CZ108999A3

CZ108999A3 - Kosmetický prostředek

Info

Publication number: CZ108999A3
Application number: CZ991089A
Authority: CZ
Inventors: Stewart Paton Granger; Alla Robert Burger; Ian Richard Scott; Koichi Iwata; Kelly Hua Zhang; Anthony Vincent Rawlings
Original assignee: Unilever N. V.
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 1999-08-11
Also published as: PL332430A1; CA2265635C; EP0932387A1; BR9712124A; CZ295983B6; EP0932387B1; JP3589469B2; KR20000048705A; DE69719528T2; CA2265635A1; AU714271B2; ES2193357T3; ZA978660B; TW503112B; WO1998013020A1; KR100330678B1; AR009096A1; ID21932A; CN1105554C; AU4775897A

Description

(57) Anotace:

Kosmetický prostředek pro péči o pleť obsahující a/ 0,001 až 10 % sloučeniny ze skupiny retinol, retlnylester a směsi těchto látek, b/ 0,001 až 50 % sloučeniny, která v koncentraci 100/uM vyvolá inhibici nejméně 20 % esterlflkace retinolu, katalyzované enzymy LRAT nebo ARAT, sloučenina se volí z cyklických alifatických nenasycených uhlovodíků, diterpenů a smáčedel obecného vzorce I, kde R znamená alifatický nasycený nebo nenasycený uhlovodíkový zbytek s 8 až 20 atomy uhlíku a c/ nosič, přijatelný z kosmetického hlediska.

N—CH,CK,0H • * • · · · ··' ?!/ Μ

Kosmetický prostředek

Oblast techniky

Vynález se týká kosmetického prostředku, obsahujícího amid mastné kyseliny a retinol nebo retinylester.

Dosavadní stav techniky

Retinol (vitamin A), je endogenní sloučenina, která se přírodně vyskytuje v lidském organismu a má zásadní význam pro normální diferenciaci epitheliálních buněk. Z tohoto důvodu byly přírodní i syntetické deriváty vitaminu A široce užívány k léčení různých kožních onemocnění a k obnově pokožky. Kyselina retinová byla užívána například k léčení akné, vrásek, lupenky, stařeckých skvrn a odlišně zbarvených oblastí pokožky, jak bylo popsáno například v publikacích Vahlquist A. a další, J. Invest. Dermatol., sv, 94, Hollad D. B. a Cunliffe W. J., 1990, str. 496 až 498, Ellis C. N. a další, Pharmacology of Retinols in Sin, Vasel, Karger, sv.

3, 1989, str. 249 až 252, Lowe N. J. a další, Pharmacology of Retinols in Sin, sv. 3, 1989, str. 240 až 248 a PCT patentová přihláška S. WO 93/19743.

Obvykle se považuje použití retinolu nebo esteru retinolu za výhodnější než použití samotné kyseliny. Retinol se přirozeně vyskytuje v lidském organismu a jeho použití se tedy považuje za bezpečnější než použití kyseliny retinové. Estery retinolu se in vivo hydroiyzují za vzniku retinolu.

Je pravděpodobné, že se estery retinolu a retinol v pokožce metabolicky mění na kyselinu podle následujícího schématu:

re tinyle ster

X retinol kyselina retinová • 4 • 4 4·· • « 4 4 « • * · 4 • » · 4

Většina endogenního retinolu je však rychle převedena na neúčinné estery mastných kyselin pro uložení v keratinocytech pokožky. Esterifikace retinolu na neúčinné retinylestery je prováděna v buňkách přenosem acylové skupiny alifatické kyseliny z acylCoA, reakce je katalyzována enzymem acylCoAretinoltransferázou, ARAT, nebo může jít o přenos acylové skupiny z fosfatidyloholinu, katalyzovaný enzymym lecithinretinolacyltransferázou, LRAT. Tyto esterifikační reakce jsou v keratinocytech velmi účinné, takže převážná většina 95 % buněčných retionidů je ve formě retinylesterů s mastnými kyselinami. Přestože tedy retinol a retinylestery jsou při použití bezpečnější než kyselina retinová, jsou naneštěstí méně účinné.

Vynález je z částí založen na objevu, že některé sloučeniny mohou vyvolat inhibici těchto esterifikačních reakcí a tím potenciaci účinku retinolu zvýšením množství retinolu, které je k dispozici pro přeměnu kyseliny retinové. Směs těchto látek s retinolem nebo retinylestery tedy napodobuje působení kyseliny retinové, její použití je však bezpečnější.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří kosmetický prostředek pro péči o plet, který obsahuje

a) 0,001 až 10 % sloučeniny ze skupiny retinol, retinylester a směsi těchto látek,

b) 0,0001 až 50 % sloučeniny, která v koncentraci ΙΟΟ^υΜ vyvolá inhibici nejméně 20 % esterifikace retinolu, katalyzované LRAT nebo ARAT při měření na mikrosomech in vitro, přičemž tato sloučenina je odlišná od amidu mastné kyseliny nebo dimethylimidazolidinonu a volí se ze skupiny cyklických alifatických nenasycených uhlovodíků, • 0

0« * * 0 · • · 00·· 00 ·0 diterpenů a smáčedel typu hydroxyethylimidazolinových derivátů mastných kyselin vzorce I

R \

l

N

N—CřLCrLOH (I) kde

R znamená alifatický nasycený nebo nenasycený uhlovodíkový zbytek s přímým nebo rozvětveným řetězcem, obsahující 8 až 20 atomů uhlíku, nebo směs těchto látek, a

c) nosič, přijatelný z kosmetického hlediska.

Sloučeniny, užité spolu s retinolem a/nebo retinylesterem se volí podle schopnosti vzniklé kombinace napodobit účinek kyseliny retínové na pokožce. Další možností je zkouška in vitro na mikrosomech ke stanovení, zda takové látky vyvolávají dostatečnou inhibicí esterifikace retinolu, katalyzované LRAT nebo ARAT.

Uvedený prostředek je možno použít k péči o plet místním nanesením prostředku na pokožku k napodobení účinku kyseliny retínové.

Pod pojmem péče o plet se rozumí například prevence a/nebo léčení suché pokožky nebo pokožky, poškozené například slunečním zářením, léčení nebo prevence vrásek, stařeckých skvrn, zvýšení flexibility stratům corneum nebo zesvětlení barvy pokožky a obecně zlepšení jejího clekového stavu.

• · to * to·· to·· • to * to *«·* to ·* to·· · « · to ·« ··«* ·« ·· toto ··

Podle vynálezu je možno přidáním účinného množství sloučeniny, která v koncentraci 100 ^uM vyvolává inhibici nejméně 20 % esterifikace retinolu, katalyzované ARAT nebo LRAT při měření in vitro na mikrosomech podstatně zlepšit účinek kosmetického prostředku.

Popis výhodných provedení

První základní složkou kosmetického prostředku podle vynálezu je sloučenina ze skupiny, tvořené retinolem a rétinylesteru. Pod pojmem retinol se mimo jiné rozumí následující isomery retinolu. alfall-trans-retinol, 13-cis-retinol, ll-cis-retinol, 9-cis-retinol, 3,4-dičehydroretinol. Výhodný mi isomery jsou alfall-trans-retinol, 13-cis-retinol, 3,4-didehydroretinol a 9-cis-retinol. Nejvýhodnější je alfall-trans-retínol vzhledem k tomu, že je běžně dodáván.

Retinylester je ester retinolu. Retinvlestery, vhodné pro použití v kosmetickém prostředku podle vynálezu mají 1 až 30 atomů uhlíku, s výhodou 2 až 20 atomů uhlíku v esterové skupině, nejvýhodnější jsou estery, obsahující 2, 3 a 16 atomů uhlíku vzhledem k tomu, že jsou běžně dostupné. Jako příklady retinylesterů je mošno uvést například: retinylpalmitát, retinylformiát, retinylacetát, retinylpropionát, retinylbutyrát, retinylvalerát, retinylisovalerát, retinylhexanát, retinylheptanoát, retinyloktanoát, retinylnonanoát, retinyldekanoát, retinylundekanoát, retinyllaurát, retinyltridekanoát, retinylmyristát, retinylpentadekanoát, retinyl heptadekanoát, retinylstearát, retinylisostearát, retinylnonačekanoát, retinylarachidonát, retinylbehenát, retinylp linoleát a retinyloleát.

I *«*

4 4 4 4

4 »* 4 4

Výhodné estery pro použití v kosmetickém prostředku podle vynálezu se volí z retinyIpalmitátu, retinylacetátu a retinylpropionátu vzhledem k tomu, že tyto látky se běžně dodávají a jsou proto nejlevnější. Retinyllinoleát je rovněž výhodný vzhledem ke své účinnosti.

Retinol a/nebo retinylester je v prostředku podle vynálezu obsažen v množství 0,001 až 10 %, s výhodou v množství 0,01 až 1 % a zvláště 0,01 až 0,5 %.

