CZ120298A3

CZ120298A3 - Použití proteinu získaného z chemokinu savců

Info

Publication number: CZ120298A3
Application number: CZ981202A
Authority: CZ
Inventors: Louis Martin Pelus; Andrew Garrison King
Original assignee: Smithkline Beecham Corporation
Priority date: 1995-10-24
Filing date: 1996-10-24
Publication date: 1998-09-16
Also published as: BR9611173A; PL326364A1; KR19990066997A; TR199800742T2; MX9803217A; HUP9802531A2; AU712235B2; JPH11512747A; ZA968896B; NZ321789A; NO981818D0; EP0866806A4; AR004093A1; NO981818L; AU7520996A; WO1997015595A1; EP0866806A1; HUP9802531A3

Description

Použití proteinu odvozeného z chemokinu savce

Oblast techniky

Tento vynález se obecně týká způsobů mobilizace krvetvorných kmenových buněk.

*

Dosavadní stav techniky

Všichni členové interkrinové neboli chemokinové skupiny jsou bazické polypeptidy vázající heparin mající čtyři cysteinové zbytky,, které tvoří dva disulfidové můstky. Všechny tyto proteiny, které byly funkčně charakterizovány, se zdají být zahrnuty do prozánétlivých a/nebo obnovujících funkcí.

f

V klinických situacích je při použiti chemoterapie o vysokých dávkách biomolekulou volby G-CSF. Obecně se při takové léčbě u pacientů zahajuje podáním nízké dávky chemoterapeutického prostředku, jako je cyklofosfamid. Během remise se pacient léčí pomoci některého CSF (faktor stimulující tvorbu kolonií), jako je G-CSF, který způsobuje připadnou mobilizaci buněk z kostní dřeně do periferní cirkulace pro získání leukoforezované krve. Pacientovi se potom podá vysoká dávka chemoterapie pro vyvolání klinické remise jejich karcinomu. Výsledné selhání funkce kostní dřeně se léčí infuzí dříve, odebraných a uložených krvinek. Tento postup se . může modifikovat, například vynecháním zahajovací dávky chemoterapie a/nebo léčebnými programy se'střídavými odběry krve.

I když vypadají tato použití transplantačních techniky krvetvorných kmenových buněk slibně, požadují se několikanásobné postupy aferézy pro obdržení dostatečného množství kmenových'buněk“¹ projejiclfúspěšné naroubovaní pro**¹léčbu závažného útlumu kostní dřené při použití samotného G-CSF [viz například Bensinger a kol., Blood, 81, 3158 (1993) a R. Haas a kol., Sem. in Oncology, 21, 19 (1994)]. Proto přes tyto významné pokroky a dostupnost určitých regulačních biomolekul zůstává opožděná obnova krvetvorby závažnou příčinou morbidity a mortality pacientů s útlumem kostní dřeně.

V oboru je neustálá potřeba prostředků a způsobů pro zlepšeni obnovy krvetvorby, zejména v případech chemoterapie spojené s útlumem kostní dřené.

Podstata vynálezu

Tento vynález ve svém jednom aspektu poskytuje použití některého chemokinu při přípravě léku pro stimulaci krvetvorných kmenových buněk. Tento chemokin zahrnuje proteiny odvozené od KC (killer cells - zabíječské buňky), grofi, groa a groi včetně zralých, modifikovaných a multimerních forem těchto chemokinů.

Ve svém dalším aspektru tento vynález poskytuje způsob mobilizace krvetvorných kmenových buněk u živočicha, zahrnující podáváni tomuto živočichovi účinného množství některého zralého nebo modifikovaného či multimerniho chemokinu, jak se zde popisuje.

Další aspekty a výhody tohoto vynálezu se popisují dále v následujícím podrobném popisu preferovaných ztělesnění tohoto vynálezu.

A A

Popis obrázků na výkresech

Obr. 1 je graf ukazující účinek ρτοβ [aminokyselin 1 až 73. se SEQ ID č. (dále identifikační číslo sekvence) 3] při testu mobilizace s jedním prostředkem z příkladu 1.

ώf . ' Obr. 2 je graf ukazující účinek modifikovaného ςττοβ (aminokyseliny 5 až 73 identifikačního čísla sekvence 3) při testu mobilizace jedním prostředkem z příkladu 1.

Obr. 3 je sloupcový graf ukazující srovnání fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem (PBS), interleukinu 8 (IL-8), grofi (aminokyseliny 1 až 73 identifikačního čísla sekvence 3) a modifikovaného gro$ (aminokyseliny 5 až 73 identifikačního čísla sekvence 3) při těstu mobilizace jedni τη prostředkem.

Následuje podrobný popis tohoto vynálezu.

Tento vynález poskytuje modifikované proteiny, zejména chemokiny spojené se zánětlivými odpověďmi, krvetvorbou a tvorbou kostní dřeně, přičemž tyto modifikované proteiny jsou charakterizované zvýšenou biologickou aktivitou ve srovnání s odpovídajícími nemodifikovanými nebo neodřižnutými zralými proteiny. Tento vynález poskytuje způsoby pro léčbu útlumu kostní dřeně mobilizací krvetvorných kmenových buněk z kostní dřeně do periferní krve s použitím zralých nebo modifikovaných či multimerních chemokinů, které se zde popisují.

I. Definice

Krvetvorný synergní faktor neboli HSF se podle této definice vztahuje k třídě proteinů zahrnující přirozené še* vyskytuj ici^1- chemokinyamodifikováné*chemokiny, které”jsou charakterizované tím, že mají synergní aktivitu při stimulaci krvetvorby při podání in vivo a in vitro s jiným krvetvorným faktorem, jako je faktor stimulující tvorbu kolonií (CSF) nebo v kombinaci s přirozeně cirkulujícími faktory CSF.

