CZ158998A3

CZ158998A3 - Tumorová vakcína a způsob její výroby

Info

Publication number: CZ158998A3
Application number: CZ981589A
Authority: CZ
Inventors: Walter Schmidt; Max Birnstiel; Tamas Schweighoffer; Peter Steinlein; Michael Buschle
Original assignee: Boehringer Ingelheim International Gmbh
Priority date: 1995-11-23
Filing date: 1996-11-21
Publication date: 1999-06-16
Also published as: CA2238176A1; EE9800161A; CO4520254A1; US20020085997A1; NZ322910A; UY24430A1; AU720131B2; TW514530B; TR199800912T2; BG62999B1; PL326756A1; RO115275B1; NO982329D0; AR004341A1; HUP0000318A2; PL188537B1; BG102439A; WO1997019169A1; RU2206329C2; EE03778B1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká vakcíny proti nádorům obsahující tumorové buňky, z nichž alespoň část má na svém povrchu alespoň jeden 5 haplotyp MHC-I pacienta, a způsobu její výroby.

Dosavadní stav techniky

Vývoj léčebné vakcíny založené na tumorových bunňkách spočívá v podstatě na následujících předpokladech: existují 10 kvalitativní nebo kvantitativní rozdíly mezi tumorovými buňkami a normálními buňkami; imunitní systém má v podstatě schopnost rozpoznat tyto rozdíly; imunitní systém může - prostřednictvím aktivní specifické imunizace vakcínami - být stimulován k tomu, aby na základě těchto rozdílů tumorové buňky rozpoznal a přivodil jejich 15 odvržení.

Aby se dosáhlo antitumorové odpovědi, musí být splněny alespoň dva předpoklady; tumorové buňky musí za prvé exprimovat antigeny nebo neoepitopy, které se nevyskytují na normálních buňkách. Za druhé musí být imunitní systém odpovídajícím způsobem 2o aktivován, aby reagoval na tyto antigeny. Podstatnou překážkou při imunoterapii nádorů je jejich nízká imunogenicita, hlavně u lidí. To je potud překvapující, že by se dalo očekávat, že velký počet genetických změn maligních buněk by měl vést ke vzniku peptidových neoepitopú, které jsou rozpoznány ve spojení s molekulami MHC-I 25 cytotoxickými T-lymfocyty.

V poslední době byly objeveny s nádory spojené a nádorově specifické antigeny, které představují takové neoepitopy a tím i potenciální cíle pro reakci imunitního systému. Jestliže se přesto

- 2 nepodaří imunitnímu systému nádory, které exprimují tyto neoepitopy odstranit, není to zřejmě způsobeno chybami neoepitopů, ale tím, že je na tyto neoantigeny nedostatečná imunitní odpověď.

Pro imunoterapii rakoviny na buněčné úrovni byly vyvinuty dvě 5 všeobecné strategie: na jedné straně adoptivní imunoterapie, která spočívá na pomnožení tumorreaktivních T-lymfocytů in vitro a jejich znovuzavedení do organismu pacienta; na druhé straně aktivní imunoterapie, která používá tumorových buněk v očekávání, že se tím vyvolají nové nebo zesílené imunitní odpovědi proti tumorovým 10 antigenům, které vedou k systémové tumorové odpovědi.

Tumorové vakcíny spočívající na aktivní imunoterapii se vyráběly různými způsoby; jedním příkladem jsou ozářené tumorové buňky, které reagovaly s imunostimulačními adjuvans jako je Corynebacterium parvum nebo Bacillus Calmette Guerin (BCG), aby 15 vyvolaly imunitní reakce proti tumorovým antigenům (Oettgen, H.F. a Old, L.J., 1991, Biologie Therapy of Cancer, Editors: DeVita, V. T. Jr., Hellman, S., Rosenberg, S. A., Nakladatelství J. B. Lippincott Company, Philadelphia, New York, London, Hagerstown, 87 -119).

V posledních letech se pro aktivní imunoterapii proti rakovině 2o používaly především geneticky modifikované tumorové buňky, přičemž cizí geny zavedené do tumorových buněk spadají do tří kategorií:

Jedna z nich používá tumorové buňky, které byly geneticky modifikovány tak, aby produkovaly cytokiny. Místní současný výskyt tumorových buněk a signálu cytokinů by mohl představovat stimul 25 vyvolávající antitumorovou imunitu. Přehled použití této strategie se uvádí v publikacích Pardoll, D. M., 1993, Immunology Today 14, 6, 310, Zatloukal, K. et al., 1993, Gene 135, 199 - 20, Dranoff, G. a Mulligan, R. C., 1995, Advances in Immunology 58, 417.

U tumorových buněk, které byly geneticky změněny tak, aby 30 vylučovaly cytokiny jako IL-2, GM-CSF nebo IFN-γ nebo aby exprimovaly kostimulující molekuly, bylo v experimentálních zvířecích

- 3 modelech ukázáno, že vyvolávají silnou antitumorovou imunitu (Dranoff, G. et al., 1993, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90, 3539 - 3543; Zatloukal, K. et al., 1995, J. Immun. 154, 3406 - 3419). U člověka, který je již značné zatížen tumorem a u něhož se vyvinula tolerance proti tumoru, je však podstatně těžší zcela porozumět kaskádě komplexních vzájemných působení, aby mohla proběhnout účinná antitumorová reakce. Skutečná účinnost tumorových vakcín sekretujících cytokiny pro použití u lidí není ještě prokázána.

Další kategorie genů, kterými se mění tumorové buňky z hlediska svého použití jako tumorové vakcíny, kóduje tzv. vedlejší proteiny („accessory proteins“); cílem tohoto postupu je změnit funkci tumorových buněk na buňky produkující antigen („Neo-APCs“), aby mohly vytvářet přímo T-lymfocyty specifické vůči tumoru. Příklad takového použití se popisuje v Ostrand-Rosenberg, S., 1994, Current Opinion in Immunology 6, 722-727.

identifikace a izolace tumorových antigenů (TAs) popřípadě z nich odvozených peptidů popisované například v literatuře Wólfel, T. et al., 1994 a), lnt. J. Cancer 57, 413 - 418, Wólfel, T. et al., 1994 b), Eur. J. Immunol. 24, 759-764; Carrel, S. and Johnson, J.P., 1993, Current Opinion in Oncology 5, 383-389, Lehmann, J.M. et al., 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 9891-9895; Tibbets, L.M. et al., 1993, Cancer, Jan. 15., Vol. 71, 2, 315-321 nebo ve zveřejněných mezinárodních přihláškách WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031, WO 95/00159 byla předpokladem pro použití tumorových antigenů jako imunogenů pro tumorovou vakcínu, a to jak ve formě proteinů, tak i ve formě peptidů. Tumorová vakcína ve formě tumorových antigenů jako takových však není dostatečně imunogenní, aby vyvolala buněčnou imunitní odpověď, jaká by byla žádoucí pro eliminaci tumorových buněk nesoucích tumorové antigeny; rovněž společná aplikace adjuvans nabízí pouze omezené možnosti pro zesílení imunitní odpovědi (Oettgen, H. F. a Old, L. J., 1991, Biologie.

···· · ·· ······ ·· • · · · · · · · · · • · ······· • · ·· · ·· ······ • · · ····· · • · ··· ·· «··· ··

- 4 Therapy of Cancer, Editors: DeVita, V. T. Jr., Hellman, S., Rosenberg, S. A., Nakladatelství J. B. Lippincott Company, Philadelphia, New York, London, Hagerstown, 87-119).

Třetí strategie aktivní imunoterapie pro zvýšení účinnosti tumorových vakcín se zakládá na xenogenizovaných autologních tumorových buňkách (tedy buňkách, které byly učiněny cizími, změněny na cizí buňky). Jako základ této koncepce slouží domněnka, že imunitní systém reaguje na tumorové buňky, které exprimují cizí protein a stržena touto reakcí se vyvolá také imunitní odpověď proti io těm tumorovým antigenům (TAs), které byly vyprodukovány tumorovými buňkami vakcíny.

Přehled o těchto různých použitích, při kterých se stanou tumorové buňky vzhledem ke své zesílené imunogenicitě v důsledku zavedení různých genů cizími, je uveden v literatuře Zatloukal, K. et 15 al., 1993, Gene 135, 199-20.

Centrální úlohu při regulaci specifické imunitní odpovědi má trimolekulární komplex sestávající ze složek antigenní receptor Tbuňky, molekula MHC („Major Histocompatibility Complex“) a jejich ligand, kterým je peptidový fragment odvozený z proteinu.

Molekuly MHC-I (popřípadě odpovídající lidské molekuly, HLAs) jsou peptidové receptory, které přísně specificky dovolují vazbu milionů různých ligandů. Základem tohoto jevu jsou alelicky specifické peptidové motivy, které mají následující kritéria specificity: peptidy mají v závislosti na haplotypu MHC-I definovanou délku, zpravidla 8 až 10 zbytků aminokyselin. Dvě z poloh aminokyselin představují typicky tzv. „kotvu“, která může být obsazena pouze jednou jedinou aminokyselinou nebo zbytkem aminokyseliny s úzce příbuzným postranním řetězcem. Přesná poloha aminokyselin kotvy v peptidu a požadavky na jejich vlastnosti se liší podle haplotypů MHC-I. C30 konec peptidových ligandů je často alifatický nebo nabitý zbytek. Tyto • · · · alelicky specifické motivy ligandů peptidu MHC-I jsou dosud známy například pro H-2K^d, K^b, K^k, K^km1, D^b, HLA-A*0201, A*0205 a B*2705.

V rámci přeměny proteinů uvnitř buňky se normální proteiny, genové produkty, které byly učiněny cizími a cizí genové produkty, 5 například virové proteiny nebo tumorové antigeny, rozkládají na malé peptidy; některé z nich jsou potenciálními ligandy pro molekuly MHC-I. Tím je dán předpoklad pro jejich prezentaci molekulou MHC a v důsledku toho vznik buněčné imunitní odpovědi, přičemž není ještě zcela vysvětleno, jakým způsobem se peptidy jako ligandy MHC-I 10 v buňkách produkují.

