CZ147594A3 - Agents for separating active compounds against osteoporosis and methods of such separation - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu identžrkování terapeutických činidel k ošetřování osteoporozy. Vynález se týká izolování, klonování a použití nukleových kyselin zahrnujících promotorové oblasti genů savců transformujících růstový faktor (5, jež jsou novými regulačními prvky označovanými jako prvky citlivé na raloxifen”. Vynález se také týká geneticky budované eukaryotické buňky obsahující rekombinantní expresní obrazce <“expression constructs), kde prvky citlivé na raloxifen jsou operativně vázány na referenční geny (reportér gene). V takových buňkách jsou prvky citlivé na raloxifen schopny modulovat transkripci referenčních genů v odezvě na zpracování určitými sloučeninami. Vynález se také týká způsobů identifikování činidel působících proti osteoporoze. jež indukují transkripci určitých genů cestou prvků citlivých na raloxifen a jež specificky nevyvolávají škodlivé a nežádoucí vedlejší účinky, jež byly spojovány s terapií náhrady estrogenu, jako je zvýšené nebezpečí rakoviny dělohy a prsu. Nukleové kyseliny. buňky a způsoby podle vynálezu poskytují účinné způsoby vytriďování údajných zdrojů činidel působících proti osteoporoze a identifikování takových činidel, které s výhodou postrádají nežádoucí vedlejší účinky spojené se známými činidly působícími proti osteoporoze. Vynález se také týká způsobu navozování tvorby kostní hmoty, způsobu ošetřování osteoporozy a způsobu ošetřování zlomenin kostí, jenž spočívá v podávání sloučeniny, která, když je vázána na estrogenrií receptor, navozuje mocně transkripci z prvku citlivého na za raloxifen.

V roce 1991 vynaložily americké farmaceutické společnosti 7,9 miliard dolarů na výzkum a vývoj věnovaný identifikaci nových terapeutických činidel <Phanaaceutica1 Manulacturer s Association). Velikost tohoto nákladu je dána částečně tím, že se musí vyzkoušet stovky, ne-li tisíce chemických sloučenin k identifiko2 vání jediného terapeuticky účinného činidla, jež nevyvolává v nepřijatelné míře nežádoucí a škodlivé vedlejší účinky. Rostou požadavky na ekonomické metody zkoušení velkého počtu chemických sloučenin k rychlé identifikaci takových sloučenin, jež budou pravděpodobně účinné v potírání nemoci. V současné době takových ekonomických systémů existuje málo.

Jednou nemocí, u níž je podezření, že postrádá rychlou metodu vytřiďování velkého množství potenciálních terapeutických činidel je ztráta kostní hmoty. Ke ztrátě kostní hmoty dochází u velmi rozmanitých pacientů, včetně pacientek, které prodělaly hysterektomii (chirurgické odebrání dělohy), dále pacientů, kterým byly dlouhodobě podávány kortikosteroidy, kteří trpí Cushingovým syndromem, nebo nají gonální dysgenesi, včetně žen po přechodu.

Dosavadní stav techniky

Mechanismus ztráty kostní hmoty není dobře znám avšak jako praktické důsledky jsou známy nerovnováha ve vytváření nové zdravé kosti a v resorpci staré kosti za ztráty kostní hmoty. Tato ztráta kostní hmoty zahrnuje jak pokles obsahu minerálů v kostech tak složek bílkovinové matrice kosti a vede ke zvýšené lámavosti především stehenních kostí, předloktních kostí a páteře. Tyto fraktury vedou ke zvýšení úmrtnosti, k výrazným ztrátám rovnováhy a pohyblivosti a v četných případech ke zvýšení úmrtnosti v důsledku přidružených komp1 i kac í.

Nekontrolovaná ztráta kostní hmoty může vést k osteoporose a k závažnějším oslabujícím onemocněním, jejichž hlavní charakteristikou je ztráta kostní hmoty (snížená hustota a zvětšení mezer mezi kostmi) bez ztráty objemu kostí za vzniku porozity a lámavostí kostí.

Nejběžnějším typem osteoporozy je osteoporoza v postmenopausálnťm období žen, postihující podle zjištění 20 až 25 milionů žen ve Spojených státech amerických. Výraznou charakteristikou post menopausální osteoporosy je značná a rychlá ztráta kostní hmoty v důsledku skutečnosti, že vaječníky neprodukují estrogen. Zjistilo se, že estrogeny jsou schopny omezit postup osteoporotické ztráty kostní hmoty a náhrada estrogenu představuje ošetřování post menopausální osteoporosy ve Spojených státech amerických a v četných jiných zemích.

Estrogeny, podávané v malých dávkách, mají příznivý vliv na kosti; avšak u četných poruch byla implikována terapie dlouhodobé náhrady estrogenu, včetně zvýšeného rizika rakoviny dělohy a prsu. Tyto vážné vedlejší účinky způsobují, že četné ženy toto ošetřování odmítají. Alternativní terapeutické režimy, zaměřené ke snížení nebezpečí rakoviny, jako podávání kombinací progestogenu a estrogenu, způsobují u některých pacientek pravidelné krvácení, které je pro většinu starších žen nepřijatelné. Úvahy týkající se těchto významných nežádoucích vedlejších účinků spojených s terapií náhrady estrogenu a s omezenou schopností estrogenů zvrátit stávající ztrátu kostní hmoty, jsou silným popudem k vyvíjení účinných alternativních terapií ztráty kostní hmoty, jež nezpůsobují nežádoucí vedlejší účinky.

Jiným přístupem v osteoporotické terapii je použití antiestrogenů. Obecně zabraňují (antagonizují) antiestrogeny činnosti estrogenu v těle. Antiestrogeny se váží na estrogenový receptor, ačkoli se má zato, že interakce mezi antiestrogeny a receptorem estrogenu zahrnuje odlišnou oblast receptářů než tu, na kterou se váže estrogen. Na druhé straně vykazují některé antiestrogeny farraakologické vlastnosti, jež jsou směsí agonistických a antagonistických vlastností. Jinak řečena, mají tyto sloučeniny určité účinky, jež napodobují estrogen, při antagonizování jiných účinků, jež jsou obvykle spojeny s podáváním estrogenu v buňkách, které vypuzují receptor. Vzhledem k tomuto smíšenému účinku některých antiestrogenu, jsou nositeli stejných nepříznivých účinku spojených s terapií náhrady estrogenu.

Jedním entiestrogenem o němž je známo, že vykazuje takové smíšené agonisticko-antagonistické-účinky je tanoxifen, což je droga, používaná k ošetřování rakoviny prsu. Tamoxifén působí jako antagonist estrogenu ve své schopnosti snižovat růst prsních tumorů, působí však také jako agonisující svojí schopností snižovat množství sérového cholesterolu jak u žen zdravých, tak u žen s rakovinou prsu. Love a kol. Annals Int. Med. 115, str. 860 až 864 <1991). Tamoxifen působí také na zvětšování hustoty kostí u pacientek s rakovinou prsu. Love a kol. M. Eng. J. Med. 326, str. 852 až 856 <1991). Nejméně jedna studie vedla k domněnce, že možné zvyšování hustoty kostí tamoxifenem se jeví jako omezené na bederní část páteře, s uváděnou ztrátou kostní hmoty ve vřetenní kosti u některých pacientek s rakovinou prsu ošetřovaných tamoxifenem. Kromě toho se také mělo zato, že ošetřování tamoxifenem přispívá ke zvyšování hmotnosti žen po přechodu. Love a kol., Ann. Int. Med. 326, str. 852-856 <1991).

Zřetelně se rýsuje potřeba zlepšených antiosteoporotik, která umožní zvyšování hustoty kostí bez negativních vedlejších účinků. Naneštěstí neexistuje běžný způsob rychlého a účinného vytřiďování velkého počtu sloučenin k odhalení sloučenin, které by vykazovaly žádoucí antiosteoporotické účinky. Jelikož tento vytřiďovací proces představuje časově nejnáročnější a nejnákladnější operaci v identifikaci zlepšených antiosteoporotických sloučenin, je nanejvýš žádoucí vývoj rychlého způsobu k vyzkoušení velkého počtu sloučenin, k odhalení sloučenin, jež mají pravděpodobně antiosteoporotické účinky.

Je dobře známo, že? estrogeny vyvíjejí svůj vliv napřed vázáním na receptor estrogenu a pak vázáním komplexu estrogen/receptor estrogenu na DNA. Komplex hormon/receptor moduluje genovou expresi cestou této vazby s DNA. Kumar, Cell, 55, str. 145 až 156 <1988). Antiestrogeny se také vážou na receptury estrogenu. Ačkoli se tyto komplexy antestrogen/receptor vážou na DNA, obvykle genovou expresi nemodulují. Jak komplex estradiol/receptor estrogenu. tak komplex hydroxytaminoxofen/receptor estrogenu se vážou in vitro na vazbové oblasti nazývané prvky citlivé na estrogen (estrogen responsive elements). Kumar, Cell, 55, str. 145 až 156 <1983).

Uspořádání komplexu 1 igand/receptor je předmětem různých debat. Avšak poslední studie naznačují rozdílnost v uspořádání mezi

- 7J receptorem estrogenu vázaným na estradiol a téhož receptoru estrogenu vázaného na 4-hydroxytamoxifen nebo ICI 164,384. Klinge a kol., J.Ster. Biochem. Mol. Biol. 43, str. 249 až 262 (1992).

Ve snaze zaměřit racionálně problém vývode zlepšených antiosteoporotických činidel, zkoumali badatelé proteiny, o nichž je známo, že hrají úlohu v údržbě kostí. Jedním proteinem, o němž je známo, že ovlivňuje přetváření a zvrat ve vývoji kostí, je transformující růstový faktor β (Transforming Growth Factor β, TGFf)). Ačkoli se považuje obvykle za jedinou sloučeninu, je TGFfi ve skutečnosti rodinou molekul, o nichž se dnes ví, že zahrnují nejméně tři isoformy; TGF@-1, TGFfi-2 a TGF0-3. Arrick a kol., Canc. Res., 50, str. 299 až 303 (1990). Podle tohoto vynálezu se zjistilo, že odebrání vaječníků indukuje významný pokles TGF3-3 v krysích kostech (dosud nepublikované, autorem shromážděné údaje}; jiní badatelé zjistili také stejný typ korelace s ohledem na úroveň TGFp (isoformy nespecifikovány}. Finkelman a kol.. Proč. Hat 1 Acad. Sci. USA, 89, str. 12190 až 12193 (1992). Podle vynálezu se také zjistilo, že podávání raloxifenu, antiestrogenu, krysám s odebranými vaječníky, uchovává koncentrace TGFfl-3 na úrovních stejných nebo vyšších než zjišťovaných u kontrolních zvířat. Přímá závislost mezi úrovní TGF0-3 a periodicky se opakujícími úrovněmi estrogenu nebo antiestrogenu a poznatkem, že TGFá Cisoforma nespecifikována) hraje významnou úlohu v přetváření a zvratu ve vývoji kostí naznačuje, že osteoporoza může pocházet ze snížené exprese TGFfi-3 in vivo. Noda a kol. Endocrin. 12, str. 2991 až 2994 (1989).

Domněnka, že snížené úrovně TGFři-3 mohou připustit ztrátu kostní hmoty, je podmiňována poznatky, že TGFíl byl izolován z velkého počtu zdrojů a vykazuje velmi odlišné účinky. Zabraňuje například růstu mesenchymálních buněk a epitelových buněk, snižuje biosynthesu proteoglykanů, fibronektinů a aktivátorů plasminogenu a je chemostatický pro fibroblasty, makrofágy a buňky hladkých svalů. Flaumenhaft a kol. J. Cell. Bio., 120, str.995 až 1002 (1993).

Kromě toho způsobují antiestrogeny, jako je tamoxifen nebo toremifen, že lidské zárodečné fibroblasty vylučují TGF3 <bez odkazu na isoformy) v nepřítomnostmi rec&ptoru estrogenu. Colletta a kol. Br.J.Cancer, 62. st,r. 405 až 409 <1990). Zjistilo se, že TGF{1 stimuluje osteoblastické vytváření kosti a zabraňuje tvoření osteoclastu a osteoclastových účinků- Mundy, Clinieal Application of TGFfi Ciba Foundation Symposium č. 157, str. 137 až 151, Viley, Chichester. TGF3 způsoboval represi rozdělení jedné endometriální řady rakovinových buněk <Ishikava), ukázalo se však. že je mitogenický vzhledem k jiným takovým liniím buněk <HEC-50). Murphy a kol- J.Ster. Biochem- Molec. Bio. 41. str.309 až 314 <1992).

Tříměsíční antiestrogenní ošetřování tamoxifenera bylo korelováno se zaváděním extracelulárně TGFřJ-l v biopsi rakoviny prsu. Butta a kol., Cancer Res., 52, str. 4261 až 4264 <1992). Klesající koncentrace TGFp-l raRNA byla zjištěna v jedné lidské endometriální linii rakovinových buněk <HEC-50). rostoucí v prostředí obsahujícím 1 % ctFBS <dvojnásobně uhlím stripovaný FBS), jestliže byly takové buňky vystaveny působení buď estradiolu nebo určitým antiestrrjgenům. Gong a kol. Canc. Res. 52, str. 1704 až 1709 <1992).

IJ TGF<a-2 mRNA dochází k expresi působením linií buněk T^47D a MDA-MB-231. Zpracování takových linií buněk estradiolem snížilo expresi TGFíi-2 mRNA, ale tamoxif en stejný jev nevykazoval. TGFří-3 zavádí aitogenesi, synthesu kollagenu a aktivitu alkalické fosfatázy v kulturách kostních buněk obohacených osteoblastem tří- až čtyřnásobně vyšší rychlostí než TGFíi-l. Arrick a kol. Canc. Res. 50, str. 299 až 303 <1990).

Celkový přehled vlastností TGFíi je obsažen v článcích Sporn a kol., J. Cell Bio, 105, str. 1039 až 1045 <1987), Massague, Cell. 49, str. 437 až 438 <1987) a Moses. Cell 63. str.245 až 247 <1990). V těchto článcích jsou všeobecně popsány vlastnosti, jež působily TGFřl v systémech in vitro a in vivo.

Komplexní obraz shora popsané exprese naznačuje jedinečný a složitý mechanismus regulace exprese různých icoforem TGFp. Promotorové oblasti pro každý gen ΤΟΓβ-l,TGFp-2 a TGFfí-3 byly klonovány a popsány. Kin a kol. J.Biol. Chen., 264, str. 402 až 408 <1989). Noma a kol. Grovth Factors, 4, str.247 až 255 C1991), Lafyatis a kol.. J.Biol. Chen., 265. str. 19128 až 19136 ¢1990)Byly charakterizovány pronotory pro TGF/3-2 a TGF(i-3 a uvádí se o nich, že obsahují prvky citlivé na cAMP, místa AP-1, AP-2 a SP-1. Nona kol. zaznamenal, že aktivita promotoru TGFíš-2 závisí na oblasti zkoumaného promotoru a na linii buněk, zvolené k indukční zkoušce.

V mezinárodní zveřejněné přihlášce vynálezu číslo PCT/US92/ 00419 je popsán nejméně jeden způsob účinného vytříďování biologického působení velkého počtu sloučenin, kde jsou nárokovány způsoby transkripčně regulující exprese růstového faktoru. Tato patentová přihláška popisuje zkoušky k identifikování sloučenin, schopných vyvolat transkribci cestou promotorových oblastí lidského genu růstového hormonu, genu c-ErbB2, promotorové oblasti sekvence K-ras a staršího promotoru a navyšovatelů cytomegaloviru. Tato přihláška je zaměřena především na problém stanovení a regulace různých onkogenůV současné době vyžadovalo identifikování sloučenin, jež pravděpodobně vykazují antiosteoporotický účinek, nahodilé zkoumání jednotlivých sloučenin na základě epidemiologických studií, užitečnosti odvozených chemických sloučenin v dosahování žádaného účinku a jiné časově náročné a neúčinné způsoby. Jak prodlení, způsobené běžnými vytřiďovacími způsoby, tak ekonomická náklad, nost takového neúčinného zkoušení zdůrazňují potřebu ekonomických a účinných způsobů identifikování potenciálních antiosteoporotických drog, jez si zaslouží dodatečné zkoumání.

Stručný popis obrázků

Na obr.

Na obr.

Na obr.

.1 je znázorněna proraotórová oblast genu TGF/d-l je znázorněna promotorová oblast genu TGFp.-2 je znázorněna promotorové oblast genu TGFfJ-3

Na obr. 4 jsou znázorněny relativní úrovně exprese referenčního genu v buňkách transfektovaných s expresními obrazci tvořenými promotorem TGFfi-2 operativně připojeným ke genu CAT nebo promotorem TGFp-3 operativně připojeným ke genu CAT, v přítomnosti kontrolní sloučeniny, estrogeriu. raloxifenu a tamoxifenu. Obecně působí buňky obsahující obrazec íconstrukt ) TGFíJ-3 expresi nejvyšší úrovně referenčního genu, následovaný buňkami, jež obsahují obrazec TGF3-2 a obrazec TGFři-3.

Na ose x jsou TGF{i-l, TGFíl-2 a TGFfJ-3, na ose y aktivita CAT

Na obr- 5 je znázorněna indukce referenčního genu za kontroly buď prvku citlivého na estrogen nebo části promotoru TGFíí-3 v přítomnosti estrogenu, raloxifenu a kombinací estrogeriu a raloxifenu. Teto obrázek ukazuje výrazně odlišné obrazce regulace vykonané dvěma regulačními sekvencemi.

Na ose x je koncentrace <log[Ml>, na ose y aktivita luciferazy

Na obr. 6 je sloupečkový diagram ukazující relativní úrovně exprese referenčního genu v buňkách transfektovaných s expresí obrazců obsahujících část promotorové sekvence TGF0-3 a vystavených působení kontrolní sloučeniny, estrogenu, raloxifenu a kombinace estrogenu a raloxifenu vždy v přítomnosti a v nepřítomnosti estrogenového receptoru. Receptor estrogeriu je nutný pro navození exprese referenčního genu jak estrogeny tak arit iestrogeny.

Na obr. 7 jsou znázorněny různé oblasti estrogenového receptorového CER) proteinu vypuštěním obrazců udaných v příkladu 11. Přídavně je znázorněno relativní navození ohybů dosažitelné v buňkách transfektovaných s různými mutanty ER a exprese obrazce zahrnujícího promotor· TGF{i-3 a gen luciferazy.

Na obr. 8 jsou znázorněny úrovně exprese referenčního genu dosažitelné v buňkách transfektovaných s expresí obrazce sestávajícího z promotoru TGFfi-3 a genu CAT v přítomnosti různých koncentrací estradiolu, raloxifenu, tamoxifenu a ICI 164,384. Obecně je raloxifen nejmocnějším induktorem při všech koncentracích, po něm následuje ICI 164,384 a tamoxifen. Estrogen je nejméně mocným induktorem v tomto systému.

Na ose x je koncentrace CM), na ose y aktivita CAT

Na obr. 9 je znázorněna relativní exprese referenčního genu v buňkách CHO transfektovaných s expresním obrazcem sestávajícím z části promotoru TGFfJ.-3 a genu luciferazy v přítomnosti různých koncentrací estradiolu a raloxifenu. Obecně je raloxifen mocnějším induktorem s výjimkou při nižších koncentracích.

Na ose x je koncentrace CM), na ose y aktivita CAT

Na obr.10 je znázorněna relativní exprese referenčního genu v buňkách MCE-7 transfektovaných s expresí obrazce sestávajícího z promotoru TGFfJ-3 a genu luciferazy v přítomnosti různých koncentrací estradiolu a raloxifenu. Raloxifen je mocnějším induktorem při všech koncentracích.

Na ose x je koncentrace CM), na ose y aktivita luciferazy

Na obr. 11 jsou znázorněny chemické struktury sloučenin vyhodnocených v příkladu 10.