Termín zralé chemokiny, též známý jako interkriny, se zde používá pro definici proteinů, které se v oboru konvenčně uvádějí jako KC, groa, grop a groT. Sekvence aminokyselin myšího proteinového KC, který obsahuje 72 zbytků, se vhodným způsobem udává pod identifikačním číslem sekvence 1. Tyto sekvence lze obdržet od instituce Genbank pod přírůstkovým číslem J04596. Sekvence humánního proteinového groa (aminokyseliny 1-73) se uvádějí pod identifikačním číslem.sekvence 2. Sekvence humánního proteinového grop (aminokyseliny 1-73) se uvádějí pod identifikačním číslem sekvence 3. Sekvence humánního proteinového gro-r se uvádějí pod identifikačním číslem sekvence 4. Sekvence cDNA a aminokyselin pro groi se též udávají v mezinárodní patentové přihlášce, publikace č. WO 92/00326 (9. ledna 1992). Tyto sekvence groT jsou dále zveřejněné v Mezinárodní patentové přihlášce, publikace č.WO 94/29341 (22. prosince 1994), která se zde uvádí formou odkazu.

Termín modifikované chemokiny se definuje stejně jako ve výše citované mezinárodní přihlášce. Modifikované chemokiny se odvozují od KC, grop, groa a groT, přednostně od grop, gro a a gřoi a nej výhodně ji od grop. Modifikované chemokiny zahrnují deamino-proteiny charakterizované eliminací od zhruba 2 do zhruba 8 aminokyselin od aminového (N—) konce řetězce zralého proteinu. Tyto deamino-chemokiny

použitelné při způsobu podle tohoto vynálezu jsou výhodně charakterizovány odstraněním od zhruba 2 do zhruba 8 'áminókysél in“ z * ámxňověříó*kónčě“ ře‘tězčě^wzřáléhó'’ proteinu / *-'“'··¹Nejvhodnější modifikované chemokiny jsou charakterizovány odstraněním prvních čtyř aminokyselin od tohoto aminového konce řetězce. Případně mohou deamino-chemokiny použitelné v rámci tohoto vynálezu obsahovat vložený N-terminální , methionin, zejména v případě rekombinantní exprese.

N-terminální methionin, který se vkládá do proteinu za účelem exprese, může být štěpen bud během zpracování proteinu hostitelskou buňkou nebo synteticky s použitím známých způsobů. Alternativně může být v případě požadavku tato aminokyselina štěpena enzymatickou reakcí nebo jinými známými prostředky.

Pod pojem modifikovaný chemokin se zahrnují též analogy či deriváty těchto proteinů, které sdílejí biologickou aktivitu zralého proteinu. Takové analogy a deriváty, jak se zde definuji, zahrnují modifikované proteiny, které jsou též charakterizovány změnami známé sekvence aminokyselin v proteinech, například v proteinech uvedených pod identifikační-* mi čísly sekvence 1 až 4. Tyto analogy jsou Charakteristické tím, že mají sekvenci aminokyselin, která se liší od sekvence ve zralém proteinu o 8 nebo méně aminokyselinových zbytků, přednostně o zhruba 5 nebo méně zbytků. Může se dávat přednost tomu, aby jakékoliv rozdíly v sekvencích aminokyselin proteinů zahrnovaly pouze konzervativní substituce aminokyselin. Konzervativní substituce aminokyselin nastávají tehdy, když má některá aminokyselina v podstatě stejný náboj jako aminokyselina, kterou nahrazuje, a daná substituce nemá žádný významný vliv na místní konformaci proteinu nebo na jeho biologickou aktivitu. Alternativně se mohou preferovat změny, jako je uvedení určité aminokyseliny

•· •· «· *

do sekvence, která může pozměnit stabilitu proteinu nebo umožnit jeho expresi v žádané hostitelské buňce. Další charakteristikou Vécrito' modiíikovaných'¹ proteinů může být zvýšená biologická účinnost ve srovnání se zralým proteinem.

Pojem multimerní protein neboli multimer zde znamená multimerní formy zralých a/nebo modifikovaných proteinů použitelných v tomto vynálezu, například dimery, trimery, tetramery a ostatní agregované formy. Takové multimerní formy se mohou připravit syntézou nebo rekombinantní expresí a mohou obsahovat chemokiny získávané kombinací syntetických a rekombinantních způsobů, jak se popisuje podrobněji níže. Multimery se mohou vytvářet přirozené při expresi nebo se mohou tvořit do těchto násobných forem. Multimerní chemokiny mohou zahrnovat multimery stejného modifikovaného chemokinu. Jiný multimer se může vytvářet, agregací různých modifikovaných proteinů. Ještě jiný multimer se vytváří agregací modifikovaného chemokinu podle tohoto vynálezu a známého zralého chemokinu. Přednostně by měl dimer nebo multimer použitelný v tomto vynálezu obsahovat nejméně jeden deamino-chemokinový protein a nejméně jeden další chemokin nebo další protein charakterizovaný tím, že vykazuje stejný typ biologické aktivity. Tento další protein může být přídavným deamino-chemokinem nebo jiným známým proteinem.

II. Proteiny použitelné v tomto vynálezu

Obecně zahrnují chemokiny použitelné při způsobu podle tohoto vynálezů zralé chemokiny nebo modifikované a multimerní proteiny odvozené od těchto chemokinů, které se podrobně popisují v mezinárodní patentové přihlášce, publikace č. WO 94/29341.. Je žádoucí volba těchto chemokinů

ze skupiny KC, groa, grofi a groi a nej vhodnějším chemokinem je grop.

