CZ154898A3

CZ154898A3 - Oligonukleotidy pro inhibici růstu nádorů zprostředkovaných IL-8 a receptorem IL-8

Info

Publication number: CZ154898A3
Application number: CZ981548A
Authority: CZ
Inventors: Zbigniew Pietrzkowski; Dariusz Cieslak; Gordana Olbina
Original assignee: Icn Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 1995-11-21
Filing date: 1996-11-16
Publication date: 1998-09-16
Also published as: PL326674A1; CN1202900A; US5849903A; EA199800391A1; WO1997019097A1; EP0879241A1; SI9620122A; EA000841B1; SK66098A3; KR19990071523A; MX9804009A; US6017898A; CA2236825A1; JPH11507245A; AU708096B2; AU1053197A; EP0879241A4

Description

Oligonukleotidy pro inhibici růstu nádorů zprostředkovaných IL-8 a receptorem IL-8

Oblast techniky

Oblasti vynálezu je léčeni pomoci oligonukleotidů, konkrétněji použiti oligonukleotidů k modulaci exprese IL-8 a/nebo receptoru IL-8 ke kontrole růstu, metastáz a/nebo angiogeneze nádorů.

Dosavadní stav techniky

IL-8

Interleukin-8 (IL-8, neutrofilový aktivační protein-1, nebo NAP-1) je člen rodiny chemokinů C-X-C mající vztah k cytokinům, která je široce zapojena do zánětlivých odpovědí, poranění tkáně, růstové regulace a buněčné adheze (Ceretti, D.P., et al., Molecular Characterization of Receptors for Human Interleukin-8, GRO/Melanoma GrowthStimulatory Activity and Neutrophil Activating Peptide-2, Molecular Immunology, 30(4), 359-367, 1993, a Koch, A.E., et al., In šitu expression of cytokines and cellular adhesion molecules in the skin of patients with systemic sclerosis, Pathobiology, 61(5-6), 239-46, 1993). Přehled rodiny C-X-C je podán v práci autora Streiker, R.M., et al. (Role of C-XC Chemokines as Regulators Of Angiogenesis In Lung Cancer, J. of Leukocyte Biology, 57, 752-762, 1995). Bylo také ukázáno, že IL-8 má silný stimulační účinek na angiogenezu (viz např. Koch, A.E., Interleukin-8 as a Macrophage-Derived Mediator of Angiogenesis, Science, 258, 1798-1800, 1992).

• · ····

Je známo, že IL-8 je tvořen celou řadou normálních lidských somatických buněk včetně monocytů/makrofágů, dermálních fibroblastů, cévních endotelových buněk, keratinocvtů a buněk mesangia (Yasumoto, K., et al., Tumor Necrosis Factor Alpha and Interfěron Gamma Synergistically Induce Interleukin 8 Production in a Human Gastric Cancer Cell Line Through Acting Concurrently on AP-1 and NF-kB-like Binding Sites of the Interleukin 8 Gene, J. of Biological Chemistry, 267(31), 22506-11, 1992). Tyto buňky zjevně tvoří IL-8 pouze když jsou stresovány, a ne v podmínkách normálního růstu a homeostázy. Faktory, které indukují tvorbu IL-8, zahrnují zánět, IL-1, TNF, LPS a trombin.

Je také známo, že IL-8 je obecně secernován nádorovými buňkami. Nádor v tomto smyslu definovaný znamená nekontrolované a progresivní množení buněk, včetně benigních nádorů a všech forem novotvarů a rakoviny. V jedné studii bylo prokázáno, že IL-8 byl přítomný v 80 % zkoumaných karcinomových buněčných linií a v 83,3 % zkoumaných nádorových tkání. Bylo také ukázáno, že IL-8 je růstový faktor nádorů a že protilátka anti-IL-8 a antisense (s opačnou orientací) oligonukleotid k receptoru IL-8 jsou účinné v tlumeni růstu nádorových buněk in vitro (Ishoko, T., et al., výše, Schadendorf, D., et al., IL-8 Produced by Human Malignant Melanoma Cells in Vitro Is an Essential Autocrine Growth Factor, J. Immunol., 151(15), 2667-2674, 1993) .