Na obr. 12 je znázorněna relativní úroveň indukce exprese reporterového genu v buňkách MG63 transfektovaných s expresními obrazci promotoru TGFp-3/CAT a promítnuta na různé koncentrace sloučenin z příkladu .10. Celkově je sloučenina 177366 nejmocnějším induktorem, zatímco sloučenina 98005 nevykazuje žádnou indukci.

Na ose x je koncentrace CM), na ose y aktivita CAT

Na obr. 13 jsou znázorněny části pronotoru TGFfi-3 použité k identifi kování 41 základních párů prvku zodpovědného za raloxifen a je znázorněna relativní indukce exprese referenčního genu raloxifenem v buňkách transfórnovanýeh s plasmidy tvořícími počáteční část sekvence promotoru TGFři-3 operativně vázané na referenční gen. Ačkoli indukce ohybu, dosažitelná obrazcem pB-301, je nejvyšší, je přítomnost prvku zodpovědného za raloxifen (základní páry *35 - +75) zřetelně nezbytná k jakékoli významné indukci transkripce raloxifenem v těchto buňkách.

Na obr. 14 je znázorněna analýza promotoru TGF#l-3. Je znázorněno hlavní transkripční startovací místo a motiv CCCTC, jak je popsáno v příkladu 11.

Na obr. 15 je znázorněna relativní exprese referenčního genu v buňkách Hep2 transfektovaných s expresním obrazcem tvořeným promotorem LDLR a genem luciferazy v přítomnosti estrogenového íeceptoru a různých koncentrací estradiolu a raloxifenu. Obecně je raloxifen mocnějším induktorem.

Na ose x je koncentrace CM), na ose y aktivita LDLR luciferazy

Na obr. 16 je znázorněna relativní exprese referenčního genu v buňkách Hep2 transfektovaných s expresním obrazcem tvořeným promotorem LDLR a genem luciferazy v přítomnosti různých koncentrací estradiolu a raloxifenu a v nepřítomnosti receptoru estrogenu - Žádná ze sloučenin nevykonává indukci při koncentracích při

10^-6 M nebo nižší. Vysoké koncentrace raloxifenu expresi poněkud Indukují, což naznačuje odlišný, na ER nezávislý indukční mechanizmus takových koncentrací.

Na ose x je koncentrace CM), na ose y aktivita LDLR luciferazy

Na obr. 17 je postupový diagram ukazující příklad sekvence operací, jež mohou být prováděny podle tohoto vynálezu k vyhodnocování sloučenin z hlediska jejich schopnosti indukovat transkripci referenčních genů operativně vázaných ke zde popsanému regulačnímu kontrolnímu elementu. Má se zato, že existuje korelace mezi sloučeninami vykazujícími indukční profily popsané v příkladu 13 a schopností takových sloučenin působit jako antiosteoporozní drogy in vivo.

Podstata vynálezu

Způsob vytriďování sloučenin s možným působením Jako antlosteoporozní činidlo z množiny sloučenin, při kterém se z množiny sloučenin Identifikuje sloučenina, jež je schopna indukovat transkripci z prvku citlivého na raloxifen promotoru savců, jenž není nespecifickým transkripčním induktorem. není schopena indukovat transkripci z prvku citlivého na estrogen promotoru savců a jenž je antiestrogenní nebo neestrogenní sloučeninou, spočívá podle vynálezu v tom, že

Ca> se zkouší sloučeniny z hlediska schopnosti indukovat transkripci z prvku citlivého na raloxifen promotoru savců,

Cb) zkouší se sloučeniny z hlediska neschopnosti indukovat transkripci z promotoru savců nemajícího prvek citlivý na raloxifen ,

Cc) zkouší se sloučeniny z hlediska neschopnosti indukovat transkripci z promotoru citlivého na estrogen a <d> zkouší se sloučeniny z hlediska schopnosti zabraňovat estrogenové indukci transkripce z promotoru citlivého na estrogen v přítomnosti estrogenu.

Vynález tedy poskytuje nové a účinné způsoby vytriďování chemických sloučenin ke zjištění, zda jsou tyto sloučeniny schopny modulovat expresi genů citlivých na steroidní hormon z promotoru sestávajícího z pivku citlivého na raloxifen. Vynález se též týká nukleových kyselin, sestávajících v podstatě z nukleotidové sekvence zahrnující pivek citlivý na raloxifen izolovaný z promotorové oblasti genu TGF{i a eukaryotických buněk s nimi transfektovaných. Je též poskytnut rekombinantní obrazec exprese sestávající z prvku citlivého na raloxifen operativně vázaného na referenční gen. Vynález se též týká způsobu indukce tvoření kosti, způsobu ošetřování osteoporozy a způsobu ošetřování zlomenin kostí, který je založen na podávání sloučeniny, která, je-li vázána na estrogenový receptor, mocně indukuje transkripci z prvku citlivého na raloxifen promotorové oblasti genu TGF/A.

Vynález se týká nových a účinných způsobů vytriďování che12 mických sloučenin ke zjištění, zda jsou tyto sloučeniny schopné modulovat, expresi genu citlivého na steroidový hormon ze savčího promotoru, majícího prvek citlivý na raloxifen, podle vynálezu a následujícího popisu. Vynález se týká nukleových kyselin sestávajících v podstatě z nukleotidové sekvence savčího promotoru majícího takový na raloxifen citlivý prvek. Podle výhodného provedení je promotor mající prvek citlivý na raloxifen odvozen od promotorové oblasti genu pro lidský TGF0-3 nebo TGF0.-2.

Vynález se dále týká rekombinantních eukaryotických expresních obrazců zahrnujících promotor, majícího prvek citlivý na raloxifen, který je operativně vázán na referenční gen. Podle výhodných provedeních je referenčním genem chloramfenikolacetyltransferázový gen nebo gen luciferázy. Obzvlášt výhodným je gen luciferázy. Buňky transféktované s takovým obrazcem eukaryotické exprese, jež jsou schopny vykonávat expresi referenčního genu jsou-li takové buňky vystaveny působení raloxifenu nebo jiných antiestrogenních sloučenin, vynález rovněž zahrnuje.

Vynález se dále týká způsobu idukování tvorby kostní hmoty, spočívající v podávání účinného množství sloučeniny, která, jeli vázána na receptor estrogenu, ovlivňuje mocně transkripci z prvku citlivého na raloxifen promotorové oblasti genu TGFfi-3Vynález také zahrnuje způsob ošetřování osteoporozy, založený na podávání účinného množství sloučeniny, která, je-li vázána na receptor estrogenu, ovlivňuje mocně transkripci z prvku citlivého na raloxifen promotorové oblasti genu TGF{i-3.

Vynález se také týká způsobu ošetřování zlomenin kostí, založeného na podávání účinného množství sloučeniny, která, je-li vázána na receptor estrogenu, ovlivňuje mocně transkribci z prvku citlivého na raloxifen promotorové oblasti genu TGFp-3.

F'ředevším se vynálezu týká nukleové kyseliny sestávající v podstatě z nukleotidové sekvence obsahující prvek citlivý na raloxifen, přičemž je prvek izolován, z promotorové oblasti savčího, s výhodou lidského genu transferujícího růstový faktor {i- Ve výhodných provedeních je genem, transfořujícím růstový faktor β, lidský gen TGF3-2 nebo TGFťJ-3. Podle dalších výhodných provedení vynálezu sestává nukleová kyselina v podstatě z promotorových sekvencí genu TGF@-3, jak popsáno v plasmidu pB-301 (obsahujícím sekvence promotoru TGF/i-3 z poloh -301 do +110): pB-221 (obsahujícím sekvence promotoru TGFíJ-3 z poloh -221 do +110): pB-91 (obsahujícím sekvence promotoru TGFč-3 z poloh -91 do +110); pB-60 (obsahujícím sekvence promotoru TGF/i-3 z poloh -60 do +110); pB47 (obsahujícím sekvence promotoru TGF/l-3 z poloh -47 do +110) a pB-38 (obsahujícím sekvence promotoru TGFřl-3 z poloh -33 do+110), jak je zde dále popsáno.

Dále se vynález týká obrazce rekombinantní exprese zahrnujícího nukleovou kyselinu, sestávající v podstatě z nukleotidové sekvence obsahující prvek citlivý na raloxifen, přičemž je prvek izolován z promotorové oblasti savčího, s výhodou lidského genu transferujícího růstový faktor íi operativně vázaný k referenčnímu genu. Podle výhodných provedení je genem, transferujícím růstový faktor β, lidský gen TGFíl-2 nebo TGF/J-3. Podle výhodných provedení je referenčním genem chloramfenikolacety1transferázový gen nebo gen luciferázy. Obzvlášt výhodným je gen luciferázy. Podle dalších výhodných provedení vynálezu je nukleová kyselina tvořena promotorovou sekvencí sestávající v podstatě z promotorové sekvence genu TGF/i-3 zahrnující plasmidy pB~301 (obsahující sekvence promotoru TGFíi-3 z poloh -301 do +110); pB-221 (obsahující sekvence promotoru TGF/i-3 z poloh -221 do +110); pB-91 (obsahující sekvence promotoru TGF@-3 z poloh -91 do +110); pB-60 (obsahující sekvence promotoru TGFfi-3 z poloh (-60 do +110): pB-47 (obsahující sekvence promotoru TGF3-3 z polohy -47 do +110) a pB-38 (obsahující sekvence promotoru TGFfi-3 z polohy -38 do +110), jak je zde dále popsáno a operativně vázané na referenční gen.

Z jiného hlediska jsou obrazce rekombinantní exprese podle vynálezu schopné vykonávat expresi referenčního genu zakódovaného takovým obrazcem v eukaryotických buňkách transfektovaných s takovým obrazcem. Ve výhodných provedeních vykonávají Lakové eukaryotické buňky přídavně expresi proteinu estrogenového recepturu nebo jeho mutantriích odvozenin. Ve zvlášt výhodných provedeních je schopna exprese referenčních genů rekonbi riantn ím i exp14 lesními obrazci podle vynálezu být indukována zpracováním takových buněk raloxifenem nebo jinými zde definovanými antiestrogenními sloučeninami.

Třetím hlediskem vynálezu je eukaryotická buňka, do níž byl zaveden rekombinantní expresní obrazec podle vynálezu. Ve výhodném provedení je eukaryotickou buňkou buňka transfektovaná rekombinantním expresním obrazcem podle vynálezu. Ve výhodném provedení vykonávají eukaryotické buňky podle vynálezu expresi proteinu estrogenního receptrjru nebo jeho mutantriích odvozenin. Ve zvlášt výhodných provedeních je schopna exprese referenčních genů rekombinantními expresními obrazci podle vynálezu být indukována zpracováním takových buněk raloxifenem nebo jinými zde definovanými antiestrogenními sloučeninami.

Vynález také poskytuje způsob vytriďování množiny sloučenin k identifikování sloučenin s potenciální možností působit jako antiosteoporozní činidla. Podle jednoho hlediska tohoto provedení spočívá způsob podle vynálezu ve vytřídění sloučeniny z množiny sloučenin, k identifikování sloučenin s potenciální možností působit jako antiosteoporozní činidla. Způsob podle vynálezu spočívá v identifikování z množiny sloučenin sloučeninu, jež je schopna zavádět transkripci z prvku citlivého na raloxifen promotoru savců, jenž je specifickým transkribčním induktorem, není schopen indukovat transkribci z prvku citlivého na za estrogen promotoru savců a jenž je antiestrogenní nebo neestrogenní sloučeninou. Způsob podle tohoto provedení vynálezu sestává dále z následujících operací:(a) vyzkoušení sloučeniny z hlediska její schopnosti indukovat transkripci z prvku citlivého ria za raloxifen promotoru savců, Cb) vyzkoušení sloučeniny z hlediska její neschopnosti indukovat transkripci z promotoru savců nemajícího prvek citlivý na raloxifen, Cc) vyzkoušení sloučeniny z hlediska její neschopnosti indukovat transkripci z promotoru citlivého na estrogen, a Cd) vyzkoušení sloučeniny z hlediska její schopnosti zabraňovat estrogenové indukci transkripce z promotoru citlivého na estrogen v přítomnosti estrogenu.

Ve výhodném provedení je zkouška podle operace (a) určena ke zjištění schopnosti sloučeniny indukovat expresi referenčního genu operativně vázaného na savčí promotor tvořený prvkem citlivým na raloxifen. Podle jiného výhodného provedení vynálezu je zkouška podle operace (b) určena ke zjištění neschopnosti sloučeniny indukovat expresi referenčního genu operativně vázaného na savčí promotor, přičemž promotor neobsahuje prvek citlivý na raloxifen. Podle jiného výhodného provedení vynálezu je zkouška podle operace (c) určena ke zjištění neschopnosti sloučeniny indukovat expresi referenčního genu operativně vázaného na savčí promotor citlivý na eštrogen. Podle konečného výhodného je zkouška podle operace Cd) určena ke zjištění schopnosti sloučeniny zabraňovat na estrogenu závislé indukci exprese referenčního genu operativně vázaného na savčí promotor citlivý na eštrogen v přítomnosti estrogenuPodle obzvlášť výhodných provedení tohoto vynálezu je savčí promotor citlivý na raloxifen izolován ze savčího, s výhodou lidského genu β, transformujícího růstový faktor. Nejvýhodnější jsou provedení. kde genem β, transferujícím růstový faktor, je lidský gen ΤΟΓβ-2 nebo ΤΟΡβ-3. Podle dalších výhodných provedení je referenčním genem chloramfenikolacetyltransferázový gen nebo gen luciferázy. Podle dalších výhodných provedení vynálezu sestávají promotorové sekvence citlivé na raloxifen v podstat? z promotorové sekvence genu TGF£-3, zahrnující plasmidy pB-301 (obsahující sekvence promotoru ΤΟΡβ-3 z polohy -301 do +110); pB-221 (obsahující sekvence promotoru Τ0Ρβ-3 z polohy ~22l do +110): pB-91 (obsahující sekvence promotoru TGFP--3 z polohy -91 do pB-60 (obsahující sekvence promotoru Τ9Γβ-3 pB-47 (obsahující sekvence promotoru Τ0Ρβ-3 z polohy -47 do a pB-33 (obsahující sekvence promotoru Τ6Ρβ-3 z polohy -33 do +110), jak je zde dále popsáno, a operativně vázané na referenční gen.

Specifická výhodná provedení vynálezu se ozřejmí nás ledujícím podrobnějším poi>isen .některých výhodných provedení a patentovými nároky.

Popis obsahuje řadu zkratek. Tak například znamená ΤΟΡβ” •110) poloh -60 do +110) -110)

CAT* je estrogen a transformační růstový faktor β (bez odkazu na isoformu). Τ6Γβ-1, TGF3-2 a TGF£-3 mají v oboru zavedený význam, znamenají totiž tri známé isoformy genů transformačního růstového faktoru β. Zkratka znamená chloramfenikolacetyl CoA transferázu. ”Estradiol je zde vyjadřován zkratkou E2. Zkratka ER zde znamená receptorový protein estrogenu.

Zde používaný výraz prvek citlivý na raloxifen (raloxifene responsive element) se vztahuje na nukleotidové sekvence nukleové kyseliny tvořící savčí promotorovou oblast genu TGF3, jež jsou schopny indukovat transkripci kteréhokoli strukturálního genu, ke kterému je prvek citlivý na raloxifen operativně vázán v hostujících buňkách vystavených receptorovým proteinům raloxifenu a estrogenu. Prvky citlivé na raloxifen zahrnují, bez záměru o jakékoliv omezení nukleotidové sekvence tvořené promotorovými sekvencemi Τ9Εβ plasraidů pB-301 (obsahující sekvence promotoru TGF£-3 z poloh -301 do +110); pB-221 (obsahující sekvence promotoru ΤΟΓβ-3 z poloh -221 do +110); pB-91 (obsahující sekvence promotoru Τ0Εβ-3 z poloh -91 do +110); pB-60 (obsahující sekvence promotoru Τ0Γβ-3 z poloh -60 do +110); pB-47 (obsahující sekvence promotoru Τ0Εβ-3 z poloh -47 do +110) a pB-38 (obsahující sekvence promotoru Τ0Εβ-3 z poloh -38 do +110), jak je zde «dále popsáno a nukleové kyseliny mající v podstatě stejnou biologickou aktivitu jako tyto riukleové kyseliny. Záměrem této definice je obsáhnout všechny variace promotorových oblastí genů ΤΟΕβ. Izolované prvky citlivé na raloxifen podle tohoto vynálezu mohou být odvozeny od promotorů Τ6Γβ pocházejících od kteréhokoli savčího druhu, s výhodou jsou však lidského původu.

Ve zde použitém významu se má zato, že antiestrogen zahrnuje úplné nebo částečné antagonisty estrogenu. Všechny estradioly použité v popsaných příkladech jsou Ι7β-Ο5Τ,ΓΟ<1 i o 1 .

Výrazem účinné množství se zde vždy míní množství sloučeniny, jež, je-li vázáno na receptur estrogenu, je při podání savci schopno indukovat transkripci z prvku citlivého na raloxifen. Jednotlivá dávka podávané sloučeniny se stanoví podle jednotlivých okolností daného případu, mezi něž patří cesta podávání, jednotlivý ošetřovaný případ a podobné úvahy.

Výraz nočně Cpotently) reprezentuje sloučeninu, která.

je-li vázána na receptor estrogenu, indukuje transkripci z prvku citlivého na raloxifen při minimální efektivní koncentraci <MEC) menší nebo rovné 10 nM <lxlO^-8M) při zde popsaných zkouškách sloučeniny in vitro. Viz příklady 5, 6, 10 a 14.

Všechny části promotorových sekvencí jsou určovány jejich vzdáleností, počtem nukleotidů od hlavního transkripěního počátku genu, přičemž se tento počátek považuje za +1, jak patrno na obr. 1 až 3. Záporné znaménko <-) před číslem znamená, že nukleotid je 5 od počátku, kladné znaménko C + ) před číslem znamená, že nukleotid je 3 od počátku. Sekvence jsou rovněž identifikovány číslováním vyznačeným v SEQ ID NOS;1-3, a jsou specificky korelovány s číslováním na obr. 1 až 3.

DNA, která zakodovává prvky citlivé na raloxifen podle vynálezu, může být získána podle vynálezu chemickou syntézou, amplifikací in vitro [včetně polymerázové řetězové reakce CPCR), avšak bez omezení na nil, nebo kombinací těchto postupů z přírodně se vyskytujících zdrojů, jako jsou kultury savčích buněk, genoraická DNA z takových buněk, nebo z knihoven DNA.

Prvky citlivě na raloxifen mohou být s výhodou operativně vázány na referenční geny a použity buď k přechodné nebo stabilní transformaci příslušných hostujících buněk použitím vhodných vektorů, obrazců a prostředků v oboru dobře známých, jako transfer DNA mediovaného genu, včetně, avšak bez omezení, transfekce, clektroporace a virově-mediované infekce. Zde použitým pojmem recombiriant expression construet” Crekombinantní expresní obrazec) se míní obrazce DNA schopné zaměřit expresi referenčních genů, k nimž jsou operativně vázány prvky citlivé na raloxifen.

Operativně vázány jsou oblasti DNA, jsou-li funkčně ve vzájemném vztahu. Například promotor je operativně vázán na kódovací sekvenci, jestliže řídí transkripci sekvence; vazební místo ribosomu je operativně vázáno' na kódující sekvenci, je-li umísí.ěrio tak, že umožňuje translaci. Operativně vázaný znamená obecně přilehle vázaný.

Referenční geny (reportér genes) jsou geny, které kódují strukurální proteiny schopné kvantifikace standardními prostředky. jako jsou měření enzymatické aktivity, kalorimetrie, chemiluminiscence, měření přítomnosti radioaktivity ve vzorku, ELISA, mimotělní vazba, zkouška radioimunity nebo jiné kvantifikační způsoby, známé v oboru. Referenční gen se bude měnit v závislosti na zvoleném hostiteli a na zvoleném způsobu transformace. Bez záměru o jakékoliv omezování zahrnují referenční geny chloramfenikolacetyltransferázu, luciferázu 0-galaktosidázu, alkalickou fosfatázu, nebo kterýkoli jiný kvantifikovatelný proteinový produkt. Ve výhodném provedení podle vynálezu je referenčním genem 1uc i f eráza.

