg

Thr

Asn

Asn

•Arg

Phe

Gly

Arg

Ala

Glu

Pro

Asn Ile

Ala

145

150

L55

160

Ala

Leu

Ala

Glu

Leu

Ala

Ala

Leu

Gin

Leu

Leu

Pro

Arg

Leu Asn

Glu

165

170

175

Gly

Leu

Val

Ile

Thr

Gin

Gly

Phe

Ile

Gly

Ser

Glu

Asn

Lys Gly

Arg

180

185

190

Thr

Thr

Thr

Leu

Gly

Arg

Gly

Gly

Ser

Asp

Tyr

Thr

Ala

Ala Leu

Leu

195

200

205

Ala

Glu

Ala

Leu

His

Ala

Ser

Arg

Val

Asp

Ile

Trp

Thr

Asp Val

Pro

210

215

220

Gly

Ile

Tyr

Thr

Thr

Asn

Pro

Arg

Val

Val

Ser

Ala

Ala

Lys .Arg

Ile

225

220

235

240

Asp

Glu

Ile

Ala

Phe

Ala

Glu

Ala

Ala

Glu

Met

Ala

Thr

Phe Gly

Ala

245

250

255

Lys

Val

Leu

His

Pro

Ala

Thr

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Arg

Ser Asn

Ile

260

265

270

Pro

Val

Phe

Val

Gly

Ser

Ser

Lvs

Asn

Pro

Arg

Ala

Gly

Gly Thr

Leu

275

280

285

Val

Cys

Asn

Lys

Thr

Glu

Asn

Pro

Pro

Leu

Phe

Arg

Ala

Leu Ala

Leu

290

295

300

Arg

Arg

Asn

Gin

Thr

Leu

Leu

Thr

Leu

His

Ser

Leu

Asn

Mei

Leu

His

305

310

315

320

Ser

Arg

Gly

Phe

Leu

Ala

Glu

Val

Phe

Gly

Ile

Leu

Ala

Arg

His

Asn

325

330

335

Ile

Ser

Val

Asn

Leu

Ile

Thr

Thr

Ser

Glu

Val

Ser

Val

Ala

Leu

Thr

340

345

350

Leu

Asp

Thr

Thr

Gly

Ser

Thr

Ser

Thr

Gly

Asp

Thr

Leu

Leu

Thr

Gin

355

360

365

Ser

Leu

Leu

Met

Glu

Leu

Ser

Ala

Leu

Cys

Arg

Val

Glu

Val

Glu

Glu

370

ó i 0

380

Gly

Leu

Ala

Leu

Val

Ala

Leu

Ile

Gly

Asn

Aso

Leu

Ser

Lys

Ala

Cys

385

390

395

400

Gly

Val

Gly

Lys

Glu

Val

3 U λ i aC

Gly

Val

Leu

Glu

Pro

Phe

Asn

Ile

Arg

405

4L0

415

Met

Ile

Cys

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

His

Asn

Leu

Cys

Phe

Leu

Val

Pro

420

425

430

Gly

Glu

Aso

Ala

Glu

Gin

Val

Val

Gin

Lys

Leu

His

Ser

Asn

Leu

Phe

435

440

445

Glu

2) Informace o řetězci č. 9:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

3) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 9:

CTTTCACTGA TATOCCTCCC 20

2) Informace o řetězci č. 10:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 10:

AAAAAGTGGA CCAAATGGTC 20

2) Informace o řetězci č. 11:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 11:

CATCTAAGTA TGCATCTCGG 20

2) Informace o řetězci č. 12:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 12:

TGCCCCTCOA GCTAAATTAG 20

2) Informace o řetězci č. 13: i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 13:

TGCACGGTAG GATGTAATCG 20

2) Informace o řetězci č. 14: i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 14:

TTAATGAAAC AAATGCCCGG 20

2) Informace o řetězci č. 15:

i) vlastnosoi řeoezce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 15:

TTTATTCATA ATTGCCACCG 20

2) Informace o řetězci č. 16:

i) vlastnosti řeoězce:

A) Délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 16:

CACGGTAATA CATATAACCG 20

2) Informace o řetězci c. 17:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce S. 17:

CCTGCAATTG TCAAACGTCC 20

2) Informace o řetězci č. 18:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 18:

GTCGACGCGC TTGAGATCTT 20

Informace o řetězci č. 19:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 19:

TCATAAAGAG TCGCTAAACG 20

100

2) Informace o řetězci č. 20

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 20

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: syntetická DNA xi) popis řetězce č. 20:

CAACCGCCCG GTCATCAAGC 20.

Zastuouje:

Or. ZDENKA KOREJZOVÁ

101

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kódová DNA pro enzym dihydrodipikolinátsyntetázu z bakterie z rodu Escherichía s mutací pro desenzitizaci inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby.
2. 2. Kódová DNA podle nároku 1, v níž se mutace pro desenzitizaci inhibice L-lysinem voií z mutace, při níž je zbytek alaninu v poloze 81 nahrazen zbytkem valinu, mutace, při níž je zbytek histidinu v poloze 118 nahrazen zbytkem tyrosinu a mutace, při níž je zbytek alaninu v poloze 81 nahrazen zbytkem valinu a současně je zbytek histidinu v poloze 118 nahrazen zbytkem tyrosinu, počínaje vždy od N-zakončení řetězce aminokyselin dihydrodipikolinátsyntetázy, definovaného řetězcem č. 3.
3. 3. Bakterie z rodu Escherichía coli, vyznačující se t í m , že je transformována uložením kodové DNA pro dihydrodipikolinátsyntetázu z bakterie z rodu Escherichia s mutací pro desenzitizaci inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby do buněk.
4. 4. Bakterie z rodu Escherichía podle nároku 3, v y značující se tím, že je transformována uložením DNA s mutací pro desenzitizaci inhibice L-lysinem v důsledku zpětné vazby ze skupiny mutace, při níž je zbytek alaninu v poloze 81 nahrazen zbytkem valinu, mutace, při níž je zbytek histidinu v poloze 118 nahrazen zbytkem tyrosinu a mutace, při níž je zbytek alaninu v poloze 81 nahrazen zbytkem valinu a současně je zbytek histidinu v poloze 118 nahrazen zbytkem tyrosinu, počítáno od N-zakončení řetězce aminokyselin pro dihydrodipikolinátsyntetázu, definovaného řetězcem č. 4.