Předpokládá se, že kvůli svému účinku na růst má IL-8 významnou úlohu v metastatickém šíření melanomů a dalších nádorů (Schadendorf, D., et al., výše). Bylo například dokázáno, že IL-8 je přímo zapojen do mechanismu metastazování melanomů (Singh, R.K., et al., Ultraviolet B Irradiation Promotes Tumorigenic and Metastatic Properties ♦ ♦ • ·

• · · ·

• · 9 ·· 99 ·· · · « in Primary Cutaneous Melanoma via Induction of Interleukin 8, Cancer Res., 55, 3669-3674, 1995), a také plicniho karcinomu (Greenspoon, S.A.,, et al., The expression of IL-8 during Tumorigenesis and Metastasis in a model of human nonsmall cell lung cancer/SCID mouše chiméra, Clinical Research, 42, 404A, 1994). Bylo také nalezeno, že IL-8 hraje roli v nádorové neovaskularizaci, například u karcinomů dlaždicových buněk hlavy a krku (Cohen, R.F., et al., Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., 121, 202-209, 1995). IL-8 hraje tedy důležitou úlohu v nádorovém růstu, metastázách a angiogenezi.

Receptor IL-8

IL-8 je ligandem pro receptor IL-8 v buněčné membráně, a má se za to, že pro činnost IL-8 je vyžadována interakce mezi IL-8 a receptorem IL-8. Dosud byly identifikovány dva geny receptoru IL-8, receptor IL-8 typu A a typu B. Oba geny patři k rodině receptorů spojených s proteinem G, takzvané rodině se sedmi transmembránovými doménámi. Bylo prokázáno, že receptor A je aktivován IL-8 a receptor B je také aktivován IL-8, stejně jako dalšími cytokiny patřícími do rodiny C-X-C včetně růstového faktoru stimulující aktivitu melanomu (Melanoma Growth Stimulatory Activity - MGSA) . Uvádí se, že receptor B je pozoruhodný pro svou „promiskuitu, pro vazbu s růstovým regulačním genem (GRO) (také známý jako růstový faktor stimulující aktivitu melanomu - MGSA), neutrofilovým aktivačním peptidem-2 (NAP2) a neutrofilovým aktivačním peptidem-1 (CAP-1), všechny z nich jsou nakupeny na lidském chromozomu 4ql3-q21 (Ahuja, S.K, Molecular Evolution of the Human Interleukin-8 Receptor Gene Cluster, Nátuře Genics, 2, 31-36, 1992, Cerretti et al., výše). Obecné účinky vyvolané působením IL-8 a MGSA na • 4 4444 neutrofily zahrnuji mobilizaci kalcia, indukci respiračniho záchvatu, degranulaci sekrečních vezikul a zvýšení GTPázové aktivity a vazby GTP.

Receptor B IL-8 byl nalezen nejenom v neutrofilech a dalších buňkách hematopoetických linií, ale také v buňkách jiných než hematopoetických. Receptor B IL-8 byl nalezen například v buňkách responzivních na MGSA, nádorový nekrotický faktor a nádorové promotory, včetně placentárních a ledvinných buněčných linii (Mueller, S.G., et al., Melanoma Growth Stimulatory Activity Enhances the Phosphorylation of the Class II Interleukin-8 Receptor in Non-hematopoietic Cells, J. Biol. Chem., 269, 1973-1980, 1994, NF-kB Subunit-Specific Regulation of the Interleukin-8 Promotér, Mol. & Cell. Bio., 13(10), 6137-6146, 1993). Úloha a funkce receptoru B IL-8 přítomného v rakovinných a jiných nádorových buňkách není ještě plně objasněna. Existuje ale důkaz, že aktivace IL-8R B je 1) zapojena do mechanismu růstové regulace melanomových a tumorigenních fibroblastů, 2) je spojena s transformací plicních buněk azbestem, a 3) koreluje s metastatickým potenciálem melanomu.

Byly izolovány cDNA kódující alespoň dva receptory IL-8 a přiřazeny chromozomu 2q35 (Morris, S.W., et al., Assignment of the Genes Encoding Human Interleukin-8 Receptor Types 1 and 2 and an Interleukin-8 Receptor Pseudogene to Chromosome 2q35, Genomics, 14, 685-691, 1992, Murphy, P.M., and Tiffany, H.L., Cloning of Complementary DNA Encoding a Functional Human Interleukin-8 Receptor, Science, 253, 1280-1283, 1991). Byly také identifikovány biochemicky dva další receptory IL-8, které odpovídají dříve identifikovaným cDNA (Moser, et al., Expression of Transcripts for Two Interleukin Receptors in Human *···

Phagocytes, Lymfocytes and Melanoma Cells, Biochem., 285-292, 1993).

294,

Vzhledem stimulačním účinku IL-8 na růst buněk responzivnich výhodné mit (oligonukleotidy které moduluji karcinomů in na různé nádorové růstové dispozici antisense orientací opačnou ke

IL-8 expresi buď vivo. Zejména účinné by nebo bylo oligonukleotidy, které jsou a melanomu, protože každý vlastní růstové faktory.