Použití, které využívá tohoto mechanismu pro učinění tumorových buněk cizími s ohledem na zesílení imunitní odpovědi spočívá v působení mutagenních chemikálií jako je N-methyl-N’nitrosoguanidin na tumorové buňky. To by mělo vést k tomu, že 15 tumorové buňky mutantních variant produkují od buněčných proteinů odvozené neoantigeny, které jsou cizím genovým produktem (Van Pel, A. a Boon, T., 1982, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79, 4718-4722). Protože jsou však mutagenní události rozprostřeny náhodně na genomu, je možno mimo to očekávat, že jednotlivé buňky v důsledku 20 rozdílných mutagenních událostí prezentují také rozdílné neoantigeny a tento způsob je tak obtížně možno kontrolovat z kvalitativního a kvantitativního hlediska.

Další použití převede tumorové buňky na cizí tím, že se transfekují geny jednoho nebo více cizích proteinů, například cizími 25 molekulami MHC-I nebo proteiny MHC s rozdílným haplotypem, které se potom objeví na povrchu buňky (EP-A20569678; Plautz, G.E. et al., 1993, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90, 4645-4649; Nabel, G.J. et al., 1993, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90, 11307-11311). Toto použití spočívá na výše uvedené představě, že buňky, jestliže jsou podány ve 3o formě celobuněčné vakcíny, mohou být rozpoznány jako cizí na základě exprimovaných proteinů, popřípadě od nich odvozených

- 6 ···· · ·· ···· ·· ♦· • · · · · · ···· • · ··· ···· • · · · · · · ······ • · · ···· · · peptidů, nebo v případě exprese autologních molekul MHC-I, zvýšeným počtem molekul MHC-I na povrchu buněk se optimalizuje produkce tumorového antigenu. Změna tumorových buněk cizím proteinem může vést k tomu, že buňky produkují peptidy pocházející z cizího proteinu v kontextu MHC a změna z „vlastních na „cizí“ probíhá v rámci rozpoznávání komplexu MHC-peptid. Rozpoznání proteinu nebo peptidu jako cizího má za následek, že se v průběhu imunitního rozpoznávání vytvoří imunitní odpověď nejen proti cizímu proteinu, ale také proti tumorovým antigenům vlastním tumorovým buňkám. V průběhu tohoto procesu se aktivují buňky produkující antigen (Antigen Presenting Celíš, APCs), které proteiny (včetně TAs) vyskytující se v tumorové buňce vakcíny zpracovávají na peptidy a používají jako ligandy pro své vlastní molekuly MHC-I a MHC-II. Aktivované buňky APC obsahující peptid putují do lymfatických uzlin, kde rozpozná malé množství nediferencovaných T-lymfocytů peptidy na APC pocházející z TA, což může být použito jako stimul pro expanzi klonů, jinými slovy pro vytvoření tumorově specifických buněk CTL a T-pomocných buněk.

Předkládaný vynález měl za úkol připravit novou vakcínu proti tumorům na základě tumorových buněk převedených na cizí buňky, jejichž pomocí může být vyvolána účinná buněčná antitumorová imunitní odpověď.

Při řešení stanoveného úkolu se vycházelo z následujících předpokladů: zatímco nemaligní normální tělesné buňky jsou imunitním systémem tolerovány, reaguje tělo imunitní obranou na normální buňku, jestliže například na základě virové infekce syntetizuje tělu cizí proteiny. Příčina spočívá v tom, že molekuly MHC-I poskytují cizí peptidy, pocházející z tělu cizích proteinů. V důsledku toho registruje imunitní systém, že se s buňkou událo něco nežádoucího, cizího. Buňka se odstraní, buňky APC se aktivují

- 7 a vytvoří novou specifickou imunitu proti buňkám exprimujícím cizí proteiny.

Tumorové buňky sice obsahují příslušné tumorově specifické tumorové antigeny, jsou ale jako takové jako vakcína nevyhovující, 5 protože jsou na základě jejich nízké imunogenicity imunitním systémem ignorovány. Vloží-li se však na rozdíl od dosud známých způsobů do tumorové buňky ne cizí protein, ale cizí peptid, jsou jako cizí vnímány navíc k cizím peptidům také buňce vlastní tumorové antigeny. Převedením buněk na cizí peptidem by mělo být možno 10 dosáhnout, že se buněčná imunitní odpověď vyvolaná cizími peptidy zaměří proti tumorovému antigenu.

Příčina nízké imunogenicity tumorových buněk nemusí být kvalitativním, ale může být kvantitativním problémem. Pro peptid odvozený z tumorového antigenu to může znamenat, že je sice 15 prezentován molekulami MHC-I, ale v koncentraci, která je příliš nízká, aby vyvolala buněčnou tumorově specifickou imunitní odpověď. Zvýšení počtu tumorově specifických peptidů na tumorové buňce by mělo rovněž způsobit převedení tumorové buňky na cizí, které by vedlo k vyvolání buněčné imunitní odpovědi. V protikladu se způsoby, 2o u kterých se tumorový antigen popřípadě od něj odvozený peptid produkuje na povrchu buňky tím, že se buňka transfekuje DNA kódující příslušný protein popřípadě peptid, jak je tomu u mezinárodních zveřejněných přihlášek WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031 a WO 95/00159, by měla být připravena vakcína, která 25 vyvolává při jednoduché výrobě účinnou imunitní odpověď.

V literatuře (Mandelboim, O. et al., 1994, Nátuře 369, 5. May, 67-71 Mandelboim, O. et al., 1995, Nátuře Medicine 1, 11, 1179-1183) bylo navrhováno inkubovat buňky RMA-S s peptidy odvozenými od tumorových antigenů a tím vyvolat buněčnou imunitní odpověď proti 3o odpovídajícím pacientu vlastním tumorovým antigenům. Pro buňky navrhované pro vakcinaci proti tumorům se podle Mandelboima · ·· ···· ·· ·· • · · ·· · · · · · • · ······· • · · · · · · ······ • · · ···· «· ·· ··· ·· ·· ····

- 8 používá označení RMA-S (Kárre, K. et al., 1986, Nátuře 319, 20. Feb., 675), protože mohou provádět funkce APC. Mají tu vlastnost, že jejich molekuly HLA na buněčném povrchu jsou v důsledku defektu v buněčném mechanismu TAP („transport antigenních peptidů“;

odpovědný za zpracování peptidů a jejich vazbu na molekulu HLA) prázdné. Proto jsou tyto buňky k dispozici pro vložení některého peptidů, současně také fungují jako produkční vehikulum pro peptid nabídnutý z vnějšku. Dosažený antitumorový účinek spočívá ve vyvolání imunitní odpovědi proti peptidů přítomnému na buňkách, io který se nabídne imunitnímu systému bez bezprostřední souvislosti s antigenním repertoárem tumorové buňky.

Podstata vynálezu

Vynález se týká tumorové vakcíny pro podávání pacientovi, 15 která se skládá z tumorových buněk, které samy o sobě produkují peptidy odvozené od tumorových antigenů v kontextu HLA a z nichž alespoň část vykazuje na buněčném povrchu alespoň jeden haplotyp MHC-I pacienta a do kterých je vložen jeden nebo více peptidů a) a/nebo b) takovým způsobem, že tumorové buňky v kontextu s peptidy 2o imunitního systému pacienta jsou rozpoznány jako cizí a vyvolávají buněčnou imunitní odpověď, přičemž peptidy

a) fungují jako ligandy pro haplotyp MHC-I, který je pacientům a tumorovým buňkám vakcíny společný a odlišují se od peptidů odvozených od proteinů exprimovaných buňkami pacienta, nebo

b) fungují jako ligandy pro haplotyp MHC-I, který je pacientovi a tumorovým buňkám vakcíny společný, a jsou odvozeny od tumorových antigenů exprimovaných buňkami pacienta a vyskytují se na tumorových buňkách vakcíny v koncentraci, která je vyšší než koncentrace peptidů, který je odvozen od

- 9 stejného tumorového antigenu jako je exprimován na tumorových buňkách pacienta.

Lidské molekuly MHC se podle mezinárodních zvyklostí budou v následujícím textu označovat také jako „HLA“ („Human Leucocyte Antigen“).

Pod „buněčnou imunitní odpovědí“ se rozumí imunita cytotoxických T-buněk, která způsobí v důsledku vytváření tumorově specifických cytotoxických CD8-pozitivních T-buněk a CD4-pozitivních pomocných T-buněk zničení tumorových buněk.

Účinek vakcíny z tumorových buněk podle vynálezu spočívá především v tom, že se zesílí imunogenní účinek zásoby tumorových antigenů, která je k dispozici na tumorových buňkách prostřednictvím peptidu.

Peptidy typu a) se v následujícím označují jako „cizí peptidy“ nebo „xenopeptidy“.

V jedné formě provedení vynálezu jsou tumorové buňky vakcíny autologní. V tom případě se jedná o buňky, které byly odebrány léčenému pacientovi, na které bylo působeno ex vivo peptidem (peptidy) a) a/nebo b), které byly popřípadě inaktivovány a potom znovu podány pacientovi. (Způsoby výroby autologních tumorových vakcín se popisují v WO 94/21808, na jejichž uveřejnění odkazujeme.)

V jedné formě provedení vynálezu jsou tumorové buňky alogenní, tzn. nepocházejí z léčeného pacienta. Použití alogenních buněk se dává přednost především v tom případě, jestliže hrají roli pracovní a ekonomické důvody; příprava individuálních vakcín pro každého jednotlivého pacienta je pracovně náročná a nákladná a mimo to se u jednotlivých pacientů vyskytují obtíže při kultivaci tumorových buněk ex vivo, takže buňky není možno získat v dostatečně vysokém počtu pro výrobu vakcíny. Při alogenních tumorových buňkách je nutno brát ohled na to, aby subtyp HLA pacienta souhlasil.