Druhou základní složkou kosmetického prostředku podle vynálezu jsou látky, které při zkouškách na mikrosomech in vitro vyvolávají v koncentraci 100/UM nejméně 20% inhibici esterifikace retinolu, katalyzované LRAT nebo ARAT. Dále bude popsána zkouška in vitro ne mikrosomech pro stanovení vhodnosti zkoumané látky pro zařazení do kosmetického prostředku podle vynálezu.

Ve výhodném provedení vynálezu se pro zařazení do kosmetického prostředku volí látky, které v koncentraci 100/UM vyvolávají inhibici nejméně 40 a s výhodou nejméně 50 % esterifikace retinolu, katalyzované LRAT nebo ARAT.

Zkouška na mikrosomech in vitro

Mikrosomy se získají způsobem podle publikace 1. C.

Saari a D. L. Bredberg, CoA and Non-CoA Dependent Retinol Esterification in Retinal Pigment Epithelíum, J. Biol. Chem., 263, 8084 až 8090, 1988.

Roztok, obsahující 0,1 M pufru s fosfátem sodným o pH 7, 5 mM dithiothreitolu, 2 mg/ml sérového albuminu skotu, 40^uM roztok palmitoyl CoA, 40^uM roztok dialuroyIfosfatidylcholinu, 10/UM roztok retinolu a zkoumanou látku nebo pouze rozpouštěd lo v případě slepé zkoušky se inkubuje 1 hodinu při teplotě

0

0 0 0

000 000· 0 0* 0000 00 «0 00 00 °C s mikrosomální frakcí, izolovanou z pigmentových epitheliálních buněk sítnice skotu. Po inkubaci se reakce zastaví přidáním stejného objemu ethanolu a vytvořené retinylestery (retinyllaurát z reakce, katalyzované LRAT a retinylpalmitát z reakce, katalyzované ARAT) se extrahují hexanem. Hexanová vrstva se oddělí, odpaří pod dusíkem a odparek se analyzuje pomocí HPLC na sloupci v reverzní fázi s rozměrem 3,9 x 300 mm při použití 80% methanolu v tetrahydrofuranu jako mobilní fáze a při detekci fluorescencí (excitace 325 nm, emise 480 nm) ke kvantitativnímu stanovení retinyl esteru. Množství esteru, vytvořeného v přítomnosti rozpouštědla jako slepé zkoušky se pokládá za 100 %, ze získaných hodnot se vypočítá inhibice tvorby esterů v procentech pro každou ze zkoumaných látek. Při kontrolním pokusu se stejné množství mikrosomů inaktivuje varem po dobu 5 minut, čímž dojde k nejméně 95% inhibici tvorby esteru.

Příkladem sloučenin, splňujících podmínky svrchu popsané zkoušky in vitro na mikrosomech mohou být cyklické alifatické nenasycené uhlovodíky, diterpeny, flavonony, flavonoly a některá smácedla typu derivátů hydroxyethylimidazolínů s mastnými kyselinami. Tyto látky budou dále podrobněji popsány. Použít je však možno i jiné látky, pokud splní uvedené podmínky.

Cyklické alifatické nenasycené sloučeniny

Vhodné látky tohoto typu byly vybírány podle výsledků svrchu uvedené zkoušky na mikrosomech.

Výhodné cyklické alifatické nenasycené sloučeniny se volí ze skupiny cyklických alifatických nenasycených aldehydů, ketonů, alkoholů a esterů.

• · · · ft · · · ft « · ft · •· ···· ♦* ·· · ft ftft

Výhodnými cyklickými alifatickými nenasycenými aldehydy, ketony, alkoholy a estery jsou: alfa-damaskon, beta-damaskon, delta-damaskon, iso-damaskon, damascenon, alfa-ionon, beta-ionon, allyl-alfa-ionon, isobutylionon, alfa-methy1ionon, gamma-methylionon, brahmanol, sandanol, alfaterpineol, lyral, ethylsafranát a směsi těchto látek. Jde o sloučeniny s následující strukturou:

ch_3vch₃

ch₃ alfa-damaskon

CH_3sx^CH3 ch₃ \^'ch₃ be ta-damaskon

isodamaskon

damascenon

CH·

CH₃ ch₃ alfa-ionon

beta-ionon

allyl-alfaionon

lyral

ethyl-safranát • · ·

Κ dosažení maximálních výhod při nejmenších nákladech se cyklická alifatická nenasycená sloučenina volí ze skupiny damaskonů a iononů se svrchu uvedenou strukturou.

Nejvýhodnějšími cyklickými alifatickými nenasycenými sloučeninami jsou alfa-damaskon a/nebo alfa-ionon.

Cyklickou alifatickou nenasycenou sloučeninu je možno do prostředku podle vynálezu zařadit v množství, které se pohybuje v rozmezí 0,0001 až 50 % hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost kosmetického prostředku, výhodné rozmezí je 0,01 až 10 a zvláště 0,1 až 5 % hmotnostních.

Diterpeny

Diterpeny, vhodnými pro použití v kosmetickém prostředku podle vynálezu jsou takové diterpeny, které splňují svrchu uvedenou zkoušku na mikrosomech. Výhodný je geranylgeranion s následující strukturou

CHj

OH

Diterpeny mohou být v kosmetickém prostředku podle vynálezu obsaženy v množství 0,0001 až 50 % hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost prostředku, výhodné rozmezí je 0,01 až 10 a zvláště 0,1 až 5 % hmotnostních.

Flavonony a flavonoly

Flavonony a flavonoly, použitelné v kosmetickém prostředku podle vynálezu jsou látky, které splňují podmínky to· ♦ · *» · ι φβ »«#· * · * τ ♦ * * toto · · to toto· · · · to to t · «4 · · ·· «««to·» toto· to«to· « <

toto totototo «to ·· to* toto svrchu popsané zkoušky in vitro na mikrosomech. Výhodnými flavonony a flavonoly jsou naringenin, quercetin a směsi těchto látek.

Naringenin a qu&rcetin mají následující strukturu

Naringenin

Flavonony nebo flavonol mohou být v prostředku podle vynálezu obsaženy v množství 0,0001 až 50 % hmotnostních, s výhodou 0,01 až 10 a zvláště 0,1 až 5 % hmotnostních.

Quercetin a/nebo naringenin dodává firma Sigma. Pro účely vynálezu je také možno použít extrakty z rostlin, které obsahují quercetin a/nebo naringenin, může jít například o • «

- 12 rutin, nebo extrakty z čeledí prvosenkovitých, cibulovitých a citrusovitých rostlin.

Smáčedla na bázi sloučenin hydroxyethylimidazolinu s mastnými kyselinami.

Ze smáčedel tohoto typu jsou vhodná ta.'smáčedla, která splňují podmínky svrchu uvedené zkoušky in vitro na mikrosomech. Výhodné látky tohbto typu je mošno vyjádřit obecným vzorcem

N—Cři,CH,OH kde R znamená alifatický nasycený nebo nenasycený uhlovodíkový zbytek s přímým nebo rozvětveným řetězcem, obsahující 8 až 20 atomů uhlíku.

Jako příklad vhodných hydroxyethylimidazolinových derivátů mastných kyselin je možno uvést kokoylhydroxyethylímidazolín, v němž R je odvozeno od masných kyselin kokosového oleje, z nichž většina má 12 atomů uhlíku a některé mají delší řetězce, dále může jít o laurylhydroxyethylimidazolin vzorce R = myristylhydroxyethylimidazolin vzorce

R = CH^(CH_?)i?, stearylhydroxyethylimidazolin vzorce R=CH^(CH^)^5 a oleylhydroxyethylimidazolin R % · CH = CHÍCH?)?.

V uvedených sloučeninách obsahuje R s výhodou 8 až 18 a zvláště 11 až 18 atomů uhlíku. Nejvýhodněji je použitou látkou oleylhydroxyethylimidazolin vzhledem ke své účinnosti a dobré dostupnosti.

• · » · • · · · • · Β · Β · · · ·

Β » ΒΒΒΒ Β* « Β · ··

- 13 Uvedené hydroxyethylimidazolinové deriváty mohou být v kosmetickém prostředku podle vynálezu obsaženy v množství 0,0001 až 50 % hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost prostředku, s výhodou jsou obsaženy v množství 0,01 až 10 a zvláště 0,1 až 5 % hmotnostních.

Kosmeticky přijatelný nosič

Kosmetický prostředek podle vynálezu obsahuje také kosmeticky přijatelný nosič jako ředidlo, disperzní prostředí nebo nosič pro retinol a/nebo retinylester a N-substituovaný amid mastné kyseliny, nosič nebo nosné prostředí slouží zejména ke snadnému nanášení kosmetického prostředku na pokožku.