Existuji přinejmenším dva hlavni malobuněčný plicní karcinom SCLC) a plicní karcinom malobuněčný, (non-small cell zahrnuje přibližně jednu neuroendokrinní markéry (značky) do lymfatických uzlin, mozku, zahrnuj e zahrnuje karcinom.

proti faktory by oligonukleotidy směru transkripce), receptoru IL-8 u výhodné plicnímu z těchto karcinomů bylo poskytnout karcinomu tvoři své typy plicní rakoviny, (smáli cell lung carcinoma jiný než malobuněčný, nelung carcinoma - NSCLC) . SCLC čtvrtinu případů, exprimuje , a obecně časně metastazuje kosti, plic a jater. NSCLC většinu zbývajících typů plicnich nádorů, a adenokarcinom, epidermoidní karcinom a velkobuněčný

NSCLC je charakterizován růstovými faktory a receptory podobnými epitelovým, a je lokálně invazivní.

Melanomové buňky, na rozdíl od mohou proliferovat faktorů.

růstového stimulaci, v nepřítomnosti

Tato nezávislost zjevně faktoru a cytokinů včetně TGF-A, TGF-E, normálních melanocytů, exogenních vyjadřuje autokrinní růstových produkci růstovou pro řetězců A a B destičkového růstového faktoru, základního fibroblastového růstového faktoru, IL-8, IL-6, IL-1, granulocytového a makrofágového faktoru stimulujícího kolonie, a MGSA (Guo, Y., et al., Inhibition of Human Melanoma Growth and Metastasis in Vivo

·· * · * * • · ·· ··· ·· « ·· • 999 by Anti-CD44 Monoclonal Antibody, Cancer Res., 54, 15611565, 1994).

V současnosti bylo dosaženo určitého úspěchu při použití antisense oligonukleotidů ve 20 μΜ koncentraci pro snížení exprese receptoru IL-8 ' a inhibici růstu buněk plicniho karcinomu (Ishiko, T., et al., výše) a buněk maligního melanomu (Schadendorf, D., et al., výše). Tyto publikace ale vyjadřují studie in vitro, a není vůbec jasné, ze by tytéž oligonukleotidy byly účinné in vivo. Dokonce s ohledem na práci in vitro, přinejmenším jeden vědec ohlásil úspěch pouze s modifikovanými fosforothioátovými antisense oligonukleotidy (Bargou, R.C., Regulation of Proliferation In The New Hodgkin Cell Line HD-MYZ by AntisenseOligonucleotides Against IL-6 and IL-8, Molecular Basis of Cancer Therapy)- Tedy stále trvá potřeba oligonukleotidů, které inhibují růst, metastázy a/nebo angiogenezi melanomu a plicniho karcinomu in vivo prostřednictvím interferonu s expresí IL-8 a/nebo receptoru IL-8. Kromě toho, protože se IL-8 a receptor IL-8 zdají být obecně zapojeny do mechanismů nádorového růstu, metastáz a angiogeneze, jevů, které jsou charakteristické pro většinu typů karcinomu, je potřeba se při léčení karcinomů a jiných nádorů zaměřit obvykle na jeden nebo více genů.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje oligonukleotidy, které jsou účinné v léčení nádorů, zejména melanomu, karcinomu plic, prostaty a prsu. Vynález dále poskytuje způsoby pro použití těchto oligonukleotidů v léčbě nemocí.

·♦ ···<

Popis obrázků

Nové charakteristické rysy vynálezu jsou vyloženy a rozlišeny v připojených patentových nárocích. Vynález je v souladu s výhodnými a příkladnými provedeními, spolu s jeho dalšími výhodami, konkrétněji popsán v následujícím detailním popisu společně se souvisejícími doprovodnými obrázky, ve kterých:

Obrázek 1 je histogram ukazující růstově inhibiční účinek kontrolního oligonukleotidu ICN-131, IL-8 oligonukleotidu ICN-70 (sekvence s identifikačním číslem 2) a IL-8 oligonukleotidu ICN-133 (sekvence s i. č. 3), v koncentraci 0,1 μΜ, na melanomové buňky (ATCC HTB140), buňky plicního karcinomu (ATCC HTB177), buňky karcinomu prostaty (ATCC HTB81) a buňky karcinomu prsu (T47D) během 72 hodin léčby. Označení oligonukleotidů následuje:

ICN-131	CAC	CGG	AAG	GAA	CC	(sekvence	s	i.	č.	1)
ICN-70	GAA	AGT	TTG	TGC	CTT ATG GA	(sekvence	s	i.	č.	2)
ICN-133	GGC	GCA	GTG	TGG	TCC	(sekvence	s	i.	č.	3)

Obrázek 2 je histogram ukazující růstové inhibiční účinek receptoru B IL-8 oligonukleotidu ICN-247 (sekvence s identifikačním číslem 5), ICN-107 (sekvence s i. č. 4) a