·ιιιιίιιΐι>.ιιι*ιιιιΐ!!·ιιΐι·ΐΜΐ·Ίιιιι I<* mu, n*1 >'i*n ι·ι ·|ΐιιί ***.. , - - — -A— **' ·ι- r

V jednom preferovaném ztělesnění využívá způsob podle tohoto vynálezu deamino-chemokinový protein podle tohoto vynálezu. Tento protein obsahuje sekvenci aminokyselin zralého chemokinu použitelného při tomto vynálezu odříznutou u svého konce řetězce nesoucího aminoskupinu mezi polohami aminokyselin 2 a 8 v sekvencích uvedených pod identifikačním číslem 1 až 4. Přednostně má deamino-protein podle tohoto vynálezu aminokyseliny rozmezí proteinové sekvence 5 až 73 v rámci identifikačních čísel sekvence 2 až 4 nebo aminokyseliny 5 až 72 v rámci identifikačního čísla sekvence 1. Nejvhodnějšim způsobem podle, vynálezu je deamino-grc^, který má aminokyseliny rozmezí sekvence aminokyselin proteinu 5 až 73 podle identifikačního čísla sekvence 3. Tento deamino-grrop je charakteristický tím, že má nejméně o zhruba dva řády vyšší 'biologickou účinnost než nemodifikovaný lidský grofi, jak bylo stanoveno v testu HSF v pracích citovaných výše.

Jak se popisuje ve W094/29341, lze. podobným způsobem modifikovat proteiny KC, grroa a groi, které jsou použitelné při způsobech podle tohoto vynálezu. Tyto proteiny se všechny popisují v literatuře a jsou známé tomu, kdo má zkušenost v oboru.

Preferované multimemí proteiny použitelné v tomto vynálezu zahrnuji dimery nebo multimery obsahující nejméně jeden deamino-chemokinový protein a nejméně jeden další chemokin nebo jiný protein charakterizovaný stejným typem biologické aktivity. Tento další protein může být dalším deamino-chemokinem nebo jiným známým proteinem. Například • ·

žádaný dimer použitelný v těchto způsobech podle tohoto vynálezu zahrnuje dva deamino-proteiny, jak se popisuje výše, přednostně navzájem spojené disulfidovými vazbami/žádaný ' multimer může být též agregátem dvou nebo více deamino-grop proteinů, zejména dvou proteinů skládajících se z aminokyselin 5-73 identifikačního čísla sekvence 3. Alternativně může být další dimer podle tohoto vynálezu deamino-grop protein podle tohoto vynálezu v kombinaci se zralým grofi proteinem. Podobně mohou různé kombinace dimerů nebo jiných multimerních forem zahrnovat kombinaci zralého nebo modifikovaného grop a jiných chemokinů, jako jsou proteiny KC, groa. a groi. Například deamino-grop protein podle tohoto vynálezu může vytvářet dimer s nemodifikovaným zralým proteinem groa. Ten, kdo má zkušenost v oboru, může obdržet další žádané multimery s použitím modifikovaných chemokinů podle tohoto vynálezu. Avšak použití multimerních forem dvou či více různých modifikovaných proteinů, jak se zde definují, je použitelné při způsobu podle tohoto vynálezu. Chemokin použitý v tomto způsobu může být též multimerní formou některého modifikovaného chemokinů, jak se diskutuje výše a dalšího známého zralého proteinu.

Tyto proteiny a monomery se podrobné popisují v literatuře a'mohou se syntetizovat nebo vytvářet rekombinantně s použitím konvenčních způsobů a/nebo způsobů popsaných v mezinárodním patentu, publikace č. WO 94/29341.

III. Farmaceutické prostředky

Je žádoucí, aby chemokiny použitelné při způsobu podle tohoto vynálezu byly užity při přípravě léků a/nebo aby byly použitelné ve formě farmaceutického prostředku. Chemokiny mohou být proto formulovány do farmaceutických prostředků « 4 • 4 4 · · · φφ φ ♦· 4 44 a podávány stejným způsobem, který se popisuje například v mezinárodních patentových přihláškách, publikace č. WO 9Ó/Ó2762^W(2'2?“Í3řezna7*í99ŮJ^^publík^cZc? WO 94/29341 ’(22 prosince 1994).

Tyto léky nebo farmaceutické prostředky použitelné při mobilizaci krvetvorných kmenových buněk obsahují terapeuticky účinné množství zralého, modifikovaného nebo multi^ merního chemokinu, jak se zde definuje, a přijatelný farmaceutický nosič. Pojem farmaceutický, jak se zde používá, zahrnuje veterinární aplikace podle tohoto vynálezu.

Pojem terapeuticky účinné'množství” se týká takového množství chemokinu, ať v monomerní či multimerní formě, které je použitelné, pro mobilizaci kmenových buněk v dostatečné míře pro dosaženi požadovaného fyziologického účinku.

Obecné se zralý chemokin, modifikovaný chemokin nebo deamino-chemokin použitelný v tomto vynálezu (například i

grrop) podává v množství od zhruba 0,01 ňg/kg tělesné hmotnosti do zhruba 1 g/kg tělesné hmotnosti, přednostně od zhruba 0,01 ng/kg tělesné hmotnosti do 10 mg/kg tělesné hmotnosti na dávku. Je žádoucí, aby při .použití multimerniho chemokinu při způsobu podle tohoto vynálezu lék nebo prostředek obsahoval množství multimerniho proteinu blízké spodní hranici tohoto rozmezí. Přednostně se tyto farmaceutické prostředky podávají člověku nebo jinému savci injekčně.