Nosná prostředí, odlišná od vody nebo užívaná společně s vodou zahrnují kapalná nebo pevná změkčovadla, rozpouštědla, zahuštovadla, látky, zadržující vodu a různé práškové materiály. Zvláště výhodným nosičem nevodné povahy je polydimethylsíloxan a/nebo polydimethylfenylsiloxan. Silikony pro použití v kosmetickém prostředku podle vynálezu mají s výhodou viskozitu 10 až 10 000 000 mm²/s při teplotě 25 °C. Zvláště vhodné jsou směsi silikonů s nízkou a vysokou viskositou. Tyto silikony se běžně dodávají pod obchodními názvy Vicasil SE a SF (General Electric Company) a pod čísly 200 a 550 (Dow Orning Company). Množství silikonu, které je možno použít v prostředku podle vynálezu je 5 až 95 %, s výhodou 25 až 90 % hmotnostních prostředku.

Kosmeticky přijatelný nosič bude tvořit obvykle 5 až 99,9, s výhodou 25 až 80 % hmotnostních prostředku a může v nepřítomnosti dalších kosmeticky přijatelných složek doplnit kosmetický prostředek na požadované množství. Ξ výhodou tvoří φφφφ * · φ ♦ · · • φ · φ · »· · · · · • * Φ · · · · * Φ ·Μ ·· • φφ ΦΦΦΦ Φ « Φ Φφ » Φ Φ« · · · Φ ··

- 14 nosné prostředí nejméně z 50 % a zvláště z 80 % hmotnostních voda. Výhodný obsah vody je zvláště 60 až 80 % hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost kosmetického prostředku.

Případné další účinné a pomocné složky

K získání emulze typu voda v oleji nebo olej ve vodě, může být v kosmetickém prostředku podle vynálezu obsažen olej nebo materiál typu oleje spolu ε emulgátorem v závislosti na hydrofilnelipofilní rovnováze HLB použitého emulgátoru.

Kosmetické prostředky podle vynálezu s výhodou obsahují ochranné látky proti slunečnímu záření. Jde o materiály, běžně užívané k ochraně proti ultrafialovému záření. Z těchto látek je možno uvést deriváty PABA, cinnamát a salicylát. Je například možno použít oktyimethoxycinnamát a 2-hydroxy-4-methoxybenzofenon, známý také jako oxybenzon. Oktyimethoxycinnamát a 2-hydroxy-4-methoxybenzofenon se běžně dodávají pod obchodními názvy Parsol MCX a Benzophenon-3. Přesné množství těchto látek v emulzi se může měnit v závislosti na požadovaném stupni ochrany proti slunečnímu záření.

Další výhodnou případnou složkou jsou esenciální mastné kyseliny EFA, to znamená takové mastné kyseliny, které jsou nezbytné pro tvorbu plasmatické membrány všech buněk, například u keratinocytů dochází při nedostatku EFA ke zvýšené proliferaci. Tento stav je možno léčit dodáním EFA.

EFA také podporují biosyntézu lipidů v pokožce a zejména lipidy pro tvorbu bariery. Z esenciálních mastných kyselin je možno zvláště uvést kyselinu linolovou, gamma-linolenovou, homo-gemma-linolenovou, columbinovou, eicosa-(n-δ,9,13)trienovou, erachidonovou, timnodonovou, hexaenovou a směsi těchto kyselin.

· «

- 15 • » 0 * 0 000 0

00* #«·* · 0 00 0000 00 00 «· · ·

Do kosmetických prostředků podle vynálezu se často přidávají změkčovadla. Množství zmčkčovadel se může pohybovat v rozmezí 0,5 až 50, s výhodou 5 až 30 % hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost prostředku. Změkčovadla pro toto použití jsou látky z různých chemických skupin, jako estery, mastné kyseliny a alkoholy, polyoly a uhlovodíky.

Estery mohou být monoestery nebo diestery. Přijatelnými příklady diesterů mastných kyselin mohou být dibutyladipát, diethylsebakát, díisopropyldimerát a díoktyIsukcinát. Přijatelné estery mastných kyselin s rozvětveným řetězcem zahrnují 2-ethylhexylmyristát, isopropylstearát a isostearylpalmitát. Přijatelné estery trikarboxylových kyseliny zahrnují triisopropyltrilinoleát a trilaurylcítrát. Přijatelné estery mastných kyselin s přímým řetězcem zahrnují laurylpalmitát, myristyllaktát, oleylerukát a stearyloleát. Výhodnými estery jsou kokokaprylát/kaprát (směs kokokaprylátu a kokokaprátu), acetát myristyletheru propylenglykolu, diisopropylačipát a cetyloktanát.

Z vhodných mastných alkoholů a kyselin je možno uvést sloučeniny, obsahující 10 až 20 atomů uhlíku. Zvláště výhodné jsou cetyl-, myristyl-, palmityl- a stearylalkoholy a příslušné kyseliny.

Z polyolů, použitých jako změkčovadla je možno uvést alkylpolyhydroxysloučeniny s přímým nebo rozvětveným řetězcem. Výhodnými látkami z této skupiny jsou propylenglykol, sorbitol a glyeerol. Použitelné jsou také polymerní polyoly, jako polypropylenglykol a polyethylenglykol. Butylenglykol a propylenglykol jsou zvláště výhodné jako látky, které usnadňují průnik.

• · · · * « · ··· • * * · »· · · * * · · » » » « · • * **·· · ·I · · * ·

- 16 Z uhlovodíků, použitých jako změkčovadla je možno uvést zejména uhlovodíky, obsahující 12 až 30 atomů uhlíku. Specifickými příklady mohou být minerální oelj, vazelína, squalen a isoparafiny.

Další kategorií funkčních složek pro kosmetické prostředky podle vynálezu jsou zahuštovadla. Látky tohoto typu budou obvykle obsaženy v množství 0,1 až 20, s výhodou 0,5 až 10 % hmotnostních z celkové hmotností kosmetického prostředku. Jako příklady zahuštovadel je možno uvést zesítěné polyakryláty, dodávané pod obchodním názvem Carbopol (B. F. Goodrich Company). Je také možno užít gumy, jako xanthan, carrageenan, želatinu, karayu, pektin a gumu z bobů. Za určitých okolností může být zahuštovadlo voleno z látek, použitých jako silikon nebo jako změkčovadla. Například silikonové pryže s viskositou vyšší než 10 centistoke a také některé estery, například glycerolstearát mohou v kosmetickém prostředku splnit dvojí funkci.

Do kosmetických prostředků podle vynálezu je možno začlenit také práškové materiály. Takovými složkami jsou například křída, mastek, kaolin, škrob, smektit, chemicky modifikovaný křemičitan horeČnatohlir.itý, organicky modifikovaná montmorilonitová hlinka, hydratovaný křemičitan hlinitý, vysušený oxid křemičitý, oktenylsukcinát škrobu ve formě hlinité soli a směsi těchto látek.

Do kosmetických prostředků podle vynálezu mohou být zařazeny v malém množství také další složky, jako jsou barviva, parfémy a podobně. Množství těchto složek se může pohybovat v rozmezí 0,001 až 20 % hmotnostních.

• 9 • · · · · « · * ·« 9999 99 99 *· ··

- 17 Použití kosmetického prostředku

Kosmetický prostředek podle vynálezu je primárně určen pro místní podání na lidskou pokožku, zejména k péči o piet a k prevenci nebo odstranění vrásek nebo jiných projevů stárnutí pokožky.

Při použití se malé množství prostředku, například 1 až 100 ml, nanese na příslušné části pokožky z vhodné nádobky nebo aplikátoru a popřípadě se pak materiál roztírá a/nebo vetře do pokožky rukou, prsty nebo vhodnými pomůckami.

Výrobky a balení

Prostředky podle vynálezu pro místní podání mohou být například emulze, krémy nebo gely. Tyto materiály mohou být baleny do vhodných nádobek podle viskozity a předpokládaného použití. Například emulze nebo krémy je možno uložit do lahviček, popřípadě opatřených ve výstupním otvoru kuličkou pro snadnější nanášení, nebo je možno prostředek uložit do přístroje pro nanášení aerosolu s hnacím prostředkem nebo do nádobky s mechanickým nanášením pomocí prstů. V případě krému je možno použít nedeformující se kelímek nebo také tubu. Prostředek je rovněž možno ukládat do kapslí, například podle US 5 063 057.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu. V příkladové části přihlášky budou užity různé materiály a budou také prováděny různé typy zkoušek.