ICN-247 (sekvence s i. č. 5), v koncentraci 0,1 μΜ, na melanomové buňky (ATCC HTB140), ne-malobuněčný plicní karcinom (ATCC HTB177), buňky karcinomu prostaty (ATCC HTB81) a buňky karcinomu prsu (T47D) během 72 hodin léčby. Označení oligonukleotidů následuje:

ICN-107	CTT	CCT	GTC	TGA	TGG	CTT CT	(sekvence	s	i.	č.	4)
ICN-247	TGA	AAA	TTT	AGA	TCA	TC	(sekvence	s	i.	č.	5)
ICN-297	AGT	GTG	CGT	GTG	G		(sekvence	s	i.	č.	6)

φφ φφ φ φ φ φ φ φφφ φ φφφ φ φ φ φ φ φφ φφ φ φφ φφφ · φφφ φ φφφφ φ φ φφφ φφ φφ φφφφ φφ φφφφ φ φ φ φ φφφφ « φ φ φ · φ φφ φφφ

Obrázek 3 je tabulka ukazující kinetiku růstu subkutánního melanomu u nahých myší „balb/c nude/nude vyjádřenou jako směrnice přímky stanovené lineární regresní analýzou pro neošetřené myši a myši ošetřené ICN-131 a ICN70 (sekvence s identifikačním číslem 2).

Obrázek 4 je tabulka ukazující kinetiku růstu subkutánního plicního karcinomu u nahých myší „balb/c nude/nude vyjádřenou jako směrnice přímky stanovené lineární regresní analýzou pro neošetřené myši a myši ošetřené ICN-131 a ICN-70 (sekvence s i. č. 2).

Příklady provedení vynálezu

Detailní popis specifických provedení

Syntéza oligonukleotidů

Diskuse níže popisuje přípravu různých oligonukleotidových sekvencí, a testování těchto sekvencí na účinnost proti plicním a/nebo melanomovým karcinomovým buňkám. Všechny testované sekvence byly syntetizovány na automatikém syntetizátoru DNA (Applied Biosystems. Model 394) jako fosfodiesterové oligonukleotidy za použití standardní fosfodiesterové metody. Výsledné oligonukleotidy byly purifikovány HPLC za použiti semipreparačních kolon C8 pro reverzní fázi (ABI) s lineárním gradientem 5% acetonitrilu v O,1 M trietylamoniumacetátu a acetonitrilu. Čistota produktů byla kontrolována HPLC za použití analytické kolony C18 (Beckman).

•	• 4		♦ ···	··	99
• ·	•	*	•	•	•	• ·	9	9
9	•	•	• ·	···	• ·	99
•		···	« «	♦	•	• ·♦·	9	9
•		•	•	•	•	•	9	9
• · ·		• ·			99	99

Testování in vitro

Testování oligonukleotidových sekvencí se provádělo na linii velkobuněčného plicního karcinomu ATCC HTB 177, melanomových buňkách ATCC HTN 140, buňkách rakoviny prostaty ATCC HTB81 a buňkách rakoviny prsu T47D. Buňky se rutinně pasážovaly v tkáňové kultuře ve zvlhčovaném inkubátoru ve 37 °C v 5% CC>2/95% vzduchu při atmosférickém tlaku. Obě buněčné linie byly pěstovány jako adherentní kultury v 90% RPMI 1640, doplněném 10% fetálnim bovinním sérem. Buňky byly vysety na 96-jamkové mikrotitrační destičky v množství 2000 buněk na jamku a následně jednou ošetřeny s antisense oligonukleotidy nebo kontrolními oligonukleotidy v 0,1 μΜ koncentraci. Po 72 hodinách kultivace byl ke všem buňkám jednorázově přidán [³H]-thymidin v množství 1 μθί/jamka/200 μΐ, buňky byly pěstovány po další dvě hodiny, automaticky sklizeny pomocí přístroje Harvester 96 (Tomtec) a na počítači impulzů beta se určila inkorporace [³H]-thymidinu. Aby se zajistila přesnost výsledků, všechny kultivace se prováděly ve třech provedeních a alespoň třikrát opakovaly. Výsledky jsou uvedeny na obrázcích 1 a 2.