V případě použití cizích peptidů kategorie a) se jedná u alogenních tumorových buněk o buňky jedné nebo více buněčných 5 linií, z nichž alespoň jedna buněčná linie exprimuje alespoň jeden, s výhodou více tumorových antigenů, které jsou identické s tumorovými antigeny léčeného pacienta, tj. tumorová vakcína se sladí s tumorovou indikací pacienta. Tím je zaručeno, že cizí peptidy na tumorových buňkách vakcíny produkované MHC-I vyvolaly 10 buněčnou imunitní odpověď, která vede k expanzi tumorově specifických buněk CTL a T-pomocných buněk, a která se zaměřuje proti tumorovým buňkám pacienta, protože exprimují stejný tumorový antigen jako buňky vakcíny.

Jestliže je třeba ošetřit vakcínou podle vynálezu například 15 pacientku trpící metastázami rakoviny prsu, u kterých se vyskytuje mutace Her2/neu (Allred, D.C. et al.,1992, J. Clin. Oncol. 10 (4), 599605, Peoples, G.E. et al., 1994, J. Immunol. 152, 10, 4993-9; Yoshino, I. et al., 1994 a), J. Immunol. 152, 5, 2393-400; Stein, D. et al., 1994, EMBO-Journal, 13, 6, 1331-40; Yoshino, I. et al., 1994 b), Cancer 20 Res., 54, 13, 3387-90; Fisk, B. et al., 1995, J. Exp. Med. 1881, 21092117; Han, X.K. et al., 1995, PNAS 92, 9747-9751) použijí se jako vakcína alogenní, na HLA-haplotyp pacienta vyladěné tumorové buňky, které exprimují rovněž jako tumorový antigen mutovaný Her2/neu. V poslední době byly izolovány četné tumorové antigeny 25 a byla vysvětlena jejich souvislost s jedním nebo více rakovinnými onemocněními. Další příklady takových tumorových antigenů jsou ras (Fenton, R.G. et al., 1993, J. Nati. Cancer Inst. 85, 16, 1294-302; Gedde Dahl, T. et al., 1992, Hum. Immunol. 33, 4, 266-74 Guarini, A. et al., 1995, Cytokines and Molecular Therapy I, 57-64; Jung, S. et al., 30 1991, J. Exp. Med. 173, I, 273-6; Morishita, R. et al., 1993, J. Clin.

Invest. 91, 6, 2580-5; Peace, D. J. et al., 1991, J. Immunol. 146, 6,

2059-65; Skipper, J., and Stauss, H. J., 1993, J. Exp. Med. 177, 5, 1493-8) tumorové antigeny MÁGE (Boon, T. et al., 1994, Annu. Rev.

Immunol. 12, 337-65; Slingluff, C. L. et al., 1994, Current Opinion in

Immunology 6, 733-740; van der Bruggen, P. et al., 1994, Eur. J.

Immunol. 24, 9, 2134-40 Issn: 0014-2980; WO 92/20356); přehled různých tumorových antigenů se uvádí navíc v Carrel, S. a Johnson, J.P., 1993, Current Opinion in Oncology 5, 383-389.

Přehled známých v rámci vynálezu použitelných tumorových antigenů a z nich odvozených peptidú se uvádí v tabulce.

io Tumorové antigeny pacienta se obvykle určují v průběhu stanovení diagnózy a léčebného plánu standardními metodami, například pomocí testů na základě CTL se specificitou pro určovaný tumorový antigen. Takové testy byly popsány mj. u Hérin M. et al., 1987, Int. J. Cancer, 39, 390, Coulie, P.G. et al., 1992, Int. J. Cancer,

50, 289-297; Coulie, P. G., Lehmann, F., Lethe, B., Herman, J.,

Lurquin, C., Andrawiss, M., a Boon, T. (1995). Proč. Nati. Acad. Sci.

USA 92, 7976-80; Cox, A.L. et al., 1994, Science 264, 5159, 716-9; Rivoltini, L. et al., 1995, The Journal of Immunology 154, 2257-2265;

Kawakami, Y. et al., 1995, The Journal of Immunol. 154, 3961-3968 20 a v WO 94/14459; z těchto pramenů je možno také převzít různé tumorové antigeny popřípadě od nich odvozené peptidové epitopy. Tumorové antigeny vystupující na buněčný povrch mohou být také prokázány imunologickými testy na bázi protilátek. Jestliže jsou tumorové antigeny enzymy, například tyrosinázy, mohou být 25 prokázány enzymatickými testy.

V další formě provedení vynálezu může být jako výchozí materiál pro vakcínu použita směs autologních a alogenních tumorových buněk. Toto provedení vynálezu přichází v úvahu pro použití zvláště tehdy, jestliže jsou tumorové antigeny exprimované 30 pacientem neznámé nebo jsou pouze neúplně charakterizovány a/nebo jestliže alogenní tumorové buňky exprimují pouze část • · • · · · • · • · ♦ · · · · ······ • · · · · · · · · • · ··· ·· ·· · · · ·

- 12 tumorových antigenů pacienta. Přimíšením autologních tumorových buněk na které bylo působeno cizím peptidem je zajištěno, že alespoň část tumorových buněk vakcíny obsahuje co největší počet pacientovi vlastních tumorových antigenů. U alogenních tumorových buněk se 5 jedná o takové, které souhlasí s pacientem v jednom nebo více haplotypech MHC-I.

Peptidy typu a) a b) se definují podle požadavku vazby na molekulu MHC-I podle své sekvence subtypem HLA pacienta, kterému má být vakcína podávána. Určení subtypu HLA pacienta tedy 10 představuje podstatný předpoklad pro výběr, popřípadě konstrukci vhodného peptidu.

Při použití tumorové vakcíny podle vynálezu ve formě autologních tumorových buněk se projeví subtyp HLA automaticky prostřednictvím geneticky determinované specificity molekuly HLA 15 u pacienta. HLA-subtyp pacienta může být stanoven standardními metodami, jako je mikrotest na lymfotoxicitu (MLC-Test, Mixed Lymphocyte Culture) (Practical Immunology, Editors: Leslie Hudson and Frank C. Hay, Blackwell Scientific Publications, Oxford, London, Edinburgh, Boston, Melbourne). Principem testu MLC je nejdříve 2o reakce lymfocytů izolovaných z krve pacienta s antisérem nebo monoklonální protilátkou proti určité molekule HLA v přítomnosti králičího komplementu (C). Pozitivní buňky se lyžují a přijímají indikátorové barvivo, zatímco nepoškozené buňky zůstávají nezbarveny.

Pro určení haplotypu HLA pacienta je možno použít také RTPCR (Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Herausgeber: Ausubel F.M., et al., John Wiley & Sons, lne., kapitola 2 a 15). K tomu účelu se pacientovi odebere krev a z ní se izoluje RNA. S touto RNA se nejprve provede reverzní transkripce, při které vznikne cDNA 3o pacienta. cDNA slouží jako matrice pro polymerázovou řetězovou reakci s páry primerů, které specificky způsobí amplifikaci fragmentu

DNA, který zastupuje určitý haplotyp HLA. Jestliže se po elektroforéze na agaróze objeví pruh DNA, exprimuje pacient odpovídající molekulu HLA. Jestliže se pruh neobjeví, je pacient na tento haplotyp negativní. U každého pacienta je třeba očekávat alespoň dva pruhy.

Při použití vynálezu ve formě alogenní vakcíny se používají buňky, u kterých je alespoň jedna část nastavena na alespoň jeden subtyp HLA pacienta. S ohledem na co nejširší použitelnost vakcíny proti vynálezu se výhodně vychází ze směsi různých buněčných linií, které exprimují dva nebo tři různé nejčastěji zastoupené subtypy HLA, 10 přičemž se bere ohled zvláště na haplotypy HLA-A1 a HLA-A2.

Vakcínu založenou na směsi alogenních tumorových buněk exprimujících tyto haplotypy je možno použít u široké populace; je možno jí pokrýt přibližně 70 % evropského obyvatelstva (Mackiewicz, A. et al., 1995, Human Gene Therapy 6, 805-811).

Definice peptidů používaných podle vynálezu pomocí subtypu

HLA určuje tyto peptidy z hlediska jejich kotvících aminokyselin a jejich délky; definované kotvící polohy a délka zaručují, že tyto peptidy při tvorbě peptidů příslušné molekuly HLA mohou být produkovány na povrchu buněk tumorů tvořících vakcínu a tyto buňky jsou rozpoznány jako cizí. Následkem toho je stimulován imunitní systém a buněčná imunitní reakce také proti tumorovým buňkám pacienta.

Peptidy, které jsou vhodné v rámci předkládaného vynálezu jako cizí peptidy kategorie a), jsou dostupné ve velké šíři. Jejich sekvence 25 může být odvozena od přirozeně se vyskytujících imunogenních proteinů, popřípadě jejich produktů buněčného odbourávání, například od virálních nebo bakteriálních peptidů nebo od tumorových antigenů, které jsou pro pacienta cizí.