• I 4 · 4« 4 · · · ·« «··· · · ···« • « · · 4 * · · · · 4 • 4 · 4 · · · · « • 4 Μ·« · · · · · · ·

1S

Materiály a metody

Buněčná kultura

Lidské keratinocyty, izolované z předkožky novorozence působením trypsinu se pěstují v Eaglově prostředí v Dulbeccově modifikaci DME Hams F12 (1 : l) s 10 % fetálního telecího séra v přítomnosti ozáření myších fibroblastů 3T3 pro zahájení dělení kolonií keratinocytů. Buňky byly pěstovány až do druhé pasáže a pak byly udržovány ve zmrazeném stavu pro příští použití. Pak byly keratinocyty opět rozmraženy ve svrchu uvedeném prostředí a pěstovány 5 dnů, načež bylo prostředí vyměněno na prostředí na bázi MCBD 153, prosté séra a vhodné pro pěstování keratinocytů, KGM (Clonetic Corporation, San Diego, CA), prostředí obsahuje 0,15 mM vápníku, nebo je také možno užít prostředí KSFM, prosté séra a vhodné pro pěstování keratinocytů (GIBCO), které obsahuje 0,09 mM vápníku. Ve dni 7 vytvořil buněčný materiál vrstvu, souvislou na 80 až 90 %, vrstva byla zpracována trypsinem a nanesena na plotny v prostředí, prostém séra, pro různé zkoušky.

Zkouška s thymidinem

Příjem H-thymidinu a proliferace keratinocytů

Příjem H-thymidinu keratinocyty, pěstovanými v kultuře, byl užit jako zkouška na proliferaci keratinocytů. Thymidin je jeden ze čtyř deoxynukleotičů, které jsou monomerními jednotkami DNA, univerzální banku genetické informace u živočichů.Před dělením buněk, například keratinocytů dochází k úplné replikaci genomu dělící se buňky. K tomuto účelu buňka produkuje velké množství DNA tak, aby obě dceřinné buňky obsahovaly totožné kopie genetického materiálu. V případě, že se do živného prostředí pro keratinocyty přidá 3

H-thymidin, dojde k zařazení tohoto značeného nukleosidu • · ·♦ ·· ·· • · · a a · a » · ·<<«« a * « a · * a · · · · · ·· a· ·· óo nově syntetizované DNA v průběhu přípravy na dělení buněk. Míra příjmu radioaktivního thymidinu do určité populace buněk je tedy přímo úměrná množství syntetizované DNA v této buněčné populaci a je tedy současně také indikátorem proliferace těchot buněk.

Keratinocyty, pěstované svrchu uvedeným způsobem se nanesou na plotny s 24 vyhloubeními v množství 20 000 buněk na vyhloubení v 1 ml prostředí. Materiál se inkubuje 4 dny nebo tak dlouho, až se vytvoří vrstva, souvislá na 60 až 70 %, pak se prostředí vymění za čerstvé prostředí. 24 hodin po výměně prostředí se ve trojím opakování do vyhloubení přidají zkoumané látky a po dalších 4 hodinách se do každého vyhloubení přidá ještě 50 mikrolitrů živného prostředí s obsahem

1/UCi H-thymidinu. Buněčný materiál se pak inkubuje dalších 24 hodin. Pak se prostředí odstraní, přidá se 10% kyselina trichloroctová TCA, chlazená ledem a plotny se inkubují v ledu 30 minut. Pak se buněčný materiál pětkrát promyje 5% TCA a nechá se rozpouštět v 500 mikrolitrech 0,1 M NaOH nejméně 1 hodinu, obvykle přes noc. Pak se vzorkyoEeutralízují přidáním 0,1 M HC1, načež se 50 mikrolitrů preparátu užije ke stanovení celkového obsahu bílkovin. Radioaktivní vodík v DNA se na základě počtu rozpadů za minutu DPM stanoví kapalinovou scintííací při použití vzorku s objemem 900 mikrolitrů. Příjem thymidinu se vyjádří jako DPM/mikrogram bílkoviny.

Zkouška na transglutaminázu

Zkouška na transglutaminázu a diferenciace keratinocytů

V průběhu konečné diferenciace epidermis se vytváří na vnitřním povrchu periferie buněk vrstva bílkoviny s tlouštkou 15 nm, označovaná jako obalová vrstva CE. Tato vrstva CE je tvořena řadou bílkovin, které byly spolu zesíteny za tvorby N^eta-(gaxnma-glutamyl)lysinisodipeptídových vazeb, tato * 0 0 · 0 0 0 · 0 • · 0 « I ♦»« · · · • 0 · · 0 0 0 0

0 0 0 00 00 0 · 0«

- 20 tvorba je katalysována působením nejméně dvou různých transglut&mináz TG, k jejichž expresi dochází v epidermis. K expresi transglutaminázy I TG I dochází ve velkém množství v diferencovaných vrstvách epidermis, zvláště v granulami vrstvě, avšak nedochází k ní v nediferencované bazální vrstvě. To znamená, že uvedený enzym je vlastně průkazem diferenciace keratinocytů, přičemž vyšší množství enzymu je vždy uka zatelem diferencovanějšího stavu. Při průkazu tohoto enzymu zkouškou ELISA při použití protilátky proti uvedenému enzymu je možno prokázat stav diferenciace vypěstovaných keratinocytů, jak bude uvedeno v následujících příkladech.

V případě příkladu 1 bylo použito následujícího postupu:

Keratinocyty, vypěstované svrchu uvedeným způsobem, byly naneseny na plotnu s 96 vyhhloubeními v množství 3000 buněk na vyhloubení ve 200 mikrolitrech živného prostředí.

Po inkubaci 4 dny bylo prostředí vyměněno za prostředí, obsahující zkoumané látky, každá látka byla užita v dané koncentraci vždy v šesti opakováních. Pak byly buňky pěstovány dalších 72 hodin a pak po odsátí živného prostředí byly plotny uloženy při teplotě -70 °C. Pro použití byly plotny vyjmuty z mrazicího zařízení a buněčný materiál byl promyt PBS. Bylo přidáno 100 mikrolitrů sterilní vody a buněčný materiál se rozruší zmrazením na -70 °C s následným rozmražením. Buňky se inkubují 1 hodinu při teplotě místnosti v PBS se 3 %

BSA, jde o promývací pufr se sérovým albuminem skotu, pak se buněčný materiál promyje čerstvým podílem promývacího pufru. Buňky se inkubují spolu s 50 míkrolitry primární myší monoklonální protilátky proti lidské transglutamínáse, IgG (Biomedical Industries) v ředění 1 : 2000 v promývacírn pufru 1 hodinu pří teplotě 37 °C a pak se promyjí dvakrát po sobě promývacírn pufrem. Pak se buněčný materiál inkubuje 150 mik• 0 0

0 0 • 00 * · · 0 · 0 * 0 · 0 0000 » · 0 0 0 0 00 0000 00 00 rolitry sekundární protilátky (fragment Fab, protilátka IgG proti myším tkáním, konjugované s peroxidázou, Amersham) v ředění 1 : 4000 v promývacím pufru 1 hodinu při teplotě 37 °C, načež se dvakrát promyje promývacím pufrem. Buňky se inkubují s roztokem substrátu, jde o roztok 4 mg o-fenylendiaminu a 3,3 mikrolitrů 30% peroxidu vodíku v 10 ml 0,1 M citrátového pufru o pH 5,0 celkem 5 minut při teplotě místnosti ve tmě pod hliníkovou fólii. Reakce se zastaví přidáním 50 mikrolitrů 4 N kyseliny sírové. Absorbance vzorků se odečítá příslušným přístrojem při 492 nm. Ze šesti vzorků byly ke čtyřem vzorkům přidány obě protilátky, ke dvěma byla přidána pouze sekundární protilátka ke stanovení vazby protilátky, konjugované s enzymem. Koncentrace transglutaminázy byly stanoveny odečtením takto zjištěného pozadí z koncentrace, zjištěné v jednotlivých vzorcích a stanovením směrodatné odchylky pro vzorky, k nimž byly přidány obě protilátky.

V ostatních příkladech byl užit následující postup:

Keratinocyty, vypěstované svrchu uvedeným způsobem byly naneseny na plotnu s 95 vyhloubeními v množství 3000 buněk na vyhloubení ve 200 ml živného prostředí. Po inkubaci 4 dny bylo prostředí nahrazeno prostředím s obsahem zkoumaných látek, zkoušky byly prováděny v šesti opakováních. Pak byl buněčný materiál pěstován ještě 72 hodin, načež byly po odsátí živného prostředí plotny uloženy při -70 °C. Po vyjmutí z mrazicího zařízení byl buněčný materiál znovu zmrazen a rozmražen a pak třikrát promyt PBS. Pak byly buňky inkubovány 1 hodinu při teplotě místnosti v pufru TBS s 5 % ΒΞΑ. Pak byly buňky inkubovány se 100 mikrolitry primární protilátky, monoklonální myší protilátky IgG proti lidské transglutamináse (Biomedical Technologies lne.) v ředění 1 : 2000 v pufru TBS s 1 % BSA 2 hodiny při teplotě 37 °C, načež byly 6x promyty promývacím pufrem TBS s 1 % BSA a s 0,05 % Tween-20.