Testování in vivo

Pokusy in vivo shrnuté na obrázcích 3 a 4 se prováděly na myších kmene „Balb/c nude/nude, které mají deficit lymfocytů T, ale ne lymfocytů B či buněk NK. Podle laboratorního protokolu se subkutánně injikovalo 2,5 milionu melanomových buněk (ATCC HBT140) v Hanksově izotonickém roztoku. 10 dnů později se měřila velikost nádoru a tentýž den se do tumoru injikovaly oligonukleotidy v koncentraci 0,1 μΜ ve 100 μΐ Hanksova izotonického roztoku. Injekce se opakovala dvakrát denně po dobu 14 dnů. Velikost nádoru v mm²se měřila 7., 10. a 14. den ošetřování. Poslední den léčení

•	99	99	9999	99	99
99 9	9	9	9	9	9 >	9	9
• 9	9	•	9	999	9 9		99
•	• M 9	9	•	9 9	999	9	9
9	9	9	•	9	9	9	•
9 9«	99	• 9	999	··		99

(14. den) byla zvířata usmrcena, aby se odebraly nádorové tkáně a analyzovaly se na histopatologické úrovni a na expresní hladiny genu/proteinu. V případě buněk plicního karcinomu se injikovalo 0,25 milionu buněk (ATCC HBT177). Zvířata byla následně ošetřena, jak popsáno pro melanom.

Oligonukleotidové farmaceutické přípravky

Stejně jako jiné oligonukleotidy, mohou být oligonukleotidy podle předkládaného vynálezu upraveny pro podávání do těla mnoha cestami vhodnými pro vybraný způsob podávání, včetně int rámus kulami ho, Kromě toho, že způsobu perorálního, intravenózního, intraperitoneálniho, topického apod. obsahují jeden nebo více různých oligonukleotidů, mohou předmětné farmaceutické přípravky obsahovat jednu nebo více nebiologicky aktivních sloučenin, tj. excipientů, jako jsou stabilizátory (na podporu dlouhodobého uskladnění), emulgátory, pojivá, zahušťovadla, soli, konzervační látky apod.

Podávání oligonukleotidů, jak je zde popsáno, je v oboru dobře známo pro celou řadu zvířat, včetně savců, a zejména včetně lidí. Například práce Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, CRC press (Saghir Akhtar, ed. 1995) detailně uvádí mnoho těchto cest podávání a strategií, a a je plně zahrnuta v odkazech. Pouze pro přiklad, bez omezení použitelnosti celé knihy, kapitola 5 popisuje podávání tradiční intravenózní, intraperitoneální a subkutánní cestou, spolu s neinvazivními cestami, jako je intranazální, oční, transdermální a iontoforetická (Id. 7183), z nichž každá je použitelná pro předkládaný vynález. Kapitola 6 téhož textu se zabývá modifikacemi produkce oligonukleotidových léčiv rezistentních k nukleázám a termíny nukleotid(y), oligonukleotid(y) a baze nukleové ♦♦♦ • «· • ··«9

9· ·<··· ♦ · ··«· • 9·

9999 • 99

9» ·· ♦·· ··♦· ·♦ ··

9 9 9

999

999 99

99

9999 kyseliny, jak se zde používají, zahrnuji i specificky popsané modifikace a všechny další konzervativně modifikované varianty přirozené formy takových sloučenin (Id. 85-104) . Nárokované oligonukleotidy mohou být také vázány k lipidu nebo jiné sloučenině, která je aktivně přenášena přes buněčnou membránu, buď se spojkou nebo bez ní, a podávány perorálně, jak je vyjeveno v patentu Spojených Států č. 5 411 947, který je také zahrnut v odkazech. Dále mohou být oligonukleotidy podle předkládaného vynálezu podávány v „nahé formě, enkapsulované, ve spojeni s vezikuly, lipozomy, perlami, mikrosférami, jako konjugáty, a jako aerosol přímo do plic, za použití například produktu č. SPAG 2 firmy ICN Biomedicals. Tedy oligonukleotidy předkládaného vynálezu mohou být podávány v podstatě všemi známými aplikačními cestami pro oligonukleotidy, za použití všech přijatých modifikací pro vytváření nukleotidových analogů a předléků, a včetně všech příslušných pojiv a excipientů, dávkových forem a léčebných režimů. Oligonukleotidy mohou být použity která jsou sloučeninu, v dávkách v oboru obvyklá ale přizpůsobeny vychytávání buňkou.

transport a všechny najednou nebo mohou být pro účinnější a množství, bioaktivní pro

Dávky mohou být podávány rozděleny do řady menších absorbci, dávek, které jsou poté podávány v různých časových intervalech. V současnosti nejvýhodnější podávání oligonukleotidů předkládaného vynálezu zahrnuje intravenózní podávání mezi asi 0,1 a 100 mg oligonukleotidu na kg tělesné hmotnosti pacienta, 1 až 14x týdně po dobu přibližně 40 dnů.