Vhodné cizí peptidy je možno vybrat například na základě

3o z literatury známých peptidových sekvencí; například na základě prací Rammensee, H. G. et al., 1993, Current Opinion in Immunology 5, 35·*·· · ·» ···< ·· ·» ··· · · · ···· • · ··· · · · · • · ·· · ·· ······ • · · ···· · · • · · · · · · ·· ·· ··

- 14 44; Falk, K. et al., 1991, Nátuře 351, 290-296 je možno vybrat pro rozdílné motivy HLA popsané, od imunogenních proteinů různého původu odvozené peptidy, které jsou vhodné pro tvorbu molekul subtypů HLA. Pro peptidy, které mají částečnou sekvenci proteinů s imunogenním účinkem, je možno na základě již známé nebo popřípadě teprve později stanovitelné peptidové sekvence srovnáním sekvencí s ohledem na specifické požadavky HLA určit, které z nich jsou vhodnými kandidáty. Příklady vhodných peptidů je možno nalézt například v Rammensee, H. G. et al., 1993, Current Opinion in Immunology 5, 35-44; Falk, K. et al., 1991, Nátuře 351, 290-296; Rammensee, H.G., 1995, Current Opinion in Immunology 7, 85-96; stejně jako v WO 91/09869 (peptidy HIV); peptidy odvozené od tumorových antigenů byly mj. popsány ve zveřejněných mezinárodních patentových přihláškách WO 95/00159 a WO 94/05304.

Vhodnými kandidáty pro xenopeptidy jsou peptidy, jejichž imunogenicita byla již prokázána a také peptidy, které jsou odvozeny od známých imunogenů, například virových nebo bakteriálních proteinů. Tyto peptidy silně reagují na základě své imunogenicity v testu MLC.

Místo použití originálních peptidů je možno použít také peptidy, které jsou odvozené v nezměněné formě z přírodních proteinů na základě minimálních požadavků týkajících se polohy kotvy a délky; v tomto případě se také podle vynálezu používají syntetické peptidy, které byly navrženy podle požadavků na ligandy MHC-I. Tak je možno například vycházeje z ligandu H2-K^d Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile (LFEAIEGFI) změnit aminokyseliny, které nejsou kotevními aminokyselinami pro získání peptidů se sekvencí Phe Phe Ile Gly Ala Leu Glu Glu Ile (FFIGALEEI); mimo to může být nahrazena kotevní aminokyselina Ile v poloze 9 aminokyselinou Leu.

Peptidy odvozené od tumorových antigenů, tedy od proteinů, které jsou exprimovány v tumorové buňce a neobjevují se nebo se ·> φ φ « « • φφ φ» · φ · ·· • · ··· · · φ · • · · e · ·· ····φ· >·· ···· ·· ·· φ · · ·» φφ · · φφ

- 15 objevují v podstatně nižších koncentracích v odpovídajících netransformovaných buňkách, mohou být použity v rámci předkládaného vynálezu jako peptidy typu a) a/nebo typu b).

Délka peptidu s výhodou odpovídá minimální sekvenci osmi až deseti aminokyselin s požadovanými kotevními aminokyselinami, která je žádoucí pro případnou vazbu na molekulu MHC-I. Peptid může být také popřípadě prodloužen na C- a/nebo N-konci, pokud toto prodloužení neovlivní schopnost vazby, popřípadě může být prodloužený peptid zpracován na minimální sekvenci na celulární úrovni.

V jedné formě provedení vynálezu může být peptid prodloužen negativně nabitými aminokyselinami nebo mohou být negativně nabité aminokyseliny vestavěny do peptidu, a to na jiných pozicích než jsou kotevní aminokyseliny, aby se dosáhlo elektrostatické vazby peptidu na polykationt, jako je polylyzin.

Pod pojem „peptidy“ spadají v rámci předkládaného vynálezu podle definice také větší proteinové fragmenty, popřípadě celé proteiny, u nichž je zaručeno, že po aplikaci APC budou zpracovány na peptidy, které se hodí k molekule MHC.

V této formě provedení se tak antigen nepoužívá ve formě peptidu, ale jako protein nebo proteinový fragment, popřípadě jako směs proteinů nebo proteinových fragmentů. Protein představuje antigen, popřípadě tumorový antigen, od kterého se odvozují po zpracování (procesingu) získané fragmenty. Z buněk přijaté proteiny, popřípadě proteinové fragmenty jsou zpracovány a mohou potom být v kontextu MHC prezentovány imunitními efektorovými buňkami a tím vyvolat popřípadě zesílit imunitní odpověď (Braciale, T. J. a Braciale, V. L., 1991, Immunol. Today 12, 124-129; Kovacsovics Bankowski, M. a Rock, K. L., 1995, Science 267, 243-246 a York, I.A. und Rock, K.L., 1996, Ann. Rev. Immunol. 14, 369-396).

···· • · • · >>· ♦··· • »· • · · Λ · ·· ♦ · ·· ·· ·· a · ·· • · · · • ♦·· ··· * ·

V případě použití proteinů nebo proteinových fragmentů je možno prokázat identitu procesovaných koncových produktů chemickou analýzou (Edmanovo odbourávání nebo hmotnostní spektrometrie zpracovaných fragmentů; srovnej přehledný článek 5 Rammensee, H. G., Friede, T., a Stepvanovic, S. (1995) Immunogenetics 41, 178-228 a tam citovanou původní literaturu) nebo biologickými testy (schopnost buněk APC stimulovat T-buňky, které jsou specifické pro zpracované fragmenty).

Výběr peptidových kandidátů z ohledem na jejich vhodnost jako io peptidových fragmentů v podstatě probíhá ve více stupních: obecně se kandidáti vhodně testují v sériových pokusech, a nakonec v testu vazby peptidů na schopnost vazby na molekulu MHC-I.

Vhodnou metodou výzkumu je například analýza FACS založená na průtokové cytometrii (Flow Cytometry, Acad. Press, Methods in 15 Cell Biology, 1989, Vol. 33, Vyd.: Darzynkiewicz, Z. a Crissman, H. A.; uživatelský manuál FACS Vantage™, duben, 1994, Becton Dickinson; uživatelský manuál CELL Quest™ Software User’s Guide, June 1994, Becton Dickinson). Přitom se peptid značí fluorescenčním barvivém, například FITC (fluoresceinizothiokyanát) a nanese se na tumorové 20 buňky, které exprimují příslušnou molekulu MHC-I. Při průtoku se jednotlivé buňky ozařují laserem určité vlnové délky; emitovaná fluorescence se měří a závisí na množství peptidů navázaném na buňce.

Dalším způsobem určení množství navázaného peptidů je 25 Scatchardovo blotování. K tomu se používá peptid, který je značený J¹²⁵ nebo ionty vzácných kovů (například europium). Na buňky se potom působí při 4 °C různými definovanými koncentracemi peptidů 30 až 40 minut. Pro určení nespecifického vzájemného působení peptidů na buňky se přidá k některým vzorkům přebytek neznačeného peptidů, 30 který zabrání specifické interakci značených peptidů. Potom se buňky promyjí a tím se odstraní materiál, který je nespecificky spojený

- 17 s buňkami. Množství peptidu navázaného na buňky se nyní určí buď scintilačním počítáním na základě vyzařované radioaktivity nebo spektrometrem vhodným pro měření dlouhotrvající fluorescence. Takto získané výsledky se potom vyhodnotí standardními metodami.

Ve druhém kroku se testují kandidáti s dobrou schopností vazby na svou imunogenicitu.

Imunogenicita xenopeptidů odvozených od proteinů, jejichž imunogenní působení není známé, může být například testována testem MLC. Pro předkládaný vynález jsou vhodné peptidy, které v tomto testu, který se s výhodou rovněž provádí sériově s rozdílnými peptidy, přičemž výhodně se použije jako standard peptid se známým imunogenním účinkem, vyvolají zvláště pevnou reakci.

Další možností testování kandidátů peptidů vázajících se na MHC-I na jejich imuinogenicitu spočívá v testování vazby peptidů na buňky T2. Tento test se zakládá na specifickém typu buněk T2 (Alexander, J. et al., 1989, Immunogenetics 29, 380) nebo buňkách RMA-S (Kárre, K. et al., 1986, Nátuře 319, 20. Feb., 675), které mají defektní mechanismus transportu peptidu TAP a stabilní molekuly MHC-i produkují teprve tehdy, jestliže se na ně nanesou peptidy, které jsou produkovány v kontextu MHC-I. Pro tento test se používají například buňky T2 nebo RMA-S, které jsou stabilně transfekovány genem HLA, například genem HLA-A1 a/nebo HLA-A2. Jestliže se nanesou na buňky peptidy, které jsou dobrými ligandy MHC-I, přičemž jsou produkovány v kontextu MHC-I tak, že mohou být rozpoznány imunitním systémem jako cizí, způsobují tyto peptidy, že se na povrchu buněk ve významném množství objevují molekuly HLA. Prokázání HLA na povrchu buněk například pomocí monoklonálních protilátek umožní identifikaci vhodného peptidu (Malnati, M. S. et al., 1995, Science 267, 1016-1018; Sykulev, Y. et al., 1994, Immunity 1, 15-22). Také v tomto případě se výhodně používá standardní peptid se známou dobrou schopností vazby na HLA, popřípadě MHC.

- 18 ···· · ·· ···· ·· ·· • · · · · · ···· • · · · · ···· • · · · · ·· ······ • · · * · · · · ·

V jedné formě provedení vynálezu může autologní nebo alogenní tumorová buňka vakcíny vykazovat větší množství xenopeptidů s rozdílnou sekvencí. Použité peptidy se mohou v tomto případě rozlišovat již tím, že se vážou na různé subtypy HLA. Tím je možno dosáhnout, že je zahrnuto větší množství, popřípadě společné subtypy HLA jednoho pacienta nebo větší skupiny pacientů. Vakcína se podává v ozařované formě.

Další, popřípadě přídavná variabilita týkající se xenopeptidů produkovaných na tumorových buňkách, může spočívat v tom, že se peptidy, které se vážou na určitý subtyp HLA, liší sekvencí, která není rozhodující pro vazbu HLA, protože jsou odvozeny od proteinů různého původu, například od virových a/nebo bakteriálních proteinů. V důsledku takové variability, která vakcinovanému organismu nabízí větší šířku rámce převedení buněk na cizí, může přinést zesílení stimulace imunitní odpovědi.