- 22 • b toto ·· «>

Β · * · to · to · • · · · ··· ·

Pak byl buněčný materiál inkubován se 100 mikrolitry fragmen· tu Fab sekundární protilátky, protilátky IgG proti myším tká· ním, konjugované s peroxidázou (Amersham) v ředění 1 : 4000 v promývacím pufru celkem 2 hodiny při teplotě 37 °C, načež byl materiál 3x promyt promývacím pufrem a pak ještě 3x PBS. Buňky pak byly ínkubovány s roztokem substrátu, 4 mg o-fenylendíaminu a 3,3 mikrolitrů 30% peroxidu vodíku v 10 ml O,1M citrátového pufru o pH 5,0 celkem 5 minut při teplotě místnosti a ve tmě pod hliníkovou folií. Reakce byla zastavena přidáním 50 mikrolitrů 4 N kyseliny sírové. Absorbance vzorků byla odečítána příslušným přístrojem při 492 nm. Ze Šesti opakování byly ke čtyřem vzorkům přidány obě protilátky a ke dvěma z nich pouze sekundární protilátka ke stanovení pozadí vazby enzymu konjugovanou protilátkou. Koncentrace transglutaminázy I byly stanoveny odečtením tohoto pozadí od výsledku pro každý ze vzorků za současného stanovení směrodatné odchylky.

Stanovení DNA

Množství transglutaminázy I, zjištěná po zpracování buněk může být ovlivněna počtem buněk, to znamená, že čím větší bude počet buněk, tím vyšší bude koncentrace enzymu. Koncentrace enzymu byla tedy normalizována na obsah DNA v buňkách téhož vyhloubení, čímž byly vyloučeny variace, způsobené rozdílem v počtu buněk. Kvantitativní stanovení DNA je zvláště vhodným ukazatelem počtu buněk včetně keratinocytů vzhledem k tomu, Že každá z buněk má stejný genom a tím i stejné množství DNA. Celkové množství DNA ve vyhloubení je tedy přímo úměrná počtu buněk v tomto vyhloubení. Pak je možno stáhnout údaje o koncentraci enzymu na zjištěné množství DNA.

* · ·· «· »» *t • · · · · * · * · · » · ··· • ·· · ·« « · '· - 23 - ** *··· ........

Keratinocyty byly naneseny na plotny s 96 vyhloubeními v množství 3000 buněk na vyhloubení ve 200 mikrolitrech živného prostředí. Po inkubaci 4 dny bylo prostředí nahrazeno prostředím s obsahem zkoumaných látek, každá zkouška byla pro vedena v šesti opakováních. Pak byly buňky pěstovány ještě 72 hodin, načež bylo živné prostředí odstraněno odsátím a plotny byly uloženy nejméně na 1,5 hodiny při teplotě -70 °C. Pak byly plotny vyjmuty z mrazicího zařízení a na 30 minut rozmraženy, do každého vyhloubení bylo přidáno 100 mikrolitrů barviva Hoechst (konečná koncentrace 1 mikrogram/ml) a plotny byly inkubovány 15 minut, překryty a výsledek byl odečítán fluorímetrem (excitace 360 nm, emise 460 nm). Pak byl roztok barviva odstraněn a vyhloubení byla promyta PBS a tak připravena na stanovení transglutaminázy.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Kyselina retinová je účinnější než retinol při směně stadia diferenciace keratinocytů

Byl sledován účinek transglutaminázy, normalizované na obsah DNA v buňkách po přidání kyseliny retinové RA a retínolu ROH, výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 1:

• · »· ··

• · *4 ·· ·» • · · • * · · · • « ♦ · • · »♦· I • « • «

- 25 Všechny zkoušené koncentrace kyseliny retinové, to znamená 2,5 x 10 M, 2,5 x 10 M a 2,5 x 10 M snižovaly diferenciaci keratinocytů ve významné vyšším rozsahu než retino! ve stejných koncentracích. Sníženi množství transglutami— názy bylo závislé na dávce jak v případě kyseliny retinové, tak v případě retinolu. To je v souladu se skutečností, že kyselina retinová má na diferenciaci epithelu větší účinnost než retinol.

Příklad 2

Esterifikace retinolu v mikrosomech in vitro

Mikrosomy byly získány podle publikace J. C. Saari a D, L. Bredberg, CoA and Non-CoA Dependent Retinol Esterifikation in Retinal Pigment Epithelium, J. Biol. Chem., 23,

8084 až 8090, 1988:

Roztok, obsahující 0,1 M pufru s fosfátem sodným o pK 7, mM dithiothreitolu, 2 mg/ml sérového albuminu skotu, 40/UM roztok palmitoyl CoA, 40^uM roztok dialuroylfosfatidylcholinu, 10/UM roztok retinolu a zkoumanou látku nebo pouze rozpoušted lo v případě slepé zkoušky se inkubuje 1 hodinu při teplotě 37 °C s mikroscmální frakcí, izolovanou z pigmentových epítheliálních buněk sítnice skotu. Po inkubaci se reakce zastaví přidáním stejného objemu ethanolu a vytvořené retinylestery (retinyllaurát z reakce, katalyzované LRAT a retinylpalmitát z reakce, katalyzované ARAT) se extrahují hexanem. Hexanová vrstva se oddělí, odpaří pod dusíkem a odparek se analyzuje pomocí HPLC na sloupci v reverzní fází C_1Q s rozměrem 3,9 x 300 mm při použití 80% methanolu v tetrahydrofuranu jako mobilní fáze a při detekci fluorescencí (excita« · t« * · · · * · * • ♦ · * » I ce 325 nm, emise 480 run) ke kvantitativnímu stanovení retinylesteru. Množství esteru, vytvořeného v přítomnosti rozpouštědla jako slepé zkoušky se pokládá za 100 %, ze získaných hodnot se vypočítá inhibice tvorby esterů v procentech pro « «V • · « · · « · · • · · • 9 tt · · ·

každou ze zkoumaných látek. Při kont množství mikrosomů inaktivuje varem dojde k nejméně 95% inhibici tvorby	rolním po dobu esteru.	pokusu se 5 minut,	stejné čímž
Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 2:
Tabulka	2
sloučenina koncentr. ,uM	% inhib. ARAT	% inhib LRAT
oleylhydroxyethylimidazolin	100	90	95
oleylhydroxyethylimidazolin	10	14	28
kapryloyIhydroxyethylimidasolin	100	-	8
díazolidinyl močovina	100	0	0
thiamin	100	0	0
kofein	100	0	0
adenin	100	0	0
kyselina fenylbenzimidazolsulfonová	100	0	0
urac i 1	100	0	0
tryptofan	100	0	0
kokoglutamát	100	0	0
dimethylkokoaminoxió	100	0	0
sodná sůl kokoaminu diacetátu	100	0	0
o1ey1amidopropylbe tain	100	0	0
oleylaminoxíd	100	0	0
lauroylsarkosin	100	20	0

·* · v t ··*· » 4 * 4 « · • · · » ♦ »4 4 ·· * * · 4 · · 4 «4 14» »·« ··· · * 4 4 » 4 « « * » · V 4» «* 44 *4

- 27 Je zřejmé, že smáčedla na bázi hydroxyethylimidazolinu jsou účinnými inhibitory esterifikace, kdežto jiná smáčedla a jiné heterocyklické sloučeniny jsou v podstatě neúčinné. Hydroxyethylimidasolinovy derivát kyseliny kaprylové vzorce R - neinhibuje dostatečně LRAT.

Příklad 3

Byl opakován postup podle příkladu 2 pří použití různých hydroxyethylimidazolidinových smáčečel se skupinami R, uvedenými v tabulce 3. Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 3.

Tabulka 3

1 R	konc. ,uM i	% INKIS. ARAT	% INHIB. LRAT
\| Oleyl	100	90	90
\| Oleyl	10	15	12
I) Laury 1	100	53	47
jj Laury 1	10	0	0
\| Coco	100	68	65
J Coco	10	0	0

Výsledky v tabulce 3 ukazují relativní účinnost zbytku kyseliny olejové, laurové a zbytků kyselin z kokosového oleje. Zbytky kyselin z kokosového oleje jsou velmi výhodné pravděpodobně z toho důvodu, že neobsahují pouze zbytky o 12 atomech uhlíku, nýbrž také některé delší zbytky.

Údaje v tabulce 2, týkající se hydroxyethylimidazolidinového derivátu kyseliny kaprylové ukazují pouze 8% inhibici při koncentraci 100 yuM. Je tedy zřejmé, že výhodnost klesá

- 28 od nejvhodnějšího zbytku kyseliny olejové přes zbytky kyselin z kokosového oleje a zbytek kyseliny laurové až ke zbytku kyseliny kaprylové.

9» ·· • 9 · 9 • 9 9 « « 9 • · 9

9999 • 9 99 * · 9 * * 99 · • 9 9 9 • · 9 ·

99

9*’· · 9 9 9 9 * ·9 9 9·« • 9

9 «9

Příklad 4

Zkouška na transglutaminázu byla provedena při použití oleylhydroxyethylimidazolinu OHI, kyseliny retinové RA, retinolu ROH a retinylpalmitátu RP. Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 4.