Avšak podávání se může provést jakoukoliv vhodnou vnitřní cestou a může se opakovat podle potřeby, například jednou až třikrát denně po dobu od jednoho dné až do zhruba jednoho týdne.

vhodné farmaceutické nosiče jsou dobře známy tomu, « φ · φ φ · φ * ·♦· ♦ · φ φ · φφφ φφφ φφφ φφφ φφφφ

- 10 kdo má zkušenost v oboru, a jejich volba je snadná. V současné době je preferovaným nosičem fyziologický roztok. Pří’padně*mohou*f ármacéúťické*présťřědky^Lpodlé* tohoto“ vynálezu obsahovat též další účinné složky nebo se mohou podávat spolu s jinými terapeutickými prostředky. Vhodné případné složky nebo další terapeutické prostředky zahrnují ty látky, které jsou běžné pro léčbu stavů této.povahy, například mezi jinými ostatní protizánětlivé, diuretické a imunosupresivní prostředky. Je žádoucí, aby se tyto chemokiny zvláště dobře hodily pro podávání ve spojení s faktorem stimulujícím tvorbu kolonii.

IV. Způsoby mobilizace krvetvorných kmenových buněk

Tento vynález poskytuje zlepšené způsoby léčby stavů charakterizovaných imunosupresí nebo nízkými počty krvetvorných kmenových buněk .a buněk od nich diferencovaných včetně, avšak bez omezení na tyto případy, zánětu, horečky, virové, mykotické a bakteriální infekce, rakoviny, myelopoetické dysfunkce, poruch krvetvorby, aplastické anémie a autoimunitních onemocněni a stavů charakterizovaných nízkou tvorbou a/nebo diferenciaci krvetvorných buněk a/nebo buněk kostní dřeně. Tento způsob zahrnuje podávání farmaceutického prostředku podle tohoto vynálezu zvolenému savci. Přednostně se tento prostředek podává spolu s faktorem stimulujícím tvorbu kolonii anebo obsahuje tento faktor. Vhodné zdroje faktoru stimulujícího tvorbu kolonií jsou dobře známy a zahrnuji například přírodní, syntetické a rekombinantní GM-CSF, M-CSF, G-CSF a IL-3. V dalším preferovaném ztělesnění je možno podávat in vivo některý deamino-chemokin použitelný při tomto vynálezu a umožnit jeho působení synergním způsobem s faktory stimulujícími tvorbu kolonii přítomnými v těle vybraného pacienta.

v jednom preferovaném ztělesnění využívá způsob podle tohoto vynálezu deamino-chemokiny, které se zde popisuji, 7 spolu, s GM-CSF (nebo G-CSF). Použití některého modifikovaného chemokinu, jako je deamino-grop, v souladu se způsobem podle tohoto vynálezu v kombinaci s CSF (bylo pozorováno, že tato kombinace vykazuje synergrii účinek) umožňuje podávání nižších dávek CSF pacientovi, čímž snižuje mimořádně nepříznivé vedlejší účinky způsobené GM-CSF (G-CSF).

Zralé chemokiny a modifikované či multimerní chemoki- ny použitelné ve způsobu podle tohoto vynálezu lze charakterizovat schopností mobilizovat krvetvorné kmenové buňky při jejich samotném podávání nebo tím, že vykazují synergní aktivitu při stimulaci krvetvorby při použití in vivo a in vitro s jiným krvetvorným faktorem, jako je faktor stimulující tvorbu kolonií nebo růstový faktor nebo v kombinaci s přirozeně cirkulujícími, faktory stimulujícími tvorbu kolonii nebo při podáváni v léčebném programu v rámci chemoterapie.

Ve svém jednom ztělesnění tento vynález poskytuje způsob mobilizace krvetvorných kmenových buněk u živočicha podáváním tomuto živočichovi účinného množství prostředku nebo léku obsahujícího některý zralý chemokin zvolený ze skupiny zahrnující lidský grop (identifikační číslo sekvence 3), lidský groa (identifikační číslo sekvence 2), lidský groT (identifikační číslo sekvence 4) a myší KC (identifikační číslo sekvence 1).

v dalším ztělesnění tohoto vynálezu zahrnuje jeden způsob mobilizace krvetvorných kmenových buněk u živočicha podáváni tomuto živočichovi účinného množství modifikovaného

• v • ·	t	• ·	99
• *	•	• ··· ·	•
• ·	•	• ·	•
	•	99	1«

• ♦ · • · ♦ ♦ • ♦ · ·· ·

- 12 proteinu odvozeného od některého chemokinu zvoleného ze skupiny ςττοβ, groa, groi a KC. Jako preferované ztělesnění se zde poskytuje způsob mobilizace krvetvorných kmenových buněk u živočicha podáváním tomuto živočichovi účinného množství modifikovaného proteinu odvozeného od chemokinu lidského grog (identifikační číslo sekvence 3).

Ještě v dalším aspektu tento vynález poskytuje způsob mobilizace krvetvorných kmenových buněk u živočicha zahrnující podávání tomuto živočichovi účinného množství některého multimerního proteinu, který zahrnuje nejméně jeden z chemokinů popsaných výše ve spojení s některým druhým chemokinem.