Ve formě provedení vynálezu, při které se tumorová vakcína skládá ze směsi alogenních tumorových buněk různých linií a popřípadě také autologních tumorových buněk, mohou být všechny tumorové buňky upraveny stejným (stejnými) peptidy, nebo mohou vykazovat tumorové buňky různého původu vždy také různé xenopeptidy.

V rámci pokusů provedených u předkládaného vynálezu byl jako cizí peptid typu a) použit virový peptid sekvence Leu Phe Glu Ala lle Glu Gly Phe lle odvozený od hemaglutininu viru chřipky, který je ligandem H2-K^d; podtrženy jsou kotevní aminokyseliny.

Pomocí tohoto přirozeně se vyskytujícího virového peptidu použitého jako cizího peptidu byla vyrobena tumorová vakcína, která byla testována na zvířecím modelu (model melanomu a karcinomu tlustého střeva).

Pro výrobu tumorové vakcíny byl použit další virový peptid sekvence Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met, který se odvozuje od

- 19 nukleoproteinu viru chřipky a je ligandem haplotypu HLA-1 H2-K^b(Rammensee, H. G. et al., 1993, Current Opinion in Immunology 5, 35-44); kotevní aminokyseliny jsou podtrženy; ochranný účinek této vakcíny byl potvrzen v jiném melanomovém modelu.

Byla vyrobena další vakcína, přičemž byly tumorové buňky převedeny na cizí cizím peptidem sekvence Phe Phe lle Gly Ala Leu Glu Glu lle (FFIGALEEI). Zde se jedná o syntetický, v přírodě dosud neznámý peptid. Při výběru sekvence byl kladen důraz na to, aby byly splněny požadavky týkající se vhodnosti ligandů pro molekulu MHC-I io typu H2-K^d. Vhodnost peptidu k získání antitumorové imunity podle koncepce aktivní imunoterapie byla potvrzena na myším karcinomu tlustého střeva CT-26 (syngenní pro myší kmen Balb/c).

V dalším provedení vynálezu může tumorová vakcína obsahovat navíc autologní a/nebo alogenní tumorové buňky a/nebo fibroblasty transfekované geny cytokinů. V WO 94/21808 a v Schmidt, W. et al., May 1995, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92, 4711-4714 se popisují účinné tumorové vakcíny, které byly vyrobeny pomocí jako „přenosová infekce“ označené metody transportu DNA expresním vektorem IL-2 (tento způsob spočívá na endocytóze zprostředkované receptorem

2o a využívá buněčného ligandů, zvláště transferinu, konjugovaného s polykationtem jako je polylyzin, k vytvoření komplexu s DNA, stejně jako endosmolytického prostředku jako adenovirus).

S výhodou se míchají peptidem ošetřené tumorové buňky a buňky exprimující cytokin v poměru 1:1. Jestliže se například smíchá 25 vakcína IL-2, která produkuje 4000 jednotek IL-2 na 1 x 10⁶ buněk s 1 x 10⁶ tumorových buněk ošetřených peptidem, může být takto získaná vakcína použita pro dvě ošetření, přičemž jako optimum dávky bylo přijato 1000 až 2000 jednotek IL-2 (Schmidt, W. et al., May 1995, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92, 4711-4714).

··· ·· · ···· • · ··· ···· • · · · · · · ······ ··· ···· · · ·· · · · · · · · ·· · ·

- 20 Kombinací cytokinové vakcíny s tumorovými buňkami ošetřenými peptidem mohou být s výhodou sjednoceny účinky obou těchto typů vakcín.

Zpracování buněk a formulace vakcín podle vynálezu probíhá obvyklým způsobem, jak se popisuje například v Biologie Therapy of Cancer, Editors: DeVita, V. T. Jr., Hellman, S., Rosenberg, S. A., Verlag J. B. Lippincott Company, Philadelphia, New York, London, Hagerstown nebo v WO 94/21808.

V dalším hledisku se vynález týká způsobu výroby tumorové vakcíny složené z tumorových buněk pro podávání pacientovi.

Způsob se podle vynálezu vyznačuje tím, že se tumorové buňky, které samy o sobě produkují v kontextu HLA peptidy odvozené od tumorových antigenů a z nichž alespoň část exprimuje alespoň jeden haplotyp MHC-I pacienta, smísí s jedním nebo více peptidy, které

a) fungují jako ligandy pro haplotyp MHC-I, který je společný pacientovi a tumorovým buňkám a jsou odlišné od peptidů odvozených od proteinů, které jsou exprimovány buňkami pacienta, nebo

b) fungují jako ligandy pro haplotyp MHC-I, který je společný pacientům a tumorovým buňkám vakcíny a jsou odvozeny od tumorových antigenů, které jsou exprimovány buňkami pacientů, přičemž se tumorové buňky inkubují s jedním nebo více peptidy a) a/nebo b) v přítomnosti organického polykationtu tak dlouho a v takovém množství, dokud nejsou peptidy navázány na tumorové buňky takovým způsobem, že jsou rozpoznány v kontextu s tumorovými buňkami imunitním systémem pacienta jako cizí a vyvolají buněčnou imunitní odpověď.

Množství peptidu je s výhodou přibližně 50 pg až přibližně 160 pg na 1 x 10⁵ až 2 x 10⁷ buněk. V případě použití peptidu

kategorie b) může být koncentrace také vyšší. Pro tyto peptidy je podstatné, že jejich koncentrace na tumorových buňkách vakcíny je zvýšena proti koncentraci peptidu na tumorových buňkách pacienta, který je odvozen od stejného tumorového antigenu, takovým 5 způsobem, že tumorové buňky vakcíny jsou rozpoznány jako cizí a vyvolají buněčnou imunitní odpověď.

K vhodným polykationtům patří homologní organické polykationty jako polylyzin, polyarginin, polyornitin nebo heterologní polykationty s dvěma nebo více rozdílnými kladně nabitými 10 aminokyselinami, přičemž tyto polykationty mohou mít různé délky řetězce, dále nepeptidické syntetické polykationty jako polyethylenimin, přirozené, na DNA se vázající proteiny polykationtového charakteru jako histony nebo protaminy, popřípadě jejich analogy nebo fragmenty, jako je spermin nebo spermidin. 15 K vhodným organickým polykationtům patří v rámci předkládaného vynálezu také polykationtové lipidy (Felgner, J. H. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 2550-2561; Loeffler, J.-P. et al., 1993, Methods Enzymol. 217, 599-618; Remy, J.S. et al., 1994, Bioconjug-Chem., Nov-Dec, 5 (6), 647-54; Behr, J. P., 1994, Bioconjug-Chem., Sept-Oct, 5(5), 3822o 9), které je možno mj. získat komerčně pod názvy Transfectam, Lipofectamin nebo Lipofectin.

Jako polykationty se s výhodou používají polylyzin (pL) o délce řetězce přibližně 30 až přibližně 300 lyzinových zbytků.

Požadované množství polykationtu v poměru k peptidu může být 25 v jednotlivých případech určeno empiricky. V případě použití polylyzinu a xenopeptidů kategorie a) je hmotnostní poměr pL ku peptid s výhodou přibližně 1:4 až přibližně 1:12.

Doba inkubace je obecně 30 minut až 4 hodiny. Řídí se podle toho, kdy je dosaženo maximálního obsazení peptidem; stupeň 3o obsazení je možno sledovat analýzou FACS a tímto způsobem také zjistit požadovanou délku inkubace.

- 22 ···· · ·· ···· ·· ·· ··· · · · · · · · • · · · · ···· • · ·· · · · ······ • · · · · · · · · ·· ··· · · · · ·· · ·

V dalším provedení vynálezu se polylyzin používá v alespoň částečně konjugované formě. S výhodou je část polylyzinu ve formě konjugované s transferinem (Tf) (konjugát transferin - polylyzin TfpL, tento případ se popisuje rovněž ve zveřejnění WO 94/21808), přičemž 5 hmotnostní poměr pL ku TfpL je s výhodou přibližně 1:1.

Místo s transferinem může být polylyzin konjugován s jinými proteiny, například s celulárními ligandy popisovanými ve WO 94/21808 jako internalizační faktory.

Působení na tumorové buňky může také popřípadě probíhat io v přítomnosti DNA. DNA je s výhodou ve formě plazmidu, například jako plazmid neobsahující sekvence kódující funkční eukaryotické proteiny, tedy jako prázdný vektor. Jako DNA může být použit v principu každý běžný funkčně získatelný plazmid.

Množství DNA v poměru k popřípadě s proteinem 15 konjugovanému polykationtu jako například k pL, TfpL nebo směsi pL s TfpL, je s výhodou přibližně 1:2 až přibližně 1:5.

Doba trvání inkubace, množství a druh polykationtu v poměru k počtu tumorových buněk a/nebo množství peptidu, jestli, popřípadě v jakém poměru, se s výhodou polykationt konjuguje, popřípadě 20 s jakým proteinem, výhodnost přítomnosti DNA a popřípadě její množství je možno určit empiricky. K tomu se mění jednotlivé parametry postupu a peptid se za jinak identických podmínek nanese na tumorové buňky a provede se test, jak účinně se peptid na tumorové buňky navázal. Vhodnou metodou k tomuto účelu je analýza 25 FACS.

Způsob podle vynálezu je vhodný kromě úpravy tumorových buněk také k úpravě jiných buněk.

Místo tumorových buněk mohou být způsobem podle vynálezu upraveny jedním nebo více peptidy autologní, i pacientům vlastní 3o fibroblasty nebo buňky fibroblastových buněčných linií, které jsou

- 23 sladěny buď se subtypem HLA pacienta nebo byly transfekovány odpovídajícím genem MHC-I, které jsou odvozeny od tumorových antigenů exprimovaných tumorovými buňkami pacienta. Takto upravené a ozářené fibroblasty mohou být použity jako tumorová 5 vakcína jako takové nebo ve směsi s tumorovými buňkami upravenými peptidem.