Transfektované buňky (transfected cells) jsou buňky, jež byly transfektovány elementem citlivým na raloxifen - referenčními genovými rekombinantními expresními obrazci za použití rekorabinantních technik DNA. Buňky, které byly transfektovány rekombinantním prvkem, citlivým na raloxifen - referenčními genovými expresními obrazci, které vykazují expresi estrogenového receptoru, buď jako charakteristika takových buněk nebo v důsledku kotransfekce estrogenový receptor kódujícího expresního obrazce, vykazují expresi genového produktu referenčního genu za vhodných okolností (například vystavení účinku antiestrogenu nebo jiného induktoru). Například výhodná linie buněk pro použití podle vynálezu MCE-7, způsobuje konstitutivně expresi estrogenového receptoxu. Pro takové linie buněk, transfekce rekombinantním prvkem, citlivým na raloxifen, - referenční genový expresní obrazce samotné. poskytují vhodné buňky pro použití podle vynálezu. Alternativně MG63 buňky vykazují expresi referenčních genů způsobem závislým na raloxifenu pouze po kotransfekci prvku citlivého na raloxifen - referenčního genového expresního obrazce a estrogenového receptorového expresního obrazce.

Kultury buněk, odvozených z mnohobuněčného organizmu, jsou žádoucími hostiteli pro expresi prvku citlivého na raloxifen referenčního genového expresního obrazce. V zásadě je použitelná jakákoli kultura vyšších eukaryotických buněk, jež buď způsobují expresi estrogenového recepturu, nebo jsou geneticky modifikovány k expresi estrugenovéhu receptoru (nebo části takového receptoru) Jak patrno z příkladů, jsou vhodné buňky savců. Propagace takových buněk v buněčné kultuře se stala běžným rutinním postupem. Tissue Culture, Academie Press, vydavatelé Kruše & Patterson ¢1973). Příklady užitečných linií hostících buněk jsou buňky MCF-7, MG63, HeLa, RL95.2, HepG2 a CHO (produkty společnosti American Type Culture Collection, Rockville. Maryland). Pro účele tohoto vynálezu je obzvlášt výhodné použití řady buněk MCF-7, jelikož tato linie buněk konstitutivně způsobuje expresi estrogenového receptoru.

Hostujících buněk, které způsobují expresi estrogenového receptoru nebo části tohoto receptoru a obsahují prvek citlivý na raloxifen - referenční genový expresní obrazec, se může používat k hodnocení sloučenin se zřetelem na jejich schopnost indukovat transkripbci cestou prvku citlivého na raloxifen, jak popsáno v následujících příkladech- Podle výhodného provedení vynálezu se má zato, že sloučeniny indukují transkripci cestou regulačního prvku (včetně nukleové kyseliny odvozené z promotoru TGFfi nebo jejího delečního obrazce, bez záměru na jakémkoliv omezení), jestliže se transkripce referenčního genu zvýší na dvojnásobek v přítomnosti sloučeniny ve srovnání s expresí v nepřítomnosti té sloučeniny- Podle méně výhodného provedení jsou sloučeniny považovány za induktory transkripce, jestliže indukují transkripci na úroveň o 50 %' vyšší než kontrolní. Obecně však indukce, zjistitelná nad pozadím postačí k vykázání indukce chemickou sloučeninou .

Při provádění vytřiďování podle vynálezu (viz příklad 13), se dává přednost použití plasmidu pB-301, vzhledem k vysoké úrovni odezvy na raloxifen působené tímto plasraidem. Jiná provedení používají obrazců obsahujících oblast promotoru TGF(i-3, zaujímající polohy -38 až -»-75. Ve všech operativních provedeních podle vynálezu je prvek citlivý na raloxifen vázán na referenční gen v kontextu umožňujícím transkripci, nebot tento prvek je nutný k umožnění zde popsané indukce citlivé na raloxifen.

Pořadí provádění operací způsobu vytříďování podle vynálezu je možno měnit a v některých případech mohou být některé operace vypuštěny. Následující příklady objasňují specifická provedení podle vynálezu a jejich různá použití. Tyto příklady praktického provedení však vynálezu toliko objasňují a nijak ho neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Konstrukce referenčních plasmidů

A. phTG12. pTGF-1 a pB-499

Jako první krok ve vývoji linií buněk, užitečných pro vytři ďování potenciálních antiosteoporozních činidel, řada referenčních plasmidů kódujících chloramfenikolacety1transferázový gen (CAT) (Gorman a kol., Molec. Cell. Biol., 2, str. 1044 až 1051 (1932)), operativně vázaný na promotorové sekvence z genů TGF3-1, TGF/1-2 a TGFři-3, se získá z A. Roberts, National Institutes of Health, Laboratory of Chemoprevention (NIH/NCI, Bethesda, MD). Tyto plasmidy se označí phTG12 (TGFp-l), pTGF-1 (TGFři-2) a pB-499 (TGFfl-3). Sekvence každého z těchto promotorů lze nalézt v publikaci Kim. a kol. J- Biol. Chen., 264, str. 402 až 403 (1939) (TGFfi-l): Noma a kol. Grovth Factor, 4, str. 247 až 255 (TGF(i-2); a Lafyatis a kol., J.Biol. Chem., 265, str. 19123 až 19136 (TGF03). Sekvence promotorů genu TGF_-1 byla předána GenBank/EMBL Data Bank pod číslem J04431 . Sekvence promotorů TGFíJ-1,TGF/i-2 a TGFřJ-3 jsou znázorněny na obr. 1, 2 a 3 a jako SEQ ID.NOS: 1

3.

Alternativně lze vyrobit referenční plasmidy obsahující CAT, operativně vázané na každý z promotorů Τ6Εβ, subklonováním každého promotoru ΤΟΕβ do obchodně dostupného obrazce CAT, například pCAT-Basic (Promega, Madison, VI), pomocí běžných klonovacích technik. Sambrook, Fritsch a Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Mariual, 2. vydání, nakladatelství Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nev York (dále jen Sambrook a kol.).

K identifikování oblasti nebo oblastí promotoru genu TGF3-3 citlivého na aritiestrogenní raloxifen se analyzují genové exprese reference CAT zaměřené obrazci obsahujícími částečné sekvence promotoru genu TGFA-3. Od A. Robertse se získá šest referenčních obrazců ”TGFíJ-3 promotorové delece/CAT- Označení plasmidů a rozsah promotorové oblasti obsažené v každém z těchto plasmidů jsou dále uvedeny:

pB-301	-301	až	+110	(odpovídající 1896 a SEQ ID č.:3)	až	2306	v	obr .3
pB-221	-221	až	+ 110	(odpovídající 1976 a SEQ ID č.=3)	až	2306	v	obr. 3
pB-91	-91	až	+110	(odpovídající 2106 a SEQ ID č.:3)	až	2306	v	obr. 3
pB-60	-60	až	+ 110	(odpovídající 2137 a SEQ ID č.=3)	az	2306	v	obr. 3
pB-47	-47	až	+ 110	(odpovídající 2150 a SEQ ID č.:3)	až	2306	v	obr. 3
pB-33	-33	až	+ 110	(odpovídající 2159 a SEQ ID č.:3)	az	2306	v	obr. 3
Jsak	je dále	popsáno,	zkonstruují se dva další	deleční ob-

razce promotoru TGFji-3. První z nich sestává z oblasti sekvencí lidského promotoru TGFři-3 odpovídající polohám -33 až -*-75 v promotorové sekvenci odpovídající 2159 až 2271 znázorněné na obr. 3 a SEQ ID č.C3 (Lafyatis a kol.). Druhý deleční obrazec sestává z oblasti sekvencí lidského promotoru TGFřJ-3 odpovídající polohám -33 až +35 v promotorové sekvenci odpovídající 2159 až 2231 znázorněné na obr. 3 a SEQ ID č.=3. Zavedenou praxí v oboru je identifikovat všechny promotorové sekvence identifikované vzhledem ke vzdálenosti od počátku transkripce.

Tyto plasmidy se generují následovně:

Syntetizují se oligonukleotidy odpovídající rozsahu sekvence promotoru TGFíi-3, požadované v každém plasmidů, pomocí syntetizéru DNA/RNA (model 284, Applied Biosystems lne., Foster City,CA) za syntetizačních podmínek β-kyanoethylfosfoamiditu specifikovaných výrobcem. Syntetizují se komplementární páry oligonukleotidů pro každý plasmidový obrazec, čistí se, mísí a nechají se vytvořit dvouřetězcové DNA odpovídající příslušným sekvencím promotoru

TGF(J-3 o sobě známými způsoby CSambrook a kol.). Hind III a Xbal restrikční enzymová rozeznávací místa se syntetizují jako příslušné převislé konce u konců sekvencí 5 a 3. Dvouřetězcové promotorové sekvence se pak ligaeí začleňují do HindlII/Xbal digestovaného Cdigested) CAT referenčního plasmidu pB-301 a propagují se v bakterii za standarních podmínek. Tímto způsobem produkovaný referenční plasmid obsahující oblast -33 až +75 promotoru TGFíJ-3 se označuje jako pTGFp+75CAT a plasmid obsahující oblast -38 až +75 promotoru TGFřl-3 se označuje jako pTGF0+35CAT. Těchto plasmidů se použije ve zkouškách CAT, jak dále popsáno v příkladu

B. Referenční plasmidy luciferázy obsahující deleční obrazce promotoru TGFéJ-3 včetně kontroly neobsahující žádný díl promotorové oblasti pTGFfJ-301LUC, pTGF3-38LUC, pTGF(i-75LUC. pTGFfÍ-35LlJC a pLUC.

Zkonstruují se čtyři plasmidy obsahující gen luciferázy CREF) expresovaný za transkripčního řízení sekvencí promotoru TGFp-3 při měnění jeho delečních derivátů. Plasmid pTGF-301LUC se připraví digescí Cdigesting) pB-301 s HindlII a pak se otupí konce převisu generovaného natr-ávením HindlII zpracováním Klenovovým fragmentem bakteriální DNA polymerázy CBoeringer-Mannhein, Indianopolis, IN). Pak se provede digesce Xbal k uvolnění části promotoru TGF0-3 odpovídající polohám -301 až +110.Tento fragment se subklonuje do Smal/Xbal netráveného pSP73 (Promega) k vytvoření shuttle-vektoru pSPTGFfi-301.

Po amplifikaci in vivo v bakterii se peparace izolovaného a vyčištěného pSTGFfJ-301 se podrobuje d i gesci s Ndel a HindlII a promotorovou sekvenci obsahující fragment se izoluje po oddělení na 0,8¾ agarosovém gelu (BRL-Liíe Technologies,lne.,Gaithersburg , MD). Luciferazu obsahující obrazec pLDLRLUClO (popsaný v americkém patentovém spise číslo , přihláška vynálezu číslo 08/ 018985, podaná 3. března 1993 a dále popsané v odstavci O) se podrobuj e digesci Ndel/HindIII a čistí se po elektroíoreze agarozovým gelem. Tyto izolované fragmenty se pak smísí, ligaridují a použijí k transformaci bakterie (Sambrook a kol.)

Plasmidy pTGFfi-38LUC, pTGFři-75LUC a pTGFíi-35LUC se připraví napřed excisí sekvencí promotoru TGFft-3 z pB-38, pTGFfJ-75CAT a pTGFfJ-35CAT dvojitou, čdigescí BamHI/Xbal. Plasmid Basic-pGL2 (nebo *'pGL2LUC“) (Promega) obsahující luciferázu se připraví digescí Nhel/BamHI a každý z rekombinaritních plasmidu ligací vhodných sekvencí promotoru TGFfi-3 do plasmidu obsahujícího luciferázu. Těchto plasmidů se použije v luciferázových zkouškách, jak je dále popsáno v příkladu 6Zkonstruuje se kontrolní plasmid obsahující luciferázový gen nemající však žádný díl genu TGFfJ-3 digescí plasmidu DNA pTGF{i+· 75LUC s restrikcí endonukleázy Xbal a HindlII. Přečnívající konce se naplní reakcí Klenovovým enzymem v pořítomnosti všech čtyř dNTPS za standardních podmínek (Sarabrook a kol.). Takto otupené konce se ligandů jí s T4 DNA ligasou (Eioehringer Mannheim) za podmínek udávaných výrobcem. Výsledný plasmid nese označení pLUC.

C. Referenční plasmid pLDLRLUClO, obsahující promotor' LDLR

Referenční plasmid pLDLRLUClO je popsán v americkém patentovém spise číslo (americká přihláška vynálezu číslo 08/ 010985, podaná 3. března 1993 a dále citovaná jako '985). Konstrukce plasmidu je podrobně popsána takto;

Zesílí se sekvence páru baží 1546 promotoru lidského receptoru LDL pomocí polymerázové řetězové reakce. Reakční směs, obsahující po 20 pikoraolech syntetických oligonuk1eotidu

5' -GCGCCATATGAGTCTTAACTGCCAAAAATTCTTATCATCAAT -3' (SEQ ID č.;4) a

5' -AAGCAAGCTTTCGCAGCCTCTGCCAGGCAGTGTCCCGACCCGGA -3 (SEQ ID Č. -5) a 1 ,jg lidské genoraické GNA, vyčištěné od buněčné linie adenokarcinoma P3ULCA. po 200 μΜ dATP, dGTP. dCTP a TTP, 2,5 jednotek polymerázy Tag DNA, 10 mM Tris-HCL pH 9,3, 50 mM KOI, 15 mM MgCls. 0,1 % želatiny v konečném ok·jemu 100 pL se podrobí 30 cyklům tvr>řenýn 15 s při 96 C, 30 s při 55 C a 1 min při 72 C. Materiál se podrobí gelové elektroforéze na 1¾ agarovém gelu a izoluje se 1546 pás páru basí a podrobí se digesci restrikční enzym pros24 třednictvím HindlII a Ndel- Tento fragment se liganduje do plasmidu pSP72 (Promega), který byl prve podroben digescí s HindlII a Ndel. Výsledný vektor pNLDLRP se podrobuje digesci s Ndel a HindlII, materiál se podrobí elektroforéze na 1%' agarovém gelu a z něj se znovu izoluje sekvence 1546 páru bází receptoru LDL.

Plasmidový vektor pSv2 se zkonstruuje digescí plasmidu pSv2-globin s HindlII a BglII. pak ligandováním linkeru Nrul-Xhol do vektoru. Plasmidový globin pSv2 je popsán v americkém patentovém spise číslo 4 775624. Linker obsahuje následující sekvence:

5' -AGCTTCGCGACTCGA6A - 3' <SEQ ID č:6) a

5' -GATCTCTCCAGTCGCGA - 3' <SEQ ID č:7).

Výsledný vektor se značí r^jSv2-H NXB, jelikož obsahuje místo

BamHI, Nrul, Xhol a BglII. Fragment HindlII-BglII plasmidu pAlc4<NRRL B-13783), který obsahuje luciferázový gen svatojánské mušky Cfirefly luciferase gen) <REF), se pak liganduje do místa HiridlII-Bgl II plasmidu pSv2-HNXB.

Popsaný fragment 1546 páru bází se izoluje a klonuje do vektoru pSv2 obsahujícího referenční luciferázový geri, který byl podroben digesci s restrikčním enzymem k doplnění s Ndel a částečně s HindlII. Výsledný vektor pLDLRLUClO obsahuje promotor lidského receptoru LDL řídícího expresi luciferázového genu svatojánské mušky, signální znak resistence arapici 11 inu a počátek replikace.

Příklad 2

Expresní plasmidy receptoru lidského estrogenu

Estrogenový receptor obsahující savčí expresní obrazce pCMVER a pRSV se získají od organizace B.S.Katzenel1enbogen, Department of Physiology and Biophysics University of Illinois <Urbana-Champaign, IL). Reese a Katzenel1enbogen, J.Biol.Chem., 266, str. 16880 až 16887 <1990). Těchto plasmidu se použije v expresních zkouškách jak dále popsáno, například v příkladu 7.

- 25 Příklad 3

Konstrukce plasraldu obsahujícího gen souboru prvek citlivý na cstrogen/luciferáza

Navrhnou se, syntetizují a tepelně se zpracuuí komplementární oligonukleotidy odpovídající prvku citlivému na estrogen CEPE) od promotoru Xenopus laevis genu vitellogeninu Az, odpovídajícímu polohám -341 až -310 (Metzger a kol., Nátuře, 334, str. 31-36 ¢1983)] k vytvoření dvouřetězcové oblasti, jež je nezbytným prvkem citlivým na estrogen, jak popsáno v příkladu 1. Syntetizuje se sekvence obsahující restrikt Xhol rozeznávacího místa enzymu k lemování sekvencí ERE, přičemž prvek má následující nukleotidové sekvence (vyznačené jako SEQ ID č:8 a 9):

'-TGG-AGA-AAA-GTC-AGG-TCA-CAG-TGA-CCT-GAT-CAA-AC-3 '

3'-CT-TTT-CAG-TCC-AGT-6TC-ACT-GGA-CTA-GTT-TGA-GCT-5 ' Dvouřetězcová ERE se subklonuje do Xhol-digestovanou pGLl2Basic (Proraega), přičemž luciferázový gen se umístí pod transkripcionální vliv ERE. Tento plasmid se označí pGL2ERELUC a použije se v dalších pokusech (příklad 6).

Příklad 4

Transfekce DNA

A. Buněčná kultura

Savčí buňky se kultivují v prostředí (označovaném jako 3 ^: 1 media) sestávajícím z prostředí Dulbecco modifikované Eagle media a F12 media (smíšených v poměru 3=1, obchodní produkt společnosti GIBCO, Grand Island, NY), bez fenolové červeně, obsahujícím 10 %' hovězího zárodečného séra (FBS; Hyclone, Logan, UT). Buňky vykazují pasáž ve čtyřdenních intervalech. Den před transfekcí se buňky trypsinizují inkubací s 1 ml roztoku systému 0,05 % trypsinu/5,3 mM tetraacetáttetrasodiumethylendiaminu (GIBCO) 5 minut při teplotě místnosti a pak se očkují do mdia 3:1, obsahujícího na 10¾ uhlí stripované FBS (csFBS; Hyclone) při hustotách jeden milion buněk na 10 cm kultivační misku.

B- Přechodná kotransfekce obrazců TOFp. a obrazců lidských ER

Pokusy s.kotransíekcí se provádějí v buňkách MG63 /.lidského osteosarkomu) pomocí savčího transfekčního systému ProFection CPromega). Smísí se 10 ag promotoru TGF/) obsahujícího referenční plasmíd DNA a 5 jig lidského estrogenového receptoru ChER) obsahujícího expresní plasmíd <pRSV-ER nebo pCMV-ER, obchodní produkt společnosti B.S.Katzenellenbogen, Department of Physiology and Biophysics University of Illinois CUrbana-Champaign, IL) [Reese a Katzenellenbogen, J.Biol.Ghem., 266, str. 10880 až 10887 ¢19905] a plasmíd pRSV (kontrolní), společně se vysráží a transfektují se do 2 až 4 milionů buněk v 10 cm kultivačních miskách. Po inkubaci 15 hodin při 37 G s precipitátem DNA se buňky vyjmou dvojnásobným promytím buněk solankou Dulbecco pufrovanou

GIBCO). Pak se buňky doplní csFBS. Po příslušné době s fosfátem CD-PBS; obsahujícím 10 % vyhodnocované se čerstvým mediem 3:1 při dají s1oučeni ny zřetelem na schopnost modulovat expresi referenčního genu a zkouší se jak dále popsáno.