Tabulka 4

příkl.	sloučenina	konc. yUM	% kontroly
1	RA	0.25	35.1
1	ROH	0.25	76.2
i	OHI	T_	80.7
1	rok+ohi	0.25-1	45.1
2	RA	0.25	43.4
2	ROH	0.025	91.6
2	OHI	1	78.2
2	ROH+OHI	0,025+1	57.9
3	RA	0.25	45.9
3	R?	0.25	91.5
3	OHI	1	91.1
3	RP+OKI	0.25+1	71.6
Z	výsledků, uvedených v	tabulce 4 je	zřejmé, že kyše
na retinová podstatně snižuje	diferenc iac i	keratinocytů,

1kdežto retinol, oleylhydroxyethylimidazolin a retínylpalmitát neovlivní diferenciaci keratinocytů nebo ji ovlivní jen do menšího rozsahu než kyselina retinová.

V pokusech 1 a 2, v nichž byl retinol kombinován s oleylhydroxyethylimidazolinem došlo k synergnímu účinku na pokles diferenciace keratinocytů na hodnoty, odpovídající hodnotám při použití kyseliny retinové.

• 4 • 4 · 4 « • 4 4 · 4444 • « 4 44 44 · • 4 * 4 4 4 4

44*4 «4 «·

V pokusu 3 byl oleylhydroxyethylímidazolin kombinován s retinylpalmitátem, výsledek nebyl tak průkazný jako v pokusech 1 a 2, presto však je možno pozorovat synergní účinek na pokles diferenciace.

Tento příklad také prokazuje, že sloučeniny, které splňují podmínky zkoušky na mikrosonech in vitro, mají účinek na keratinocyty v kombinaci s retinolem, přičemž tento účinek je srovnatelný s účinkem kyseliny retinové.

Příklad 5

Zkouška in vitro na mikrosomech byla provedena se sloučeninami, uvedenými v následujících tabulkách 5A a 5B.

Sloučeniny z tabulky BA byly podrobeny zkouškám v koncentraci 100 /UM. Sloučeniny z tabulky RB byly zkoušeny v koncentraci lOO^uM.

Tabulka 5 A

sloučenina	% inhib. ARAT	% inhib.
alfadamaskon	83	98
betadamASKON	84	92
deitadamaskon	87	95
i sodamaskon	80	92
damascenon	70	79
alf aionon	45	49
betaionon	22	24
allylalfa-ionon	22	36
isobutylionon	8	45

LRAT

alfa-methy1ionon	67	77
gamma-methyli onon	21	38
brahmanol	70	75
sandanol	15	43
alfa-terpineol	26	25
timberol	34	33
lyral	76	71
tonalid	50	33
ethylsafranát	51	49
traseolid	41	21
sandalon	23	12
	Tabulka 5B
al f a-damaskon	67	87
beta-damaskon	45	52
delta-damaskon	58	64
damascenon	2 3	29
allylalfa-ionon	16	17
Z výsledků,	uvedených v tabulkách 5A i	i 5B je

že některé cyklické alifatické nenasycené sloučeniny jsou účinnými, inhibitory esterifikace retinolu, katalysované působením LRAT a ARAT.

Srovnávací příklad 6

Zkouška in vítro na mikrosomech byla provedena s dai-

šími cyklickými alífai	.i ckými nenasycenými	sloučeninami. Vý-
sledky jsou shrnuty v	následující tabulce	6, v níž byla
každá látka podrobena	zkouškám při koncentraci lOO^uM.
T a b	u 1 k a 6
sloučenina	% i.nhib. ARAT	% inhib. LRAT
dihydro-alfa-ionon	13	18
alfa-ionol	0	0
beta-ionol	0	0
cinnamaldehyd	0	0
vanílin	0	0
eukalyptol	0	0
menthol	0	0
thymol	0	0
carvon	0	0
kamphor	0	0
menton	0	0
fenchylalkohol	12	4
isocyklogeran.iol	18	16
dimethylionon	0	9
delta-methylionon	a	10

Z výsledků je zřejmé, že jen některé cykl.ické alifatické nenasycené sloučeniny vyvolávají dostatečnou inhibici esterifikace retinolu, katalyzované LRAT a ARAT.

Příklad 7

Byl zkoumán vliv sloučenin z tabulky 7 a jejich kombinací na diferenciaci keratinocytů. Výsledky byly vyjádřeny v procentech kontroly. Koncentrace transglutaminázy byla normalizována na množství DNA. údaje jsou ze dvou pokusů, v nichž

byla po shrnuty	změněna koncentrace retinolu. v následující tabulce 7.	Získané výsledky	jsou
	Tabulka 7
pokus	sloučenina	koncentrace mM	% kontroly
1	kyselina retinová	0,00025	24
i	retino!	0,001	67
1	alfa-damaskon	i	92
1	retinol + alfa-damaskon	0,001+1	34
2	kyselina retinová	0,00025	8
2	retinol	0,00025	63,5
2	alfa-damaskon	1	86
2	retinol + alfa-damaskon	0,00025+1	30

Výsledky v tabulce 7 prokazují, že samotný alfa-damaskcn a samotný retinol nejsou příliš účinné, avšak kombinace těchto dvou látek dává vznik synergii a zvýšenému snížení množství transglutaminázy, která napodobuje účinek kyseliny retinové na diferenciaci keratinocytů. Výsledky jsou také dokladem dobré korelace mezi zkouškou in vitro na mikrosomech a mezí výsledky, získanými na buněčné kultuře.

• · · · * * 4 · • · a··· · · ·· «♦ ··

- 33 Příklad 8

Test in vitro na mikrosomech byl proveden s diterpenovými sloučeninami, geranylgeraniolem nebo řarnesolení. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 8.

Tabulka 8

sloučenina	koncentrace /UM	% inhibice ARAT	% inhibice LRAT
gerany lgeraniol'''	100	81	77
geranylgeraniol	10	38	16
farnesol^	100	43	43
farnesol	10	20	10
1 TCI America (Portland, Oregon) nebo také Sigma Organics (Atlanta, Georgia). 2 Givaudan Co., Bedoukian Co., nebo Dragaco Co.	a CTC
Z výsledků,	uvedených v tabulce	8 je zřejmé,	že geranyl-

geraníol i farnesol způsobují inhibici esterifikace retinolu. Geranylgeraniol je podstatně účinnější inhibitor esterifikace než farnesol s následující strukturou:

H

- 34 Příklad 9

Příjem H-thymidinu byl měřen způsobem, který byl po-

psán svrchu při popisu shrnuty v tabulkách 9A	použitých metod. Získané a 9B.	výsledky jsou
Tabulka	9A
P o k u	s 1
	DPM/m,i krogram průměr	bílkoviny s. d.	% kontro
kontrola		( 278)	100
250 nM retinolu	2082	(145)	108
250 nM kyseliny retinové 3013	( 226 )	156
250 nM retinolu + 10 nM geranylgeraniolu	2970	( 308)	154
T	a b u I k a	9B
P	okus 2
	DPM/mikrogram průměr	bílkoviny s. d.	% kontroly
kontrola		( 322 )	100
250 nM retinolu	974	(148)	107
250 nM kyseliny retinové 1494	(45)	163
250 nM retinolu + 10 nM geranylgeraniolu	1450	(318)	159

• «toto to « • · · · · « * φ • to to»·· ·« «· · ··

- 35 Z výsledků je zřejmé, že geranylgeraniol významně zvyšuje účinek retinolu na proliferaci buněk až do úrovně, srovnatelné s působením kyseliny retinové. Výsledky jsou rovněž důkazem dobré korelace mezi výsledky zkoušky na mikrosomech a výsledky, získanými v buněčné kultuře.

Příklad 10

Zkouška na mikrosomech in vitro byla provedena při použití sloučenin, uvedených v tabulce 10. Získané výsledky jsou shrnuty rovněž v tabulce 10. Sloučeniny byly použity v koncentraci 100 ^uM.

Tabulka 10 sloučenina % inhibice ARAT % inhibice LRAT kontrola 0 naringenin 33 quercetin 25

Příklad 11

Synergní inhibice diferenciace karatinocytů kombinací naringeninu a retinolu

Po působení zkoumaných látek po dobu 72 hodin byly zjištěny koncentrace transglutaminázy I, normalizované na obsah DNA v buňkách. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 11. Naringenin byl získám od firmy Sigma.