V praxi způsobu mobilizace krvetvorných kmenových buněk lze pojem účinné množství těchto proteinů definovat jako takové množství,· které při podání pacientovi vhodnými způsoby mobilizuje.krvetvorné kmenové buňky a zvyšuje počet krvetvorných kmenových buněk v periferní krvi. Očekává se, že toto množství je vyšší než množství požadované pro stimulaci růstu nebo vývoje krvetvorných progenitorových buněk. Toto účinné množství zvyšuje počet buněk v krevním obéhu, které jsou diferenciované od krvetvorných kmenových buněk v použitelných klinických či veterinárních situacích. Žádané účinné množství může být zhruba od 0,01 ng/kg do 10 mg/kg tělesné hmotnosti na dávku.

Vhodné způsoby podávání pro mobilizaci kmenových buněk zahrnuji, avšak bez omezení pouze na tyto způsoby, injekci bolusu nebo přírůstkové podávání účinného množství injekce, intravenózní kapací infúzi nebo další vhodnou vnitřní cestu podávání. Dávkování se může podle potřeby opakovat, například jednou až třikrát denně po dobu od jednoho • · · » * · * « ···· · • · · ·· · · · • ♦ · * · »

- 13 dne do zhruba jednoho týdne.

Navíc se může způsob podle tohoto vynálezu používající zralé chemokiny nebo modifikované či multimerni chemokiny definované výše použít v léčebných schématech transplantace krvetvorných kmenových buněk periferní krve. Například po případně použité zahajovací dávce chemoterapeutického prostředku se výše identifikované zralé chemokiny nebo modifikované či multimerni chemokiny podávají místo faktorů stimulujících tvorbu kolonií, které se nyní používají pro mobilizaci krvetvorných kmenových buněk z kostní dřeně do periferní cirkulace pro jejich získávání stejně tak jako pro zpětné podání po vysokých dávkách chemoterapie. Vhodné chemoterapeutické prostředky zahrnuji, bez omezení na vyjmenované látky, dobře známé sloučeniny, jako je cyklofosfamid, cis-platina, ARA-C, 5-fluoruracil, etopsid, epirubicin, karboplatin, busulfan, mitoxantron a karmustin. Při podávání s chemokiny. podle, tohoto vynálezu jsou množství chemoterapeutik taková, jaká se používají konvenčně, to jest okolo 1,2 g/m² etopsidu, 800 pig/m² ARA-C, ‘200 mg/kg cyklofosfamidu, a tak dále. Ohledně těchto dávkování viz práci autorů Hass a kol., Seminars^lin Oncol., 21, 19-24 (1994),. která se zde uvádí formou odkazu.

Chemokiny určené výše se mohou užívat pro doplněni konvenčně používaných faktorů stimulujících tvorbu kolonií v léčebných schématech. Alternativně lze použít výše určené chemokiny v kombinovaných léčbách spolu s jinými krvetvornými regulačními biomolekulami, jako jsou molekuly účastnicí se krvetvorby popsané v citacích výše nebo spolu s růstovými faktory, konvenčními léčivými prostředky a/nebo léky sloužícími pro stejné účely. Vhodné zdroje těchto růstových faktorů jsou dobře známé a zahrnují, bez omezení na tyto

případy, přírodní, syntetické a rekombinantni GM-CSF, G-CSF, faktor kmenových buněk a ligand flt3. Ostatní vhodné biomolekuly zahrnují (S)-5-oxo-L-prolyl-a-glutamyl-L-a-aspartyl-N⁸-(5-amino-l-karboxypentyl)-8-oxo-N⁷-[N-/N-(5-oxo-L-prolyl)-L-a-glutamyl/-L-a-aspartyl]-L-threo-2,7,8-triaminooktanoyllysin [(pGlu-Glu-Asp)2-Sub-(Lys)₂l [Pelus a kol., Exp. Hematol., 22, .239-247 (1994)]. Ten, kdo má zkušenost v oboru, může snadno zvolit další léčiva a léky pro spolupodávání.

Výhodami použití tohoto vynálezu namísto tradičních způsobů transplantace kmenových krvetvorných buněk v periferní krvi nebo ve spojení s těmito způsoby je rychlejší obnova polymorfonukleárních buněk a/nebo destiček ve srovnáni s transplantací kostní dřeně, snížení rizika infekce a umožnění potenciálně vyšších léčebných dávek chemoterapie nebo sérií dávek intensivní chemoterapie.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady slouží pouze pro ilustraci a neomezují předmět tohoto vynálezu.

Příklad 1

Test mobilizace

Chemokiny odvozené of KC (identifikační číslo sekvence 1), grrc3 (identifikační číslo sekvence 3) a groi (identifikační číslo sekvence 4) včetně modifikovaných a multimerních chemokinů se připraví s použitím známých způsobů, viz například WO 94/29341 ohledné další diskuse týkající se přípravy takových chemokinů. Tyto chemokiny se testují ♦ v *

- 15 ohledně schopnosti mobilizovat krvetvorné kmenové buňky u myší. Každý chemokin se testuje v koncentracích 50, 10 a 2 μ9/πιγΞ a podává se subkutánní, intramuskulární, intraperitoneální, intravenózní nebo perorální cestou. Kinetika chemokinové mobilizace krvetvorných kmenových buněk se monitoruje v 15-minutových intervalech po dobu 60 minut odebíráním vzorků krve myší kardiální punkci. Mobilizované krvetvorné kmenové buňky se frakčionují a sbírají oddělováním na základě gradientu hustoty s použitím Lympholyte-M™. Buňky se promyjí pro další použití.

.Zralé krevní elementy se spočítají s použitím hematologického analyzátoru Technicon™ H1 s veterinárním programovým vybavením. Mobilizace zralých zánětlivých. buněk, jako jsou polymorfonukleární buňky (PMN), eosinofily a basofily, se bere v úvahu při hodnocení celkového potenciálního zánětlivého profilu..