0. Stabilní kotransfekce obrazců TGF/) a obrazců lidských ER

K transfekčníro pokusům se použije buněk MCF-7, což vede ke stabilní integraci transfektovaných plasmidových sekvencí do recipientních buněčných genomů. Při těchto pokusech se smísí plasmid DNA obsahující promotor TGFf) s DNA kódující selektivní signální znak. Například se smísí 60 jjg plasmidu DNA (pTGF/i-SOlLUC, pGL2LUG nebo pGLERELUC) obsahujícího promotor TGF/) se 60 pg derivátu pSV2HYG plasmidu pSV2HYGtB obsahujícího hygromycinový resistantní gen (dále popsáno v americkém patentovém spise číslo americká přihláška vynálezu číslo 07/953633. podaná 29. září 1992) a transfektuje se na dva miliony buněk MCF-7 za použití shora popsaného systému ProFection systému CFroraega). Po inkubaci přes noc při 37 C se precipitát z buněk vymyje, jak shora popsáno, a buňky se pak doplní čerstvým mediem 3=1, obsahujícím 10 %

FBS, a pěstují se po dobu dalších 48 hodin při 37 C a v té buňky dosáhnou zpravidla shlukování. E^uňky se trips inizu j í popsaným způsobem a každá miska kultury se přenese do dvou době shora cm kultivačních misek do media 3=1, obsahujícího 10 % FBS. Selektuje se hygromycinová resistance kultivací buněk v prostředí doplněném 200 jag/ml hygromycinu B ÍCalbiochem-Novabiochem, LaJolla, CA). Toto selektivní prostředí se nahrazuje čerstvým prostředím doplněným hygromycinem B každé dva dny bez rozrušení buněk v průběhu selekční zkoušky. Klonální kolonie se stanou viditelnými po růstu po dobu přibližně 14 dní v selektivním prostředí. Takové klony se izolují a přenesou se do jednotlivých důlků 24 důl kove kultivační destičky CFlov Laboratories, McLean, VA) pomocí sterilní pipety. Takové klony se nechají růst a udržují se v selektivním prostředí

K identifikování hygromycinu resistentních klonů, jež byly úspěšně ko-transfektovány s plasmidovými sekvencemi obsahujícími luciferázový gen, se použije reakce polyroerázového řetězce (PCR) k detekci sekvencí DNA, odvozených od luciferázové cDNA, v trarisfektované DNA. Syntetizují se ol igonukleotidové primery PCR odpovídající polohám 355-377 (primer s informačním obsahem) a 929-911 (primer bez informačního obsaahu) luciferázové sekvence cDIÍA. PCR se provede pomocí Perkin-Elmerova systému ‘9600 Gene Amp PCR pro 35 cyklů za podmínek v podstatě stejných, jak je popsáno výrobcem každý cyklus PCR zahrnuje 45 s při 94 C, 45 s při 55 C a dvě minuty při 72 C.

Klony, odolávající hygromycinu, obsahující luciferázu se inkubují estrogenera nebo raloxifenero, jak shora popsáno, a účinek na expresi referenčních genů se analyzuje zkouškami na míru enzymatické aktivity přítomné v buněčných extraktech. Ke zkouškám luciferázy se buňky lyžují v lyzovéra činidle eukaryotických buněk obsahujícím 0.1M fosfátový pufr (pH 7,3)/1 % Triton-100 (Boehringer Mannheim)/2raM EDTA a InM dithiothreitolu (RTT, Boehriňger Mannheim), a zkouší se pomocí protokolu optimizované nepodporované luciferázové zkoušky, vyvinuté laboratoří Analytice! Luminescence Laboratory (Sara Diego.CA). Světelný tok se měří a zaznamenává pomocí l um inomet.ru s ni krotit rovon destičkou (ML3000), Dyn těch Lóborafories, l-hantí · j y, VA.·. Klonu taKovy ch st.al.ij lne l.mns — fektovanych buněk s obraze i referenčního genu se pan pouzí ie v nových entiosteoporotických vytřiďovacírh zkouškách, jak dále popsáno ( pří klad 13 ) .

Príklad 5

Analýza transkripční aktivace estrogenem a arit i estrogeny zprostředkovaná -promotorem TGFfi

Ze stavu techniky je známo, že exprese genů TGF^-l, TGF<3-2 a TGF0-3 je odlišně indukovatelná pomocí estrogenu a tamoxifenu. Viz Background of Related Art. Rozsah a model této indukovatelnosti je charakterizován za shora popsaného použití plasmidů obsahujících promotor TGFíJ v řadě následujících zkoušek exprese in v i troKultury buněk MGG3 se přechodně společně trarisfektují s plasmidem pRSVER a některým z phTG12, pTGF-1, nebo pB2-499 pomocí systému PrcFection (Promega). Pro každou transíektovanou buněčnou kulturu se do každé kultivační misky po kapkách přidají přec ipitáty kalciumfosfátu obsahujícího DNA a pečlivě se v médiu promíchají. Hodnota pH média se pečlivě udržuje na pH 7,2 až pil 7,4.

Transfektované buněčné kultury se pak inkubují přes noc v 3¾ afmosiere oxidu uhličitého při 37 L. Po celonocni inkubaci se ze všech kultur přecipitát odstraní odsátím média z kultivačních misek, načež následuje dvojnásobné promytí každé misky D-PE5S- U každé transf ektované linie buněk se pufr nahradí 10 ml čestvého média obsahujícího 10 % csFBS a jednu z následujících sloučenin:

a. 10 μΐ ethanolu (nosič hormonů) = kontrolní,

b. 10 μ 1 estrád iolu 17{1 (Sigma) ( estrád i o 1 ” ) o koncentraci ÍLV^IÍ v ethanolu, c- 10 ul raloxifenu (Eli Lilly Laboratories) o koncentraci

10^_<lM v ethanolu

d. 10 jj 1 Tamoxifenu (Sigma) o koncentraci 10'⁴M v ethanolu

Po 24-hodinové inkubaci s těmito hormonálními přípravky (nebo kontrolním nosičem), se buňky promyjí dvakrát D-PBS. Pak se buňky setřou z kultivačních misek pomocí kaučukové stěrky a 1 ml

D-PBS. Odstředěním v deskové odstředivce (MicroMax Model IEC Nevark.NY) po dobu 2 minut při 8000 otáčkách za minutu se buňky shromáždí. Supernatarit se oddělí a buněčné pelety se resuspendují ve 150 μΐ 0,25M roztoku Tris-KCI (hodnota ρΚ 7.8). Buňky se lysují ve třech cyklech vymrazování v lázni led/ethanol a tání ve vodní lázni o teplotě 37 C (3 minuty v každém cyklu). K odstranění buněčných úlomků se preparáty lysovaných buněk odstřeďují 5 o

minut při 15000 otáčkách za minutu při teplotě 4 C. Supernatanty, obsahující rozpustné lysáty buněk, se přenesou do nové sady zkumavek ke zkoušení chloramfenikoloacetylferázové aktivity (CAT).

Dříve, než se přikročí ke zkouškám CAT takových buněčných lysát-ů, se zjistí napřed obsah proteinu každého lysátu pomocí komerčně dostupné zkoušky (BioRad Laboratories, Richmond, CA). Množství každého buněčného lysátu, obsahující celkem 100 pg proteinu, se pak smísí s CAT zkušebním pufrem C0.4M Tris-HCl (hodnota pH ?,8)/0,5mM acetyl-CoA (Boehringer Mannheim)/0,1 pCi Dthreo-(dich loracety 1 -1,2-[^1-4 Cl -chloramf eni kolu ) na dobu 15 hodin. Po této inkubaci se reakce ukončí energickou extrakcí reakční směsi 900 pl ethylacetátu. Oddělí se organická a vodná fáze krátkým odstředěním v průběhu jedné minuty při 14000 otáčkách za minutu a přibližně 800 j.il organické fáze se přenese do nové sady zkumavek. EthyTacetám se ocparí ke zxoncent-ΐováni LAT katalyzova— ných reakčních produktů.

Acetylované a neacetylované chloranfenikolové druhy se oddělí chromatografií v tenké vrstvě za použití systému chloroform/ methanol v objemovém poměru 95 : 5 jako vzestupného pufru. Radioaktivita každého takto odděleného druhu skvrn Betascope 603 (Betagen, Intel1igenticž

CA). Vypočte se procento acety1ováných impulzů ve vztahu k celkovému počtu impulzů k získání relativní CAT aktivity každého zkoušeného transfoktantu (všechny zde vyjádřené CAT-aktivity jsou počítány na tomto základě). Každá zkouška se provede dvojmo.

Výsledky uvedeného pokusu pro linie transfektovaných buněk MG63 jsem znázorněny na obr.4. Výsledky reprezentativního pokusu jscu v následující tabulce:

se měří analyzátorem lne., Kountain Viev,

Tabu1 ka I

Promotor	Kontrola	Estradiol ohyb	Ra1ox i f en	Tamoxifen ohy b skut. ind.;
skut.	ohy b ind. *
skut.	ind.x
TGFťi-1	6,4	4,7	0.7	5,6	0.9	6,9 1,1
TGFd-2	0,3	1,29	1,6	2.3	2,9	2,0 2,6
TGFíi-3	0,7	2. 1	2,3	G , 2	7,3	1,9 2,6
x Ohybová	indukce	je vypočtena na zák	ladě porovnán í	s kontrolou
Tyto	výsledky	ukazu j í,	že trans	kripce	referenčního genu C,

je indukována estrogenem a antiestrogeny raloxifenem a tamoxifenem, přičemž raloxifen vykazuje větší potenci než estrogen, zvláště pro promotor TGFíl-3. Na rozdíl od toho, oblast promotoru TGF{1-1 použitá v tomto pokusu (poloha -1032 až +72?) nevykazuje žádnou odezvu jak na estradiol, tak na raloxifen.

Příklad 6

Odlišná iridkce promotoru TGF0-3 a ERF promotoru vitellogeninu estrogenem a raloxifenem

Výsledky získané v předchozím příkladě ukazují, že promotor genu TGFti-3 je transkripčně citlivý jak na estrogen, tak na arit i estrogenové” sloučeniny jako je raloxifen a tamoxifen, a že ta transkripce je indukována raloxifenovým zpracováním v poměrně větší míře, než je transkripční indukce vytvářená v odezvě na estrogen. Tento příklad ukazuje, že gen kódující Xeriopus proteinový vitel logeriin se chová in vivo přesně opačné, to jest transkripce vitellogeninového genu je silně indukována estrogenem a pouze chabě indukována raloxifenem. Kromě toho raloxifen silně aritagonizuje estrogenem indukovanou indukci produkce vite11ogeni nu, jsou-li načují, že nich genů v obě sloučeniny dány dohromady. Okamžité výsledky nazsekvence promotoru TGF._ řídící' transkripci reíerenereferenčnícb p-Jasmidech, vyzkoušené v příkladu o, ob31 sáhují nový, na raloxifen citlivý prvek, charakterizovaný jedinečným modelem citlivosti na estrogen a arit i estrogen.

Tento model citlivosti na estrogen a aritiestrogen je dále zkoumán systémem zkoušek referenčních genů popsaným v předchozích příkladech. Kultury buněk KG63 se přechodně ko-transfektují s'pB-301 a pRSVERv jak popsáno v příkladu 4. Takové přechodně transfektované kultury se zkoušejí z hlediska transkripční aktivace exprese referenčních genů zpracováním estradiolem a raloxifenem v koncentracích pohybujících se v desetinásobkových přírůstcích od 10~⁹M do 10~⁵M. Zkouší se také kombinace estrogenu a raloxifenu ke zjištění vlivu raloxifenu při 1O^-3M na indukci referenčního genu v odezvě na estrogen pomocí stejné serie koncentrací jako u estrogenu samotného. Tyto zkoušky byly v podstatě provedeny v příkladu 3.

Podobné zkoušky se provedou za použití kultur- buněk MG63 přechodně transfektovaných s p6L2EREL.UC a pRSVER. V těchto zkouškách se však množství raloxifenu, přidávaného v kombinaci s estrogenera mění tak, že koncentrace raloxifenu je dvaceti násobná oproti koncentraci estrogenu ve směsi (například 10~⁹ll estrogenu/ 2xlO^_8ři raloxifenu; 10~^sM estrogenu/2x10M raloxifenu, atd.j.

Transfektované buňky se zpracují různým množstvím a různými kombinacemi hormonů a pak se propláchnou dvojnásobně P-PRP.. Pak se buňky štěpí inkubací s 2?0 ;il štěpného činidla eukaryot i ckých buněk (jak popsáno v příkladu ř<) při 4 C po dobu 20 minut a. přenesou se do zkumavek mikroodstředivky setřením kaučukovou stěrkou. Buněčné lysáty se odstřeďují minutu k odstranění buněčných ú zkouší z hlediska obsahu proteinů minutu při 14000 otá onků. buněčné extrakty a aktivity luciferázy.

ách se p i,;

Zkoušky luciferázy se pr každého buněčného extraktu co 1 čího 4, Oníí ATP/lOmM síranu (pH7,3>/1OnM DTT) v jednotíivýc oveáou násled>-'vně: Přidá se 00,ul 00 p1 reakčního puíru A (obsahujíhořečnatého/30mM tri ci nového puf ru h i * η I c i r h — i ί c í o k i L r a ο r j v, t_- s τ· i c κy .

-1,- | u i ku

i. s íorečnanu draselného (pH 7,3) Roehringer Manuté im) a vy tvořeného světla se měří pomocí 3 um i rmnei ru M1.3O00 mi • t i i.rač ní destičky (za podmínek integrovaného záblesku, vysokého zisku, integrovaného, okénka =10 s při teplotě 22 C) . Aktivity luciferázy se vypočtou jako celkové vyzářené světlo, vztažené na obsah proteinu v každém vzorku buněčného lysátu.

Výsledky těchto zkoušek jsou uvedeny v tabulce:

Tabulka II pro pB-301^;

Ra1ox i f en Estradiol E2 ·+· Ra 1	kontrolní 0,7 0,7	10“ 9 M 2,4 1,1 17,3	io~8ií 9,6 3,2 16,0	10_7M 9,63 5,5 7,3	10~6ll 10~5M 9,05 5,25 5.2 8,0 9.3 10,5
pro PGL2ERELUC:
	kontrolní	10-9li	10~8M	10“7M	10~6M 10-511
Ra1ox i f en	1,7	1 = 9	1,5	2,0	1,9 1,9
Estradiol	1,7	5.8	5,5	5,9	6,2 6,5
E2 + Ral	—	1,8	1,9	2,1	2,3 2,4
Reprezentativní	výsledky tě	chto poku	sů jsou	znázorněny ria
obr /5 ’
Tyto	vy s I ky 3 ó	»sně dokazuj	í exi st ene	ί odděl	?né pronotorové
oblasti v	pronotoru	genu TGF3, j	ež je citlivá na	anti estroge n y.

Zatímco raloxiferi působí jako mocný antagonizující činitel vůči transkripci iniciované promotory genů obsahujících ERE, jako je gen vitallogeninu, zjištuje se zde, že působí jako super-agonizující činitel v indukování transkripce z promotoru TGF#-3 Je zajímavé, že při nižších koncentracích raloxifen a estrogen synergicky indukují transkripci z promotoru TGFfl-3 do referenčních plasmidu podle vynálezu, což naznačuje, že ralo- xifenem indukovaná transkripce genů může být zprostředkována novým mechanismem.

l’í'i κ 1 ad 7

Aktivace na receptoru estrogenu závislých genů TGFfi-3 estrogenem a antiestrogeny

Ze stavu techniky je známo, že schopnost estrogenu a antiestrogenů ovlivňovat produkci TGFfi závisí na expresi estrogenového receptem (ER), avšak úroveň, pri ktere ie tento vliv vykonáván, nebyla dosud známa (například transkripcionální, translacionální nebo post-translacionální). Byla proto vykonána řada pokusů k vyzkoumání domnělé závislosti indukce exprese referenčního genu na expresi ER, pomocí obrazců obsahujících promotor TGFfi podle vynálezu. Chybějící exprese ER virtuálně zrušuje expresi TGF0-3, nezávisle na přítomnosti estradiolu nebo raloxifenu. Použitím rautantních proteinů ER bylo zjištěno, že rozdílné oblasti molekuly ER jsou zodpovědné za indukci estrogenu a raloxifenu.

A. Indukce TGF0-3 závislého ria ER

Připraví se kultury MG63 ke ko-transfekci jako v příkladu 4. Jedna taková kultura se ko-transfektuje s pB2.499 a pRSVER a jiná se ko-transfektuje s PB2-499 a vektorem plasmidu pRSV (kontrolním). Pak se vyzkouší schopnost následujících sloučenin indukovat transkripci cestou na raloxifen citlivého pivku genu TGEfJ-3 v podstatě stejně jako v příkladu 5’· \ a) «ethanol ( i:·) 17 β - es tra d i o 1 (. 10~ ⁷ M ) <c> raloxifen (2 x 10“⁶M)

Cd) 17(.i-estradiol CIO^-7!!) a raloxifen (2 x 10~⁶Μ)

Výsledky jednoho takového pokusu jsou sestaveny v následující tabulce a reprezentativní příklad chromatogramu v tenké vrstvě je znázorněn na obr. 6 robu ika III

Nosič hcirmonu Estrád i ol Raloxifen Estradiol + Raloxifen .1 o 1 η i ρ 1 as iii i d

P1 asm id ER expr ese , G 4,6

Tyto výsledky jasně naznačují, že k indukci exprese referenčního genu zprostředkované promotorem genu TGFfi-3 v odezvě na estrogen, antiestrogen a jejich kombinaci je potřeba exprese ER.

B. Analýza oblastí proteinu F.R potřebných k indukci z promotoru TGFíS-3 ' - Ze stavu techniky je známo, že k vázání estrogenu je třeba oblasti proteinu ER označené E”, zatímco oblast C je nutná k vázání DNA- Viz Kumar a kol., EMBO J.,9, str. 2231-2236 ¢1936). Bylo také potvrzeno, že k ER-aktivaci genů obsahujících ERE je nezbytná oblast '*C” , zatímco oblast ”E je požadována k induktibilitě závislé na estrogenu.

Ke stanovení oblastí ER zapojených do indukce transkripce z promotoru TGFp-3 se připraví kultury buněk MG63 ke ko-transfekci podobně jako v příkladu 4. Buňky se transfektují se směsí p'fGF0-3UlLUC a jednoho z následujících expresních plasmidů, zahrnujících různé mutanty dělení ER;

a. pCMV-ER

b. pCMV-ERdelta A/B

c. pGMV-ERdeltaB/C/D

d. pCMV-ERdeltaE/F e - pGMV- ERi -530

f. pCllV-ERl5<joQ

Další vysvětlení rozsahu každého dělení v těchto plasmídech popisuje Reese & Katzenellenbogen, J.Biol.Chem, 266, str. 10830 až 10887 <1990) a obr. 7

Schopnost těchto nutantů ER ke sprostředkování aktivace TGFp-3 indukované raluxifenem se z kouší zpracováním ko-transfektovaných buněk nosičem CIOjjI ethanolu) nebo 1O~⁷M raloxifenu. Nárůst aktivity luciferázy indukované raloxiřenen oproti základní aktivitě se vypočte jako indukce ohybu raloxifenein v přítomnosti různých mutantních forem ER. jak vyznačeno na obr. 7·.

Výsledky jednoho takového pokusu jsou uvedeny v nás ledu.) ící tabulce IV.

Tabulka IV

Tvar nutantu ER nosič ra1 ox i f en indukce ohybu

	pCMV-ERwt	3,7	32,3	8,9
	pCMV-ERdelta A/B ”	14,2	39,4	2,8
*	pCMV-ERdeItaB/C/D	21,2	73,4	3,4
	pCMV-ERdeltaE/F	17,4	20,9	1,2
•	pCMV-ERi-530	13,4	26,5	2,0
	pCMV-ERL54oQ	12,2	39,8	3,3
	Tyto výsledky	ukazují, že oblast vázajíc	í hormony (například
	E oblast molekuly	estrogenového receptoru)	je nutnou a postaču-

jící ke zprostředkování raloxifenem stimulované transkripce referenčních genů referenčních plasmidů podle vynálezu, zprostředkované promotorem TGFíí-3. K tomuto procesu není, jak se zdá, zapotřebí oblasti C molekuly ER. Tento poznatek podporuje dále domněnku, že nový mechanismus aktivace transkripce genu zahrnujícího ER může být zapojen do transkripce z promotoru TGFé?-3.