<

Q °3

P >.

o o

c

I

-P c

tJ

Ή Ό

P C

P v O

I-i ‘—t Uj tn

O c c

O O

P ;tí

P C

C

H c

1' μ

c

H

O c

¹—i o c

P

i) í, >

Ή

P >

- 37 * 4 4 4 4 «4

444« 44 44

Z výsledků, uvedených v tabulce 11 je zřejmé, že 2,5 x 10 M kyseliny retinové melo značný účinek na potlačení transglutaminázy I v keratinocytěch, a to až na 42 % hod_q noty pro kontroly. Množství 2,5 x 10 retinolu bylo zcela neúčinné (91 %) a 10 M naringeninu rovněž nemělo žádný vliv _z -9 na koncentraci enzymu, Avšak při použiti směsi 2,5 x 10 M -7 retinolu a 10 M naringeninu došlo ke mženi koncentrace transglutaminázy I až na 53 % koncentrace u kontrol. Naringenin a retinol tedy měly synergní účinek při potlačování diferenciace geratinocytů, přičemž, tento účinek byl srovnatelný s účinkem kyseliny retinové.

Příklad 12

Sinergní účinek naringeninu a retinylpalmítátu na inhibici diferenciace keratinocytů

Účinek uvedených látek na koncentraci transglutaminázy 1, normalizovanou na obsah DNA v buňkách byl sledován po působení zkoumaných látek po dobu 72 hodin. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 12.

OJ ítí • « « · · · · ·

- 38 • · · * ♦ « « • * · · · ··· • · · · · · · * · ε

p —

¹-i

M ω

C l'J c

-¹ c

•H c

u

CO

Γ*

C

Cd p

Ό p

P

E —i <

í— 3J P Q Rl ‘‘’'C «3

Γ-, P ρ >-.

O 3 O

C

JX -ΤΟ P c d P 3, >O 3 O X

c P ΰ O) 0) o²5 %> ií O ro ftd C	P o o c	0.001	0.296	1	0.065
s
ř*
o
0^ ť	t^f		i—1	iH	ΐ—(
r «	o		O	O	o
	o		O	o	o
P.CJ 2	o	1	o	o	o
s
					s
o
i—1				<0
0	m	rH		Co	'4?
3 X	c?	O		Ol	m
GXI	i—1	O			o
• C3		*		•	•
an tí	o	O	1	o	o
3
Ή i—i
P 0
0 3		P	m	1—i	lf>
3 P		o	'C	o	o
a c		o	rH	o	o
0		*	•	•	•
a x	1	o	o	o	o

		u			06
	o	OP	06	06	in
	o	(X	n	o\	00
<	Γ-*	o	0Ί	co
O”		—*	*—'
Q					P
	*zT	co	CJ	o	o
>>	>	in	03	σι	•
N · >,	♦			•	m
Ό Ό P	t—f	Ol			r~í
O - 0
Η « 3	-H	-H	+(	+1	+i
P
3 +r c		i-H	Ol	l“-\|	Ol
>3 0	MD	o	m	o	rH
sn a					*
»3 O	o	co	>	Lfi	m
3 3 R	Ul	—1	r?		sř
a x
					2
					o
			1—		o
			>	r-¹ y·*	1—i
			c —	P
			p a	c	4.
			jj CC	<D
		<	Φ —	Ol	a
		CÍ	a	c	(k 0
			<D	H	Ή
		S—i Λ	2 p>	3	2 C
		Γ»	T (0	(0	« Φ
	0	o	O JJ	p	o σ
	3	1—1	t—i -rt		r-4 CZ
	JJ	X	x e	2	X -P
	c	in	lO ι—1	«	in 3
	0	»	• (0	ó	• (0
	u	Ol	c; a	·—H	oj 2

• · · · 0 · 0 · t 0 · • 0 0 0 *000 0 00 0

000 · 0 0 · Φ ·

0000 ·· 00 0 · 00

- 39 Ί

Z výsledků v tabulce 12 je zřejmé, že 2,5 x 10 M kyseliny retínové účinně potlačuje koncentraci transglutaminázy I v keratinocy těch, a to až na 32 % hodnot u kontrol. Koncentrace 2,5 x ΙΟ’⁹ M retinylpalmitátu je neúčinná (93 %) a

-¹- 8

M naringeninu má jen malý inhibiční účinek na transglu-8 -9 taminazu I. Avšak kombinace 2,5 x 10 M retinolu a 10 M naringeninu snižuje koncentrací transglutaminázy I v keratinocytech na 85 % kontrolních hodnot. Jde tedy o synergní účinek, kombinace obou látek potlačuje diferenciaci keratinocytů obdobným způsobem jako kyselina retinová.

Příklad 13

Quercetin a retinol mají synergní inhibiční účinek na diferenciaci keratinocytů

Byl zkoumán účinek použitých látek po jejich působení 72 hodin na koncentraci transglutaminázy I, normalizovanou na obsah DNA v buňkách. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 13. Quercetin byl získán od firmy Sigma.

ΓΟΗ ctí

Η

Ό ctí

Η

ΰ * Η 1 Ή φ 0 □ L Ε Η .CJ ® ΰ° &	0.003	0.001	CO ΓΊ η ο	ι	ρ- η ο ο

S
Ρ» '			rM	Η	ιη
ο	Ο		Ο	ο	Η
0^Η	ο	1	ο	ο	ο
Α X	ο		ο	ο	ο
ο,ιη
ar* ž
κ
ο
PC
	ΓΊ	τΡ		CÚ	Ι>
X	'Τ	ο		<Ί	Η
ρ·	Ο	ο	I	γί	ο
ο	.				*
0 η	ο	ο		ο	ο
0 X
φΐη
& ΓΊ
Ο

4-> 0		Η	ΓΊ	η	I—ί
ΓΊ C ,		ο		ο	ο
£. Ρ	1	ο	ο	ο	ο
CL C 0		ο	ο	ο	ο
a -χ

		<ίΡ	dP	dP	dP
		ΓΊ	Ο	ιη	ο
		ιη	σι	00	C
ť_ Q		'—	*
Ν	\Ό	Η	00	C0	ο
ΓΊ	ο	Η	ΓΊ	ΊΟ
Ό Ό >.	•	•	•	⁴	*
Ο Ή	Η	ΓΊ	σ	η	C0
ί Εη Κ 0 8	-Η	+1	-Η	-Η	-Η
C +1 Ρ
>í1 J Γ	ΊΟ Λ3	(Η	γί		LTi
Sr ο	ιΗ Ο	σ	σ.	ο
<ο ο i	• ο (Τι Η	ιη	Η	σ	ro
a χ ρ.	<ο *—	η	ÚO	ιη	Η

			Η
			0
			C	C	ř C
			-ΓΊ	»γ4	•Η
			JJ	U	X Ρ
			φ	Φ	ο φ
		2	a	U	a ο
					η
		Σ	Σ	Φ	Σ Φ
		*·			? Φ
		ο	ο	σ	ο Ο
		ι—1	Η		Η
		X	X	Σ	X Σ
		ιη	LD		ιητ
			•	ο	• ο
		ΓΊ	ΓΊ	ι—(	ΓΊ ν'

• · · 9 9 * · • * « * 9 9 9 » • 9 9 9 9 9 9 • 9 · 9 « • · 9 · 99 9« · · • 9 9 · • · · · • · · · 9 9 9 • · 9 9 9 9

• ··♦

- 41 Z výsledků, uvedených v tabulce 13 je zřejmé, že kon_7 centrace 2,5 x 10 M kyseliny retinové účinně snižuje množství transglutaminázy I v keratinocytěch, a to až na 52 % _7 kontrolní hodnoty. Koncentrace 2,5 x 10 M retinolu je neúčinná (90 %) a 10 M quercetinu mělo jen malý inhibiční účinek na množství uvedeného enzymu. Avšak kombinace 2,5x10 M retinolu + 10 ® M quercetinu snížila koncentraci transglutaminázy v keratinocytech až na 70 % kontrolní hodnoty. Obe látky tedy měly synergní účinek a potlačovaly diferenciaci keratinocytů způsobem, srovnatelným s účinkem kyseliny retinové.

V průběhu uvedených zkoušek byla kyselina retinová použita jako pozitivní kontrola a referenční sloučenina, s níž byl srovnáván účinek dalších zkoumaných látek. Kyselina retinová snižuje koncentraci transglutaminázy I v keratinocytech pokožky v závislosti na použité dávce. Jinak řečeno, kyselina retinová snižuje diferenciaci keratinocytů. Retinol a retinylpalmitát jsou při inhibici diferenciace keratinocytů statisticky významně méně účinné než kyselina retinová.

Neočekávané výsledky, ilustrované jednotlivými příklady prokazují, že účinek retinolu nebo retinylesteru na keratinocyty, pěstované v buněčné kultuře je možno zvýšit až na účinek, srovnatelný s účinkem kyseliny retinové tak, že se retinol nebo jeho ester kombinuje se sloučeninou, která v koncentraci 100 yUM vyvolává alespoň 20% inhibici esterifikace retinolu, katalyzované LRAT nebo ARAT při měření zkouškou na mikrosomech in vitro. Tato látka se užije v množství 0,0001 až 50 % hmotnostních, vztaženo na celkové množství použitého prostředku. Získaný účinek je vyšší než účinek retinolu nebo jeho esteru nebo použité látky jako takové, jde o synergní účinek obou látek, vyvolávající u keratinocytů odpověď, srovnatelnou s účinkem kyseliny retinové.