V dalším provedení mohou být upraveny místo fibroblastů dendritické buňky. Dendritické buňky jsou APC kůže; mohou být upraveny in vitro, tzn. z pacienta izolované buňky se smísí in vitro s jedním nebo více peptidy, přičemž peptidy jsou odvozeny od tumorových antigenů pacienta a vážou se na molekulu MHC-I nebo MHC-II pacienta. V dalších provedeních mohou být tyto buňky upraveny peptidem také in vivo. K tomu se injikují komplexy peptidu, polykationtu a popřípadě DNA s výhodou intradermálně, protože v kůži 15 se dendritické buňky vyskytují zvláště často.

V rámci předkládaného vynálezu byl peptid uveden do komplexu pro přenos do buněk CT-26 s TfpL nebo pL a pro přenos do buněk M-3 s nefunkčním plazmidem (prázdným vektorem). V systému CT-26 bylo zjištěno, že ozářená tumorová vakcína, která byla

2o převedena na cizí pomocí peptidu vytvářela účinnou antitumorovou aktivitu: 75 % očkovaných myší mohlo eliminovat testovací podání tumoru, které vedlo u všech kontrol, které buď nedostaly žádnou vakcínu nebo dostaly vakcínu bez xenopeptidu, k tvorbě tumoru. V systému M-3 byl testován stejný xenopeptid za podmínek, které pro 25 organismus vzhledem k tvorbě tumoru znamená ještě vyšší možnost výskytu, při experimentálním uspořádání, které více napodobovalo stav u člověka. Myš s metastázami byla očkována xenopeptizovanými ozářenými buňkami M-3. 87,5 % takto očkovaných myší mohlo metastázy eliminovat, zatímco všechny neošetřené a sedm z osmi 30 myší, které dostaly vakcínu bez xenopeptidu, onemocněly nádorem.

Dále bylo zjištěno, že míra systémové imunitní odpovědi tumorové vakcíny závisí na metodě, kterou se peptid nanese na tumorové buňky. Jestliže se peptid buňkám podá pomocí polylyzinu/transferinu, je účinek zřetelně vyšší, než když se buňky 5 inkubovaly 24 hod s peptidem („pulzy“). Také adjuvantní příměs peptidu k ozářeným vakcínám byla málo účinná. Transfekcí transferinem mohlo být buď zabezpečeno účinné přijetí peptidu do buněk, nebo také působení polylyzin/transferinu působí, že peptid zůstává lpět na buněčné membráně, tím se fyzikálně přivede do io blízkosti molekuly MHC-I a může se potom na ni navázat, přičemž na základě své silné afinity může vytlačit buněčné peptidy, které jsou navázány slaběji.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 a - c: Analýza FACS buněk M-3 ošetřených cizím peptidem.

Obr. 1 d: Mikrofotografie buněk M-3 ošetřených FITC peptidem.

Obr. 2 a, b: Léčení myší DBA/2 s metastázami melanomu M-3 20 vakcínou buněk M-3 s cizím peptidem.

Obr. 3 a: Titrace cizího peptidu pro výrobu tumorové vakcíny.

Obr. 3 b: Srovnání tumorové vakcíny z tumorových buněk s cizím peptidem s tumorovou vakcínou sekrenující IL-2.

Obr. 4 a: Ochrana myší Balb/c předběžnou imunizací vakcínou z buněk karcinomu tlustého střeva s cizím peptidem.

Obr. 4 b: Výzkum podílu T-buněk na systémové imunitě.

- 25 toto·· to toto ······ ··· toto ···· • · ··· ··· • · ·· « ·· ··· ··· to····

Obr. 5: Ochrana myší C57BL/6J před imunizací vakcínou z melanomových buněk s cizím peptidem.

Příklady provedení vynálezu

V následujících příkladech bylo použito následujících materiálů a metod, pokud není uvedeno jinak.

Klon myší melanomové buněčné linie Cloudman S91 (Klon M-3; ATCC No. CCL 53.1) byl získán z ATCC.

Melanomová buněčná linie B16-F10 (Fidler et al., 1975) byla získána z depozitáře NIH DCT Tumor Depository.

Výroba konjugátů transferin-polylyzin transfekčních komplexů obsahujících DNA byla převzata z popisu WO 94/21808. Peptidy LFEAIEGFI, FFIGALEEI, LPEAIEGFG a ASNENMETM byly syntetizovány na peptidovém syntezátoru model 433 A se zpětnovazebním monitorem, Applied Biosystems, Foster City, Kanada) za použití materiálu TentaGel S PHB (Rapp, Tubingen) jako pevné fáze metodou Fmoc (aktivace HBTU, Fastmoc™, měřítko 0:25 mmol). Peptidy byly rozpuštěny v 1 Μ TEAA pH 7,3 a čištěny reverzní chromatografií na koloně Vydac C 18. Sekvence byly stanoveny hmotnostní spektrometrií na přístroji MAT Lasermat (Finnigan, San Jose, Kanada).

Testování účinnosti vakcíny proti rakovině na její ochranný účinek proti tvorbě metastáz („terapeutický myší model“) a testování na profylaktickém myším modelu bylo provedeno podle protokolu popsaného ve WO 94/21808, přičemž jako myší model byl použit model DBA/2 a Balb/c.

- 26 Příklad 1

Srovnávací analýza FACS buněk M-3, na které bylo působeno různými způsoby cizím peptidem

Pro tento výzkum, zobrazený na obr. 1 byl použit xenopeptid LFEAIEGFI nanesený jedenkrát na buňky M-3 s komplexy TfpL/DNA („Transloading“; obr. 1a), jednou byly buňky inkubovány s peptidem („pulsy“; obr. 1b) a jednou byl peptid přimíšen k buňkám s pomocí adjuvans (obr. 1c).

Pro metodu „transloading“ bylo smíseno 160 pg xenopeptidu LFEAIEGFI značeného FITC popřípadě neznačeného kontrolního peptidů s 3 pg transferin-polylyzinu (TfpL), 10 pg pL a 6 pg psp65 (Boehringer Mannheim, bez LPS) v 500 pl pufru HBS. Po 30 min při pokojové teplotě byl uvedený roztok vložen do kultivační láhve T75 s

1,5 x 10⁶ buňkami M-3 ve 20 ml média DMEM (10 % FCS, 20 mmol glukóza) a inkubován při 37 °C. Po 3 hod byly buňky dvakrát promyty PBS, odděleny roztokem PBS/2 mM EDTA a resuspendovány pro analýzu FACS v 1 ml pufru PBS/5 % FCS.

„Pulsy“ buněk s peptidem byly provedeny s 1 - 2 x 10⁶ buňkami ve 20 ml DMEM s 450 pg peptidů (FITC - značený nebo neznačený) v průběhu 3 hod při 37 °C.

Pro adjuvantní smísení bylo před analýzou FACS inkubováno 10⁶ buněk uvolněných z kultivační láhve se 100 pg peptidů značeného FITC v 1 ml PBS/5 % FCS 30 min při pokojové teplotě. Buňky byly po výměně PBS/5 % FCS promyty a ještě jednou analyzovány. Analýza FACS byla provedena s použitím zařízení FACS Vantage (Becton Dickinson), opatřeného argonovým laserem 5 W nastaveným na 100 mW při 488 nm podle doporučení výrobce. Výsledek analýzy FACS je uveden v obr. 1a až 1c. Obr. 1d ukazuje mikrofotografie cytocentrifugovaných buněk M-3; Horní obrázek ukazuje buňky, které získaly peptid pomocí komplexu („transloading“), dolní obrázek

- 27 ukazuje buňky, které byly s peptidem inkubovány („pulsy“). Pro barvení jader bylo použito DAPI.

Buňky M-3, do kterých byl vložen komplex obsahující peptid, ukazovaly posun fluorescence o téměř dva řády ve srovnání s buňkami bez vloženého peptidů nebo s buňkami, na které bylo působeno samotným polylyzinem, což ukazuje na účinný přenos peptidů na buňky prostřednictvím komplexu TfpL/DNA (obr. 1a). Inkubace s peptidem (pulsy) byla méně účinná, což se odrazilo v posunu fluorescence pouze o jeden řád, který při fluorescenční mikroskopii není prakticky prokazatelný (obr. 1d). V případě adjuvantního smísení zmizel peptid po kroku praní (obr. 1c), což ukazuje na to, že vazba peptidů je zcela nepatrná.

Příklad 2

Léčení melanomových metastáz u myší DBA/2 vakcínou z melanomových buněk s přimíšeným cizím peptidem („terapeutický myší model“)

a) Výroba tumorové vakcíny z buněk M-3

160 pg xenopeptidu LFEAIEGFI bylo smíseno s 3 pg transferinpolylyzinu (TfpL), 10 pg pL a 6 pg psp65 (bez LPS) v 500 pl pufru HBS. Po 30 min při pokojové teplotě byl přidán uvedený roztok do kultivační láhve T75 s 1,5 χ 10⁶ buňkami M-3 ve 20 ml média DMEM (10 % FCS, 20 mM glukóza) a směs byla inkubována při 37 °C. Po 3 hodinách bylo médium vyměněno za čerstvé a buňky byly inkubovány přes noc při 37 °C a 5 % CO₂. 4 hod před aplikací byly buňky ozářeny dávkou 20 Gy. Příprava vakcíny probíhala podle popisu ve WO 94/21808.

b) Účinnost tumorové vakcíny • · · ·

až 12 týdnů staré myši DBA-2 s pětidenními metastázami (získány podkožní injekcí 10⁴ živých buněk M-3) byly v odstupu jednoho týdne ošetřeny dvakrát podkožní injekcí tumorové vakcíny (dávka: 10⁵ buněk/zvíře). součástí experimentu bylo osm myší.