Příklad 3

Působení estrogenu a antiestrogenů na promotor TGFf.>-3

Zjistilo se, že transkripční aktivace proaotoreR TGF{1 zprostředkované exprese genů estrogenovými a antiestrogenovými sloučeninami je závislá na koncentraci- Jak popsáno v příkladu 5, kultury buněk MG63 se přechodně společně transfektují s pB-301 a pRSVER. Takto přechodně trrisfektované kultury buněk se rozdělí na čtyři skupiny po dvanácti kulturách a každé z těchto čtyř skupin se použije ke zkoušce schopnosti jedné estrogenové a antiestrogenové sloučeniny indukovat individuálně transkripci z promotoru TGFíí. II každé ze čtyř skupin po dvanácti kulturách se zkouší každá jednotlivá estrogenová a antiestrogenová sloučenina ve replikovaných kulturách při šesti koncentracích., měněných v desetinásobných přírůstcích od 10'⁹11 do 10⁵M, jakož i v jedné sadě replikovaných kultur, zpracovaných pouze nosičem (pro celek uV ói nácti kultur na experimentální zpracování)- Hormony se rozpustí v ethanolu a aplikují se na kultury v dříve popsaných mediích. Čtyřmi zkoušenými estrogeny a antiestrogeny jsou:

a. 170-estradiol (Signa Chemical Corp., St. Louis150)

b. raloxifen (Eli Lilly, Indianopolis, IN) c- tamoxifen (Sigma)

d. ICI 164384 (popsaný v evropské přihlášce vynálezu číslo ΕΡ138504, zveřejněné 20. července 1988).

Po 24 hodinovém zpracování hormony (nebo se buňky promyjí, oddělí se, lysují a zkouší kontrolním vzorkem) hlediska aktivity, jak je popsáno v příkladu 5. Výsledky jednoho takového pokusu jsou v následující tabulce V a jsou vyznačeny na obr. 8.=

Tabulka V

	nosič	10~9M	ίο-*’?!	io~7»	ΙΟ 6 M	io_5íí
estradiol	0,83	0,96	1 , 10	1,60	4,3	3,4
ra 1 ox i f eri	0,83	6,90	19,1	18,10	19,6	14,8
tamox i f eri	0,85	0,91	1,20	0,98	td , '3	1 *:í Λ
ICI 164384	0,85	0,89	0,88	10,90	15,2	< r- C? , -j

j r or.i otěru TGF β - 3 , křivku závislosti ; s e c hny e s troge ny vy kazu j e liči •.LIčiVCé⁴ a antiestrogeny ovlivňují aktivitu :azda s 1 oucen i na svou i π·. 1 i v i dua 1 η r Raloxifen je daleko nejnocněišín aktivátorem, vykazujícím více než dvojnásobnou indukci transkripce referenčního genu a mající ED»o při nanomolárních koncentracích. Na rozdíl od toho vykazuje est.radiol pouze čtyřnásobnou indukci exprese referenčního genu a EDso o dva řády vyšší než u raloxifenu. Tamoxifen aktivuje promotor TGFp-3 pouze při vysokých úrovních (to jest větších než mikromolárních). ICI 164384 vykazuje EDbo 10“⁷M, avšak tato sloučenina se jeví jako značně méně aktivní při vysokých koncentracích (1O''⁵M). Tyto výsledky ukazují, že je nalezen nový prvek v pronotorové oblasti genu TGFp-3, nazvaný prvek citlivý r:a raloxifen (PRE). Tento prvek indukuje transkripci jak v přítonnosti . estrogenu, t ak antiestrogenú a každá z těchto sloučenin vykazuje charakteristiý na dávce závislý pro37 fil transkripční aktivace.

Příklad 9

Transkripční aktivace promotoru TGF(S-3 zprostředkovaná raloxifeňem v buňkách CHO a MCF-7

Schopnost indukovat transkripci z promotoru TGF{.}-3 na rozdíl od estrogenem zprostředkované indukce byla předvedena na rozraani tých buněčných liniích.

Aktivace TGFfí-3 v buňkách CHO

Kultury buněk CHO se přechodně ko-transfektují s pB-301 a pRSVER. jak popsáno v příkladu 4, a použijí se ke zjištění schopnosti raloxifenu a estradiolu indukovat transkripci cestou prvku citlivého na raloxifen. Zpracuje se dvanáct přechodně transfektovayriých kultur v replikách bud’ s estradiolem nebo raloxifenem při šesti koncentracích pohybujících se v desetinásobkových přírůstcích od 10~⁹M do 10^-5M (stejně jako samotný kontrolní nosič pro celkem dvanáct kultur). Hormony se rozpustí v ethanolu a aplikují se na kultury ve shora popsaném mediu.

Po 24 hodinovém zpracování hormony (nebo kontrolním vzorkem) se buňky promyjí, oddělí lysují a zkouší h1edis k a a ktiv i ty jak popsáno v příkladu 5. Výsledky jsou VI a jsou vyznačeny na obr. 9-^: v n á s 1 e d u j í c í +. a b u 1 c e

Tabulka VI es; br ad i o t ra1ox i f en

OM

10,6

10,6

10' ⁹ M

11,9

21,3 lO~^aM

10- -'Π 29,4 19,7

10- ⁶ li 32,9 20,0

Ί-5Μ

10, 1

Tyto výsledky ukazují, že prve pozorovaná citlivost promotoru TGF/.i-3 na eštrogen a raloxifen zůstává zachována při zkouškách s buňkami CHO.

B. Aktivace TGF(.i-3 v buňkách MCF

Kultury buněk MCF-7 se přechodně ko-transfektují s pTGFd301LUC. jak popsáno v příkladu 4. Těchto kultur se použije k vyzkoušení schopnosti raloxifenu a estradiolu indukovat transkripci buněk tohoto typu. Kultury se zpracovávají estradiolero nebo raloxifenem při následujících koncentracích: GM, 1O^-9M, 1O^-S1‘1, 10^-7M, 10^_6M a 10^-5M. Hormony se rozpustí v ethanolu a aplikují se na kultury ve shora popsaném mediu.

Po 24 hodinovém zpracování hormony (nebo kontrolním vzorkem) se buňky promyjí, oddělí se, lysují a zkouší z hlediska aktivity LUC jak popsáno v příkladu 5. Výsledky jsou v následující tabulce VII a jsou vyznačeny na obr.10.

Tabulka VII estradiol ra1ox i fen

0M 7,8 7 , o

10-5 M 19,2 158,0

1O^-/M

107,3 314,0

10~⁶M

101,3 451,0

10~⁵M

122,0 206.0 ΐΟ'θΜ 9.1 09,0 (Aktivita luciferazy je vyjádřena v tisících jednotek) Podobné zkoušky se provedou s lidskými endometriálními rakovinovými buňkami (RL.59,2), lidskými mozkovými rakovinovými buňkami (HeLa) a opičími ledvinovými buňkami (COS-1) (American Type Culture Collection, Rockville, KP). 2j j πi c iováná pr omotorem TGFd-3 je nem v buňkách všech zkoušených ce). Tyto výsledky ukazují, že z e t. r a n s k r i ρc e ne m a r a 1 ox i r e genu typů (s kolísáním necnoatl Jndi..kindukce transkripce refereněnícb promotor u TGF{>-3, zprostředkovaná estrogenem a raloxifenem není omezena na specifický ty;.- buněk. Různá míra indukce v různých buňkách však může ukazovat, na nahromaděn i ji ny/ li í? η ktor ů v těchto buňkách zapojených do regulace. Skutečnost, že citlivost promotoru TGF(ě-3 na estrogen a raloxifen je zjištěna ;íi použití jak luciferazy, tak CAT jakožto referenčních genů naznačuje, že tato regulace je všeobecnou vlastností exprese genů z tohoto promotoru .

Příklad 10

Porovnávací indukce exprese referenčního genu z promotoru Τ0Ρβ-3 raloxifenem a příbuznými sloučeninami

Ze stavu techniky je známo, že antiestrogenové sloučeniny jsou schopné indukovat expresi genu ΤΟΡβ způsobem závislým na dávce. (Knabbe a kol., Am.J.01in.One.,14 Cdodatek2), S15-S20 (1991). Kromě toho, jak bylo ukázáno v příkladu 8, jsou raloxifen a tamoxifen schopné indukovat expresi genu TGF(i-3 způsobem závislým na dávce.

Pokusy podle tohoto příkladu se provedou se záměrem korelovat schopnost sloučenin indukovat transkripci cestou prvku promotoru TGF£-3, citlivého na raloxifen, s jejich známými uterotropickými schopnostmi, jak to bylo předveno u krys zbavených vaječníků. Z hlediska jejich schopnosti indukovat transkripci cestou prvku promotoru TGFíl-3 citlivého na raloxifen se zkouší sedm sloučenin strukturálně příbuzných s raloxifenem. Tyto sloučeniny lze rozlišit na základě spektra aktivity in vivo v rozmezí od uterotropických (LY112676, LY81099 a LY13314) po arit i uter otrop ické (LY113526, LY139482 a LY177366), se začleněním sloučeniny, o níž je známo, že je inertní in vivo (LY980Q5).

Dále se uváděj i jména IlJPAt těchto sloučenin a americké patentové spisy, ve kterých jsou popsány:

113526

139432

2-(p-hydroxyfeny1)benzolB3thien-3-y1- 4 133314 p—12-(1-pyrrolidiny1)ethoxy]feny 1 keton [4-[2-( hexahydro-ÍH-azepin-1-y 1 )ethoxy 3 f eriy 1 ] - 4 383635 >66

93335

112676 [6-hydroxy-2-(4-hydroxyfeny1)benzol 81thien3-yl]methanon

- < 2,2 - d i m e t hy 1 -1 - οχ o p roxy )-2-14-(2,2-dine thy 1-1-oxopropoxy)f eny13 benzolBJ thien3-y1114-12-(1-piperidiny1)ethoxy1 feny 13’' ethanonhydroch1or i d p-hydroxyf eny1 3 - ( -hydoxyfeny1)benzo18]thien-2-y1-keton (p-hydroxyfeny1)-5-hydroxy-3-£enyIbenzo37/932933 podaná

28.červen ce 1992

-1 37*' [B3 thien-2-y1-keton

81099 p-hydroxyf eny1-3-f enylbenzol B1

075227 thien-2-y1-keton

133314 Sůl [3,4-dihydro-2-<4-methoxypenyl>1-naf tan1eny11 [4-C 2-<1-pyrro1 idi ny1)ethoxy1 feny 11 methanem, sůl methansulfonové kyseliny

Tyto sloučeniny jsou vyznačeny na obr.11.

K porovnání jejich schopnosti indukovat transkripci z promotoru genu TGF£-3 se zkouší v proměnlivých koncentracích raloxifen, LY81099, LY98005. LY112676, LY113526, LY13314, LY139482 a LY177366 <Eli Lilly and Company, Indianopolis, Indiana). Kultury buněk MG63, přechodně ko-transfektované s pB-301 a pRSVER, se zpracují jako v příkladě 6 se shora uvedenými sloučeninami při

koncentrac í c h	0M, 10_9M,	108M,	10_7M,	10-f-M a	1O5M .	Výsledky
pokusů jsou v	následuj ící	tabule	e a jsou	znázorněny na o	br. 12.
Tabulka VIII	0M	io-9m	10®K	io-7m	ΙΟ6 Π	10'5 M
i a1ox i fen	0,61	2,1	6,4	7,5	7,0	4,0
LY81099	0,61	0,6	0,5	0,7	0,9	2,3
1.Y98005	0.61	0,4	0,5	0,5	0,4	0,5
LVI12676	0.61	0,6	0,6	0,5	1,7	3 8
LY113526	0,61	0,7	0,7	0,6	2,0	2, 1
I.Y13314	0,61	0,7	0,7	3,1	6,6	1,0
LY139482	0,61	0,3	2,5	2,7	2,5	2,0
LY177366	0,61	1 , 1	7,9	10,2	7,9	6,1

Sloučeniny vykazující uterotropické vlastnosti in vivo (to jest estr-ogenické sloučeniny) vykazují hodnoty EDso přibližně 1O~⁷M a mají relativně nízkou indukci -ohybu <’*fold índuetion”) exprese referenčních genů z promotoru TGFíl-3, což je profil velni podobný jaký vykázal estrogen v příkladu 8. Na rozdíl od toho sloučeniny, jejichž profil cen í * *') ·-» - H i ny. Data ρϋΓΐίτΐ Ώ in vivo, je podobný ralcixifenu in vivo, výkazuvetší indukci ohybu noz es troce) j 11 kcr týkající se raloxifenu, jsou převzai-a z americké přihlášky vynálezu číslo 07/920933, podané 23. července 1992. V souhrnu sloučeniny, mající vlastnosti in vivo podobné estrogenu, vykazují významně menší indukci transkripce cestou promotoru TGF0-3 než sloučeniny, jež vykazovaly vlastnosti in vi* vo podobné antiestrogenu.

Výsledky těchto pokusu ukazuji jednotnost obsahujících referenční gen, popisovanou zde jako vytřiďovací technika k identifikování potenciálních antiosteoporozních činidel, jelikož tyto sloučeniny,jež jsou podobné raloxifenu ve svých profilech indukce a EDso, vykazují poměrně nižší uterotropické účinky než sloučeniny podobné estrogenu, mající nižší profily indukce a vyšší EDso v této zkoušce.

F'r i k 1 ad 11

Umístění prvku citlivého na raloxifen v promotoru TGF0-3 v oblasti od +35 do +75.

Alespoň část prvku citlivého na raloxifen CRRE) v promotoru lidského genu TGF0-3 je přibližně umístěna v jednotlivé 41-nukleotidové sekvenci, nacházející se v polohách +35 až +75. Zjišťuje se, že tato sekvence je nutná ke zprostředkování transkripční aktivace exprese referenčního genu, indukované raloxiíenem ve shora popsaných obrazcích exprese referenčního genu TGF0-3.

A. Identifikace prvku citlivého na raloxifen funkční analýzou delečních mutantfi promotoru TGF0-3 připravených in vitro.

Způsobem popsaným v příkladu 1 se generují kultury buněk MGG3 přechodně transfektovaných s pCMVER a s jednou variantou delečních referenčních obrazců promotoru TGF0-3<včetnč pB-499, pB-301 pB-221, pB-91, pB-60. pB-47, pTGF0-33LUC, PTGF0+75LUC. pTGFd+ 35LUC a pLUC). Tyto kultury se pak zpracují buď ethanoiem í jako kontrolou), nebo raloxifenem 10^-6M. Stupně indukce exprese referenčního genu po zpracování raloxifenem v poměru ke stupni získanému zpracováním samotným nosičem se vypočte pro každý deleční obrazec promotoru TGF0-3 a jsou vnásleduiící tabulce IX a jsou znázorněny na obr. 13:

Tabulka IX

Plasmidový vektor	Oblast promotoru TGF0-3	Indukce ohybu raloxifenem
pB-499	-499 - +110	6,3
pB-301	-301 - +110	13,1
pB-221	-221 - +110	3,7
pB-91	-91 - +110	10,1
pB-60	-60 - +110	12,5
pB-47	-47 - +110	11,5
PTGF0-33LUC	-33 - +110	7,1
PTGF/A+75LUC	-33 - +75	5,3
PTGF0+35LUC	-38 - +35	1,2
pLUC vektor samotný		0,5

Tyto výsledky ra1ox i fen do po1 oh umisfují alespoň část prvku citlivého n< -35 až +75 v sekvenci promotoru TGFfs-3 .

B. Nukleotidová sekvence prvku citlivého na raloxifen vyznačuj i vyznačena v rámečku. vodorovných šipek pod raloxifen. Viz Lobanenekov (1090).

Nukleotidová sekvence prouotoru TGFfi-3 z polohy -38 až +110 je vyznačena na obr.14- Sekvence citlivá na raloxifen byla nalezena, jak shora uvedeno, a je vyznačena na obr·. 14. Nevyplněná šipka vyznačuje počátek hlavní transkripce (+1). Dvě černé šipky počátky transkripce. Sekvence ”TATA je Domnělý motiv CCCTC je vyznačen řadou sekvencí domnělého prvku citlivého na a kol. 0ncogene,5, str.1743-1753 analysy TGFfi-3 lze odvodit dva závěry První je, že se v této oblasti promotoru TGF0-3 nenacházejí žádné pal iridr omické sekvence homologní k ERE. Tento poznatek souhlasí s výsledky uvedenými v příkladu 7 jěž ukazují, že vazební aktivitu í.R na dna není nutná. Druhým je, že aktivace TGFfi-3, zprostředkovaná raloxiíenovou aktivací, vyžaduje nejpravděpodobněji jiné faktory, jež jsou schopny vazby k sekvenci citlivé na raloxifen. Dobrýn kandidátem na takový protein je faktor CTCF identifikovaný Lobanenkovem a kol., který se účastní regulaci genu c-myc. Tyto poznatky mohou vést k identifikaci jiných genů jakožto potenciálních raloxen indukovatelných genů, jež mají prvky citlivé na raloxifen ve svých promotorech. Kromě toho by mohlo být takových genů použito k identifikaci genetických prvků majících aktivitu prvků citlivých na raloxifen k použití ve vytřiďovacím procesu uvedeném v příkladu 13.

Prvku citlivého na raloxifen podle vynálezu se použije k hledání v knihovně sekvencí GenBanky; významné honology se nacházejí mezi tímto prvkem a prvky následujících genů:

Číslo dostupnosti v bankce

dat GeBank/EMBL	Gen
X56595	Kuřecí kollagen -2 typu VI
X55373	Oblast lidského promotoru
M30137	Lidský ETS-2 (lem 5 ' >
Dl0231	Transportér myši glukózy (zesilovač 2)
Ml2731	ilyší N-rayc proto-onkogen
M13945	Myší pim-1 proto-onkogen
X63231	Gen R.norvegicus N-myc
XI6995	Myší gen 1310
M94152	Krysí receptor adenosinú
M'20131	Krysí cytochron P450IIE1
M34111	Krysí PTHrP
J05097	Receptor krysí substance P
M64236	Receptor krysí substance P

Toto zjištění podporuje existenci tohoto prvku jako diskrétní a významné regulační jednotky schopné zprostředkovávat pleiotropické fyziologické jevy in vivo v množině tkání a typů buněk.

Příklad 12

Aktivace promotoru estrogenové a raloxifenové indukce receptoru LDL

Exprese receptoru LDL hraje významnou roli v regulaci narůstání sera LDL-cholesterolu. Je znáno, že esfrogen indukuje mediátor RNA receptoru LDL in vivo. Ma a kol., Proč.Nat1.Acad.Sci.USA , 83, str.792 až 796 (1986). Jak je ukázáno v tomto příkladě, tato aktivace promotorové sekvence receptoru LDL estrogenem je zprostředkována ER. Raloxifen také indukuje promotor receptoru LDL; avšak tato indukce je závislá na ER.

A. Produkce LDLR-Luc indukovaná estrogenem a raloxifenem v přítomnosti ER

Kotransfektuje se řetězec ATCC buněk Hep02 s pLDLRLUClO a pRSVER, jak popsáno v příkladu 4. Tyto buňky se vystaví působení estrogenu a raloxifenu za podmínek uvedených v příkladu

6. Výsledky jsou v následující tabulce X a série pokusů je znázorněna na obr. 15.

Tabulka X	OM	1O”9M
estrádiol	20,9	16,6
raloxifen	20,9	20,9
B. Produkce	LDLR-Luc	i ndukovaná
v nepřifomnos	ti ER

10”9M	10”'dí	10” 6 11	io-
15,4	40,7	74,0	69,
19,9	26,9	14,6	14,

estrogenem a ra 1 ox i f eriem

Kotransfektuje se řetězec ATCC buněk Hep02 s pLDLRLUClO a s vektorem plasmidů pKSV, jak popsáno v příkladu 4. Tyto buňky se vystaví působení estrogenu a raloxifenu za podmínek uvedených v příkladu 6. Výsledky jsou v následující tabulce XI a série pokusů je znázorněna na obr. 16.