Pro monitorováni, časných a pozdních krvetvorných progenitorových buněk se provede test CFU-GM, to jest krevní vzorky odebírané během mobilizační fáze se vyhodnotí ohledně jednotek tvořících kolonie (CFU-GM) sedmého a čtrnáctého dne. Buňky se umístí, do McCoyova média bez séra v množství £

buněk/ml. Použije se jednovrstvový agarový systém obsahující McCoyovo médium obohacené živinami (hydrogenuhličitan sodný, pyruvát, aminokyseliny, vitamíny a pufr HEPES), 0,3 % Bacto agar a 15 I fetální hovězí sérum. K agarovému systému se přidají buňky ze vzorků krve (konečná koncentrace 10⁵ buněk/ml). Agarové desky se inkubují při teplotě 37 °c za přítomnosti 7,5 % oxidu uhličitého po dobu 7 až 14 dnů. Kolonie proliferujících buněk (CFU-GM) se počítají s použitím mikroskopu.

• ·Φ · Z · · · *·♦ *9 ··· * « · ·· ·· e 4« · ·*··

- 16 Navíc se 14. dne pěstování jednotek tvořících kolonie spočítají časné krvetvorné progenitorové buňky s vysokým proliferačním potenciálem (HPP).

Chemokin IL-8, který mobilizuje krvetvorné kmenové buňky jako jednotlivý faktor, se v těchto studiích používá jako pozitivní kontrola.

Předběžné pokusy ukázaly, že podávání grrop (identifikační číslo sekvence 3) vede k dávkové dependentní mobilizaci CFU-GM podobné výsledkům u kontrolních stanovení. Modifikovaný ςττοβ, protein s odříznutými N-terminálními 4 aminokyselinami (aminokyseliny 5 až 73) od grrop, mobilizoval významné vyšší počty krvetvorných progenitorových buněk než samotný grofi (aminokyseliny 1 až 73) nebo IL-8. Nebyly pozorovány žádné významné změny (větší než 3násobné) u zralých buněčných elementů myší léčených gro$ ukazující na specifickou mobilizaci krvetvorných progenitorových buněk. Tento výsledek dokazuje, že modifikované deamino-chemokiny mohou zvyšovat mobilizačni charakteristiky ve srovnání se' zralými proteiny.

Příklad 2

Test mobilizace v kombinaci s hematostimulanty

Hematostimulanty se používají v kombinaci s chemokiny udanými výše jako mobilizační faktory. Hematostimulanty zahrnuji G-CSF, GM-CSF, (S)-5-oxo-L-prolyl-a-glutamyl-L-α-aspartyl-N⁸- (5-amino-l-karboxypentyl) -8-oxo-N⁷- [ N-/N-(5-oxo-L-prolyl)-L-a-glutamyl/-L-a-aspartyl]-L-threo-2,7,8-triaminooktanoyl-lysin [(pGlu-Glu-Asp)₂-Sub-(Lys) ₂ ] (Pelus, viz citace výše) a ligand. flt-3. Lze použít jakékoliv * ·

- 17 G-cSF-mimetimum, to jest hematostimulant, který není CSF, jako G-CSF nebo GM-CSF, avšak má krvetvornou aktivitu.

Při testu kombinací se podává hematostimulant, například G-CSF, v dávce 50 gg/kg myším čtyři dny před podáním chemokinů nebo modifikovaných či multimerních chemokinů odvozených od KC (identifikační číslo sekvence 1), grop (identifikační číslo sekvence 3) a groi (identifikační číslo sekvence 4). Podobně jako v příkladu 1 se. mění dávka chemokinů a doba odběru krve.

Test CFU-GM se provede jak je popsáno výše v příkladu 1 s použitím SCF, IL-1 a GM-CSF jako zdroje aktivity stimulující tvorbu kolonií. Zralé krevní buněčné elementy, časné a pozdní progenitorové buňky, se měří jako v příkladu 1.

Studie kombinací s předběžnou léčbou hematostimulantem používá jako pozitivní kontrolu ΜΙΡ-Ια.

Příklad 3

Model transplantace myších kmenových buněk periferní krve

A. Mobilizace primitivních dlouhodobě repopulujících kmenových buněk

Následující pokus se provádí na modelu transplantace kmenových buněk in vivo pro zjištění, zda grop odříznutý na aminovém konci (aminokyseliny 5 až 73 identifikační číslo sekvence 3, nazývaný grop-T) mobilizuje primitivní dlouhodobě repopulující kmenové buňky. V tomto modelu jsou myši ozářené zářením τ příjemci buněk kostní dřeně. Přežívání myší se sleduje po dobu 100 dní.

*· 9 9 9 9 9 99 9 99

9 9 9 9 9 9 99 · «4 · «444

Schopnost kmenových buněk krve odebíraných myším léčeným buď fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem, grop-T (50 pg v 15 až 30 minutě), G-CSF (1 pg/myš dvakrát denně x 4) nebo G-CSF a poté gro8-T k zachránění jinak le£ tálně ozářených myší. Krevní mononukleární buňky (do 10 ) odebírané od myší léčených fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem chrání 0 až 10 % zvířat 100 dnů po transplantaci. Myši dostávající dřeňové buňky jako pozitivní kontrola studie byly uvažovány jako 100% základ přežívání ke 100. dni. Mobilizované krevní buňky (10® buněk/myš) odebírané od myší . léčených samotným grop-T chránily 70 % příjemců. Mobilizované krevní buňky (10® buněk/myš) odebírané od dárců léčených G-CSF chránily 80 % příjemců. Mobilizované krevní buňky odebírané od dárců léčených G-CSF a grop-T mobilizují větší počty repopulujících buněk než samotný G-CSF.