Výsledek pokusu je uveden v obr. 2a; ukázalo se, že 7 z 8 zvířat se po podání vakcíny obsahující peptid nanesený na tumorové buňky prostřednictvím komplexů TfpL/DNA uzdravilo. Ve srovnávacích pokusech byla použita vakcína, u které byl peptid LFEAIEGFI (400 pg nebo 4 mg) nanesen na buňky inkubací (3 hod při 37 °C; „pulsy“). Ze io zvířat, která dostala vakcínu se 400 pg peptidu, zůstala 3 z 8 bez tumorů, vakcína z buněk upravených 4 mg peptidu vyléčila jen jedno zvíře z osmi. Kontrolami byly ozářené buňky M-3 samotné a buňky, na které bylo působeno komplexy bez peptidu (vždy jedno z osmi zvířat zůstalo bez tumoru). U skupiny kontrolních zvířat, která nebyla 15 žádným způsobem ošetřena, se vyvinuly tumory u všech. Aby byla prověřena jednoznačnost na jedné straně způsobu výroby vakcíny a na druhé straně peptidové sekvence, byla provedena další série pokusů; u těchto experimentů byla použita vysoce tumorogenní varianta buněk M-3. V pokusech, u kterých byl testován význam 2o vnášení peptidu, byly vakcíny, ve kterých nebyl peptid nanesen na buňky prostřednictvím komplexu polylyzin-transferin, ale k buňkám byl přimíšen výlučně adjuvantním způsobem. Pro kontrolu zaměřenou na peptidovou sekvenci byly nahrazeny aminokyseliny peptidů v polohách 2 a 9, totiž fenylalanin a izoleucin, prolinem, popřípadě 25 glycinem, což vedlo k vytvoření peptidu Leu Pro Glu Ala lle Glu Gly Phe Gly (LPEAIEGFG); tomuto peptidu chybí schopnost vázat se na H2-K^d. Tvorba metastáz byla kontrolována alespoň jednou za týden. Výsledek tohoto pokusu je ukázán na obr. 2b. Vakcína vyrobená vložením LFEAIEGFI do buněk prostřednictvím komplexů TfpL/DNA

3o vyléčila 6 z 8 zvířat. Naproti tomu se u 7 z 8 zvířat, která dostala vakcínu, u které byl peptid LFEAIEGFI pouze k buňkám přimíšen, popřípadě vakcínu, která vznikla z buněk, do kterých byl

- 29 prostřednictvím komplexů TfpL/DNA vložen peptid LPEAIEGFG, který se neváže na motiv HLA, vyvinuly tumory. U kontrolní skupiny, která byla ošetřena pouze ozářenými buňkami M-3, popřípadě která nebyla žádným způsobem léčena, se vyvinuly tumory u všech zvířat.

c) Výzkum vlivu množství peptidu ve vakcíně

Podle popisu v a) byly vyrobeny peptid obsahující komplexy, které obsahovaly buď 50, 5 nebo 0,5 pg účinného peptidu LFEAIEGFI a těmito komplexy byly upraveny buňky M-3. Jako srovnání sloužila io vakcína IL-2, která sekrenovala optimální dávku IL-2 (viz příkl. 3). Touto vakcínou byly očkovány myši DBA/2, které nesly pětidenní metastázy. Vakcína s 50 pg peptidu vyléčila 6 z 8 myší, vakcína s 5 pg 4 z 8 stejně jako vakcína IL-2, zatímco vakcína s obsahem 0,5 pg vyléčila pouze 2 z 8 zvířat. Tento pokus je ukázán v obr. 3a.

Příklad 3

Srovnání vakcíny obsahující cizí peptid s tumorovou vakcínou z tumorových buněk sekrenujících IL-2 v profylaktickém myším modelu

V srovnávacím pokusu byly dvě skupiny pokusných zvířat (po

2o osmi) v odstupu jednoho týdne dvakrát předimunizovány na jedné straně vakcínou popsanou v příkladu 2a), na druhé straně vakcínou z buněk M-3, sekrenující IL-2 (vyrobenou podle protokolu popsaného v WO 94/21808, dávka IL-2 2000 jednotek na zvíře). Týden po poslední vakcinaci byly při stoupajícím počtu tumorových buněk nasazeny kontralaterální tumory („testovací podání“; dávka je uvedena v obr. 3b). Ukázalo se, že předimunizace tumorovou vakcínou podle vynálezu byla lepší než předimunizace vakcínou IL-2: nahé myši očkované vakcínou IL-2, byly chráněny pouze proti dávce 10⁵ živých vysoce tumorogenních buněk (M-3-W). Kapacita této vakcíny však byla vyčerpána při podání 3 x 10⁵ buněk, zatímco tumorové zatížení

- 30 tohoto rozměru zvířat, která byla předimunizována vakcínou z tumorových buněk s přidaným cizím peptidem bylo úspěšně eliminováno.

Příklad 4

Ochrana myší Balb/c předimunizací vakcínou z buněk karcinomu tlustého střeva obsahující cizí peptid („profylaktický myší model“)

a) Výroba vakcíny CT-26 io 160 pg xenopeptidu LFEAIEGFI popřípadě FFIGALEEI bylo smíseno s 12 pg pL, popřípadě s 3 pg transferin-polylyzinu + 10 pg polylyzinu, 30 min při pokojové teplotě v 500 pl pufru HBS byl ponechán čas pro vytvoření komplexu a potom byla směs převedena do kultivační láhve T75 s 1,5 x 10⁶ buňkami CT-26 ve 4 ml média

DMEM (10 % FCS, 20 mM glukóza) a potom byla provedena inkubace při 37 °C a 5 % CO₂. Po 4 hod byly buňky promyty PBS, bylo přidáno ml čerstvého média a probíhala inkubace přes noc při 37 °C a 5 % CO₂. 4 hod před aplikací byly buňky ozářeny dávkou 100 Gy. Zpracování vakcíny probíhalo podle popisu v WO 94/21808.

b) Testování účinnosti protirakovinné vakcíny na ochranný účinek při testovacím podání CT-26 až 12 týdnů staré myší Balb/c byly dvakrát očkovány v odstupu jednoho týdne podkožní injekcí (dávka buněk: 10⁵/myš). Ve skupině bylo 8 myší (popřípadě 7 myší při pokusu, při kterém byl pro vkládání do buněk použit pL) na experiment. Týden po poslední vakcinaci byly nasazeny kontralaterální tumory s 5 x 10⁴ rodičovských buněk CT-26. Srovnávací pokusy, ve kterých byla vakcína vyrobena jiným způsobem jako z komplexů TfpL/DNA stejně jako kontrolní

3o experimenty, byly provedeny jak je popsáno v příkladu 2. Nárůst

- 31 buněk po testovacím podání tumoru byl kontrolován alespoň jednou za týden. Výsledek pro peptid LFEAIEGFI je uveden v obr. 4a; chráněno bylo šest z osmi zvířat. V případě peptidu FFIGALEEI (v obr. 4 není ukázáno) byla chráněna čtyři z osmi zvířat.

c) Podíl T-buněk na účinku tumorové vakcíny

Aby byl prokázán podíl T-buněk na systémovou imunitu způsobenou vakcínou CT-26, byly v dalším pokusu 24 hod před vakcinací odstraněny buňky CD4⁺ intravenózní injekcí 500 pg monoklonální protilátky GK1.5 (ATCC TIB 207) a buňky CD8⁺intravenózní injekcí 500 pg monoklonální protilátky 2.43 (ATCC TIB 210). Pozitivní kontrolní skupina dostala vakcínu, aniž by byly odstraněny buňky CD4⁺ a CD8⁺. Výsledek pokusu je uveden v obr. 4b: podíl T-buněk je ukázán tím, že u všech zvířat, jejichž T-buňky byly odstraněny, se vyvinuly tumory.

Příklad 5

Ochrana myší C57BL/6J předimunizací vakcínou z melanomových buněk s obsahem cizího peptidu („profylaktickv myší model“)

V tomto příkladu byla jako pokusná zvířata použity myši kmene C57BL/6J (vždy osm zvířat na skupinu). Jako melanomové buňky byly použity buňky B16-F10 syngenní pro použitý kmen myší (NIH DCT Tumor Depository; Fidler et al., 1975).

Zvířata všech pokusných skupin byla dvakrát v odstupu jednoho týdne vakcinována podkožní injekcí 10⁵ buněk B16-F10:

V jedné pokusné sérii byla vyrobena vakcína, do které byly použity ozářené buňky B16-F10 s obsahem peptidu sekvence ASNENMETM, jak je popsáno v příkladu 2 pro vakcínu z buněk M-3.

V paralelních pokusech byly použity buňky B16-F10 sekrenující IL-2, popřípadě GM-CSF (vyrobené podle protokolu popsaného v WO 94/21808) jako vakcína pro předimunizaci; vakcína produkovala 1000 jednotek IL-2, popřípadě 200 ng GM-CSF na zvíře.

Kontrolní skupina dostala pro předimunizaci ozářené a jinak neošetřené buňky B16-F10.

Týden po poslední vakcinaci byly nasazeny pokusným zvířatům tumory protřednictvím 1 x 10⁴ živých ozářených buněk B16-F10 a růst tumorů byl dále sledován.

Výsledek pokusu je ukázán v obr. 5; Tumorové buňky obsahující cizí peptid vykazovaly nejlepší ochranný účinek před vytvořením tumorů.