Tabulka XI

	OM	1O~9M	10~«M	1O-7M	10~6M	1Q~5M
estradiol	1597	1645	1792	1574	1578	2445
raloxifen	1597	1652	1234	1025	1291	5561

Výsledky ukazují, že jak raloxifen, t.ak estrogen mají schopnost, indukovat, expresi receptoru LDL. Tyto výsledky vysvětlují účinek estrogenu a raloxifenu na snižování sérového lipidu in vivo, jak ve zvířecích, tak v lidských modelch.

Příklad 13

Způsob vytřiďování potenciálních antiosteoporozních činidel

Na podkladě předchozích příkladů se provede zkouška vytřiďování potenciálních antiosteoporozních činidel pomocí luciferázy jako referenčního genu.

Kultury buněk MVF-7 se trvale transfektují 1- pTGFři-301LUC

2. pGL2LUC nebo

3. PGL2ERLUC způsoby popsanými v příkladu 4. Buněk se pak použije způsobem pole vynálezu vyznačeném na obr. 17.

Operace 1. Při vytřiďovací zkoušce se především musí zjistit schopnost sloučeniny indukovat trankripci z promotoru TGFp-3. Zkouška se provádí v podstatě stejně, jak je vyznačeno v příkladu 9, pomocí buněk MCF-7 stabilně transfektovaných s pTGF£-301LOC. Kultura buněk a podmínky zkoušky se upraví podle formátu 96-důlkové mi krotítrační destičky- Buňky se nasadí do 96-důlkové destičky při hustotě vedoucí k přibližně 50% konfluenci. Zkušební sloučeniny lze volit z různých zdrojů, včetně farmaceutických výzkumných záznamů, ze seznamů výrobků chemických výrobců a z přírodně se vyskytujících zdrojů, jako jsou extrakty z fermentací. Buňky se inkubují v růstovém prosdtředí (popsaném v příkladu 4) obsahujícím zkoušenou sloučeninu po dobu přibližně 24 hodin. Buňky se pak lysují in šitu na destičce a lysáty se podrobují kvan46 titativní zkoušce na proteiny a na aktivitu luciferázy. Sloučeniny, jež indukují větší než dvojnásobný nárůst aktivity luciferázy se považují za hodné dalšího zkoumání.

Operace 2. Zkoušky se provádějí se sloučeninami identifikovanými v operaci 1 na buněčných kulturách, jež byly stabilně transfektovány s pGL2LUC ke zjištění, zda jsou takové sloučeniny obecnými induktory transkripce. Jestliže takové obecné induktory transkripce postrádají transkripční indukční specifičnost požadovanou pro potenciální antiosteoporetika, jež jsou modulátory genové exprese závislé na prvku citlivém na raloxifen, jsou z dalšího zkoušení vyloučeny.

Operace 3. Sloučeniny mající transkripční indukční specifičnost (to je schopnost navozovat indukci transkripce v buňkách pTGF3-301LUC aniž indukují transkripci buněk transfektovaných s pGL2LUC) pro potenciální antiosteoporetika. jež jsou modulátory genové exprese, závislé na prvku citlivém na raloxifen, jsou pak zkoušeny ke zjištění, zda takové sloučeniny indukují transkripci z prvku citlivého na estrogen. Buňky stabilně transfektované s pGL2ERELUC se zkoušejí, jak popsáno v příkladu 6, jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti estradiolu. Sloučeniny, jež aktivují PGL2ERELUC v nepřítomnosti estrogenu se z dalšího zkoušení vyloučí, jelikož schopnost těchto sloučenin indukovat transkripci z prvku citlivého na estrogen v nepřítomnosti estrogenu vyjevuje potenciální estrogenickou aktivitu in vivo.

Operace 4. Sloučeniny, které splnily kritéria operací 1 až 3, se pak dále zkoušejí ke zjištění, zda takové sloučeniny jsou buď anti-estrogenní, nebo ne-estrogenní/ne-ant,iestrogenní . K tomu se sloučeniny zkoušejí v přítomnosti estradiolu v buňkách stabilně transfektovaných s pGL2ERELUC. Inhibice estrogenem indukované luciferázové aktivity při této zkoušce indikuje, že takové sloučeniny mají anti-estrogenní aktivitu. Jak anti-estrogenní, tak ne-estrogenní sloučeniny se charakterizují svými profily odezvy na dávku a hodnotami ED50- Další pokusy lze provádět ke stanovení profilů odezvy takových sloučenin na dávku a k jejich porovnáni se známými anti-estrogeny, jako je raloxifen (viz příklad 10).

- 47 Po tomto vytřiďovacíra protokolu je možno použít konvenčních zkoušek, zejména zkoušky in vivo zahrnující příslušné zvířecí modelové systémy, k dalšímu charakterizování anti-estrogenních vlastností sloučenin identifikovaných popsaným způsoben. Vývoje takových anti-estrogenních sloučenin, majících žádoucí antiosteoporotické vlastnosti, lze pak s výhodou a urychleně dosáhnout ze sloučenin identifikovaných v této zkoušce.

Příklad 14

Korelace mezi aktivitou in vitro a in vivo.

K demonstrování korelace mezi zkouškou in vitro a modelem in vivo post-menopausální osteoporozy se provedou následující pokusy. Zkouška in vitro měří schopnost zkušebních sloučenin indukovat transkripci cestou prvku citlivého na raloxifen promotoru TGFíi-3. Model in vivo měří změny hustoty minerálů Ve stehenní kosti krys zbavených vaječníků. V těchto pokusech se použije následujících sloučenin:

raloxifen

088074

156678

171147

309503

6-hydroxy-2-(4-hydroxyfeny1)-3-14-(2-piperidinoethoxy)benzoy11 benzolb]thiofen 6-hydroxy-2-(4-hydroxyfeny1)-3-(4-hydroxybenzoy1benzolblthiofen

6-hydroxy-2-(4-hydroxyfeny1)-3-[4-(2-(3-methy 1 pyrro1 i d i n)ethoxy1)benzoy11 benzo C bl th i of en 2-(4-hydroxyf enyl)-3-14-(2-piper i d i noethoxy)]benzoy11benzo1 b]th i of en

6-hydroxy-2-(4-hydroxyfeny1)-3-14-(2-hydoxyethoxy)benzoy1]benzolblthiof en

Tyto sloučeniny se připraví způsobem obecně popsaným v americkém patentovém spise číslo 4 133814 (9. ledna 1979).

Raloxifen, 088074, 156678, 171147 a 309503 (Eli Lilly and Company) se zkoušejí ke zjištění jejich schopnosti vytvořit dvojnásobnou indukci v transkripci z promotoru genu TGFfi-3, měřené aktivitou luciferázy, při koncentracích nižších než 10 nM (to jest minimální účinné koncentaci CííEC) < lOriM). Jeden den před transfekcí se trypsinizují buňky HeLa roztokem 0,05 %' trypsinu/5,3mM tetranatriumethylendiamintetraoctové kyseliny (EDTA) k dosažení suspense jediné buňky. Oddělené propláchnuté buňky se spočítají a rozředí se na koncentraci 1 000000 buněk/mL. Přidají se tři miliony buněk a živné prostředí 3=1 media <25 mL) do baněk t-150 a řnkubují se přes noc. Následujícího dne se živné prostředí odstraní a nahradí se čerstvým prostředím <25mL)- Buňky se přechodně ko-transfektují s pTGE#-301LUC <10 pg) , pCMVER <lpg) a pRSV/igal <lpg) pomocí systému ProFection Mammalian Transfection System (Promega). Připraví se transfekční roztok smísením pTGE/5-301LtJC pCMVER <94 pg), pRSVtfgal <94 pg), chloridu vápenatého a nukleázy prosté vody <47 mL) s 2XHEPES <47 ml) za míchání. Výsledný roztok se inkubuje při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Tento transfekční roztok <3mL) se přidá do každé baňky.

<940 pg), <5.704 mL)

Po inkubaci buněk s transfekčním roztokem přes noc se prostředí odstraní a každá baňka se promyje solankovým, fosfátem pufrovaným roztokem prostým vápníku/hořčíku <10 mL, GIBCO)- Pronyté buňky se trypsinizují <3nL trypsin/EDTA) k oddělení buněk. Oddělené buňky se zpracují čerstvým prostředím <3mL). Připraví se peleta buněk a oddělí se odstředěním a odebráním prostředí a trypsinu. Buňky se resuspendují v přibližně 20 mL prostředí a sečtou se. Buňky se zředí na koncentraci 5()0000 buněk/ml . Potom se do každého důlku 9G-důlkové destičky přidá 50000 buněk (lOOpL) a buňky se inkubují přes noc.

Zkušební sloučeniny se rozpustí v dimethylsulfoxidu a zředí se napřed 1:1000. Toto zředění se provede přidáním 2p 1 roztoku drogy k lOOOpl prostředí v raikrotitrační destičce s hlubokými důlky (zředění 1=5010), pak se přidá 100 pl zředěného roztoku drogy do lOOpl prostředí už v destičce (zředění 1 = 2). K vytřiďování sloučenin se sloučeniny zředí 1=1000, jak prve popsáno, pak se dále zředí 1=100. Alternativně se zjistí minimální účinná koncentrace pomocí křivky odezvy na dávku osni zředění. 5ioučeniny a buňky se inkubují přes noc v 96-dfl1kových destičkách.

Prostředí se oddělí od buněk a každý důlek se promyje solankovým, fosfátem pufrovaným roztokem, prostým vápníku/hořcíku C200pL). Solankový roztok se odstraní a buňky se lysují 60μ1 lysového pufru ClOOmM fosforečnanu draselného, 0,2¾ Tritonu X-100, lmM DPR, pH 7,8). Výsledného roztoku se použije k vyzkoušení aktivity luciferázy nebo β-gal. Luciferazová zkouška se provede v podstatě podle příkladu 6, s tou výjimkou že luciferinový roztok obsahuje 100 mg luciferinu, 9 ml ÍM glyci1-glycinu,36 ml 40mM EGTA, 720 ml ÍM DTT, 5,4 ml 1M síranu hořečnatého a 310 ml vody. Výsledky těchto pokusů jsou uvedeny v tabulce XII.

Tabulka XII Sloučenina raloxifen

088074

156678

Zkouška TGF{?^a

Hustota kostí^b

171147

309503 značí, že zkušební sloučenina vytvořila dvojnásobnou indukci v normalizované luciferázové aktivitě s EDso <10nM ..j-.. 7;načí, že hustota minerálu v kostech ii? stát. i st i ekv vyšší než u zvířat zbavených vaječníků

Uvedené sloučeniny se také zkoušejí n ostí u c h ov áv a t hustotu minerálu kostí u hledisak jejich sekopry s zbavených vaječníků. Samičky krys Sprague Dawley staré 75 dní (o hmotnosti 225 až 275 g) se získají z laboratoří Charles River Laboratories (Portage, MI). Umístí se ve skupinách po třech a nechá se jim přístup k potravě (vápníkový kontext přibližně 1¾) a k vodě podle libosti. Teplota místnosti se udržuje na 22,2 C f 1,7 C při relativní vlhkosti 40¾. Pex-ioda osvitu je 12 hodin světlo, 12 hodin tma .

Týden po příchodu krysy ponr-j

OJ.OU.

ječníků pod narkózou f44 mg/kg Ketaninu a 5 m ler, Indianopol is, IN i nt ramusku I árně] . Ošel-ř i Xyl.izinu (Rut•jí nes i čen ncl-o

GO zkušební sloučeninou se započne v den chirurgického zákroku po zotavení z narkózy. Dávky se podávají orálně v 0,G ral 1% karboxymethy 1 celulózy (CMC). Tělesná hmotnost se zjištuje v den chirurgického výkonu a pak týdně a dávka se upravuje podle změn tělesné hmotnosti- Nosičem ošetřené nebo ošetřované, vaječníků zbavené krysy (ovex) a krysy vaječníků- nezbavené Cintaet) se vyhodnocují paralelně v každé experimentální skupině, aby sloužily jako negativní a pozitivní kontrola.

Krysy se ošetřují denně po dobu 3G dnů <6 krys na ošetřovanou skupinu) a usmrtí se odseknutím hlavy 36- den. Perioda 3G dnů je postačující k umožnění maximálního snížení hustoty kosti, měřené jak zde popsáno. Pravé stehení kosti se vyjmou a hodnotí se distalni metafysou 1 mm od patelární drážky jednofotonovou absorpciometrií. Výsledky densitometrických měření reprezentují výpočet hustoty kosti jako funkci obsahu kostních minerálů v závislosti na šířce kosti. Obecně způsobuje odejmutí vaječníků u krys snížení hustoty stehení kosti o asi 2G ve srovnání s intaktními kontrolami ošetřovanými nosičem. Výsledky těcho zkoušek jsou ve shora uvedené tabulce XII.

Výsledky těchto zkoušek ukazují, že sloučeniny, které mocně indukují transkripci z prvku citlivého na raloxifen promotorové oblasti genu T(3Fři-3, jako je raloxifen, 1G6678 a 171147, také vykazují uchování hustoty-.kost í u krys zbavených vaječníků.

Sloučeniny, které selhávají v indukci transkripce pro prvek citlivý na raloxifen, jako 083074 a 309003, selhávají také ve statisticky významné ochraně proti ztrátě minerální hustoty kostí krys zbavených vaječníků.

Je zřejmé, že jsou uvedena toliko některá specifická provedení vynálezu, a jsou možné další modifikace nebo ekvivalentní alternativy v duchu a v rozsahu vynálezu, vymezenému nás ledujícím i paten to vým i n úroky.

yyuži.teln<?st

Způsoby identifikace antiosteopor ozrrích činidel. , k.ter á indukují transkripci, genů operativně vázaných na takové prvky citlivé na raloxifen bez navozování nepříznivých a nežádoucích vedlejších ú.....

činko známých ze souačné terapie osteoporosy.

Sezná» sekvenci

(1)	0b ecné infor mace
i.)	Přihlašovatel: Yang, Na	N
ií)	Název vynálezu: činidla	pro vy tří dování, účinných
	osteoporoze a způsoby t	a k. o v é h o v y t ř i d ován 1
1.1.1.)	P o č e t s e k v e n c 1: 9
i. v)	Adresy Pro korespondenci.

A.. Adresát: Eli Lilly and Company B · U.1 i.ce: Lilly Corporate Center C , Město: Indianopoi.is

0. Stát:IN

E. . Země; Spojené státy americké

F, ZIP: 46285

v) Forma pro počítač:

A. 1yp média: Disketa ..... 8,89 vm (3,5 palce), 1,44 mb

B. . Počítač: Kompatibilní s IBMk

C. . Operační systém: MS-DOS

0, Software: PatentIn Release #1,0, Version #1,25 v-j.) Platné přihlašovací údaje

A. , číslo přihlášky: US

B. , Datum podání

C. Klasifikace v i. i.) Předchozí přihlašovací údaje

A.. Číslo přihlášky: US 08/081610 B Datum podání: 21..června 1993

C.. Klasifikace: 435 vili) I rifor»ace o zástupci/zmocněnci A.. Jméno: Leeds, James P.

B. Registrační číslo: 35241

C. Referenční/štítkové číslo Χ-90ΒΒΛ z) Te 1 ekomunikační inforsiace

A. Telefon: 317-276-1667 S. Telefax: 317-277-1917 . Informace o sekv ID. 0.1 ' Charakteristiky sekvence

A. Délka·' 2205 páru bází

B. Typ: nukleová kyselina C- Řetězec: jeden

D. Topologie: lineární i) Typ molekuly: cDNA

Charakter i st i ky

z)

A.	jinéno/k 1 íč: nisc-RMA
B.	umístění: 1. . 2
C.	další informace < známka toru TGFB-1”	číslo
Ch	arakteri s t i ky
A.	j mén o /k 1 í č '· misc - RNA
B.	umístění- 1363..1365
C.	další informace < známka	” C í 3 1 O

odpovídá -1362 proraoodonu TOFB-1

i) Popis sekvence ID. č. 1

GGATCCTTAG CAGGGGAGTA ACATGGATTT GGAAAGATCA CTTTGGCTGC TGTGTGGGGA 60

TAGATAAGAC GGTGGGAGCC TAGAAAGGAG GCTGGGTTGG AAACTCTGGG ACAGAAACCC 120

AGAGAGGAAA AGACTGGGCC TGGGGTCTCC AGTGAGTATC AGGGAGTGGG GAATCAGCAG ISO

GAGTCTGGTC CCCACCCATC CCTCCTTTCC CCTCTCTCTC CTTTCCTGCA GGCTGGCCCC 240

GGCTCCATTT CCAGGTGTGG TCCCAGGACA GCTTTGGCCG CTGCCAGCTT GCAGGCTATG 300

GATTTTGCCA TGTGCCCAGT AGCCCGGGCA CCCACCAGCT GGCCTGCCCC ACGTGGCGGC 360

CCCTGGGCAG TTGGCGAGAA CAGTTGGCAC GGGCTTTCGT GGGTGGTGGG CCGCAGCTGC 420

TGCATGGGGA CACCATCTAC AGTGGGGCCG ACCGCTATCG CCTGCACACA GCTGCTGGTG 480

GCACCGTGCA CCTGGAGATC GGCCTGCTGC TCCGCAACTT CGACCGCTAC GGCGTGGAGT 540

GCTGAGGGAC	TCTGCCTCCA	ACGTCACCAC	CATCCACACC	CCGGACACCC	AGTGATGGGG	600
GAGGATGGCA	CAGTGGTCAA	GAGCACAGAC	TCTAGAGACT	GTCAGAGCTG	ACCCCAGCTA	66 0
AGGCATGGCA	CCGCTTCTGT	CCTTTCTAGG	ACCTCGGGGT	CCCTCTGGGC	CCAGTTTCCC	720
TATCTGTAAA	TTGGGGACAG	TAAATGTATG	C-GGTCGCAGG	GTGTTGAGTG	ACAGGAGGCT	730
GCTTAGCCAC	ATGGGAGGTG	CTCAGTAAAG	C-AGAGCAATT	CTTACAGGTG	TCTGCCTCCT	840
GACCCTTCCA	TCCCŤCAGGT	GTCCTGTTGC	CCCCTCCTCC	CACTGACACC	CTCCGGAGGC	-- 9 0 0
CCCCATGTTG	ACAGACCCTC	CTTCTCCTAC	CTTGTTTCCC	AGCCTGACTC	TCCTTCCGTT	= 60
CTGGGTCCCC	CTCCTCTGGT	CGGCTCCCCT	GTGTCTCATC	CCCCGGATTA	AGCCTTCTCC	1020
GCCTGGTCCT	CTTTCTCTGG	TGACCCACAC	CGCCCGCAAA	GCCACAGCGC	ATCTGGATCA	1030
CCCGCTTTGG	TGGCGCTTGG	CCGCCAGGAG	GCAGCACCCT	GTTTGCGGC-G	CGGAGCCGGG	1140
GAGCCCGCCC	CCTTTCCCCC	AGGGCTGAAG	GGACCCCCCT	CGGAGCCCGC	CCACGCGAGA	1200
TGAGGACGGT	GGCCCAGCCC	CCCCATGCCC	TCCCC.CTGGG	GGCCGCCCCC	GCTCCCGCCC	1260
CGTGCGCTTC	CTGGGTGGGG	CCGGGGGCGG	CTTCAAAACC	CCCTGCCGAC	CCAGCCGGTC	1320
CCCGCCGCCG	CCGCCCTTCG	CGCCCTGGGC	CATCTCCCTC	CCACCTCCCT	CCGCGGAGCA	1330
GCCAGACAGC	GAGGGCCCCG	GCCGGGGGCA	GGGGGGACGC	CCCGTCCGGG	GCACCCCCCC	1440
GGCTCTGAGC	CGCCCGCGGG	GCCGGCCTCG	GCCCGGAGCG	GAGGAAGGAG	TCGCCGAGGA	1500
GCAGCCTGAG	GCCCCAGAGT	CTGAGACGAG	CCGCCGCCGC	CCCCGCCACT	GCGGGGAGGA	1560
GGGGGAGGAG	GAGCGGGAGG	AGGGACGAGC	TGGTCGGGAG	AAGAGGAAAA	AAACTTTTGA	1620
GACTTTTCCG	TTGCCGCTGG	GAGCGGGAGG	CGCGGGGACC	TCTTGGCGCG	ACGCTGCCCC	1680
GCGAGGAGGC	AGGACTTGGG	GACCCCAGAC	CGCCTCCCTT	TGCCGCCGGG	GACGCTTGCT	1740
CCCTCCCTGC	CCCCTACÁCG	GCGTCCCTCA	GGCGCCCCCA	TTCCGGACCA	GCCCTCGGGA	1300
GTCGCCGACC	CGGCCTCCCG	CAAAGACTTT	TCCCCAGACC	TCGGGCGCAC	CCCCTGCACG	1360
CCGCCTTCAT	CCCCGGCCTG	TCTCCTGAGC	CCCCGCGCAT	CCTAGACCCT	TTCTCCTCCA	1920
GGAGACGGAT	CTCTCTCCGA	CCTGCCACAG	ATCCCCTATT	CAAGACCACC	CACCTTCTGG	1980
TACCAGATCG	CGCCCATCTA	ggttatttcc	GTGGGATACT	GAGACACCCC	CGGTCCAAGC	2040
CTCCCCTCCA	CCACTGCGCC	CTTCTCCCTG	AGGAGCCTCA	GCTTTCCCTC	GAGGCCCTCC	2100
TACCTTTTGC	CGGGAGACCC	CCAGCCCCTG	CAGGGGCGGG	GCCTCCCCAC	CACACCAGCC	2160