Tento režim je založen na pozorovaném biologickém poločase podobných oligonukleotidů in vivo, který je několik minut až několik hodin, spolu s pozorováním, že účinek na syntézu proteinů může trvat až 48 nebo 72 hodin. Specifický režim ·· léčeni daný pro každého jednotlivého pacienta záleží ovšem na zkušenosti klinického lékaře a jeho úvaze o dané nemoci, zdrávi a odpovidavosti pacienta, vedlejších účincích, a mnoha dalších faktorech, jak jsou klinickými lékaři dobře známy. Například větší nebo menší hladiny dávkování, a léčebné režimy pokrývající větší nebo menší časová období jsou závislé na úsudku ošetřujícího lékaře a mohou zahrnovat klidová období, během kterých je léčeni oligonukleotidy dočasně pozastaveno. Léčba může být také kombinována dle vhodnosti s dalšími protirakovinnými a paliativními léky. Progrese/remise léčené nemoci je určována sledováním velikosti nádoru, rozsahu metastáz a dalších faktorů prostřednictvím radiologické analýzy a dalších prostředků v oboru známých, a výskyt a rozsah vedlejších účinků se určí sledováním funkce jater a/nebo ledvin, a sledováním krevního oběhu jako například použitím EKG, což je opět v oboru dobře známo.

Oligonukleotidy mohou být podávány jakýmkoliv obvyklým způsobem, jako perorálním, intravenózním, intraperitoneálním, intramuskulárním nebo subkutánním nebo dalšími známými cestami. Ale mnohé z těchto cest mohou být pro modifikované oligonukleotidy použity výhodně pro prodloužení biologického poločasu oligonukleotidů, včetně nukleotidů s modifikací nosného řetězce a/nebo sacharidu, jak je vyloženo v patentových přihláškách Spojených Států 08/333 895 a 08/333 545, jejichž význaky jsou zahrnuty v odkazech. Pro perorální podávání jsou oligonukleotidy podávány s inertním ředidlem nebo s asimilovatelným jedlým nosičem, nebo oligonukleotidy mohou být obsaženy přímo v jídle. Perorálně podávané oligonukleotidy mohou být spojeny s excipienty a použity ve formě vstřebatelných tablet, • β · to * · • ·« « · • to to··· to to • · ·«·

·· · toto #to bukálnich tablet, pastilek, kapslí, elixírů, suspenzních sirupů, oplatek apod.

Tablety, pastilky, pilulky, kapsle a podobně mohou také obsahovat následující: pojivo, jako je tragakantová guma, arabská guma, kukuřičný škrob nebo želatina, excipienty, jako je fosforečnan vápenatý, rozvolňovadlo, jako je kukuřičný škrob, bramborový škrob, alginová kyselina a podobně, kluznou látku, jako je stearan horečnatý, a sladidla, jako je sacharóza, laktóza nebo sacharin, příchutě, jako máta peprná, olej libavky položené nebo třešně. Když je jednotková léková forma kapsle, může obsahovat kromě látek výše zmíněných tekutý nosič. Mohou být také přítomny různé další látky, jako obaly nebo látky jinak modifikující fyzikální podobu jednotkové lékové formy. Například tablety, pilulky nebo kapsle mohou být obaleny šelakem, cukrem nebo oběma. Sirup nebo elixír může obsahovat sacharózu jako sladidlo, metylparaben a propylparaben jako konzervační látky, barvivo a příchuť jako třešeň nebo další příchutě. Tyto přídatné látky by měly být v použitých množstvích v podstatě netoxické. Kromě toho oligonukleotidy mohou být vloženy do léků a přípravků s prodlouženým uvolňováním léčiva.

Přípravky pro parenterální podávání zahrnují sterilní vodné roztoky nebo disperze, a sterilní prášky pro nepředvídanou přípravu sterilních roztoků nebo disperzí pro injekce. Roztoky nebo disperze mohou také obsahovat pufry, ředidla a další vhodné přísady, a mohou být navrženy tak, že podporují buněčné vychytávání oliqonukleotidů z přípravku, např. oligonukleotidy mohou být enkapsulovány ve vhodných lipozomech. Výhodně jsou roztoky a disperze pro parenterální podávání sterilní a dostatečně tekuté pro řádné podávání, dostatečně stabilní z výroby a pro použití a chráněné proti ·· ···· kontaminující činnosti mikroorganismů, jako jsou bakterie a plísně. Nosič může být rozpouštědlo nebo disperzní médium obsahující například vodu, etanol, polyol (například glycerol, propylenglykol, a tekutý polyetylenglykol, a podobně), jejich vhodné směsi a' rostlinné oleje. Správná tekutost může být udržována například použitím obalů jako je lecitin, udržováním požadované velikosti částic v případě disperze a použitím povrchově aktivních látek - surfaktantů.

Sterilní roztoky pro injekce se připravují vložením aktivních sloučenin v požadovaném množství do příslušného rozpouštědla s jednou nebo více dalšími různými složkami popsanými mohou být aktivních výše, obecně složek což je následováno sterilizací, připraveny začleněním do základní

Disperze různých sterilních sterilního vehikula, které obsahuje a další požadované složky sterilních prášků použitých k pro injekce, výhodné způsoby ve vakuu a lyofilizace, které složku a jakoukoliv další médium případě roztoků disperzní vyjmenované výše. V přípravě sterilních přípravy jsou techniky sušení poskytují práškovou aktivní požadovanou složku z předtím sterilně filtrovaných roztoků.

Farmaceutické přípravky pro topické podávání mohu být užitečné zejména s určitými bioaktivními sloučeninami pro lokální léčeni. Přípravky pro topické léčení zahrnují mazání, aerodisperze, gely, suspenze, lociony, krémy a podobně. Přípravky pro topické podávání mohou obsahovat kromě předmětných oligonukleotidů, známé nosiče, jako je isopropanol, glycerol, parafin, stearylalkohol, polyetylenglykol, atd. Farmaceuticky přijatelný nosič může také zahrnovat známou chemickou látku podporující absorpci.

Příklady těchto látek jsou např. dimetylacetamid (patent Spojených Států č. 3 472 931), trichloroetanol nebo trifluoroetanol (patent Spojených Států č. 3 891 757), « ·· ·9 ··«« ···« ·· · · · · Φ « » »* • · Φ · · ·ΦΦ * ··· • ····· « *· »··* « • · · · · «·* •« · ♦ · ··««· ···4 určité alkoholy nebo jejich směsi (patent Velké Británie č. 1 001 949) a patentová specifikace Velké Británie č. 1 464 975.

Roztoky oligonukleotidů mohou být uskladněny a/nebo podávány jako volné báze nebo farmakologicky přijatelné soli, a mohou být výhodně připravovány ve vodě vhodně smisené se surfaktantem, jako hydroxypropylcelulóza. Disperze mohou být také připraveny v glycerolu, tekutých polyetylenglykolech a jejich směsích a v olejích. Tyto přípravky a preparáty výhodně obsahují konzervační látku, aby se zabránilo růstu mikroorganismů.

Prevence činnosti mikroorganismů může být dosaženo různými protibakteriálními a protiplísňovými přípravky, například parabeny, chlorbutanolem, fenolem, kyselinou sorbovou, thiomersalem, a podobně. V mnoha případech je výhodné zahrnout izotonická činidla, jako je chlorid sodný. Prodloužení účinku přípravků pro injekci může být dosaženo použitím činidel, která opožďují absorpci, jako monostearát hlinitý a želatina.

Popsané přípravky a preparáty výhodně obsahují alespoň 0,1 % aktivního oligonukleotidů. Ovšem procento se v přípravcích a preparátech různí a může být mezi asi 2 % a 60 % hmotnosti podávaného množství látky. Množství aktivní sloučeniny v takových léčebně použitelných přípravcích a preparátech je takové, aby bylo dosaženo vhodné dávky.

Termín „farmaceuticky přijatelný nosič zahrnuje každé a všechna rozpouštědla, disperzní média, obaly, protibakteriálni a protiplísňové přípravky, izotonické a absorpci opožďující přípravky a podobně. Použití takových médií a přípravků pro farmaceuticky aktivní látky je v oboru dobře známo. V léčebných přípravcích a preparátech je zamýšleno použití jakéhokoliv obvyklého média nebo činidla s

	• ··	··	• 444	4 4	• 4
*	• · ·	•	4	•	• ·	•		4
	• 4 4	•	•	• 44	• 4		4 4
	• 4 »4	4 ·	•	• 4	···	•		4
	• 4	4	4	•	•	4		4
4	»4 ··	• 4	«•4	44		44

výjimkou toho, které je nekompatibilní s léčebnou aktivní složkou. Do přípravků a preparátů mohou být také začleněny doplňkové aktivní složky.

Kromě léčebného použití předmětných oligonukleotidů, mohou být oligonukleotidy také použity jako laboratorní . nástroj pro zkoumáni absorpce, distribuce, buněčného vychytávání a účinnosti.

Všechny citované patenty, patentové přihlášky a publikace jsou zahrnuty v odkazech.

Ve vynálezu byly vyjeveny antisense oligonukleotidy účinné v regulaci exprese receptoru IL-8 buněk nemalobuněčných plicnich karcinomů a melanomových buněk. Byly také vyjeveny způsoby použití těchto oligonukleotidů v klinické praxi. Ačkoliv byla ukázána a popsána specifická provedení a aplikace, je odborníkům zjevné, že jsou možné další modifikace bez odchylek od zdejších vynálezeckých myšlenek. Vynález proto nemůže být omezen jinak než v duchu připojených patentových nároků.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Oligonukleotid, který má jednu z následujících sekvencí:

5' CTT CCT GTC TGA TGG CTT CT 3' (sekvence s i. č. 4),

5' GAA AGT TTG TGC CTT ATG GA 3' (sekvence s i. č. 2) .

2. Oligonukleotid podle nároku 1, který má sekvenci

5' CTT CCT GTC TGA TGG CTT CT3 ' (sekvence s i. č. 4) .

3/4

Obr. 3

Kinetika růstu subkutánního melanomu u nahých myší „Balb/c Nude/Nude vyjádřená jako směrnice přímky stanovené lineární regresní analýzou

Nepárový t-test

Parametr Neléčené 1CN131 ICN 70 Průměr 3,34 2,63 -0,81 Počet myší · 8 8 8 Směrodatná odchylka 1,61 1,13 1,11 Stř. chyba průměru 0,57 0,40 0,39 Minimum: 1,55 0,94 -2,03 Maximum: 5,87 4,15 1,27 Medián: 1,99 1,68 -0,92

Srovnání neléčené skupiny se skupinou léčenou ICN 131: p = 0,3280

Srovnání neléčené skupiny se skupinou léčenou ICN 70: p < 0,0001 • · · · · · · « · · · to ♦ ♦ to · to · · to · to · · • · · · *··· · ··· • *·· · · · · · ··· · · • ··· · ··· ··· ·· ·· ··· ·· ··

3 n M a os

H ngsna %

7T Ý<P n^sna %

CM

3. Oligonukleotid podle nároku 1, který má sekvenci

5' GAA AGT TTG TGC CTT ATG GA 3' (sekvence s i. č. 2) .

4. Oligonukleotidy podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, dále obsahující nosný řetězec, kde alespoň část nosného řetězce je modifikována proti normálně se vyskytující fosfodiesterové konfiguraci.

5. Oligonukleotidy podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, dále obsahující cukr, kde alespoň jeden z cukrů je modifikován proti normální ribózové konfiguraci.

6. Oligonukleotidy podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, dále obsahující cukr a nosný řetězec, kde alespoň část nosného řetězce je modifikována proti normálně se vyskytující fosfodiesterové konfiguraci a alespoň jeden z cukrů je modifikován proti normální ribózové konfiguraci.

7. Způsob léčení karcinomu, který je alespoň částečnězprostředkován receptorem IL-8, v y z n aJt--u<j*Trc i se tím, že způsob zahrnuje posJ^ytmrCíléku obsahujícího 5' CTT CCT GTC TGAJTGG—GTT^CT 3' (sekvence s i. č. 4) a zahrnuje jjodáváííi účinného množství léku pacientovi.

• · · ·

8. Způsob podle nároku 7, vy značujicí—s—e—ť~i—nr, -že—kiuk pudúiil reku zahrnuje injekci do nádoru.

9. Způsob podle nároku 7, v y z n- ačujici ^Q ti m,žt* kruk podaní léku zahrnuje intravenózni injekci.

10. Způsob léčeni karcinomu, který je alespoň část^čaě zprostředkován IL-8, vyznačuj ti m, že způsob zahrnuje poskytnu^i__J^4ar^obsahujiciho 5' GAA AGT TTG TGC 0ΤΤΑΊΌ__βΑ---^ (sekvence s i. č. 2) a zahrnuje podávání úůíríného množství léku pacientovi.

11. Způsob podle nároku 10, v y z n a č u j í c -4- t L-Pb—že krok podáni léku zahrnuje injekci do nádoru.

12. Způsob podle nároku 10, v y z n a č u j í c i-- t—i—m,—že—kiuk podaní leku zahrnuje intravenózni injekci.

co I h1 H

4/4

Obr. 4

Kinetika růstu sůbkutánního plicního karcinomu u nahých myši „Balb/c Nude/Nude vyjádřená jako směrnice přímky stanovené lineární regresní analýzou

Nepárový t-test

Parametr Neléčené ICN 131 ICN 70 Průměr 26,41 1 6,96 12,84 Počet myší 5 5 5 Směrodatná odchylka 8,36 7,63 6,77 Stř. chyba průměru 3,85 3,41 3,02 Minimum: 16,10 9,08 6,90 Maximum: 38,00 26,98 24,04 Medián: 22,96 I 16,11 12,37

Srovnání neléčené skupiny se skupinou léčenou ICN 131: p 0,1039

Srovnání neléčené skupiny se skupinou léčenou ICN 70: p = 0,0245