• · ·

Tabulka

Sekvence peptidu	MHC haplotvp	Antiqen	Reference
SPSYVYHQF	L^d	gp70, endogenní MuLV	1
FEQNTAQA	K^b	Connexin37	2
FEQNTAQP	K^b	Connexin37	2
SYFPEITHI	K^d	JAK1	3
EADPTGHSY	HLA-A1	MAGE-1	3
EVDPIGHLY	HLA-A1	MAGE-3	3
YMNGTMSQV	HLA-A2+	Tyrosináza	3
	HLA-A0201
MLLALLYCL	HLA-A0201	Tyrosináza	3
AAGIGILTV	HLA-A0201	Melan A/Mart1	3
YLEPGPVTA	HLA-A0201	pmel17/gp100	3
ILDGTATLRL	HLA-A0201	pmel17/gp100	3
SYLDSGIHF	HLA-A24	β-Catenin	4
AINNYAQKL	D^b	SV-40 velký	5
CKGVNKEYL		T-Antigen
QGINNLDNL
NLDNLRDYL
EEKLIVVLF	HLA-B44	MUM-1	6
ACDPHSGHFV	HLA-A2	mutovaný CDK4	7
AYGLDFYIL	HLA-A24	p15, neznámá funkce	8
KTWGQYWQV	HLA-A2	gpioo	9
YLEPGPVTA
HMTEVVRHC	HLA-A2	mutovaný p53	10
KYICNSSCM	K^d	mutovaný p53	11
GLAPPQHEI	HLA-A2	mutovaný p53	12
LLGRNSEEM

• · ·· ··

- 34 Tabulka (pokračování)

Sekvence peptidu	MHChaplotyp	Antiqen	Reference
LLPENNVLSPL	HLA-A2	standardní typ p53	13
RMPEAAPPV
LLGRNSFEV
LLGRDSFEV	HLA-A2	mutovaný p53	13

1. Huang, A. Y. C„ a Pardoll, D. M. (1996) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93, 9730-5

2. Mandelboim, O. et al., 1994, Nátuře 369, 5.May, 67-71

3. Rammensee, H. G., Friede, T., a Stepvanovic, S. (1995)

Immunogenetics 41, 178-228

4. Robbins a Rosenberg, (1996) J. EXP. MED. 183, 1185-92

5. Lili, N. L., Tevethia, M. J., Hendrickson, W. G., a Tevethia, S. S. (1992) J. Exp. Med. 176, 449-57

6. Coulie, P. G., Lehmann, F., Lethe, B., Herman, J., Lurquin, C.,

2o Andrawiss, M., a Boon, T. (1995), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 7976-80

7. Wólfel, T., Hauer, M., Schneider, J., Serrano, M., Wolfel, C., Klehmann Hieb, E., De Plaen, E., Hankeln, T., Meyer zum Buschenfelde, K. H., und Beach, D. (1995). Science 269, 1281-4

8. Robbins, P. F„ el Gamil, M., Li, Y. F., Topalian, S.L., Rivoltini, L.,

Sakaguchi, K., Appella, E., Kawakami, Y., a Rosenberg, S. A. (1995) J. Immunol. 154, 5944-50

9. Kawakami, Y. et al., 1995, The Journal of Immunol. 154, 39613968

10. Houbiers, J. G., Nijman, H. W., van der Burg, S. H., Drijfhout, J. W., Kenemans, P., van de Velde, C. J., Brand, A., Momburg, F., Kast, W. M., a Melief, C. J. (1993). Eur. J. Immunol. 23, 2072-7

11. Noguchi, Y., Chen, Y. T., a Old, L. J. (1994). Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91, 3171-3175

12. Stuber, G., Leder, G. H., Storkus, W. T., Lotze, Μ. T., Modrow, S., Szekely, L., Wolf, H., Klein, E., Karre, K., und Klein, G. (1994). Eur J Immunol 24, 765-768

13. Theobald, M., Levine, A. J., und Sherman, L. A. (1995) PNAS 92, 11993-7

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Tumorová vakcína pro podávání pacientovi, vyznačující se tím, že obsahuje tumorové buňky, které samy o sobě produkují v kontextu HLA peptidy odvozené z tumorových antigenů, přičemž alespoň část z nich má na povrchu alespoň jeden haplotyp MHC-I pacienta, a do kterých byl vložen jeden nebo více peptidů a) a/nebo b) takovým způsobem, že tumorové buňky jsou v kontextu s peptidy imunitního systému pacienta rozpoznány jako cizí a vyvolají buněčnou imunitní odpověď, přičemž peptidy

a) fungují jako ligandy pro haplotyp MHC-I, který je společný pacientovi a tumorovým buňkám vakcíny, a jsou různé od peptidů odvozených od proteinů exprimovaných buňkami pacienta, nebo

b) fungují jako ligandy pro haplotyp MHC-I, který je společný pacientovi a tumorovým buňkám vakcíny a jsou odvozeny od tumorových antigenů exprimovaných buňkami pacienta a vyskytují se na tumorových buňkách vakcíny v koncentraci, která je vyšší než koncentrace peptidů odvozeného od stejného tumorového antigenů jako je exprimován na tumorových buňkách pacienta.
2. Tumorová vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje autologní tumorové buňky.
3. Tumorová vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje alogenní tumorové buňky.

• · · · • · • · • · · · · • · ··· φ φ φ φ φ φ
4. Tumorová vakcína podle nároku 3, vyznačující se tím, že alogenní tumorové buňky jsou jedné nebo více buněčných linií, ze kterých alespoň jedna buněčná linie exprimuje alespoň jeden, s výhodou více tumorových antigenů, které jsou identické s tumorovými antigeny léčeného pacienta.
5. Tumorová vakcína podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že sestává ze směsi autologních a alogenních buněk.
6. Tumorová vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid a) je odvozen od přirozeně se vyskytujícího imunogenního proteinu, popřípadě produktu jeho buněčného odbourávání.
7. Tumorová vakcína podle nároku 6, vyznačující se tím, že peptid a) je odvozen od virového proteinu.
8. Tumorová vakcína podle nároku 7, vyznačující se tím, že peptid je odvozen od proteinu viru chřipky.
9. Tumorová vakcína podle nároku 6, vyznačující se tím, že peptid a) je odvozen od bakteriálního proteinu.
10. Tumorová vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid a) je odvozen od tumorového antigenů, který je pacientovi cizí.
11. Tumorová vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid a) je syntetický peptid.
12. Tumorová vakcína podle některého z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že na tumorové buňky se působí větším množstvím peptidů rozdílné sekvence.
13. Tumorová vakcína podle nároku 12, vyznačující se tím, že peptidy se liší tím, že se vážou na rozdílné subtypy HLA.
14. Tumorová vakcína podle nároku 13, vyznačující se tím, že se peptidy liší v sekvenci, která není rozhodující pro vazbu HLA.
15. Tumorová vakcína podle některého z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že mimo to obsahuje tumorové buňky a/nebo fibroblasty, které jsou transfekovány genem cytokinu.
16. Tumorová vakcína podle nároku 15, vyznačující se tím, že cytokinem je cytokin IL-2 a/nebo IFN-γ.
17. Tumorová vakcína podle některého z nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že mimo to obsahuje fibroblasty, do kterých byl vložen jeden nebo více peptidů • · • · • · odvozených od tumorových antigenů exprimovaných pacientem.
18. Tumorová vakcína podle některého z nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že mimo to obsahuje dendritické buňky, do kterých byl vložen jeden nebo více peptidů odvozených od tumorových antigenů exprimovaných pacientem, a které se vážou na molekulu MHC-I nebo molekulu MHC-II.
19. Způsob výroby tumorové vakcíny obsahující tumorové buňky pro podávání pacientovi, vyznačující se tím, že že se na tumorové buňky produkující samy o sobě v kontextu HLA od tumorových antigenů odvozené peptidy a z nichž alespoň část exprimuje alespoň jeden haplotyp MHC-I pacienta působí jedním nebo více peptidy, které

a) fungují jako ligandy pro haplotyp MHC-I, který je společný pacientům a tumorovým buňkám vakcíny a jsou různé od peptidů odvozených od proteinů exprimovaných buňkami pacienta, nebo

b) fungují jako ligandy pro haplotyp MHC-I, který je společný pacientům a tumorovým buňkám vakcíny, a jsou odvozeny od tumorových antigenů exprimovaných buňkami pacienta, přičemž tumorové buňky se inkubují s jedním nebo více peptidy a) a/nebo b) tak dlouho a v takovém množství v přítomnosti organického polykationtu až jsou peptidy na tumorové buňky navázány takovým způsobem, že jsou v kontextu s tumorovými buňkami imunitního systému pacienta rozpoznány i jako cizí a vyvolají buněčnou imunitní odpověď.
20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že se kromě toho působí na dendritické buňky v přítomnosti organického polykationtu jedním nebo více peptidy odvozenými od tumorových antigenů exprimovaných pacientem a které se vážou na molekulu MHC-I nebo molekulu MHC-II, a dendritické buňky se smísí s tumorovými buňkami.
21. Způsob podle nároku 19 nebo 20, vyznačující se tím, že se jako polykationt použije polylyzin.
22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že se použije polylyzin s délkou řetězce přibližně 30 až přibližně 300 lyzinových zbytků.
23. Způsob podle některého z nároků 19 až 22, vyznačující se tím, že se polykationt použije v alespoň částečně konjugované formě.
24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, ž e polykationt je konjugován s transferinem.
25. Způsob podle některého z nároků 19 až 23, vyznačující se tím, že se kromě toho působí na buňky v přítomnosti DNA.
26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že DNA je plazmid.
27. Způsob podle nároku 25 nebo 26, vyznačující se tím, že poměr DNA k popřípadě částečně s proteinem konjugovanému kationtu je přibližně 1:2 až přibližně 1:5.
28. Způsob podle některého z nároků 25 až 27, vyznačující se tím, že tumorovými buňkami jsou melanomové buňky.
29. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že se použije peptid a) a/nebo b) v množství od přibližně 50 pg do přibližně 160 pg na 1 x 10⁵ až 2 x 10⁷ buněk.
30. Použití způsobu podle některého z nároků 19, 21 až 27 a 29 na fibroblasty, přičemž se použije jeden nebo více peptidů odvozených od tumorových antigenů exprimovaných pacientem.
31. Použití způsobu podle některého z nároků 19, 21 až 27 a 29 na dendritické buňky, přičemž se použije jeden nebo více peptidů odvozených od tumorových antigenů a vázajících se na molekulu MHC-I nebo MHC-II pacienta.