CTGTTCGCGC TCTCGGCAGT GCCGGGGGGC GCCGCCTCCC CCATG

2205

2. Informace o sekv ID. C-2 e z π a n s e k v e 11 c í i ) Charakteristiky sekvence

A. Bé 1 ka ' 5578 páru mází

E. Ty p ' nuk 1 eová ky se i i na

C. Řetězec; jeden

B. Topologie; lineární i i) Typ- molekuly; cDNA ix? Charakteristiky

Λ - jměno/ki ic ιΛι-signál B - um í stění; 1248..2252 ix) Charakteristiky

A. jméno/k1 í č^: exon

3. umístění; 2278..398(3 i;·;) Charakteristiky

A . j m é no/klič; i ntr o n

3. umístění; 3981..5573 ix> Charakteristiky

A. jméno .''klíč; misc-RNA

E. umístění; 3Ó35..3980

C. další informace < známka CBS, kodon start =1 i x i C h a r a k te r i s t i ky

A. jméno/klíč: raisc-RNA

B. umístění =1..2

C. další informace < známka číslo 1 odpovídá TCPB-2

TCPB-1

-????

xi) Popis sekvence IE>. č. 2

AAGCTTTTAC	CAATACCTCC	CGTCTTACCC	CTCCTGGGCT	TTGGGGAAAT	TAAAGTAGCC	60
TCTTATGAGT	AAGTCAGGGG	TCTCAGGTCT	AAGGAGTTGT	TAAGTGAGCA	ATAGGTACTC	120
AGTAAACTAA	GTATTATGAA	CAAAAGTGTG	TATGTCTATG	TCAGGAAGAG	GGGTGGCCAT	180
CAGAATTTAT	GGCTTGCGCT	GTTTCCTAGA	AGTGATGTAA	TGAACTTTTG	CTACTCTATC	240
CACACTCTAA	TCTGAATCTA	CTTAAGGTGC	ATCAGTGTCT	GTACCAAGAA	GGTTGTCTAT	300

AAACATGAAA	GATGGATGCT	CACTGGCTTG	TGGAAGCTGA	acctgtatcc	TCAGAAAATA	360
CAGTGATAGC	TAATTCAGGT	AACCAGCCAT	ATTCCACAGC	AGCATCTTCT	CTCAGTAGCT	420
CTGGTTTGGA	GCTCCTGCTC	TGTGTCTATA	ATGGCCACAG	GTGTAAGAAT	ATTCACTTTT	4S0
TGTCCAATCT	GTAGAGCTAG	CCTACTGCAG	TTCTCAAACT	GAACTCAGAG	GGAGGACCTA	540
ACTGGATGAA	ACTACTAGTC	TGACAGTAGC	GCCTCTTGAT	TATCTTTTTC	TTGGGCTACT	600
GGGATGGTAG	CTTTGCTTCA	ACTCAAAACT	GGTATCAAGG	AAAGGAACCT	GCTGGTGCTG	660
ATTTATACAT	AATTTTTAGA	ATTATTCAGA	AGTGGGTTGG	AACAATTATT	TTATTCCAGA	720
gtttttcaa.t	GTGTGATAAT	GGAAAAAATT	CTGTATTCAA	GGGAGTTTGG	AAAATGCTGG	780
GTTAAAAGAG	TGAAAAGGTT	TTCTCTTCTA	CAGGAGTTTC	AGAGCCTTTA	ACATGATAAT	840
GTTCCAGAAT	GAGGAATCTA	AGAGGACAGG	AGAGTACCCA	GTATCTCCCA	AACTTGTTTG	900
ACTCCAGAAT	TCCTGTTTGT	CAGAACATAT	TCTGGGACCA	TTGTTTCTCA	GAAGTACATA	960
GTAGGTAAGA	ACATAGTGGA	TCCTGACTGC	AAAAATCCAG	CTCTACCACT	TACTGTGGTC	1020
TCGAACAAAG	TACTTAACTT	CTTTGTACCT	CAGTCTCCTC	ATCTGCCAGA	TATGGATAAT	1080
AAGACCCACT	TTATAGGTTC	ATAGTGAAGA	TTAAATGACC	ATACACAACA	CACATCAAAT	1140
TACTAAGTGT	AGTATATGTT	AGCTATTATT	ATTTT ATTT A	TTCAGTGCTC	TACTAATAAC	1200
CTAGGCCCCA	TACACAACTG	aagtataatt	CCAAAAGTGA	TAGAAAGTTC	TTTGTGACTT	1260
TTCTGAACTC	AGGAACATCT	GAAGTAGAGA	ACAGTATAGA	GATCTTGGGT	TTGGGAGTAC	1320
ATTCAACAGA	GTTTTCCAGT	TTAAATCATC	TGTCTGGTCA	GTATGGCTGC	AGAGTCATGC	1330
CGAAATGAAA	ATGTTGACTT	TGAGTAACTA	AAGGTAAAAT	AAAAGAAAAA	GGGAAGGTGG	1440
AACAGTGGTA	AGAGTTATTC	TGTATTČÁTC	TAATTTAAGA	CTTAGTTGAA	ATTGAAAATG	1500
TCAAGTTATG	AGTAGTGTAG	AACAAGTAGA	CATCAAACAC	TTAAAATTCC	AGCTTCCTGG	1560
ATTATGCTAT	GGAAAGAATG	AAGTTGGTGG	ATAATGTTTA	GCCTAGCAAG	AAGGTCAAGA	1620
AGAAGAAAGC	CATACAAGAA	GTGGCTTAGG	CAGCAAATTA	TAAAGGTGAC	CATTCATTCA	1680
AATCAGTAAA	ACAAACAAGT	ATACCTTATT	CTTTAGGTAA	AATTGATGGA	TCTCTGTTTT	1740
CCAGCAGTTC	ACAAACAGAG	GGGTACATTG	TAAACAACAA	ACTAACAAAA	TAAATTCTGG	1800
GATGGCAACC	TGCTAAGGTA	TCCCAGAAAA	TAAGAGGTAG	GACATGAATT	TAAAAGATTG	1860
GAAGGTATGT	CTTCAGTACT	GGCCTGGCCC	TGAGTAGACT	AGTGCCCTCC	ATAGGGGTGC	1920
GTGTGCACAC	ATAATACAGG	AGGGAAGCCT	TCCCTTCTAG	AGCAAGTGAT	TCAGCTTGGG	1980
AGGCTGTGAC	TGAGCTACAC	TAAGTAAAAA	CGGGAGACTT	GATTGTCCTT	CAACAGACCT	2040

GTCCAAAATG	ACTGGAAAGT	AAATACCGTA	AATCACTGTT	GTCAGGGCGC	ACATTCCACC	2100
TCCTTCCTCC	CTTACCCACA	GCGGTCCACA	TTTCCACACT	CCCTACACGG	TTCGGGGAGA	2160
GCTCGTGGTC	TAAGTAACGA	GAGGACTTCT	GACTGTAATC	CTAGCACGTC	ACTTTGTTGA	2220
AGGCAGACAC	GTGGTTCAGA	GAGAACTTAT	AAATCTCCCC	TCCCCGCGAA	GATCGTGATG	22S0
TTATTCGCTG	GCAGCAGAAG	GTCTTGCCGA	GCGAGCTCCA	GAACGTCCTG	ACAAGAGAAA	2340
GACAGATTGA	GATAGAGATA	GAAAGAGAAA	GAGAGAAAGA	GACAGCAGAG	CGAGAGCGCA	2400
AGTGAAAGAG	GCAGGGGAGG	AGGGGGATGG	AGCATATTAC	GTGACCGGCC	TAGGGAGTCA	2460
TCCAGGAACA	AACTGAGGGG	CTGCCCGGCT	GCAGACAGGA	GGAGACAGAG	AGGATCTATT	2520
TTAGGGTGGC	AAGTGCCTCC	TACCCTAAGC	GAGCAATTCC	ACGTTGGGGA	GAAGCCAGCA	2580
GAGGTTGGGA	AAGGGTGGGA	GTCCAAGGGA	CGCCCCTGCG	CAACTCCCTC	AGGAATAAAA	2640
CTCCCCAGCC	AGGGTGTCGC	AAGGGCTGCC	GTTGTGATCC	GCAGGGGGTG	AACGCAACCG	2700
CGACGGCTGA	TCGTATGTGG	CTGGGTTGGC	GTTTGGAGCA	AGAGAAGGAG	GAGCAGGAGA	2760
AGGAGGGAGC	TGGAGGCTGG	AAGCGTTTGC	AAGCGGCGGC	GGCAGCAACG	TGGAGTAACC	2820.
AAGCGGGTCA	GCGCGCGCGC	GCCAGGGTGT	AGGCCACGGC	GCGCAGCTCC	CAGAGCAGGA	2880
TCCGCCCGCC	CTCGGCAGCC	TCTGCGC-CCC	CTGCGGCACC	CGACCGAGTA	CCGAGCGCCC	2940
TGCGAACGGC	ACCCTCCTCC	CCGCGGTGGC	TGGGCTCGCC	CCAGCGCGCA	CACGCACACA	3000
CACACACACA	CACACACACG	CACGCACACA	CGTGTCGTTC	TCTGCTCCGG	AGCTGCTGCT	3060
GCTCCTGCTC	TCAGCGCCGC	AGTGGAAGGC	AGGACCGAAC	CGCTCCTTCT	TTAAATATAT	312 0
AAATTTCAGC	CCAGGTCAGC	CTCGGCGGCC	CCCCTCACCG	CGCTCCCGCC	CCTCCCGTCA	3180
GTTCGCCAGC	TGCCAGCCCC	GGGACCTTTT	CATCTCTTCC	CTTTTGGCCG	GAGGAGCCGA	3240
GTTCAGATCC	GCCACTCCGC	ACCCGAGACT	GACACACTGA	ACTCCACTTC	CTCCŤCTTAA	3300
ATTTATTTCT	ACTTAATAGC	CACTCGTCTC	TTTTTTTCCC	CATCTCATTG	CTCCAAGAAT	3360
TTTTTTCTTC	TTACTCGCCA	AAGTCAGGGT	TCCCTCTGCC	CGTCCCCTAT	TAATATTTCC	2420
ACTTTTGGAA	CTACTGGCCT	TTTCTTTTTA	AAGGAATTCA	AGCAGGATAC	GTTTTTCTGT	3480
TGGGCATTGA	CTAGATTGTT	TGCAAAAGTT	TCGCATCAAA	AACAACAACA	ACAAAAAACC	3540
AAACAACTCT	CCTTGATCTA	TACTTTGAGA	ATTGTTGATT	TC	ATTCTGACTT	3600
TTAAAAACAA	CTTTTTTTTC	CACTTTTTTA	AAAAATGCAC	TACTGTGTGC	TGAGCGCTTT	3 660
TCTGATCCTG	CATCTGGTCA	CGGTCGCGCT	CAGCCTGTCT	ACCTGCAGCA	CACTCGATAT	3720
GGACCAGCTC	ATGCGCAAGA	GGATCGAGGC	GATCCGCGGG	CAGATCCTGA	GCAAGCTGAA	3780
GCTCACCAGT	CCCCCAGAAG	ACTATCCTGA	GCCCGAGGAA	GTCCCCCCGG	AGGTGATTTC	3840

CATCTACAAC	AGCACCAGGG	ACTTGCTCCA	GGAGAAGGCG	AGCCGGAGGG	CGGCCGCCTG	3900
CGAGCGCGAG	AGGAGCGACG	AAGAGTACTA	CGCCAAGGAG	GTTTACAAAA	TAGACATGCC	3960
GCCCTTCTTC	CCCTCCC-AAA	GTAAGTACTT	ATTTTGACTT	CCATCCCCTG	AGGTTTAGCT	4020
CTGCCCGGAG	CTCTCAAAAC	CGCAGCAGCT	CCCGGGATCG	CCCTTCCCTC	TGCCGGTTCC	40S0
CGTTCGCTCT	TTTCCCGTTC	TCCTGTCCTT	CACCCCACCA	CCTCCTTTTC	AGTTGTAGTC	4140
TTGAGGCCAT	CAGGCTTTAA	AATGTTTACT	TTCTACTTTA	TTTTCTCCAT	CTTTCCCTTG	4200
CCCCCTAACA	ATGCGGTTCT	TTAAAAGGCG	C *I?C TT	TTTCTCTTCC	CTGAAGTTCT	4260
TTAGTCGGCC	ACCAGCTAAG	GAGTCAGCCC	CACTCTGTCA	AACTAGAGGT	GCTCCCAGGG	4320
GCAGAGTTAA	ACTGAGGAAT	CTTCGTAGGT		TGCTCCGATT	GGCGTGGAGC	4380
GGCCGAACTG	GTGCACGAGG	GTTAAAAAAA	GTGCTCTCAA	AACTAGCCTC	TGCCGGAAGC	4440
GCCCCCTTTC	CGTGCTGACC	TATCAGCTGG	TTCCCCAAGC	CTTCTCTATT	GTCTCTAACT	4500
ACCCTAAAAA	TGTCAGCATC	GCCGAGACAA	AACCCGGTTT	GGAGACCCCT	CGAGAAACCT	4560
ACCTQGCCCT	CAGTCCTTGA	TGTÁTACTTT	GCTATACCTA	GGTGTTTCAT	TACCCACCGG	4620
CAAAATCCTA	TAACCACGTT	CCCTTTTCAC	TTAACCTGGA	GCGCAGAAAG	GACAACTCCG	4 o 8 0
TTTCTGACTA	TGTTTTAAAA	GGTTTTGTTC	ACGTTATTTT	TCAGCATACA	CTCAAACCTG	4740
CCTTCTTCAC	ATCTCCAGTG	TAGCAGATCA	rprprprpmQřprn	GGGTCTGTTA	TCCTGCTCCT	4300
GCCTTTTCGT	AGGCTTCCTG	CAGTTACTTC	AATGCATTCT	TAAAACTCAG	AGTAGACGAC	4860
AGCCGTATTT	T T**!*^? Τ' Τ'Τ' Τ'Τ'	TTTTTACTGG		AACAGTGTCC	TCAAAACCAG	4920
CTGGCATACA	GTAGCAATAG	GAGTGAAATG	ATTTATTGCA	GAGGAAGGGA	ACAGACAGTG	4930
TAGÁATGATT	TCAGAGTTCT	TAAAAAAAGA	AAAAAAAGAA	AGAAAGAAAG	AAAAGGGGCA	5040
GCAGCATCCA	CTTGATACCT	GAGAGGGTTA	AATACCAGGA	AGAAGAAAAA	GAAAAGTGGG	5100
GGCGGGGTGG	GGGGAACTCT	TCAACATTTG	TGTATTCCAA	ATCCAAGTCA	TAAACTTTTC	5160
ATTGGTTGCT	CATTTCTCTC	CTCCCCTTTC	CATGCCCTAT	ATACTTGCTG	GCTGCCTTTG	5220
CAAAGŤCTCT	GTGTCTTGCC	TAAATAGATA	ATATAGCCTT	CTTGGTAATT	TTCTCTTAAA	5280
GGTTCTAGTT	GCAGGGTGGT	GCTTTTCTTT	TTTAATATTT	ATTTTTAGTT	TGACAAGTCC	5340
TAGCTÁTGTG	ACCTGCCATG	TCTTGTACTT	GATGGTCTCA	GAAGTCAGCC	CATGTATCTA	54 0 0
ACCCCAGTCT	TCCTAGTGAC	CCTTATTTTG	CTGCAGTTTC	TCCTGTTCTT	GTTCAATAGC	5460
AGAACAGATG	CAGAGAATTC	TGGCAAGCAG	GATGATTTTA	TTATTGTAAT	TATGGCACTA	5520
TCCGCAACAG	CTGATAAATA	CACTCCACCC	CTGGTTATCC	CCTTTGGAAG	TAAAGCTT	557 3

2- Informace o sekv ID. C-3

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka; 3303 páru bází

B. Typ; nukleová kyselina

C. Řetězec: jeden

D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA ix) Charakteristiky

A. jméno/klíč: mRNA

B. umístění: 2170.-3303 ix) Charakteristiky

A. jméno/klíč: mRNA

B. umístění: 2214--3303 ix) Charakteristiky

A. jméno/klíč: mRNA

B. umí stěn í: 2219..3303 ix) Charakteristiky

A. jméno/klíč: raisc-RNA

B. umístění: 3301-.3303

C. další informace (známka CDS start, kodon start =1 translace M“ ix) Charakteristiky

A. jméno/klíč: TATA-slgnak

B. umístění: 2170..2176 ix) Charakteristiky

A. jméno/klíč: misc-charakteristika

B. umístění: 1896..1306

C. další informace (známka ”pB-301 -301 až -*-110’’ ix) Charakteristiky

A. jméno/klíč-' misc-charakter istika

B. umístění: 1976..2306

C. další informace (známka pB-221 -221 až +11Ο” ix) Charakteristiky

A. jméno/klíč: mise-charakterištika

B. um í s t ěn í = 2106..2306

- 59 5. umístění·· 2106..2206

C. další inforaacfe (známka ”pB-91 -91

Charakt eris t iky

Λ. jméno/klíc: nisc-charakter is tika 2. umístění: 2127..2206 až + 110' ^c.-w . další i ni oraac.'.· >. znamsa s iiarak tůr i si, i .<y

2. umístění: 2150.. 2206

C. další informace (známka p2-47 Charakter i sti ky s ΓιΤτΠΟ / *£ i 1 i aisc-charakter is ti ka

C. umístění: 2159..2306

C. další informace (známka pB-20 -22 .

a. jntno7k1íc: misc-charakteristisa

C. další informace (známka T6FD-2 po Ící Charakteristiky

Λ. jméno/ki íš: misc-charakteristika

C. li a	Iší infer	mace (známka TGFB-	-3 poloha	·“. »~i , rr .
Mi) Popis	sekvence	ID. č. 2
CAGTAGTAGC	TTCCAGAACT	TGCTTAGCAC	CTGAATCACG	TGTGAGGTTT	GTAAAGAAAC	60
AGAGATGCCA	GGGCCTCAGC	TCTGGAGACT	GATTGGTAGA	GGTGGAGTCC	AAAAAAGTAT	120
AACTTTAATA	ATTTTCCTTC	ctatcttcaa	CTGTCTGCTC	AAAGGCCTTC	CCTTATCACC	180
ctatttgaaa	CTGCAACATC	CCCCAACCTA	GGCACACCCC	ATCCTCCTTC	CCTGCTTGAT	240
TTTCTGCCAC	ACCACATTTG	TTTGTTTGCT	TGTCTGTTTG	AGACACGGTC	TTGCTCTGTC	300
GTCCAGGCTG	GAGTGCAGTG	GTGCAATCTT	GGCCCCCTGT	AAACTCGCCT	CCCTGGCTCA	3 c 0
AGTGATTATC	CTGCTCAGCC	TCCCAAGTAG	ATGCGTGCGC	CAACATGCCG	GGCTAATTTT	420
TCCATTTTTT	TGTAGAGACT	GGGTTTCGCC	GTGTTGCTGG	GGCTGGTCTC	GAATTCCTGA	430

GCTCAAGTAA	TCCTCCTGCA	TGGGCCTCCC	CAAATGCTGG	GATTACAGGC	GTGAGCCACT	540
GCACCTGGCT	CAGCACTTTT	TACCGTACTA	CATCATTTAC	atatttattt	AGTTTATCGC	600
CTCCTCCACT	GCCCCACCCC	TGCCTCTAAA	TAAAATTTCC	CTGAGGGCAG	GAGTTTTGTT	6 60
TCGTTCACTG	ATATTCTTCA	CAGAGCCTAG	AATAGTGCCT	GGTATATAGA	AACATTAAAC	720
TTTTTCTGAA	ATTTCAGAGG	CAGTATAGCA	TAGTAATTAA	GTCCAGAATC	TGGCAACGTC	7S0
CTGGGTGCAA	ATCCCAACAG	CTGACACCTA	ATAACTATGT	GACCTTGGGC	AAGTTACTTT	340
TAAAGTTTCT	ACCCCTAGGT	TTCCCATTGG	TTTTGCAAAT	GAAAGTAATG	CCTACCCAAG	900
CTAGATAGCC	TGTGTAAATA	TCGCCTCCAT	CACTCACAAG	CAGTGTGGTC	TGTAAAAAAA	960
AAAACAAAAA	ACTCTATGCC	TCAGTTTCCT	CATCCGTAAA	AGTGACCCAC	CGCTGTGCTG	1020
GGATACAGAG	AACAGCCCCT	TCAGTTAGTG	GCCTGGAAGC	CAGCCTCTCA	GAAAGGGTCC	1030
AGGAAGGCTG	GAGTGAGATG	GGGTGGAGCG	GCACTCACTC	TCAGGAAAGT	TCAGTTCAGA	114 0
GGCAAGCCCT	GTGTTGCGGG	GTGCGGGGAG	CCACGTGCCC	TACCCTCCCT	TGGCTGCTCG	12 0 0
TGGGAAAAGG	CCTAGAGGTT	CGGGCCGAGA	AGAGGAGCGA	AAGCACAGAG	CCGACTTCCC	1260
CTCACCCATC	TGGGAAATGG	CTCGGGCCAA	ctcctgactt	CGCGCTCGCT	GGCCGACGTC	1320
CTGCGGAGAC	CTCGGCGGGG	AGGGAGGCTG	AACATCTGGA	TGACATTTCT	GCGAGAGAGC	1230
GGCTCCGGAG	CGGCGGTCGG	GGAGGGAGAG	CTGCTCGTGC	GCACGTCGGG	CCGGGAGGGA	1440
GGCGATTCCT	CGGGGCCTGG	GTCTTGTTTT	TCTCGCTCTC	TACCGCAGCC	CCTTCTCCCG	1500
CCCCTCAGCC	CCCACCCCGC	AGCCCCCAGC	CCCCGAGCCT	CCCCGGCTCC	CGACCAGCCG	1560
AGCTCCTTCA	CTGGCGGCCT	CCGCTCGCCA	GAGGGCACCC	TCGATCTTCC	GGAAAACGCC	1620
ACCATTTTTC	ACTGCCCCTG	GAGCGTCTCC	AGGCTTCTGC	CCGCCTCCCG	ACTCCGATCT	16S0
TGTCAATGAA	GAATCGGGCC	AGGATCGCCG	CGGAGCGGAC	GCCGACCCTC	CGACCCGGCT	1740
CGCAGGCTGG	GAGTCCCCTC	TGCGAGGCTG	GCATGGCCGC	CCCTACCGGG	TCCCGCGCCC	1800
TCTGCGGACC	CTCCCCGGGT	TGGGCCTGGC	CGCGGGCGGC	CCCGGGACCG	GGGGACCAGG	1S60
AGGGAGAGTA	GACCGGGCCG	GACGGCGCGG	ACTGACAGCT	GGCGAGAGGG	CGCCGGGGCT	1920

GGGGGAAAGG	GAGGGAGGGG	GCTCATCGGA	GTAACTTTCC	AGAAAAACAC	CAACGTGTGG	1930
CAGGAGTGAT	TCCAAGAGGG	GAAAAAAAGT	TCAGCTACCA	CGTCGAACGA	GAGGACTCGC	2040
AAAGTATTTT	TCAAAAGGGC	TCGGCTTTTC	CTGTGCCTGT	TTAAAACATT	AACATCGTGC	2100
AGCAAAAGAG	GCTGCGTGCG	CTGGTCCCTC	CCTCCCCCAC	CCCAGGCCAG	AGACGTCATG	. 2160
GGAGGGAGGT	ATAAAATTTC	AGCAGAGAGA	AATAGAGAAA	GCAGTGTGTG	TGCATGTGTG	2220
TGTGTGTGAG	AGAGAGAGGG	AGAGGAGCGA	GAGGGAGAGG	GAGAGGGAGA	GAGAGAAAGG	2230
GAGGGAAGCA	GAGAGTCAAG	TCCAAGGGAA	TGACCGAGAG	AGGCAGAGAC	AGGGGAAGAG	2340
GCGTGCGAGA	GAAGGAATAA	CAGCAGCTTT	CCGGAGCAGG	CGTGCCGTGA	ACTGGCTTCT	2400
attttatttt	ATTTTTTTCT	CCTTTTTATT	TTTTAAAGAG	AAGCAGGGGA	CAGAAGCAAT	2460
GC-CCGAGGCA	GAAGACAAGC	CGAGGTGCTG	GTGACCCTGG	GCGTCTGAGT	GGATGATTGG	2520
GGCTGCTGCG	CTCAGAGGCC	TGCCTCCCTG	CCTTCCAATG	CATATAACCC	CACACCCCAG	2530
CCAATGAAGA	CGAGAGGCAG	CTGAAAAAGT	CATTTAGAAA	GCCCCCGAGG	AAGTGTAAAC	2640
AAAAGAGAAA	GCATGAATGG	AGTGCCTGAG	AGACAAGTGT	GTCCTGTACT	GCCCCACCTT	2700
TAGCTGGGCC	AGCAACTGCC	CGGCCCGCTT	CTCCCCACCT	ACTCACTGGT	GATCTTTTTT	2760
TTTTTACTTT	TTTTTCCCTT	TTCTTTTCCA	'Τ' q	TTATTTTCTT	TCAAGGCAAG	2320
GCAAGGATTT	TGATTTTGGG	ACCCAGCCAT	GG C	cttcttcttt	AAAATACCCA	2330
CTTTCTCCCC	ATCGCCAAGC	GGCGTTTGGC	AATATCAGAT	ATCCACTCTA	TTTATTTTTA	2940
CCTAAGGAAA	AACTCCAGCT	CCCTTCCCAČ	TCCCAGCTGC	CTTGCCACCC	CTCCCAGCCC	3000
TCTGCTTGCC	CTCCACCTGG	CCTGCTGGGA	GTCAGAGCCC	AGCAAAACCT	GTTTAGACAC	3060
ATGGACAAGA	ATCCCAGCGC	TACAAGGCAC	ACAGTCCGCT	TCTTCGTCCT	CAGGGTTGCC	3120
AGCGCTTCCT	GGAAGTCCTG	AAGCTCTCGC	AGTGCAGTGA	GTTCATGCAC	CTTCTTGCCA	3180
AGCCTCAGTC	TTTGGGATCT	GGGGAGGCCG	CCTGGTTTTC	CTCCCTCCTT	CTGCACGTCT	3240
GCTGGGGTCT	CTTCCTCTCC	AGGCCTTGCC	GTCCCCCTGG	CCTCTCTTCC	CAGCTCACAC	3300

ATG

3303

Informace o sekv ID. C.4 i ) C i i a r a k f e r i s t i ky s ekv e n c e Λ. Délka⁷ 42 párů bází B . Typ⁷ nuk 1 eová kyše 1 iria

C. Re bazar.·⁷ jeden

D. Topologie: lineární i i) Typ molekuly: cDMA xi) Popis sekvence ID. č. 4

GCGCCATATG AGTCTTAACT GCCAAAAATT CTTATCATCA AT

2. Informace o sekv ID. C.5

i) Charakteristiky sekvence A. Délka⁷ 44 párů bází

3. Ty p⁷ n uk1eová ky seli na

C. Řetězec⁷ jeden

D. Topologie⁷ lineární i i) Typ molekuly⁷ cDNA xi) Popis sekvence ID. č. 5

AAGCAAGCTT TCGCAGCCTC TGCCAGGCAG TGTCCCGACC CGGA

2. Informace o sekv ID. C.6

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka⁷ 17 párů bází

B. Typ⁷ nukleová kyselina

C. Řetězec⁷ jeden

D. Topologie⁷ lineární i i) Typ molekuly⁷ cDNA xi) Popis sekvence ID. č. G

AGCTTCGCGA CTCGAGA

CG

2. Informace o sekv ID. Č.7 i ) Charakter i st; i ky sekvence

A. Délka^: 17 párů bází

B. Typ; nukleová kyselina

C. Řetezec^: jeden

D. Topo1 og i e^: li n eá rn í ii> Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence ID. c. 7

GATCTCTCCA GTCGCGA

2. Informace o sekv ID. C. .G ij Charakteristiky sekvence

A. Délka: 35 párů bází

B. Typ: nukleová kyselina

C. Řetězec: jeden

D. Τορο1og i e^: 1 i neárn í ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence ID. ě- G

TCGAGAAAAG TCAGGTCACA GTGACCTGAT CAAAC

2. Informace o sekv ID. C.9

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka·' 35 párů bází

B. Typ: nukleová kyselina

C. Řetězec: jeden

D. Τορο1og i e^: li neárn í ii) Typ molekuly: cDNA .

xi) Popis sekvence ID. ě. 9

TCGAGTTTGA TCAGGTCACT GTGACCTGAC TTTTC

JUD,7 gin ad v o k á í

OTO

Claims (11)

1- Prvek citlivý rm raloxifen obsahu jící sekvenci nukleové kyseliny odpovídá jící. nukleotidům

2.231 až 2.2.71 podle obr. á a. sekvenci Seq 10 č.:3 nebo její komplementářní sekvenci2. ' Rekombinantní expresní obrazec obsahu jící sekvenci nukle-ový kyseliny podle nároku 1, operativně spojený s reportérovým genem jiným, než je gen kódující chlora.mfenlkolacetyltransferasu

3- Rekombinantní expresní obrazec podle nároku 2, vybraný ze souboru, zahrnujícího TGFfr-3O1 L.UC , TGF|?>-.36|JJC a TGF(i-7 5|..UC .

4. Eukaryotická buňka transfektovaná rekombinantriím expresním obrazcem podle nároku 2 nebo nároku 3.

5. Způsob vytridování in vítr o sloučenin s možným působením jako antiosteoporozní činidlo z množiny sloučenin, při kterém se z množiny sloučenin identifikuje sloučenina, jež je schopna indukovat transkripci z prvku citlivého na raloxifen promotoru savou, jenž není nespecifickým ir anskr ipcním iriduk torem, není schopna indukovat transkripci, z prvku citlivého na estrogen promotoru savoj a jenž je antiestroSenní nebo neestrogenní sloučeninou, v y z n a. č u j í c i. s e t í m , že (a) se zkouší sloučeniny z hlediska schopnosti indukovat transkripci z prvku citlivého na raloxifen Promotoru savců, (b) zkouší se sloučeniny z hlediska neschopnosti indukovat transkripci z promotoru savců nemajícího prvek citlivý na. ralo< i. s.-n , (c) zkouší se sloučeniny z hlediska neschopnosti indukovat transkripci z promotoru citlivého na estrogen a (d) zkouši, se sloučeniny z hlediska schopnosti, zabraňovat estrogenové indukci transkripce z: Promotoru citlivého na estrogen v pr í LomnOst i. estrog· ·ηυ

6. Sloučenina, která

a) přesvědčivě indukuje transkripci z prvku citlivého na raloxifen ,

b) neindukuje transkripci ze savčího promotoru nemajícího prvek citlivý na raloxifen.

« c) neindukuje transkripci z promotoru citlivého na eštrogen a

d) inhibuje estrogenem navozenou transkripci z promotoru citlivého / na eštrogen v přítomnosti estrogenu, za podmínky, že sloučenina je jiná než sloučenina daného obecného vzorce I kde znamená η O, 1 nebo 2,

R a R¹ na* sobě nezávisle atom vodíku, hydroxylovou skupinu, alkoxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, acyloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyacy loxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxypodílu a s 2 až 6 atomy uhlíku v acyloxypodílu. skupinou symbolu R³ substituovanou aryloxyskupinu, skupinou symbolu R³ substituovanou aroyloxyskupinu, skupinou symbolu R⁴ substituovanou karbonyloxyskupinu, atom chloru nebo atom bromu.

R² heterocyk1ickou skupinu ze souboru zahrnujícího pyrrolidinoskpinu, piperidinoskupinu a hexamethyleniminoskupinu,

R³ alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, atom vodíku nebo atom halogenu a

R⁴ aloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo aryloxyskupinu , a její farmaceuticky vhodná sůl.

- 66

7.

Způsob zkoušení schopnosti sloučeniny indukovat transkripci z prvku citlivého na raloxifen .vyznačující se tím, že

a) se transfektuje eukaryotická buňka, vykazující expresi estragenového reeeptorového proteinu s rekombinantním expresním obrazcem podle nároku 2, přičemž prvek, citlivý na raloxifen, je operativně vázán na reporterový gen,

b) transfektovaná eukaryotická buňka se zpracovává sloučeninou a c> měří se rozdíl mezi zpracovanými a nezpracovanými buňkami pro expresi reporterového genu.

8. Farmaceutický prostředek pro indukování tvorby kostní hmoty u savců, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou látku sloučeninu podle nároku 6, která po vázání na estrogenový receptář,indukuje potentně transkripci z prvku citlivého na raloxifen promotorové oblasti genu TGF0-3, za předpokladu, že sloučenina je jiná než sloučenina obecného vzorce I kde znamená η 0, 1 nebo 2,

R a R¹ na sobě nezávisle atom vodíku, hydroxylovou skupinu, alkoxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, acyloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyacyloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxypodílu a s 2 až 6 atomy uhlíku v acyloxypodí 1 u , skupinou symbolu R³ substituovanou aryloxyskupinu, skupinou symbolu R³ substituovanou aroyloxyskupinu, skupinou symbolu R'⁴ substituovanou karbony loxyskupinu, atom chloru nebo a Lom bromu,

R·² heterocyk 1 ickou skupinu ze souboru zahrnujícího pyrrolidi- 67 noskpinu. piperidinoskupinu a hexamethyleniminoskupinu,

R³ alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, atom vodíku nebo atom halogenu a R⁴ aloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo aryloxyskupinu , a její farmaceuticky vhodná sůl.

-t

9. Farmaceutický prostředek pro ošetřování osteoporozy, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou látku sloučeninu podle nároku 6, která po vázání na estrogenový receptor, indukuje potentně transkripci z prvku citlivého na raloxifen promotorové oblasti genu TGFíi-3, za předpokladu, že sloučenina je jiná než sloučenina obecného vzorce I kde znamená η O, 1 nebo 2,

R a R¹ na sobě nezávisle atom vodíku, hydroxylovou skupinu, alkoxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, acyloxyskupinu s 1 až 6 _? atomy uhlíku, alkoxyacyloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxypodílu a s 2 až 6 atomy uhlíku v acyloxypodílu, skupinou symbolu R³ substituovanou aryloxyskupinu, skupinou symbolu R³ substituovanou aroyloxyskupinu, skupinou symbolu R⁴ substituovanou karbonyloxyskupinu, atom chloru nebo atom bromu,

R² heterocyk1ickou skupinu ze souboru zahrnujícího pyrrolidinoskpinu. piperidinoskupinu a hexamethyleniminoskupinu,

R³ alkylovou skupinu s i až 3 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, atom vodíku nebo atom halogenu a

R⁴ aloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo ary loxyskupinu , a její farmaceuticky vhodná sůl.

10. Farmaceutický prostředek pro ošetřování zlomenin kostí, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje sloučeninu podle nároku 6, která po vázání na estrogenový receptor. indukuje potentně transkripci z prvku citlivého na raloxifen promotorové oblasti genu T6F{i-3, za předpokladu, že slou- kde znamená čí)

0, 1 nebo 2,

R a R¹ na sobě nezávisle atom vodíku, hydroxylovou skupinu, alkoxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, acyloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyacyloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxypodílu a s 2 až 6 atomy uhlíku v acyloxypodílu, skupinou symbolu R³ substituovanou aryloxyskupinu. skupinou symbolu R³ substituovanou aroyloxyskupinu, skupinou symbolu R⁴ substituovanou karbonyloxyskupinu. atom chloru nebo atom bromu,

R² heterocyklickou skupinu ze souboru zahrnujícího pyrrolidinoskpinu. piperidinoskupinu a hexamethyleniminoskupinu,

R³ alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, atom vodíku nebo atom halogenu a

R⁴ aloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo aryloxyskupinu, a její farmaceuticky vhodná sůl.

11. Farmaceutický prostředek pro navozování vytváření kostí, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou

t. í m látku sloučeninu podle nároku 6, která (a) potentně indukuje transkripci z prvku citlivého na raloxifen promotorové oblasti TGF0-3 genu, <b) neindukuje transkripci z promotoru savců nemajícího prvek citlivý na raloxifen, <.c> neindukuje transkripci z promotoru citlivého na estrogen a Cd) inhibuje estrogenem indukovanou transkripce z promotoru citlivého na estrogen v přítomnosti estrogenu za předpokladu, že sloučenina je jiná než sloučenina obecného vzorce I kde znamená η 0, 1 nebo 2,

R a R¹ na sobě nezávisle atom vodíku, hydroxylovou skupinu, alkoxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, acyloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyacyloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxypodílu a s 2 až 6 atomy uhlíku v acyloxypodílu, skupinou symbolu R³ substituovanou aryloxyskupinu, skupinou symbolu R³ substituovanou aroyloxyskupinu. skupinou symbolu R⁴ substi tuovanou karbony loxyskupinu. atom chloru nebo atom bromu,

R² heterocyk1ickou skupinu ze souboru zahrnujícího pyrrolidinoskpinu. piperidinoskupinu a hexamethyleniminoskupinu,

R³ alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, atom vodíku nebo atom halogenu a

R^ aloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo aryloxyskupinu , a její farmaceuticky vhodná sůl.

10. Použití sloučeniny podle nároku 6, která po vázání na estrogenový receptor, indukuje potentně transkripci z prvku citlivého na raloxifen promotorové oblasti genu TGF()-3, za předpokladu, že sloučenina je jiná než sloučenina obecného vzorce I kde znamená n 0. 1 nebo 2,

R a R¹ na sobě nezávisle atom vodíku, hydroxylovou skupinu, alkoxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, acyloxyskupinu s 1 až G atomy uhlíku, alkoxyacyloxyskupinu s 1 až G atomy uhlíku v alkoxypodílu a s 2 až 6 atomy uhlíku v acy1oxypodílu , skupinou symbolu R³ substituovanou aryloxyskupinu, skupinou symbolu R³ substituovanou aroyloxyskupinu. skupinou symbolu R⁴ substituovanou karbonyloxyskupinu, atom chloru nebo atom bromu,

R² heterocyklickou skupinu ze souboru zahrnujícího pyrrolidinoskpinu, piperidinoskupinu a hexamethyleniminoskupinu.

R³ alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, atom vodíku nebo atom halogenu a

R-⁴ aloxyskupinu s 1 až G atomy uhlíku nebo ary loxyskupi nu , a její farmaceuticky vhodné soli pro přípravu farmaceutického prostředku vhodného pro ošetřování osteoporosy.