B. Mobilizace kmenových buněk periferní krve

Vyhodnocuje se rychlost, se kterou se mobilizují kmenové buňky periferní krve pomocí linií zralých krevních buněk obnovených grop-T u ozářeného hostitele. Buňky periferní krve o nízké hustotě v množství 10® (LDPBC) se podají injek-. čně ozářeným příjemcům a krev se odebere kardiální punkcí 7 až 19 dnů po ozáření. LDPBC se odebírají od různých skupin za optimálních podmínek pro mobilizaci CFU-GM. Skupiny srovnávané v tomto pokusu dostávají fyziologický roztok pufrovaný fosfátem, samotný grop-T (50 pg, 15 min), samotný G-CSF (dvakrát denně x 5 dnů, 1 pg/myš) a grop-T + G-CSF. Denně se odebírá krev od normálních myší pro srovnání s transplantovanými zvířaty.

Myši, které obdrží transplantát od dárců léčených

- 19 fyziologickým roztokem pufrovaný fosfátem, nejsou schopné obnovit zralé krevní buněčné elementy a-uhynou. Rychlost obnovy, neutrofilů u myší, které dostávají buňky mobilizované odříznutým grop, je rychlejší než u zvířat, která dostávají buňky mobilizované pomocí G-CSF. Myši, které obdrží LDPBC mobilizované kombinací grop-T + G-CSF vykazují rychlejší rychlost obnovy neutrofilú néž buňky mobilizované ^^οβ ^τ· ’ ‘ A

Obnova počtů krevních destiček u stejných myší ukazuje stejné pořadí: grop-T +. G-CSF > grop-T > G-CSF >> PBS. Avšak 19. dne počty destiček zdaleka nedosahuji návrat ’ k normálním hodnotám. Tyto údaje ukazují, že krevní kmenové buňky mobilizované gro^-T se u myších příjemců začleňují, což poskytuje výsledné rychlosti obnovy neutrofilů a krevt nich destiček stejné nebo lepši než v případě kmenových buněk mobilizovaných-pomocí G-CSF.

Četné modifikace a variace tohoto vynálezu zahrnuje výše uvedený popis a předpokládá se, že jsou zřejmé.tomu, kdo· má zkušenost v oboru. Tyto modifikace a změny prostředků a postupů podle tohoto vynálezu sé uvažuje zahrnout do rozsahu patentových nároků, které se, zde dále připojují.

- 20 Seznam sekvenci (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: SmithKlíne Beecham Corporation Pelus, Louis M.

King, Andréw G.

(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Použití proteinu odvozeného z chemokinu savce (iii) POČET SEKVENCÍ: 4 (iv) ADRESA PRO. KORESPONDENCI:

(A) ADRESÁT: SmithKlíne Beecham Corporation -

Corporate Patents (B) ULICE: 709 Swedeland Road (C) MÉSTO: King of Prussia (D) STÁT: PA (E) ZEMĚ: USA (F) POŠTOVNÍ KÓD: 19406-2799 (v) FORMA PRO ČTENÍ POČÍTAČE:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) PROVOZNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMOVÉ VYBAVENÍ: Patentln Release #1.0,

Verze #1.30 (vi) ÚDAJE O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: WO (B) DATUM PODÁNÍ:

(C) ZATŘÍDĚNÍ:

·*9 > · «www • · · <* β 4 4 · ··· «· • · · « 4 4 · ·4 ·· · ·· 4 «4·· (vii) ÚDAJE O PRIORITNÍ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO.PŘIHLÁŠKY: US 08/547 262 (B) DATUM PODÁNÍ: 24. října 1995 (viii) INFORMACE O PŮVODNÍM ZÁSTUPCI:

(A) JMÉNO: Halí, Linda E.

(B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 31763 (C) ČÍSLO SPISU: SBC P50161-2PCT (ix). TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:

(A) TELEFON: 215-270-5015 (B) FAX: 215-270-5090 (2) INFORMACE PRO IDENTIFIKACI SEKVENCE ČÍSLO 1:

* (i) SEKVENČNÍ.CHARAKTERISTIKY:

(A) . DÉLKA:.. 72 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TVAR ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: ČÍSLO IDENTIFIKACE SEKVENCE: 1:

Ala Pro Ile Ala Asn Glu Leu Arg Cys Gin Cys Leu Gin Thr Met 1 ' 5 .10 15

Ala Gly Ile His Leu Lys Asn Íle Gin Ser Leu Lys Val Leu

Pro • ·

Ser Gly Pro His Cys

Thr

Gin

Thr Glu Val 40

Ile

Ala Thr

Leu

Lys 45

35

Asn

Gly

Arg

Glu

Ala

Cys

Leu

Asp

Pro

Glu

Ala

Pro

Leu

Val

Gin

50

55

60

Lys

Ile

Val

Gin

Lys

Met

Leu

Lys

Gly

Val

Pro

Lys

Ϊ

..65

70

(2) INFORMACE PRO IDENTIFIKACI SEKVENCE ČÍSLO 2:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 73 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TVAR ŘETÉZCE:

(D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY.: protein (Xi) POPIS SEKVENCE: ČÍSLO IDENTIFIKACE SEKVENCE: 2:

Ala Ser Val 1

Ala Thr Glu Leu 5

Arg

Cys Gin Cys Leu Gin Thr Leu

10

15

Gin Gly

Ile

His

Pro

Lys

Asn

Ile

Gin

Ser

Val

Asn

Val

Lys

Ser

20

25

30

Pro. Gly

Pro

His

cys

Ala

Gin

Thr

Glu

Val

Ile

Ala

Thr

Leu

Lys

35

40

45

Asn Gly

Arg

Lys

Ala

Cys

Leu

Asn

Pro

Ala

Ser

Pro

Ile

Val

Lys

50

55

60

- 23 Lys Ile Ile Glu Lys Meť Leu Asn Ser Asp Lys Ser Asn

6570 (2) INFORMACE PRO ČÍSLO IDENTIFIKACE SEKVENCE 3:

^; ( i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY: . ‘ (A) DÉLKA: 73 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TVAR ŘETĚZCE:’ (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: ČÍSLO IDENTIFIKACE SEKVENCE: 3:

Ala

Pro

Leu

Ala

Thr

Glu

Leu Arg

Cys

Gin

Cys

Leu

Gin

Thr

Leu

1

5

10

15

Gin

Gly

Ile

His

Leu

Lys

Asn

Ile

Gin

Ser

Val

Lys

Val

Lys

Ser

20

25

3 0

Pro

Gly

Pro

His

Cys

Ala

Gin

Thr

Glu

Val

Ile

Ala.

Thr

Leu

Lys

35

40

45

Asn

Gly

Gin

Lys

Ala

Cys

Leu

Asn

Pro

Ala

Ser

Pro

Met

Val

Lys

50

55

60

Lys

Ile

Glu Lys

Met

Leu

Lys .Asn Gly

Lys

Ser

Asn

65

70

(2) INFORMACE PRO ČÍSLO IDENTIFIKACE SEKVENCE 4:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 73 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TVAR ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE: neznámá

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použiti proteinu.odvozeného od chemokinu savce, zvoleného ze skupiny sestávající z (a) groa identifikační číslo sekvence 2, (b) grofi identifikační číslo sekvence 3, (c) grroT identifikační číslo sekvence 4 a (d) KC identifikační číslo sekvence 1, k přípravě léku vhodného pro mobilizaci krvetvorných kmenových buněk.
2. Použití podle nároku 1, kde chemokin je zvolen ze souboru sestávajícího ze (a) zralého gr-τοβ , .

(b} aminokyselin 5 až 73 identifikačního čísla sekvence 3, (c) multimerniho chemokinového proteinu zahrnujícího spojení dvou nebo více látek (a) nebo (b) a (d) multimerniho chemokinového proteinu zahrnujícího spojení látek (a) nebo (b) s druhým chemokinem.
3. Použití podle nároku 1, kde chemokin je zvolen ze souboru sestávajícího ze (a) zralého grroa, (b) aminokyselin 5 až 73 identifikačního čísla sekvence 2, (c) multimerniho chemokinového proteinu zahrnujícího ♦ · · · * · · ·«>· * • · · · · · · · · ·· · ♦· · ·· ··

- 26 spojeni dvou nebo více látek (a) nebo (b) a (d) multimerního chemokinového proteinu zahrnujícího spojeni látek (a) nebo (b) s druhým chemokinem.
4. Použiti podle nároku 1, kde chemokin je zvolen ze souboru sestávajícího ze (a) zralého grot, (b) aminokyselin 5 až 73 identifikačního čísla sekvence 4, (c) multimerního chemokinového proteinu zahrnujícího spojení dvou nebo více látek (a) nebo (b) a (d) multimerního..chemokinového proteinu zahrnujícího spojeni látek, (a.) nebo, (b) s druhým chemokinem.
5. Použití podle nároku 1, kde chemokin je zvolen ze souboru sestávajícího ze (a) zralého KC, (b) aminokyselin 5 až 73 identifikačního čísla sekvence 1, (cl multimerního chemokinového proteinu zahrnujícího spojeni dvou nebo více látek (a) nebo (b) a (d) multimerního chemokinového proteinu zahrnujícího spojení látek (a) nebo (b) s druhým chemokinem.

9 999 99

9 99

9 99 9 <9999
6. Použití podle nároků 1 až 5, kde uvedený chemokin zahrnuje od zhruba 0,01 ng, do zhruba 1 g tohoto léku.

,
7. Použití podle nároků. 1 až 5, kde tento lék se podává spolu s růstovým faktorem nebo jinou biomolekulou regulující krvetvůrbu.
8. Použití podle nároku 7, kde se uvedený růstový faktor je zvolen zé souboru sestávajícího z GM-CSF, G-CSF, faktoru kmenových buněk a ligandu flt-3.
9. Použití podle nároku 7, kde biomolekulou je (S)-5-oxo-L-proly1-a-glutamy1-L-a-aspartyl-N⁸-(5-amino-l-karboxypentyl) -8-oxo-N⁷-[N-/N- (5-oxo-L-proly 1) -L-a-glutamyl/-L-a-aspartyl]-L-threo-2,7,8-triaminooktanoyllysin [(pGlu-Glu-Asp)₂-Sub-(Lys)2)·
10. Použiti, podle, nároku 1, kde tento lék se používá při léčbě pacienta, který dostává transplantaci krvetvorných, kmenových buněk periferní krve.
11. Použití podle nároku 10, kde tento pacient dostal před léčbou tímto lékem dávku zvoleného chemoterapeutického prostředku, získaly se krvetvorné kmenové buňky z periferní krve tohoto léčeného pacienta, podal se chemoterapeutický prostředek a pacientovi byla podána zpět infúze získaných buněk.
12. Použití podle nároku 11, kde tento chemoterapeutický prostředek je zvolen ze souboru zahrnujícího cyklofosfamid, cisplatinu, ARA-C, 5-fluoruracil, etopsid, epirubicin, karboplatinu, busulfan, mitoxantron a karmustin.