• 0 • 0 • 0 • 00 0 0·

- 42 » 0 0 0 0 *·· 0 0 0 0 0 0 0 0 0 · 0 0 «

0000 00 «0

Svrchu uvedené výsledky prokazují, že sloučeniny, které splňují podmínky zkoušky in vitro na mikrosomech, působí synergním způsobem s retinolem a retinylestery a snižují diferenciaci kerabinucytů a/nebo zvyšují jejich proliferaci, takže jejich účinek na keratinocyty je obdobný účinku kyseliny retinové.

V následujících příkladech 14 až 19 jsou uvedeny různé kosmetické prostředky podle vynálezu, určené pro místní podání Prostředky je možno připravit obvyklým způsobem a použít je k běžnému účelu, zejména jsou tyto prostředky vhodné pro ošetření vrásek, drsné a suché pokožky, olupující se, stárnoucí a/nebo ultrafialovým zářením poškozené pokožky, kde mohou zlepšit celkový vzhled i pocit na pokožce. Prostředky jsou také určeny k použití na zdravou pokožku k prevenci nebo zpomalení jejího stárnutí.

Příklad 14

Tento příklad uvádí kosmetický prostředek podle vynálezu typu emulze voda v oleji s vysokým obsahem vnitřní fáze.

	% hmotnostní
A	B	C	D
retinol	0,5	-	-	0,01
retinylpalmitát	-	0,15	0,15	-
plně hydrogenovaný kokosový olej	3,9	3,9	3,9	3,9
naringenin	-	5	0,1	5
quercetin	1	i_	-	-
bríj 92^X	5	5	5	5
bentone 38	0,5	0,5	0,5	0,5

- 43 -	« • ft •	· · • ft « · • · • ft ftftftft	• ft · · · · · • · · · * · • · · ft • ft ·«	• · · · • ft ft · • · · « ·· • ft «« ftft
MgS0₄.7H_?0	0,3	0,3	0,3	0,3
butylovaný hydroxytoluen	0,01	0,01	0,01	0,01
parf ém	p 0	dle	pot	ř e by
voda do	100	100	100	100
Brij 92 je polyoxyethylen (2)	oleyle the r.
Příklad 15
Krém typu olej ve vodě
	%	hmotnostní
	A	B	c	D
retinylpalmitát	-	0,15	0,15	-
retinol	0,15	-	0,001	0,15
minerální olej	4	4	4	4
alfa-ionon		-	-	1
alf a-methylionon	-	0,5	-	-
lyral	-	-	-	0,2
isodamaskon	-	-	0,3	-
brij 56^X	4	4	4	4
alfol 16RD^X	4	4	4	4
triethanolamin	0,75	0,75	0,75	0,75
butan-1,3-di.ol	3	3	3	3
xanthanová guma	0,3	0,3	0,3	0,3
parf ém	podle	potřeby
butylovaný hydroxytoluen	0,01	0,01	0,01	0,01
voda do	100	100	100	100

« 1

119

-	44 -	• « · » « · «V ·»·*	• · » ♦ 1 1 • 1 1 · ·* · ·	• · · « · · • · • · · ·
x Brij 56 je cetylalkohol	POE (10)
^x Alfol 16RD je cetylalkohol.
Příklad 16
Lotion
		% hmotnostní
	A	B	c	D
retinol	-	0,15	0,15	-
retinylpalmitát	0,15	-	-	0,15
alfa-damaskon	0,1	-	0,1	-
geranylgeraniol	-	1	-	0,2
ethanol	40	40	40	40
parfém	podle	potřeby
butylovaný hydroxytoluen	0,01	0,01	0,01	0,01
voda do	100	100	100	100

Příklad 17
Tento příklad popisuje kosmetický	prostředek podle vynálezu
ve formě alkoholického lotionu.	% hmotnostní
retinol	0,15
oleylhydroxyethylimi dazolin	0,1
ethanol	40
antioxidacní látka	0,1
parf ém	podle potřeby
voda do	100

• to toto* •

• · · • to totototo - 45 -	« · · · toto to to to ·« • · · · · • · ·· ·· ··
Příklad 18
Tento příklad popisuje kosmetický prostředek inkn nnsinvací krém. «J * — Γ* ’	podle vynálezu
% hmotnostní
retínylpalmitát	0,01
kokoylhyčroxye thylimidazolin	0,1
silikonový olej 200 cts	7,5
giycery lmor.ostearát	3
cetostearylalkohol	1,6
poloxye thylen-(20)-čety1alkohol	1,4
xanthanová guma	0,5
parsol 1789	1,5
oktylmethoxycinnamát (Parsol MCX)	7
parfém	podle potřeby
barvivo	podle potřeby
voda do	100.
Příklad 19
Pletový krém nevodné povahy
% hmotnostní
retinylpalmitót	0,15
laurylhydroxyethylindazolin	1
silikonová pryž SE-30^	10
? kapalný silikon 345	20
3 kapalný silikon 344	55,79

- 46 a··· · · · · · · · • · v «to»·· · · « « ··· ··*· · · *to *·«· to· ·· toto

squalen	10
kyselina línolová i.	0,01
cholesterol	0,03
kyselina 2-hydroxy-n-oktanová	0,7
linoleát vitaminu E	0,5
květinový olej	0,5
ethanol	2.

dimethylsiíikonový polymer s molekulovou hmotností nejméně 50 000 a viskositou nejméně 10 000 cts při teplotě 25 °C, (GEC), cyklický pentamer dimethylsiloxanu (Dow Corning Corp.) tetramer dimethylsiloxanu (Dow Corning Corp.).

V případě, Se to v příkladech není uvedeno,jsou dále uvedené materiály dodávány uvedenými výrobci:

Palmitoyl CoA, BSA, diiauroylfosfatidylcholin, retinol, kyselina retinová, dithiothreitol- Sigma.

Cyklické nenasycené alifatické sloučeniny:

Damaskony - Firmenich

Tonony IFF, ostatní: uvedeno ve Flavor and Fragrance Materials, 1991, Allured Pub. Co.

Smáčeóla imidazolinové povahy: Oleylimidazolin byl Scherozoline 0 (Scher Chemical C.), ostatní od Mclntyre, pod názvem Mackezolin CY (kys, kaprylová), C (kokosový olej), L (kyselina laurová).

Zastupuje:

PATENTOVÉ

NÁROKY

Claims

• 4 44 β 4 4 · • · '

4 4» » · • * * 4 4

44 4, * 4 4 * 4 4 4« * *4 * * * · 4 ·« 4* • 4 »4 * 4 · I * 4 4 *44 441

1. Kosmetický prostředek pro péčí o plet, vyznačující se tím, že obsahuje

a) 0,001 až 10 % sloučeniny ze skupiny retinol, retinylester a směsi těchto látek,

b) 0,0001 až 50 % sloučeniny, která v koncentraci lOO^uM vyvolá inhibici nejméně 20 % esterifikace retinolu, katalyzované LRAT nebo ARAT při měření na mikrosomech in vitro, přičemž tato sloučenina je odlišná od amidu mastné kyseliny nebo óimethylimidazolidinonu a volí se ze skupiny cyklických alifatických nenasycených uhlovodíků, diterpenů a smáčedel typu hydroxyethylimidazolinových derivátů mastných kyselin vzorce I ř— N— CK,CE,0H (I) kde

R znamená alifatický nasycený nebo nenasycený uhlovodíkový zbytek s přímým nebo rozvětveným řetězcem, obsahující S až 20 atomů uhlíku, nebo směs těchto látek, a

o) nosič, přijatelný z kosmetického hlediska.

• 1 « · • « • « « « «

4 « · ·· * ·

- 48
2. Kosmetický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím,že jako cyklickou alifatickou nenesycenou sloučeninu obsahuje sloučeninu ze skupiny alfa-damaskon, beta-damaskon, delta-damaskon, isodamaskon, damascenon, alfa-ionon, beta-ionon, allyi-alfa-ionon, isobutylionon, alfa-methylionon, gajnma-methylionon, brahmanol, sandanol, alfa-terpineol, lyral, ethylsaffranát a směsi těchto látek.
3. Kosmetický prostředek podle nároku 1, v y znáčů j í c í se tím, ze jako diterpen obsahuje geranylgeraniol.
4. Kosmetický prostředek podle některého z nároků 1 až 3. vyznačující se tím, že jako retinylester obsahuje sloučeninu se skupiny retinylpalmitát, retinylacetát, retinylpropionát, retinyllinoleát nebo směsi těchto látek.
5. Způsob ošetřování pleti, vyznačující se tím, že se místně nanáší kosmetický prostředek podle některého z nároků 1 až 4.
6. Kosmetický postup pro napodobení účinku kyseliny retinové, vyznačující se tím, že se na plet nanáší kosmetický prostředek podle některého z nároků 1 až 4.

Zastupuje: