CZ104699A3

CZ104699A3 - Způsob ovlivnění pigmentace kůže u savců a kompozice k provádění tohoto způsobu

Info

Publication number: CZ104699A3
Application number: CZ19991046A
Authority: CZ
Inventors: Stanley S. Shapiro; Susan Niemec; John Kung; Miri Seiberg
Original assignee: Johnson & Johnson Consumer Companies, Inc.
Priority date: 1998-07-23
Filing date: 1998-07-23
Publication date: 2000-01-12

Abstract

Řešeníse týká způsobů pro ovlivnění pigmentace kůže u savců a „ kompozic k provádění těchto způsobů. Řešení se zejména týká j sloučenin, které ovlivňují melanogenezi akteré lze použítjako í depigmentační činidla nebojako činidla ztmavujíd kůži změnou i dráhy PAR-2.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobů vyvolání pigmentace a/nebo depigmentace kůže u savců a kompozic určených k provádění těchto způsobů. Vynález se týká zejména sloučenin, které ovlivňují melanogenezi a mohou být použity jako depigmentační činidla nebo jako činidla pro ztmavnutí pleti.

Dosavadní stav techniky

Zbarvením kůže se lidské bytosti zabývají mnoho let. Středem zájmu jednotlivců, kteří usilují o jednotný vzhled pleti, je zejména schopnost odstranit hyperpigmentaci, která se například projevuje ve stařeckých skvrnách, pihách nebo obecně na stárnoucí pleti. V určitých oblastech světa je žádoucí celkové vybělení těla. Rovněž existuje celá řada hypopigmentačních a hyperpigmentačních poruch, které je > třeba léčit. Pro mnohé jednotlivce je rovněž důležitá schopnost vytvořit opálený vzhled bez škodlivého vlivu slunečního záření. Jak pro pigmentaci tak pro depigmentaci kůže již byla navržena celá řada způsobů. Při depigmentaci kůže se například používá kyselina kojová, hydrochinon, retinoidy a další chemické sloučeniny. Pro opalování pokožky bez expozice sluncem se používá dihydroxyaceton a další podobné chemické sloučeniny.

• · · ·

01-676-99 Če

Mnohá z předcházejících řešení nebyla přijata. Mezi plochami kůže, na které se tyto kompozice aplikovaly, se často objevuje patrná oddělující linie. Pro dosažení požadovaného výsledku je tedy nezbytná přesná aplikace všech těchto sloučenin. Zjistilo se, že mnoho těchto sloučenin dráždí pokožku a jejich použití je tedy nežádoucí.

Chemická a enzymatická podstata melanogeneze je poměrně dobře zdokumentována. Melanocyty migrují z embryonální nervové trubice (neural crest) do pokožky, kde produkují sekreční granule melanosomy, které produkují melanin. Melanogeneze probíhá v melanosomu a melanin je později pomocí melanocytových dendritů distribuován do keratinocytů. Klíčovým enzymem při melanogenezi je tyrosináza, která iniciuje sled reakcí, při kterých se tyrosin převádí na biopolymerní melanin. V současné době jsou známy dva proteiny odvozené z tyrosinázy (TRP), TRP-1 a TRP-2. Tyto proteiny sdílí s tyrosinázou přibližně 40% homologii a jejich katalytická aktivity spočívají v regulaci melanogeneze. TRP-1 je nejčastější glykoprotein v melanocytech.

I přesto, že je chemická a enzymatická podstata melanogeneze dobře zdokumentována, její regulace na buněčné úrovni je prostudována pouze částečně. Tyrosináza a TRP sdílejí strukturní a biologické vlastnosti s genovou rodinou membránového proteinu spojeného s lysosomem (LAMP) a proto jejich zacílení na melanosomální membránu může indukovat jejich aktivaci. Na regulaci melanogeneze se může podílet fosforylační a defosforylační reakce na cytoplasmatických zakončeních těchto proteinů. Ukázalo se, že beta isoform rodiny proteinkinázy C (PKC) reguluje

01-676-99 Če • · humánní melanogenezi prostřednictvím tyrosinové aktivace. Genová exprese tyrosinázy, TRP-1 a TRP-2 je koordinovaná. Všechny tři enzymy se exprimují v humánním epidermu. V melanocytech, kultivovaných společně s keratinocyty, se tyto transkripty exprimují v poměru 45:45:10. V melanocytech kultivovaných samostatně jsou přítomny pouze transkripty TRP-1, což naznačuje, že signál odvozený z keratinocytů se podílí na koordinační expresi těchto genů. Regulace vzájemných reakcí keratinicytů a melanocytů a mechanizmus přenosu melanosomu do keratinocytů nejsou ještě zcela pochopeny.

Proteázou aktivovaný receptor-2 (PAR-2) je receptor sedmi spárovaných transmembránových G-proteinů, které jsou odvozeny z trombinových receptorů (TR, rovněž označované jako PAR-1 a PAR-3), ale liší se svou sekvencí. Oba receptory jsou proteolyticky aktivovány arginin-serinovým štěpením na mimobuněčné doméně. Nově vzniklý N-konec se následně aktivuje těmito receptory jako navázanými ligandy. Oba tyto receptory by mohly být aktivovány trypsinem, ale pouze TR jsou aktivovány trombinem. Pouze PAR-2 je aktivován tryprázou žírné buňky. Oba receptory by mohly být rovněž aktivovány peptidy, které odpovídají jejich novým N-zakončením, nezávisle na receptorovém štěpení. SLIGL myší PAR-2 aktivační peptid je stejně účinný při aktivaci humánního receptoru. Zatímco funkce TR je dobře zdokumentována, biologie PAR-2 nebyla doposud zcela zdokumentována. Nedávno byla popsána úloha PAR-2 aktivace při inhibici růstu a diferenciace keratinocytů (Derian a kol., „Differential Regulation of Human Keratinocyte Growth and Differentiation by a Novel Family of Protease-activate Receptors, Cell Growth & Differentiation, sv. 8, str. 743749, červenec 1997).

01-676-99 Če • · · • ·

Podstata vynálezu

Vynález se týká způsobu ovlivnění pigmentace kůže savců zahrnujícího topickou aplikaci sloučeniny, která ovlivňuje PAR-2 dráhu, na kůži savce. Kompozice podle vynálezu pro zvýšení pigmentace může obsahovat jednu nebo více sloučenin, které působí jako trypsin, tryptáza, serinproteáza nebo PAR-2 agonizující činidla. Kompozice pro snížení pigmentace , nebo pro depigmentaci kůže podle vynálezu mohou alternativně obsahovat jednu nebo více sloučenin, které působí jako inhibitory serinproteázy, trypsinové inhibitory, trombinové inhibitory, tryptázové inhibitory a inhibitory PAR-2 dráhy nebo jako PAR-2 antagonizující činidla.

Výrazem „savec, jak je zde uveden, se rozumí libovolný člen vyšších obratlovců zahrnujících třídu „savci, která je definována ve Webster's Medical Desk Dictionary 407 (1986), včetně lidí. Výraz „receptor, jak je zde uveden, má zahrnovat jak intracelulární tak extracelulární receptory a má označovat ty molekuly, které jsou schopny přijímat a převádět signál. Výraz PAR-2 označuje proteázou aktivovaný receptor-2 nebo příslušný proteázou aktivovaný receptor. Proteázou aktivovaný receptor-2 (dále jen „PAR-2) je serinproteázou aktivovaný receptor, který se exprimuje v celé řadě tkání včetně keratinocytů a fibroblastů. Trombinový receptor (rovněž označovaný PAR-1, zde dále jen „TR) je serinproteázou aktivovaný receptor, který se aktivuje v celé řadě tkání včetně keratinocytů. Biologické role PAR-2 a TR v kůži nejsou zcela známy. Nicméně se zjistilo, že vzájemné reakce mezi keratinocyty a melanocyty, vedené přes dráhu PAR-2, ovlivňují melanogenezi. Rovněž se zjistilo, že trombinové

φ φ

ΦΦΦ·

01-676-99 Če inhibitory a/nebo tryptázové inhibitory a/nebo trypsinové inhibitory a PAR-antagonizujíci činidla lze použit jako depigmentačni činidla bez toho, že by došlo k podrážděni kůže. PAR-2 agonizujici činidla a serinproteáza, jakou je například trypsin a tryptáza, lze použít jako ztmavující činidla. PAR-2 by mohl být rovněž dále použit jako cíl pro bělící a ztmavující činidla.

Stručný popis obrázků

Obr. 1A znázorňuje graf ukazující zvýšení nebo snížení relativní pigmentace epidermálních ekvivalentů obsahujících melanocyty, které byly ošetřeny známými pigmentačními a depigmentačními činidly za použití způsobu podle vynálezu;

Obr. IB znázorňuje graf ukazující zvýšení nebo snížení relativní pigmentace v epidermálních ekvivalentech obsahujících melanocyty, které byly ošetřeny způsoby a kompozicemi podle vynálezu;

Obr. 2 znázorňuje skupinu zobrazení epidermálních ekvivalentů obsahujících melanocyty, které byly ošetřeny PAR-2 agonizujícími činidly a sloučeninou I;

Obr. 3 znázorňuje graf zvýšení nebo snížení relativní pigmentace v epidermálních ekvivalentech obsahujících melanocyty, které byly ošetřeny způsoby a kompozicemi podle vynálezu;

Obr. 4A znázorňuje graf závislosti dávky a odezvy s ohledem na pigmentaci epidermálních ekvivalentů obsahujících melanocyty, které byly ošetřeny kompozicemi podle vynálezu;

0 ·00 ·

01-676-99 Ce

Obr. 4B ekvivalentů ultrafialovým znazornuie obsahuj ících světlem, po graf odezvy melanocyty které následovalo ošetření epidermálních po expozici kompozicemi podle vynálezu;

Obr. 5A znázorňuje fotografii gelů ukazujících expresi TR a PAR-2 v kůži, melanomových buňkách a epidermálních ekvivalentech obsahujících melanocyty;

Obr. 5B znázorňuje fotografii gelů ukazujících expresi TR a PAR-2 primárními humánními melanocyty;

Obr. 6A a 6B znázorňují fotografie gelů ukazujících expresi různých genů po ošetření různými kombinacemi sloučeniny I a SLIGRL;

Obr. 7 znázorňuje graf ukazující účinky různých kompozic podle vynálezu na světlost pigmentace struků morčete;

Obr. 8 znázorňuje fotografii kůže yucatánského prasete, které bylo ošetřeno kompozicemi podle vynálezu určenými pro depigmentaci kůže;

Obr. 9 znázorňuje graf světlosti kůže yucatánského prasete v průběhu ošetření způsoby a kompozicemi podle vynálezu;

Obr. 10A, 10B, 10C a 10D znázorňují fotografie F&M zabarvených histologických sekcí kůže yucatánského prasete, které bylo ošetřeno kompozicemi obsahujícími sloučeninu I v koncentracích 0, 10 μΜ, 50 μΜ a 250 μΜ za použití způsobu podle vynálezu;

Obr. 11A, 11B a 11C znázorňují fotografie epidermálních ekvivalentů obsahujících melanocyty, které • · ··· ·

01-676-99 Če byly ošetřeny kompozicemi podle vynálezu, získané pomoci elektronového mikrografu;

Obr. 11E, 11F a 11H znázorňuji fotografie kůže yucatánského prasete, která byla ošetřena kompozicemi podle vynálezu, získané pomocí elektronového mikrografu;

Obr. 11D a 11G znázorňují fotografie neošetřených míst kůže yucatánského prasete, získané pomocí elektronového mikrografu;

Obr. 12A, 12B, 12C, 12D a 12E znázorňují fotografie histologických F&M zabarvených sekcí kůže yucatánského prasete následujícím způsobem: 12A ukazuje neošetřenou kůži; 12B ukazuje kůži ošetřenou kompozicemi podle vynálezu po osmitýdenním ošetření; 12C ukazuje kůži 1 týden po ukončení ošetření; 12D ukazuje kůži 2 týdny po ukončení ošetření; a 12E ukazuje kůži 4 týdny po ukončení ošetření;

Obr. 13 znázorňuje fotografii F&M zabarvených histologických sekcí kůže yucatánského prasete, které bylo ošetřeno kompozicemi podle vynálezu;

Obr. 14 znázorňuje digitální fotografie lidské kůže před ošetřením a po ošetření kompozicemi podle vynálezu, které byly pořízeny při ultrafialovém světle a při viditelném světle.

4 4 4 4 4

99 44« «4«

4 4 4

01-676-99 Če

Nyní se zjistilo, že trypsin, tryptáza a PAR-2 agonizující činidlo lze použít pro zvýšení pigmentace a že trypsinové inhibitory a/nebo tryptázové inhibitory a/nebo trombinové inhibitory a PAR-2 antagonizující činidla mají vliv na snížení pigmentace kůže savců. Dá se předpokládat, že některé sloučeniny popsané v patentu US 5,523,308 (zde zahrnut formou odkazů), které se chovají jako trombinové a/nebo trypsinové a/nebo tryptázové inhibitory, budou vhodné při provádění způsobů podle vynálezu. Některé z těchto sloučenin, které rovněž popsal Costanzo a kol. v „Potent Thrombin Inhibitors That Probe the S_x Subsite: Tripeptide Transition State Analogues Based on a Heterocycle-Activated Carbonyl Group, J. Med. Chem., 1996, sv. 39, str. 3039-4303, mají následující strukturní vzorec:

H

ve kterém:

A se zvolí z množiny zahrnující alkylovou skupinu s 1 až 8 atomy uhlíku, karboxyalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, alkoxykarbonylalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku a v alkylovém zbytku, fenylalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovanou fenylalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s

♦ • ·

01-676-99 Ce až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), formylovou skupinu, alkoxykarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku, alkylkarbonylovou skupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, fenylalkoxykarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku, cykloalkylkarbonylovou skupinu se 3 až 7 atomy uhlíku v cykloalkylovém zbytku, fenylkarbonylovou skupinu, substituovanou fenylkarbonylovou skupinu (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), alkylsulfonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxysulfonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylsulfonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, fenylsulfonylovou skupinu, substituovanou fenylsulfonylovou skupinu (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém •· 9 99 9

01-676-99 Če

99 99

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 • · · 999 9 9 9 zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), 10-kafrosulfonylovou skupinu, fenylalkylsulfonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovanou fenylalkylsulfonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, alkylsulfinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroakylsulfinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, fenylsulfinylovou skupinu, substituovanou fenylsulfinylovou skupinu (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), fenylalkylsulfinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovanou fenylalkylsulfinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, 1-naftylsulfonylovou skupinu, 2-naftylsulfonylovou skupinu nebo substituovanou naftylsulfonylovou skupinu (ve které se naftylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), 1-naftylsulfinylovou skupinu, 2-naftylsulfinylovou skupinu nebo substituovanou naftylsulfinylovou skupinu (ve které se naftylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s *·4·

01-676-99 Ce «4 44

4 4 4 • 4 · 4 • ··· «44

4 · 44 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku);

D nebo L aminokyselina, která se naváže svým karboxylovým koncem na dusík v obecném vzorci I, se zvolí ze skupiny tvořené alaninem, asparaginem, kyselinou 2-azetidinkarboxylovou, glycinem, N-alkylglycinem s 1 až 8 atomy uhlíku, prolinem, kyselinou 1-amino-l-cykloalkylkarboxylovou se 3 až 8 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, kyselinou thiazolidin-4-karboxylovou, kyselinou 5,5-dimethylthiazolidin-4-karboxylovou, kyselinou oxadolidin-4-karboxylovou, kyselinou pipekolinovou, valinem, methioninem, cysteinem, serinem, threoninem, norleucinem, leucinem, terč.-leucinem, isoleucinem, fenylalaninem, 1-naftalaninem, 2-naftalaminem, 2-thienylalaninem, 3-thienylalaninem, kyselinou [1, 2,3, 4]tetrahydroisochinolin-l-karboxylovou a kyselinou [1,2,3,4]tetrahydroisochinolin-2-karboxylovou, přičemž dusíkový konec uvedené aminokyseliny se naváže na člen zvolený z množiny zahrnující alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, 5-tetrazolylalkylovou skupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, karboxyalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, alkoxykarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku a v alkylovém zbytku, fenylalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovanou fenylalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s

01-676-99 Če • 99 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), 1,1-difenylalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, 3-fenyl2-hydroxypropionylovou skupinu, 2,2-difenyl-l-hydroxyethylkarbonylovou skupinu, [1,2,3,4]tetrahydroisochinolin-1karbonylovou skupinu, [1,2,3,4]tetrahydroisochinolin-3karbonylovou skupinu, 1-methylamino-l-cyklohexankarbonylovou skupinu, 1-hydroxy-l-cyklohexankarbonylovou skupinu, 1hydroxy-l-fenylacetylovou skupinu, 1-cyklohexyl-l-hydroxyacetylovou skupinu, 3-fenyl-2-hydroxypropionylovou skupinu, 3,3-difenyl-2-hydroxypropionylovou skupinu, 3-cyklohexyl-2hydroxypropionylovou skupinu, formylovou skupinu, alkoxykarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku, alkylkarbonylovou skupinu s 1 až 12 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, perfluoroalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, alkylkarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, fenylalkylkarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovanou fenylalkylkarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), 1,1-difenylalkylkarbonylovou

01-676-99 Če skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovanou 1,1-difenylalkylkarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku) , perfluoroalkylsulfonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, s 1 alkylsulfonylovou skupinu alkoxysulfonylovou skupinu az až atomy atomy uhlíku, uhlíku, fenylsulfonylovou skupinu, substituovanou fenylsulfonylovou skupinu (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), 10-kafrosulfonylovou skupinu, fenylalkylsulfonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovanou fenylalkylsulfonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, perfluoroalkylsulfinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, alkylsulfinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, fenylsulfinylovou skupinu, substituovanou fenylsulfinylovou skupinu (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku

01-676-99 Če hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), 1-naftylsulfonylovou skupinu, 2-naftylsulfonylovou skupinu, substituovanou naftylsulfonylovou skupinu (ve které se naftylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), 1naftylsulfinylovou skupinu, 2-naftylsulfinylovou skupinu a substituovanou naftylsulfinylovou skupinu (ve které se naftylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 alkylovém zbytku, alkoxyskupin s 1 až hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku);

atomy uhlíku v 4 atomy uhlíku, nebo je polypeptid tvořen dvěma aminokyselinami, přičemž první aminokyselinou je D nebo L aminokyselina, která je navázána svým karboxylovým zakončením na atom dusíku v obecném vzorci I a která se zvolí z množiny zahrnující glycin, N-alkylglycin s 1 až 8 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, alanin, kyselinu 2-azetidinkarboxylovou, prolin,

01-676-99 Če

kyselinu thiazolidin-4-karboxylovou, kyselinu 5,5-dimethylthiazolidin-4-karboxylovou, kyselinu oxazolidin-4-karboxylovou, kyselinu 1-amino-l-cykloalkylkarboxylovou se 3 až 8 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, 3-hydroxypropolin, 4hydroxyprolin, 3-alkoxyprolin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku, 4-alkoxyprolin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku, 3,4-dehydroprolin, kyselinu 2, 2-dimethyl-4thiazolidinkarboxylovou, kyselinu 2,2-dimethyl-4-oxadolidinkarboxylovou, kyselinu pipekolinovou, valin, methionin, cystein, asparagin, serin, threonin, leucin, terč.-leucin, isoleucin, fenylalanin, 1-naftalanin, 2-naftalanin, 2-thienylalanin, 3-thienylalanin, kyselinu [1,2,3,4]tetrahydroisochinolin-2-karboxylovou, alkylester kyseliny 4-aspartové s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku a alkylester kyseliny 5-glutamové s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku;

a druhá D nebo L aminokyselina je navázána na dusíkový konec uvedené první aminokyseliny a zvolí se z množiny zahrnující fenylalanin, 4-benzoylfenylalanin, 4-karboxyfenylalanin, 4-karboxyalkylfenylalanin s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovaný fenylalanin (ve kterém se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), 3-benzothienylalanin, 4bifenylalanin, homofenylalanin, kyselinu oktahydroindol-2karboxylovou, 2-pyridylalanin, 3-pyridylalanin, 4-thia99 9

01-676-99 Če

9

9 9 • 9 zolylalanin, 2-thienylalanin, 3-(3-benzothienyl)alanin, 3thienylalanin, tryptofan, tyrosin, asparagin, 3-trialkylsilylalanin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, cyklohexylglycin, difenylglycin, fenylglycin, methioninsulfoxid, methioninsulfon, 2,2-dicyklohexylalanin, 2-(1-naftylalanin), 2-(2-naftylalanin), fenylem substituovaný fenylalanin (ve kterém se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), kyselinu aspartovou, alkylester kyseliny 4-aspartové s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, kyselinu glutamovou, alkylester kyseliny 5-glutamové s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, cykloalkylalanin se 3 až 8 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovaný cykloalkylalanin se 3 až 8 atomy uhlíku v alkylovém zbytku (ve kterém je kruh substituován karboxyskupinou, alkylkarboxyskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxykarbonylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku nebo aminokarbonylovou skupinou), 2,2-difenylalanin a všechny alfa alkylové skupiny s 1 až 5 atomy uhlíku všech derivátů těchto aminokyselin, přičemž dusíkový konec uvedené druhé aminokyseliny je nesubstituovaný nebo monosubstituovaný členem množiny zahrnující formylovou skupinu, alkylovou skupinu s 1 až 12 atomy uhlíku, 5tetrazolylalkylovou skupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, karboxyalkylovou skupinu s 1 až 8 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, karboalkoxyalkylovou skupinu s 1

01-676-99 Če až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, fenylalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovanou fenylalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), 1,1-difenylalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, alkoxykarbonylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxyzbytku, fenylalkoxykarbonylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxyzbytku, alkylkarbonylovou skupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, perfluoroalkylalkylkarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v prvním alkylovém zbytku a s 0 až 4 atomy uhlíku ve druhém alkylovém zbytku, fenylalkylkarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovanou fenylalkylkarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), perfluoroalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxykarbonylovou skupinu s 1 až 4

01-676-99 Če Σ Σ Σ ’ í Σ Σ * ’*: Σ

9 99999 99 99 atomy uhlíku, 10-kafrosulfonylovou skupinu, fenylalkylsulfonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, substituovanou fenylalkylsulfonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, alkylsulfinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, perfluoroalkylsulfinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, fenylsulfinylovou skupinu, substituovanou fenylsulfinylovou skupinu (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), fenylalkylsulfinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovanou fenylalkylsulfinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, 1-naftylsulfonylovou skupinu, 2-naftylsulfonylovou skupinu, substituovanou naftylsulfonylovou skupinu (ve které se naftylový substituent zvolí z alkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupiny, halogenoskupiny, amidoskupiny, nitroskupiny, aminoskupíny, alkylaminoskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupiny nebo alkoxykarbonylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), 1-naftylsulfinylovou skupinu, 2-naftylsulfinylovou skupinu a substituovanou naftylsulfinylovou skupinu (ve které se naftylový substituent zvolí z alkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, • · · · · ·

01-676-99 Če • · · · A A ·

A · A · A · • A · A · A A

A A · · · · ·· · ····· perfluoroalkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupiny, halogenoskupiny, amidoskupiny, nitroskupiny, aminoskupiny, alkylaminoskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupiny nebo alkoxykarbonylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku);

Ri se zvolí z množiny zahrnující atom vodíku a alkylovou skupinu;

R₂ se zvolí z množiny zahrnující aminoalkylovou skupinu se 2 až 5 atomy uhlíku, guanidinoalkylovou skupinu se 2 až 5 atomy uhlíku, alkylguanidinoalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v prvním alkylovém zbytku a se 2 až 5 atomy uhlíku ve druhém alkylovém zbytku, dialkylguanidinoalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v každém prvním alkylovém zbytku a se 2 až 5 atomy uhlíku ve druhém alkylovém zbytku, amidinoalkylovou skupinu se 2 až 5 atomy uhlíku, alkylamidinoalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v prvním alkylovém zbytku a se 2 až 5 atomy uhlíku ve druhém alkylovém zbytku, dialkylamidinoalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v každém z prvních alkylových zbytků a se 2 až 5 atomy uhlíku ve druhém alkylovém zbytku, alkoxyalkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku v alkoxyzbytku a se 2 až 5 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, fenylovou skupinu, substituovanou fenylovou skupinu (ve které se substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více aminoskupin, amidinoskupin, guanidinoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, atomů halogenu, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1

9 9999

01-676-99 Če • · 9

9 9

999 999

9

9 9 9 až 3 atomy uhlíku nebo nitroskupin), benzylovou skupinu, substituovanou benzylovou skupinu (ve které se substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více aminoskupin, amidinoskupin, guanidinoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, atomů halogenu, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 3 atomy uhlíku nebo nitroskupin), hydroxyalkylovou skupinu se 2 až 5 atomy uhlíku, alkylaminoalkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku v prvním alkylovém zbytku a se 2 až 5 atomy uhlíku ve druhém alkylovém zbytku, dialkylaminoalkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku v každém prvním alkylovém zbytku a se 2 až 5 atomy uhlíku ve druhém alkylovém zbytku, 4-aminocyklohexylalkylovou skupinu s 0 až 2 atomy uhlíku v alkylovém zbytku a alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku;

p znamená 0 nebo 1;

B znamená

l r₃ ve kterém n znamená 0 až 3, R₃ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, přičemž karbonylová část substituentu B je navázána na substituent E;

• · · · · · ·· ··

01-676-99 Ce > · · · ·· · ···

E znamená heterocyklickou skupinu zvolenou z množiny zahrnující 2-oxazolinylovou skupinu, 2-oxazolylovou skupinu, 2-thiazolylovou skupinu, 5-thiazolylovou skupinu, 4thiazolylovou skupinu, 2-thiazolinylovou skupinu, 2-imidazolylovou skupinu, 4-oxo-2-chinoxalin-2-ylovou skupinu, 2-pyridylovou skupinu, 3-pyridylovou skupinu, benzo[b]-2thiofenylovou skupinu, 4-triazolylovou skupinu, 6-triazolylovou skupinu, 2-pyrazolylovou skupinu, 4,5,6,7-tetrahydrobenzo-2-thiazolylovou skupinu, nafto[2,1-d]-2-thiazolylovou skupinu, nafto[1,2-d]-2-thiazolylovou skupinu, 2chinoxalinylovou skupinu, 1-isochinolinylovou skupinu, 3isochinolinylovou skupinu, benzo[b]-2-furanylovou skupinu, 2-pyrazinylovou skupinu, 2-chinazolinylovou skupinu, 5-isothiazolylovou skupinu, 3-isothiazolylovou skupinu, 8-purinylovou skupinu a substituovanou heterocyklickou skupinu, ve které se substituenty zvolí z množiny zahrnující alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupinu, halogenoskupinu, amidoskupinu, nitroskupinu, aminoskupinu, alkylaminoskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupinu, alkoxykarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku, hydroxy- nebo fenylalkylaminokarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku. Vynález se rovněž týká farmaceuticky přijatelných solí těchto sloučenin.

Zejména některé ze sloučenin výše uvedeného obecného vzorce, který obsahuje d-fenylalanin-prolin-argininový motiv, by měly být účinné při inhibici PAR-2 dráhy a měly

01-676-99 Če ·· ·· • · ·

I · · · ·· · ··· • · ·· ·· by způsobovat depigmentaci. Zvláště výhodnou sloučeninou, která se chová jako trombinový a trypsinový inhibitor a je účinná při depigmentaci kůže savců, je (S)-N-methyl-Dfenylalanyl-N-[4- [ (aminoiminomethyl)amino]-1-(2-benzothiazolylkarbonyl)butyl]-L-prolinamid (podle Chemical

Abstracts) (dále jen „sloučenina I). V rámci způsobů a kompozic podle vynálezu lze jako účinnou složku rovněž použít další sloučeniny, které jsou analogy sloučeniny I nebo mají obdobnou funkci jako sloučenina I a jsou uvedeny v patentu US 5,523,308. V rámci způsobu podle vynálezu lze rovněž použít další sloučeniny, které inhibují trypsin, například serinproteázové inhibitory, a zejména trypsinový inhibitor izolovaný ze sójových bobů (STI). Ke snížení pigmentace tímto mechanizmem lze dále použít extrakty ze sójových bobů, měsíční fazole a černé fazole a další přírodní produkty, vyrobené z těchto luštěnin, například fazolové mléko, fazolová pasta, fermentovaná pasta ze sójových bobů apod.

Dalšími zdroji serinproteázových inhibitorů mohou být extrakty z druhů, které spadají do následujících rostlinných rodů: lilkovité (například brambora, rajče, lilek apod.); trávy (například rýže, pohanka, sorghum, pšenice, ječmen, oves apod.); tykvovité (například okurky, tykve, lufa apod.); a výhodně luštěniny (například fazole, hrách, čočka, podzemnice olejná apod.).

Aniž bychom se vázali na konkrétní teorii, zjistili jsme, že sloučeniny, které jsou schopné ovlivnit pigmentaci kůže, tohoto účinku dosahují přímou nebo nepřímou reakcí s PAR-2 keratinocytu nebo s jeho aktivační proteázou a přímým nebo nepřímým ovlivněním melanogeneze. Sloučeniny podle • · · · · · • ·

01-676-99 Če ·· ·· • · * • · * • · · · · · • · • · ·· vynálezu pravděpodobně v případě zvýšení pigmentace indukují signál pro transport melanosomů melanocyty nebo pro příjem melanosomů keratinocyty v kůži nebo, v případě snížené pigmentace, tento signál redukují.

Sloučeniny, které jsou účinné v kompozicích a ve způsobech podle vynálezu lze dodávat topicky, libovolným způsobem, který je znám odborníkům v daném oboru. Pokud to dopravní parametry topicky účinného, farmaceutického nebo kosmetického činidla vyžadují, potom lze topicky účinnou kompozici podle vynálezu dále formulovat s farmaceuticky nebo kosmeticky přijatelným vehikulem, které má funkci dopravního systému a umožňuje pronikání topicky účinného činidla do kůže.

Přijatelným vehikulem pro topickou dopravu některých kompozic podle vynálezu, zejména proteinů, jakými jsou například trypsin a STI, mohou být liposomy. Výhodnějšími pro použití v rámci vynálezu jsou neiontové liposomy, které zahrnují a) glyceroldilaurát (výhodně v množství přibližně 5 % hmotn. až 70 % hmotn.); b) sloučeniny, které mají steroidový hlavní řetězec a které se nacházejí v cholesterolu (výhodně v množství přibližně 5 % hmotn. až 45 % hmotn.); a c) alespoň jeden ester mastné kyseliny, který má přibližně 12 až 18 atomů uhlíku (výhodně v celkovém množství přibližně 5 % hmotn. až 70 % hmotn.), přičemž stavební sloučeniny liposomu jsou výhodně přítomny v poměru přibližně 37,5:12,5:33,3:16,7. Nejvýhodnějšími jsou liposomy tvořené glyceroldilaurátem/cholesterolem/polyoxyethylen-10-stearyletherem/polyoxyethylen-9-lauryletherem (GDL liposomy). Výhodně jsou liposomy přítomny v množství přibližně 10 mg/ml až přibližně 100 mg/ml a výhodněji přibližně 20 mg/ml až 50 mg/ml, vztaženo k • « • ·

0

01-676-99 Če

0« 00*0 ·» • 0 00 0 0 0 0

0 0 0

000 000 0 0

00 celkovému objemu kompozice. Nejvýhodnější je poměr přibližně 37,5:12,5:33,3:16,7. Vhodné liposomy mohou být výhodně připraveny pomocí postupu, který je popsán v Příkladu 1, nicméně přijatelné jsou rovněž ostatní metody, běžně používané v daném oboru. Výše popsanou kompozici lze připravit smísením požadovaných složek ve vhodném zásobníku, přičemž jejich míšení se provádí za pokojových podmínek, v jakémkoliv běžném směšovacím zařízení s vysokou smykovou účinností, které je v daném oboru známo jako zařízení pro přípravu neiontových liposomů. Takovým zařízením může být například zařízení, které popsal Niemiec a kol., v „Influence of Nonionic Liposomal Composition On Topical Delivery of Peptide Drugs into Pilosebacious Units: An In Vivo Study Using the Hamster Ear Model, 12 Pharm. Res. 1184-88 (1995) (Niemiec). Zjistilo se, že přítomnost těchto liposomů v kompozicích podle vynálezu může zvyšovat depigmentační schopnost některých kompozic podle vynálezu.

Další výhodné formulace mohou například obsahovat sójové mléko nebo další kapalné formulace získané přímo z luštěnin nebo dalších vhodných rostlin. Taková formulace může například obsahovat vysoké procento sójového mléka, emulgátor, který udržuje fyzickou stabilitu sójového mléka, a případně chelatační činidlo, konzervační činidlo, zvlhčovadlo a/nebo zahušťovadla nebo gelační činidla.

Jako vehikula pro dopravu kompozic podle vynálezu lze rovněž použít odborníkům v daném oboru známé emulze typu olej ve vodě, emulze typu voda v oleji, formulace na bázi rozpouštědel a vodné gely.

Zdroj účinné složky, která má být použita pro formulaci podle vynálezu, bude zpravidla záviset na

01-676-99 Če • ·

44·· • 9 • 4 • · • · ·· 4· 44

4 4 4 · 4 4 • 4 · 4 4·· • · 4 · 444 444 « 4 4 4

44 4· 44 příslušné formě sloučeniny. Malé organické molekuly a peptidylové fragmenty lze chemicky syntetizovat v čisté formě, která je vhodná pro farmaceutické a kosmetické účely. Produkty přírodních extraktů lze čistit v daném obru známými technikami. Odborníkům v daném oboru jsou rovněž dostupné rekombinantní zdroje těchto sloučenin.

U alternativních provedení se může topicky aplikovatelná účinná farmaceutická kompozice nebo kosmetická kompozice případně zkombinovat s dalšími přísadami, jakými jsou například zvlhčovadla, kosmetické adjuvansy, antioxidanty, bělící činidla, inhibitory tyrosinázy a další známá depigmentační činidla, povrchově aktivní činidla, pěnidla, kondicionéry, vůně, regulátory viskozity, pufrační činidla, konzervační činidla, sluneční filtry apod. Kompozice podle vynálezu mohou rovněž obsahovat účinná množství retinoidů (tj. sloučenin, které se váží na libovolné členy z rodiny retinoidových receptorů), které zahrnují například tretinoin, retinol, estery tretinoinu a/nebo retiniolu apod.

Topicky účinnou farmaceutickou nebo kosmetickou kompozici je třeba aplikovat v účinném množství, které vyvolá změny pigmentace kůže savce. Výraz „účinné množství, jak je zde uveden, znamená množství dostatečné pro pokrytí oblasti povrchu kůže, na které má být provedena změna pigmentace. Pokud je požadována změna pigmentace, potom se kompozice volně aplikuje na povrch kůže v množství přibližně 2 μΐ/cm² až 200 μΐ/cm² topicky účinného činidla. Při použití trombinového a trypsinového inhibitoru, jakým je například sloučenina I nebo její analogy, bez ohledu na to, zda jsou syntetického nebo přírodního původu, by měla kompozice obsahovat přibližně 0,0001 % až 15 % hmotn./obj.

• · · · • ·

01-676-99 Če • · · · · · • · · · · * • ·· ··· ··· účinné složky. Výhodněji by měla účinná složka tvořit přibližně 0,0005 % až 5 % hmotn./obj. kompozice a nejvýhodněji by měla tvořit přibližně 0,001 % až 1 % hmotn./obj. kompozice. Tato rozmezí jsou samozřejmě navržena pro předchozí složky. U agonizujících/antagonizujících činidel a/nebo inhibitorů dráhy PAR-2, které mají vyšší terapeutický účinek a které nevyžadují významnější koncentrace nebo dávky, pokud mají být účinné při provádění způsobu podle vynálezu, lze naznačené rozmezí koncentrací snížit. Tyto sloučeniny mohou být syntetického nebo přírodního původu.

V kompozicích podle vynálezu lze kapalné deriváty a přírodní extrakty vyrobené přímo z rostlin nebo botanických zdrojů použít v koncentraci (hmotn./obj.) přibližně od 1 % do 99 %. Frakce přírodních extraktů a proteázových inhibitorů přírodního původu, jakým je například STI, mohou mít odlišné výhodné rozmezí, tj. přibližně 0,01 % až 20 % hmotn./obj. a výhodněji přibližně 1 % až 10 % hmotn./obj. kompozice. Je samozřejmé, že směsi účinných činidel podle vynálezu lze kombinovat a použít společně v jediné formulaci nebo je lze aplikovat postupně v různých formulacích.

Nyní se neočekávaně zjistilo, že pokud se topicky účinná činidla, například agonizující činidla PAR-2 a/nebo inhibitory a trypsin a/nebo trombin a/nebo tryptáza a/nebo jejich inhibitory, topicky aplikují na kůži zvířete, potom se dosáhne podstatné změny pigmentace kůže. Depigmentační činidla (a rovněž další činidla ovlivňující pigmentaci podle vynálezu) se výhodně aplikují na kůži savce při relativně vysoké koncentraci a dávce (přibližně 0,005 % až 1 % hmotn./obj. sloučenin, které mají vysoký terapeutický

01-676-99 Ce ·· ·· ► ♦ · · » · · · • · · · · · • · • · · · účinek, například sloučenina I a odvozené sloučeniny; přibližně 20 % až 99 % hmotn./obj. kapalných derivátů a extraktů botanických materiálů; a přibližně 1 % až 20 % hmotn./obj. frakcí přírodních extraktů a proteázových inhibitorů přírodního původu, například STI nebo jeho směsi) jednou až dvakrát denně tak dlouho, dokud se na kůži neobjeví změna pigmentace. To může být přibližně čtyři až deset týdnů, nebo i déle. Po dosažení změny pigmentace se frekvence a množství aplikované účinné složky sníží (v případě sloučenin, které mají vysoký terapeutický účinek, například sloučeniny I a odvozených sloučenin, na přibližně 0,00001 % až 0,005 % hmotn./obj.; v případě kapalných derivátů a extraktů botanických materiálů přibližně 10 % až 90 % hmotn./obj.; a v případě přírodních extraktů a proteázových inhibitorů přírodního původu, jako například STI nebo jeho směsi, na 0,01 % až 5 %), přičemž tato množství se aplikují například jednou denně až dvakrát týdně. Účinky účinných činidel podle vynálezu jsou vratné a pro jejich udržení je tedy nutná kontinuální aplikace těchto činidel.

Následující příklady mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně stanoven přiloženými patentovými nároky.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Účinek proteázových inhibitorů na pigmentaci

Pro studii pozitivní úlohy PAR-2 dráhy při pigmentaci se použil in vitro epidermální ekvivalentní systém. Použitý

01-676-99 Če hydrochinon, epidermální epidermální ekvivalentní systém obsahoval melanocyty. Jedním takovým epidermálním ekvivalentním systémem, který lze při této studii použít, je systém MelanoDerm od společnosti MatTek Co. Tento systém obsahuje normální humánní melanocyty společně s normálními humánními epidermálními keratinocyty, které se kultivovaly tak, že vytvořily vícevrstvý, vysoce diferencovaný model humánního epidermu. V následujících příkladech se ekvivalenty tři dny ošetřovaly testovanými sloučeninami a vzorky se sklidily čtvrtý den po zahájení ošetřování. Sklizené ekvivalenty se zabarvily barvivý DOPA (substrát pro tyrosinázu) a H&E (standardní histologické barvivo) nebo barvivém FontanaMason (F&M), což je další barvivo, známé odborníkům v daném oboru. Zabarvování pomocí F&M je technika zabarvování stříbrem, která jasně a čistě označuje melaniny, které mají vysokou redukční aktivitu na dusičnan stříbrný. Vícevrstvé ekvivalenty humánního epidermu obsahující melanocyty se používají jako in vitro modelový systém pro studii účinků proteázových inhibitorů na melanogenezi. Použité epidermální ekvivalenty byly komerčními produkty společnosti MatTek, Ashland, MA. O těchto ekvivalentech je známo, že v odezvě na ultrafialové B („UVB) záření a na známá bělící činidla, jakými jsou například benzaldehyd a zvyšují resp. snižují pigmentaci. Tyto ekvivalenty MelanoDerm se exponovaly benzaldehydem (Sigma, St. Louis, MO), hydrochinonem (Sigma, St. Louis, MO) a UVB radiací. UV radiace se generovala světelným zdrojem UVB FS v expoziční komoře při odstraněné krycí desce a v přítomnosti fosfátem pufrovaného solného roztoku (PBS od společnosti Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) ve spodní části komory. UVB intenzita se měřila pomocí UVX radiometru (UVP lne., San Gabriel, CA). Ekvivalenty se ·· ···· · · · • · · · · · • · · · ·

01-676-99 Če • · · ··· · · · ošetřily intenzitou 0,1 až 0,12 J/cm². U ekvivalentů ošetřených intenzitou 0,3 J/cm² nebyla pozorována žádná ztráta životaschopnosti.

Čtvrtý den expozice testovanými sloučeninami/ultrafialovou radiaci se ekvivalenty fixovaly, nařezaly a zabarvily nebo se zabarvily jako celek, bez rozděleni na řezy. Ekvivalenty MelanoDerm se fixovaly formalinem a daly do parafinových bloků, přičemž řezy z ekvivalentů MelanoDerm se zabarvily následujícími standardními postupy: (1) H&E, (2) DOPA + H&E a (3) Fontana-Mason („F&M) za použití standardních technik, které jsou odborníkům v daném oboru známy. Alternativně se zabarvily celé ekvivalenty MelanoDerm a jejich obrazy se zachytily pro obrazovou analýzu. Při této studii se použily alespoň tři řezy každého ekvivalentu a tři ekvivalenty na každý experiment. Každý experiment se zopakoval třikrát. DOPA je substrát pro tyrosinázu. F&M identifikuje molekuly redukující dusičnan stříbrný, které identifikují přednostně melaniny. Řezy zabarvené F&M se použily pro obrazovou analýzu, k níž se použil systém Optomax Image Analysis Systems od společnosti Optomax lne., Hollis, NH. Alternativně se pro zachycení obrazu použila databáze Empire Images 1.1 na počítači Gateway 2000 P5-100 (Media Cybernetics, Silver Springs, MD) . Pro obrazovou analýzu se použil program Image Pro Plus verze 4.0. Při analýze se měřily následující parametry: v případě systému Optomax (1) hladina pigmentace v jednotlivých melanocytech a (2) počet pigmentovaných melanocytů na pole; nebo v případě systému Image Pro (1) povrchová plocha, kterou zaujímají melanocyty s uloženým stříbrem a (2) počet pigmentovaných melanocytů. Při použití systému Optomax se povrchová plocha stříbra, uloženého v • · • 1

01-676-99 Če jednotlivých melanocytech, měřila v šedesáti melanocytech za použití množiny řezů tří ekvivalentů na ošetření. Počet melanocytů na pole se vypočetl z těchto řezů. „Pigmentační faktor se definoval jako průměrná povrchová plocha stříbra uloženého v jednom melanocytů, vynásobená počtem pigmentovaných melanocytů na pole. Hodnota jedna byla navržena pro neošetřené kontrolní vzorky a hodnoty ošetřených skupin se normalizovaly s jejich relevantními kontrolními vzorky. Při použití systému Image Pro se povrchová plocha dusičnanu stříbrného, uloženého v jednotlivých melanocytech, a počet melanocytů měřily pro celé ekvivalenty. Hodnota jedna byla navržena pro neošetřené kontrolní vzorky a hodnoty ošetřených skupin se normalizovaly s jejich relevantními kontrolními vzorky.

Obr. IA znázorňuje graf zvýšení nebo snížení relativní pigmentace, měřené a vypočtené systémem Image Pro z celého ekvivalentu výše popsaným způsobem, ke kterému dojde při exponování benzaldehydem (50 μΜ), hydrochinonem (50 μΜ) a UVB radiací (0,12 J/cm²).

Humánní epidermální ekvivalenty se rovněž exponovaly směsmi proteázových inhibitorů, které jsou konkrétně vymezeny v níže uvedené Tabulce A. Použitými proteázovými inhibitory byly produkty společnosti Boehringer Mannheim, Indianopolis, IN. Použily se tablety Complete Protease Inhibitor Cocktail od společnosti Boehringer Mannheim, které obsahovaly inhibitory chymotrypsinu, termolysinu, papainu, pronázy, extraktu slinivky a trypsinu. Inhibitor trypsinu ze sójových bobů („STI), získaný od společnosti Sigma, se rozpustil v 50 mg/ml liposomového vehikula nebo v lxPBS. Všechny ostatní proteázové inhibitory použité v tomto in vitro příkladu se rozpustily v lxPBS. GDL liposomy

• · · · • ·

01-676-99 Če se připravily výše popsaným způsobem Niemice a kol., ve kterém se provedly následující změny: neiontová liposomová formulace obsahovala glyceroldilaurát (Emulsynt GDL, ISP Van Dyk)/cholesterol (Croda)/polyoxyethylen-10-staerylether (Brij76, ICI)/polyoxyethylen-9-laurylether v poměru 37,5:12,5:33,3:16,7. Jako vodná fáze při přípravě liposomů se použil pufr Hepes, 0,05M, pH 7,4 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD). U těchto směsí proteázových inhibitorů a různých kombinací serinproteázových inhibitorů se testovala schopnost ovlivňovat melanogenezi. Jak ukazuje Obr. IB, některé tyto serinproteázové inhibitory, zejména STI (trypsinový inhibitor izolovaný ze sójových bobů), byly při inhibici melanogeneze velmi účinné.

Tabulka A

Testovaná formulace	Složky
Complete	Celková směs proteázových inhibitorů x25
Směs-1	Serinproteázové inhibitory - 90 pg/ml fenylmethylsulfonylfluoridu („PMSF) a 50 gg/ml L-l-chloro-3-[4-tosylamido]4-fenyl-2-butanonu („TPCK)
Směs-2	Serinproteázové inhibitory - 0,1 gg/ml aprotininu, 50 gg/ml trypsinového inhibitoru ze sójových bobů („STI)z 0,5 gg/ml leupeptinu a 0,25 gg/ml (Ll-chloro-3-[4-tosylamido]-7-amino-2heptanon-HCl) („TLCK)
STI	Trypsinový inhibitor ze sójových bobů - 1 mg/ml

01-676-99 Ce

Přiklad 2

Na pigmentaci se podílí receptor aktivovaný proteázou

Příklad 1 demonstruje, že STI redukuje pigmentaci. STI inhibuje trypsin. Protože o trypsinu se ví, že aktivuje TR a PAR-2, testovala se jeho možná účast na pigmentaci TR a PAR-2. Humánní epidermální ekvivalenty MelanoDerm se ošetřovaly denně, po dobu tří dnů, agonizujícími a antagonizujícími činidly TR a PAR-2, které jsou uvedeny v Tabulce B. Čtvrtý den se vzorky sklidily, fixovaly a zabarvily DOPA, H&E nebo F&M. Histologická analýza a analýza celkového ekvivalentu odhalily změny v pigmentaci, ke které došlo v důsledku ošetření. Obr. 2 ukazuje výsledky tohoto příkladu. Z tohoto obrázku vyplývá, že PAR-2 peptidové agonizující činidlo SLIGRL indukuje pigmentaci v jednotlivých melanocytech. Výsledkem ošetření sloučeninou I a inhibitorem trombinu a trypsinu bylo snížení pigmentace.

Obr. 3 ukazuje výsledky studií popsaných v tomto příkladu, které reprezentují hladinu pigmentace v ekvivalentech MelanoDerm ošetřených reakčními činidly TR a PAR-2. Agonizující činidla SLIGRL a PAR-2 podstatně zvýšily pigmentaci, což naznačuje, že by se PAR-2 mohla podílet na pigmentaci. Hirudin, trombin-specifický inhibitor, a TFLLRNPNDK, TR selektivní agonizující činidlo, neměly žádný vliv na pigmentaci. Nicméně SFLLRN, což je méně specifické agonizující činidlo, mělo tendenci zesvětlovat neboli redukovat pigmentaci. To naznačuje menší pravděpodobnost podílu TR na pigmentaci.

• · · ·

01-676-99 Če

Tabulka B

Reakční činidlo TR a PAR-2	Popis
Trombin	Aktivuje TR
Trypsin	Aktivuje TR a PAR-2
TFLLRNPNDK	TR Peptidové agonizujici činidlo - aktivuje pouze TR
SLIGRL	PAR-2 Peptidové agonizujici činidlo - aktivuje pouze PAR-2
SFLLRN	TR Peptidové agonizujici činidlo - aktivuje TR, TR, křížově reaguje s PAR-2
FSLLRN	Smíšený peptid - inaktivní
Hirudin	Specifický inhibitor trombinu
Sloučenina I	Inhibitor trombinu a trypsinu

Přiklad 3

Závislost dávka-odezva mezi signalizací proteázou aktivovaných receptorů a melanogenezí

Ekvivalenty MelanoDerm se ošetřily zvýšenými koncentracemi (0, 10 a 50 μΜ) SLIGRL, peptidového agonizujícího činidla PAR-2, stejným způsobem, jaký byl popsán v Příkladu 2. F&M zabarvení se provedlo čtvrtý den. Jak ukazuje Obr. 4A, zvýšení koncentrací SLIGRL, aktivátoru PAR-2, vedlo ke zvýšení pigmentace. Trypsin, aktivátor PAR-2, měl podobný efekt. Zvýšení koncentrací sloučeniny I, inhibitoru trombinu a trypsinu, z 0,1 pM na 1 μΜ při ošetření způsobilo snížení pigmentace (viz Obr. 4A). Předošetření ekvivalentů UVB zářením zvýšilo melanogenezí oproti neošetřeným kontrolním vzorkům. Jak je patrné z Obr. 4B, sloučenina I byla rovněž schopna redukovat tuto

• 9 ·♦··

01-676-99 Če pigmentaci indukovanou UVB zářením. Tento příklad demonstruje závislost dávka-odezva pro zvyšování a snižování pigmentace modulací signalizace PAR-2. Tento příklad rovněž ukazuje, že sloučenina I může inhibovat pigmentaci a zabraňovat pigmentaci indukované UV zářením.

Příklad 4

PAR-2 se exprimuje v keratinocytech, ale nikoliv v melanocytech

Exprese PAR-2 a TR byla již dříve demonstrována v keratinocytech a fibroblastech. Tento příklad ukazuje, že k expresi PAR-2 dochází v keratinocytech, ale nikoliv v melanocytech. Tento příklad dále ukazuje, že exprese TR probíhá jak v keratinocytech tak v melanocytech. V tomto příkladu se použily humánní epidermální ekvivalenty MelanoDerm humánní primární melanocytové kultury (neonatální a dospělé, získané od společnosti Clonetics, San Diego, CA) a melanomové buňky myší Cloudman S91 ze sbírky ATCC, Rockville, MD, které se nechaly růst v kultuře a ze kterých se pomocí reakčního činidla „RNA Stat-60, dostupného od „Tel-Test B, které se zabudovalo způsobem popsaným Chomczymskim v „Single Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-phenol-chloroform exctraction, 162 Anal. Biochem. 156-69 (1987), izolovaly celkové RNA. Do extrahované RNA každého vzorku se potom přidalo dostatečné množství RNázy-prosté DNázy od společnosti Promega Corporation, která je prodávána pod obchodním označením „RQ1 RNase-free DNase, takže každý příslušný produkt poskytl při použití postupu popsaného v protokolu „RQ1 RNase-free DNase publikovaném společností

9 ·99 9

9

01-676-99 Če

999

9

Promega Corporation (květen 1995) 200 ng DNázované RNA. Výsledných 200 ng DNázované RNA se podrobilo reverzní transkripci („RT), k níž se použil postup popsaný v protokolu „Superscript II Reverse Transcriptase, publikovaném společností Gibco-BRL (nyní Life Technologies, Incorporated) (duben 1992), a nahodilé hexamery, například nahodilé primery, které jsou komerčně dostupné od společnosti Life Technologies Incorporated.

Výsledné RT produkty se potom amplifikovaly polymerázovou řetězovou reakcí („PCR) za použití přibližně 0,5 jednotky (na 100 μΐ reakční směsi) tepelně stabilní DNA polymerázy, která je komerčně dostupná pod obchodním označením „Taq polymerase u společnosti Perkin-Elmer-Cetus Corporation a přibližně 0,1 gmolu/reakční směs TR a PAR-2 specifických primerů, které jsou popsány v Tabulce C a Marthinussem a kol., 1995, nebo glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázových (G3PDH) primerů, dostupných od společnosti Clontech Laboratories, lne., Palo Alto, CA, za použití postupů popsaných Marthinussem a kol., 1995, nebo v protokolu přiloženém k primerům od společnosti Clontech Laboratories.

PCR produkty se následně analyzovaly za použití 2% agarózo/ethidiumbromidových gelů v daném oboru známými způsoby a srovnávala se úroveň exprese určitých genů v keratinocytech a melanocytech. V některých případech se pro lepši vizualizaci výsledné PCR produkty vysrážely za použití známých postupů ethanolem. Při použití G3PDH primerů se použilo pouze 10 % PCR reakčních produktů. Jako negativní kontrola pro každou PCR amplifikaci se použil RNA vzorek epidermálních ekvivalentů, který nepodstoupil reverzní transkripci. Nedostatek genomových DNA • · · · · · • »

01-676-99 Ce

kontaminantů se indikoval absencí pásu na relevantních liniích v gelech. RNA vzorek lidské kůže, který se podrobil reverzní transkripci, se použil jako pozitivní kontrola v případě, kdy nebyly dostupné komerční pozitivní kontroly. Migrace RT-PCR produktů na gelech byla vždy identická s migrací pozitivních kontrolních vzorků a s migrací zaznamenaných amplimerních velikostí.

Relativní množství každého RT-PCR produktu se následně porovnala na základě analýzy hladiny mRNA G3PDH, „provozního genu, v každém příslušném produktu. Jak ukazuje Obr. 5 a 6, genová exprese G3PDH je ve všech analyzovaných časových okamžicích podobná a je tedy možné provést srovnání relativních úrovní genové exprese požadovaných genů.

Obr. 5A ukazuje, že TR a PAR-2 se podle očekávání exprimují v celé kůži a v ekvivalentech MelanoDerm („MD) . Nicméně melanomové buňky S91 („S91) PAR-2 nebo TR neexprimují. Za účelem ověření tohoto faktu se TR a PAR-2 exprese dále testovala v primárních melanocytech novorozence („mel-NB) a dospělého jedince („mel-A). Jak ukazuje Obr. 5B, primární humánní melanocyty exprimují TR, ale nikoli PAR-2. Z toho lze usuzovat, že PAR-2 agonizující a antagonizující činidla mohou reagovat s keratinocyty ale nikoli s melanocyty v ekvivalentech MelanoDerm a že TR agonizující a antagonizující činidla by mohla reagovat jak s keratinocyty tak melanocyty. Lze tedy usuzovat, že je to právě vzájemná reakce mezi keratinocytem a melanocytem, během které se keratinocyto-PAR-2 signál převede na pigmentační koncový bod.

·· ····

01-676-99 Če ·· ·· ·· • · · · · 9 • · · · 9 · · · 999 ··· • · · ·

99

Tabulka C ukazuje některé použité DNA primery, množství MgCl₂ potřebné pro PCR reakci a délku PCR cyklu.

Tabulka C

DNA primery použité při RT-PCR testu

Primer (viz navázaná sekvence)	Množství MgCl₂ (mM)	Cyklus (min) @ °C	Počet cyklů	DNA Seq.ID No.
Tyrosináza smyslná TCAGCCCAGCAT CCTTCTTC	1,25	1 @ 94 2 @ 55 3 @ 72	35	1
Tyrosináza protismyslná CAGCCATTGTTC AAAAATACTGTC C	1,25	1 @ 94 2 @ 55 3 @ 72	35	2
TRP-1 smyslný 5' CCACTCTAAT AAGCCCAAAC	2,5	1 @ 94 2 @ 55 3 @ 72	35	3
TRP-1 protismyslný 5'CTCAGCCATT CATCAAAGAC	2,5	1 @ 94 2 @ 55 3 @ 72	35	4
TRP-2 smyslný 5'AAAAGACATA CGAGATTGCC	2,5	1 @ 94 2 @ 55 3 @ 72	35	5
TRP-2 protismyslný 5'CACAAAAAGA CCAACCAAAG	2,5	1 β 94 2 @ 55 3 @ 72	35	6

»· ·»··

01-676-99 Če « »· ·· ·* ·· · · · · · · • · · · · ♦ ♦ • · · · ··· ··· • · · · · ··· ·· ·· ·· pokračování

Primer (viz navázaná sekvence)	Množství MgCl₂ (mM)	Cyklus (min) @ °C	Počet cyklů	DNA Seq.ID No.
Trypsin smyslný 5'ATCC/TACTC CTGATCCTTACC	2,5	1 @ 94 2 0 55 3 @ 72	35	7
Trypsin protismyslný 5'TGTCATTGTT /CCAGAGTCT/CT/GC/GC	2,5	1 0 94 2 Θ 55 3 0 72	35	8
PAR-2 smyslný GGGAAAGGGGTT GGGGTAGAACCA GGCTTTTCC (5' )	2,5	0,5 0 94 2 0 55 3 0 72	30	9
PAR-2 protismyslný GGCCAACGGCGA TGTTTGCCTT- CTTCCTGGGG (3' )	2,5	0, 5 0 94 2 0 55 3 0 72	30	10
TR smyslný CCTCTGAGTGCC AGAGGTACGTCT ACAG(5 ’ )	2,5	0,5 0 94 2 0 55 3 0 72	30	11
TR protismyslný CCTAAGTTAACA GCTTTTTGTAT- ATGCTGTTATTC AGG(3')	2, 5	0,5 0 94 2 0 55 3 0 72	30	12

φφ φφφφ

01-676-99 Če • · φ φφφ • φ · · »♦ * φφ φφ φ φ • · · ft φ φ φ φφφ φφφ φ · • φ φ · φ φ β « • φ φ ·

Φ·· φφφ φ φ φφ φφ pokračování

Primer (viz navázaná sekvence)	Množství MgCl₂ (mM)	Cyklus (min) @ °C	Počet cyklů	DNA Seq.ID No.
Trombin smyslný AACCTGAAGGAG ACGTGGAC(3')	2,5	0,5 @ 94 2 @ 55 3 @ 72	35	13
Trombin protismyslný CAGGAGCCCAGA ATATGAGTG (5' )	2, 5	0,5 @ 94 2 @ 55 3 @ 72	35	14

Příklad 5

Pro depigmentační účinek sloučeniny I je nutný kontakt keratinocytu s melanocytem

Z výsledků Příkladu 4 vyplývá, že melanocyty samotné nemohou odpovídat depigmentačnímu účinku PAR-2 antagonizujících činidel. Ve skutečnosti není hladina pigmentace humánních primárních melanocytů nebo choleratoxinem indukovaných S91 buněk, která je redukována hydrochinonem a benzaldehydem, ovlivněna sloučeninou I. Protože PAR-2 se neexprimuje v melanocytech, analyzovala se možná potřeba vzájemných reakcí mezi keratinocytem a melanocytem pro depigmentační účinek sloučeniny I. Primární melanocytové kultury se porovnávaly s identickými kulturami chráněnými pod epidermálními ekvivalenty (EpiDerm, trpící nedostatkem melanocytů) s cílem vytvořit ko-kulturu bez kontaktu mezi keratinocyty a melanocyty. Ty se rovněž porovnaly s ekvivalenty MelanoDerm, ve kterých jsou melanocyty přítomny v bazální vrstvě ekvivalentu. Kultury

01-676-99 Če • · · se tři dny ošetřovaly sloučeninou I, PAR-2 agonizujícím činidlem SLIGRL a TR agonizujícím činidlem TFLLRNPNDK, které uvádí Tabulka D, a čtvrtý den se obarvily pomocí DOPA. V Tabulce D jsou keratinocyty označeny písmenem „K, melanocyty jsou označeny písmenem „M a absence kontaktu keratinocytů s melanocyty je označena jako „Žádný K-M kontakt. Jak uvádí Tabulka D, u primárních melanocytů a u ko-kultur, ošetřených těmito činidly, nebyl pozorován žádný pigmentační účinek. U ekvivalentů MelanoDerm sloučenina I pigmentaci redukovala, SLIGRL pigmentaci indukoval a TFLLRNPNDK neměl na pigmentaci žádný vliv. Tyto výsledky ukazují, že kontakt mezi keratinocyty a melanocyty je potřebný pro PAR-2 účinek na pigmentaci.

Tabulka D

Ošetření	Melanocyty (žádný K)	Ko-kultury (žádný K-M kontakt)	MelanoDerm (K-M kontakt)
Sloučenina I	Žádný účinek	Žádný účinek	Zesvětlení
SLIGRL	Žádný účinek	Žádný účinek	Ztmavení
TFLLRNPNDK	Žádný účinek	Žádný účinek	Žádný účinek

Příklad 6

Sloučenina I ovlivňuje genovou expresi melanocytů

Ekvivalenty MelanoDerm se ošetřily zvýšenými koncentracemi trombinového a trypsinového inhibitoru a sloučeniny I nebo sníženými koncentracemi PAR-2 agonizujcího činidla SLIGRL. RNA extrahované z neošetřených ekvivalentů a z ekvivalentů ošetřených sloučeninou I se analyzovaly pomocí RT-PCR, způsobem popsaným v Příkladu 4,

01-676-99 Če ··· 9 · 9 9 · • · · 9 9 9 9

9 99 999 999

999 99 99 99 s cílem stanovit genovou expresi. Pro analýzu se použily genově specifické primery, jejichž seznam uvádí Tabulka C, a dále se použily Clontech primery pro humánní G3PDH, popsané v Příkladu 4. Melanogenovými geny, u kterých se testovala úroveň exprese, byly tyrosináza, TRP-1 a TRP-2.

Dávkově závislé snížení mRNA úrovní v TRP-1 a dávkově závislé zvýšení mRNA úrovně v TRP-2 bylo, jak ukazuje Obr. 6A, pozorováno u vzorků ošetřených sloučeninou I. Exprese tyrosinázy však nebyla ovlivněna. Tyto změny odpovídají dávkově dependentnímu bělícímu efektu tohoto inhibitoru. Oba vzory genové exprese mají za následek zesvětlující účinek. TRP-2 enzym zpracovává dopachinon na kyselinu 5,6-dihydroxyindolkarboxylovou (DHICA) a nikoliv na 5, 6-dihydroxyindol (DHI). Tento proces má za následek vznik hnědého, jemně dispergovaného eumelaninu, narozdíl od nerozpustného, černého eumelaninu a tedy světlejšího tónu kůže. TRP-1 stabilizuje melanogenový komplex, který umožňuje produkci pigmentu. Snížení koncentrace TRP-1 má za následek snížení tyrosinázové aktivity a snížení pigmentace. Nedostatek tohoto proteinu vede k albinismu. Zvýšené koncentrace SLIGRL však genovou expresi melanogenu neovlivnily (Obr. 6B).

TRP-1 a TRP-2 jsou specifické pro melanocyt. Sloučenina I inhibuje trypsin a trombin. Hirudin, specifický trombinový inhibitor, jak je patrné z výše uvedeného Příkladu 2, pigmentaci neovlivňuje. Na základě těchto zjištění jsme se rozhodli zjistit, zdali se v kůži exprimuje trypsin a trombin. Sonda, navržená jak pro detekci mozkového tak žaludečního trypsinu, která je uvedena v Tabulce C, detekovala expresi obou mRNA v •· ···· · ·· ·· ·· ·· · · · · · · · « · • · · ··· · · · · ~ s ········ ··· ···

01-676-99 Ce ·..· ; ..· ..· kompletním vzorku mRNA kůže, dostupného od společnosti Invitrogen, Carlsbad, CA, a stejně tak v ekvivalentech MelanoDerm. Stejný expresní vzor byl detekován pro trombin.

V normálních melanocytech se neexprimoval ani trypsin ani trombin (Obr. 5A, B) . Z těchto údajů vyplývá, že pokud by trypsin aktivoval PAR-2, potom by mohl být produkován pouze keratinocyty. Jak ukazuje Obr. 6A, ošetření sloučeninou I vedlo ke zvýšení exprese trypsinu. SLIGRL, který neovlivňoval genovou expresi melanogenu (Obr. 6B), rovněž zvýšil expresi trypsinu v testovaných ekvivalentech. Z těchto poznatků lze vyvodit, že zatímco je trypsin možným přírodním aktivátorem PAR-2 v kůži a pravděpodobně ovlivňuje pigmentaci, koncentrace jeho mRNA s pigmentací nekoreluje. Z toho vyplývá, že přírodním aktivátorem PAR-2 v epidermu je ještě další neidentifikovaná serinproteáza, která je inhibována sloučeninou I, STI apod. Sloučeniny, které indukují nebo inhibují tuto proteázu, by mohly sloužit jako ztmavující resp. zesvětlující činidla.

Příklad 7

Účinky trombinových a trypsinových inhibitorů a PAR-2 agonizujících činidel na pigmentaci in vivo

Jeden pigmentovaný struk dvou morčat se dvakrát denně, pět dní v týdnu, po dobu 7 týdnů ošetřoval sloučeninou I, přičemž dávka činila 1 až 10 μΜ ve vehikulu tvořeném směsí ethanolu a propylenglykolu v poměru 70:30. Další struk obou zvířat se ošetřoval pouze vehikulem a sloužil jako kontrolní. Chromametrické měření odhalilo po sedmi týdnech ošetřování dávkově dependentní zesvětlující účinek + 9, 6 L* • ·

01-676-99 Če resp. téměř 18 L* jednotek. Žádné viditelné známky podráždění nebyly v této době zpozorovány.

Dále se použily čtyři skupiny po třech morčatech, z nichž každé se dvakrát denně, pět dní v týdnu, po dobu osmi týdnů ošetřovalo sloučeninou I, SFLLRN, FSLLRN a SLIGRL v dávce 10 μΜ. Chromametrické měření po šesti týdnech ukázalo zesvětlující účinek sloučeniny I a ztmavující účinek SLIGRL a PAR-2 agonizujícího činidla. Výsledky získané v tomto příkladu uvádí Obr. 7.

Příklad 8

Yucatánské prasátko se ošetřilo sloučeninou I, SFLLRN, FSLLRN a SLIGRL v dávce 10 μΜ. Každá sloučenina se aplikovala na dvě místa prasete dvakrát denně, pět dní v týdnu po dobu osmi týdnů. Po osmitýdenním ošetřování se provedla chromametrická měření. Aplikace sloučeniny I přinesla viditelný zesvětlující účinek. Aplikace PAR-2 agonizujícího činidla SLIGRL měla ztmavující účinek a aplikace SFLLRN a FSLLRN neměla žádný podstatnější účinek.

Dvě yucatánská prasata se ošetřovala sedm a půl týdne nebo deset týdnů, dvakrát denně, pět dní v týdnu zvýšenými koncentracemi sloučeniny I. Pro ošetření se použily následující čtyři koncentrace účinné sloučeniny: 0, 10, 50 a 250 μΜ. Aplikační místa se nacházela na opačných stranách hřbetu prasat. Chromametrická měření se provedla před zahájením ošetřování a potom vždy po dvou týdnech. Obrázky ·· · · · · · ···· ··· ··· · · · · _ V ········ ··· ···

01-676-99 Ce ·..· ; ..· ..· se zaznamenávaly periodicky a na konci experimentu. Viditelný zesvětlující účinek byl pozorován při ošetřování dávkami 250, 50 a 10 μΜ během čtvrtého, pátého resp. šestého týdne ošetřování. Na konci osmého týdne byl zesvětlující účinek dvou nejvyšších dávek podobný. Tyto výsledky jsou znázorněny na Obr. 8. Chromametrické odečty (L*, měřená světlost) pořízené během ošetřování jednoho prasete znázorňuje Obr. 9. Je zde pozorován saturační účinek, což je závislost času a koncentrace. Tento příklad demonstruje viditelný depigmentační účinek sloučeniny I na zvířecím modelovém systému, který je nejpodobnější pigmentované lidské kůži.

Na konci těchto experimentů se odebraly biopsie pro histologickou analýzu a analýzu pod elektronovým mikroskopem (EM). Histologické vzorky se obarvily H&E a F&M. H&E zabarvení ukázalo, že ve stavbě kůže nedošlo k žádnému podráždění, zánětlivé odezvě nebo změnám, což demonstruje bezpečné používání sloučeniny I po delší časové periody. F&M zabarvení demonstrovalo, že jak v bazální vrstvě, tak v celém epidermu ošetřených vzorků došlo ke snížení pigmentace. Tyto výsledky jsou znázorněny na Obr. 10. Neošetřené vzorky a vzorky ošetřené vehikulem (Obr. 10A) byly identické a nej tmavší. Ošetření dávkou 10 μΜ (Obr. 10B) způsobilo snížení pigmentace a ošetření dávkami 50 a 250 μΜ (Obr. 100 resp. 10D) poskytly nej světlejší vzorky.

Z výsledků získaných v tomto příkladu vyplývá, že maximálního bělícího účinku sloučeniny I by bylo možné dosáhnout krátkodobým ošetřováním vyšší koncentrací sloučeniny nebo dlouhodobějším ošetřováním nižší

01-676-99 Ce koncentrací sloučeniny. Požadovaného vybělení pleti lze tedy dosáhnout pomocí alespoň dvou režimů ošetřování.

Příklad 9

Ultrastrukturní studie demonstrující účinek sloučeniny I na kůži in vitro a in vivo

Tato ultrastrukturní analýza se prováděla na ekvivalentech MelanoDerm a na kůži prasete ošetřené sloučeninou I. U ekvivalentů MelanoDerm ošetřených sloučeninou I se pomocí elektronové mikroskopie analyzovala tvorba a distribuce melanosomů. Ošetřené vzorky obsahovaly v melanocytech více melanosomů, ale méně zralých melanosomů, tj . melanosomů, které vykazovaly sníženou produkci melaninu, v porovnání s neošetřenými kontrolními vzorky (Obr. ΙΑ, 11B). Dendrity obsahující melanosomy se snadno identifikovaly v ošetřených keratinocytech (Obr. 11C), ale obtížně se nacházely v kontrolních keratinocytech. To ukazuje na abnormální tvorbu melanosomů a pomalý nebo nespárovaný přenos melanosomů do keratinocytů v ošetřených vzorcích.

Vzorky kůže yucatánského prasete, ošetřované osm týdnů sloučeninou I způsobem popsaným v Příkladu 8, se rovněž analyzovaly elektronovou mikroskopií. Melanosomy v keratinocytech ošetřených míst kůže byly v porovnání s kontrolními vzorky menší a méně pigmentované (Obr. 11D, 11E a 11F). Distribuce melanosomů v ošetřených místech kůže byla rovněž abnormální. Melanosomy se detekovaly zejména na epidermálně-dermálním rozhraní narozdíl od neošetřených kontrolních vzorků, ve kterých byla distribuce melanosomů • · · · · ·

01-676-99 Če nahodilá (Obr. 11G, 11H). Aniž bychom mohli vyloučit další mechanizmy, domníváme se, že keratinocyty ošetřené sloučeninou I nejsou schopny aktivně přijímat melanosomy z přítomných dendritů.

Příklad 10

In vivo depigmentační účinek sloučeniny I je reverzibilní

Yucatánské prase se na osmi místech ošetřovalo sloučeninou I, podávanou v dávce 250 μΜ dvakrát denně, pět dní v týdnu po dobu osmi týdnů. Na konci ošetřování vykazovala všechna místa viditelnou depigmentaci (viz Obr. 12B) . Po následující čtyři týdny (měřeno od devátého týdne experimentu) se barva ošetřených míst monitorovala a každý týden se z ošetřených míst odebraly dvě biopsie. U neošetřených míst se rovněž provedla biopsie. Depigmentační účinek bylo možné sledovat první a druhý týden po ošetření a úplný zvrat byl pozorován čtvrtý týden po ošetření. Histologická analýza řezů kůže obarvených F&M potvrdila vizuálně pozorovanou repigmentaci (viz Obr. 12). Repigmentaci bylo možno histologicky stanovit jeden týden po ošetření. Vizuální pozorování odpovídala histologické demonstraci pigmentace vrstvy stratům corneum. Tento příklad ukazuje, že sloučenina I neindukuje trvalé poškození pigmentačního procesu a že její účinek in vivo je vratný. Obr. 12A ukazuje dva histologicky F&M zabarvené řezy míst kůže, které nebyly ošetřeny sloučeninou I. Obr. 12B ukazuje dva histologicky F&M zabarvené řezy míst kůže, které se osm týdnů ošetřovaly sloučeninou I. Obr. 12C ukazuje dva histologicky F&M zabarvené řezy míst kůže, které se osm týdnů ošetřovaly sloučeninou I a u kterých • · ··* ·

01-676-99 Ce

bylo ošetřování po jednom týdnu zastaveno. Obr. 12D ukazuje dva histologicky F&M zabarvené řezy míst kůže, které se osm týdnů ošetřovaly sloučeninou I a u kterých bylo ošetřování po dvou týdnech zastaveno. Obr. 12E ukazuje dva histologicky F&M zabarvené řezy míst kůže, které se osm týdnů ošetřovaly sloučeninou I a u kterých bylo ošetřování po čtyřech týdnech zastaveno. Jak ukazuje Obr. 12E, řezy se po čtyřech týdnech po ukončení ošetření zcela repigmentovály.

Příklad 11

Příprava přírodních produktů obsahujících STI

Příklad 1 demonstruje, že přítomnost trypsinového inhibitoru sójových bobů je pro svou depigmentační aktivitu žádána ve všech zesvětlujících formulacích. Na základě analytických testů se určilo, že sójové mléko a sójová pasta představují vydatné zdroje trypsinového inhibitoru ze sójových bobů.

Při přípravě sójové pasty se sójové boby nejprve nechaly několik hodin namáčet v deionizované nebo purifikované vodě. Potom se sójové boby umlely a zcela hydratovaly přidáním malého množství vody, čímž se získala hladká pasta. Při přípravě sójového mléka se použil stejný postup, ale přidané množství vody bylo větší. (Mletí umožňuje sójovému mléku extrakci.) Potom se sójové mléko přefiltrovalo, čímž se zbavilo zbývajících částí slupek.

Takto připravené sójové mléko, sójová pasta a fermentovaná pasta ze sójových bobů mohou být použity jako •· 9 99 9

01-676-99 Če • Φ 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 99 9 9 9 9 9 999999 • · · · · · · · ·· · ΦΦΦ Φ· ·· ·· přírodní materiály obsahující STI, které jsou schopny zesvětlit barvu kůže.

Příklad 12

Ošetření přírodními materiály, které ovlivňují PAR-2 dráhu, indukuje depigmentaci

Dvě yucatánská prasata se ošetřovala osm a deset týdnů, dvakrát denně, pět dní v týdnu různými produkty připravenými ze sójových bobů a měsíčních fazolí. Tyto přírodní produkty zahrnují sójovou pastu, hydrolyzát kyseliny z proteinů sójových bobů, fermentovanou pastu ze sójových bobů, přírodní a svařené sójové mléko a komerčně dostupný extrakt ze sójových bobů (s obchodním označením Actiphyte od společnosti Active Organics, Dallas, Texas) a rovněž purifikovaný STI a různé přípravky obsahující trypsinové inhibitory ze sójových bobů a měsíčních fazolí. Sedmý týden ošetřování byla všechna ošetřovaná místa viditelně světlejší než okolní kůže, s výjimkou míst ošetřených svařeným sójovým mlékem a hydrolyzátem kyseliny z proteinu sójových bobů. Histologická analýza biopsií ošetřených míst, které byly zbarveny F&M, potvrdila depigmentační účinek produktů připravených ze sójových bobů a měsíčních fazolí. Příklad získaných histologických dat uvádí Obr. 13. Nedostatek depigmentační aktivity svařeného sójového mléka a hydrolyzátu kyseliny sójového proteinu byl vysvětlen denaturací nebo degradací sójových proteinů v těchto přípravcích. Předpokládáme, že aktivními depigmentačními činidly v produktech připravených ze sójových bobů a měsíčních fazolí je trypsinový inhibitor ze sójových bobů (STI) resp. trypsinový inhibitor z měsíčních ·· ··♦ · • · • · · · · · ·

111 111 · · · · · ·

111 111

1 19111

01-676-99 Če • 9 • » · • · · • ·· · • · ·· ·· fazolí. (Přiklad 1 ukazuje depigmentační účinek STI in vitro.) Tento příklad ukazuje, že přírodní extrakty obsahující trypsinovou inhibiční aktivitu lze použít jako zesvětlující činidla, která ovlivňují PAR-2 dráhu.

Příklad 13

STI v liposomové formulaci může zesvětlit stařecké skvrny u lidí

Osoba se třemi stařeckými skvrnami na hřbetu ruky se ošetřovala osm týdnů, dvakrát denně následujícím způsobem: stařecká skvrna, která se nacházela nejblíže paži, se ošetřila placebem obsahujícím 20 mg/ml liposomu. Střední stařecká skvrna se neošetřila. Třetí stařecká skvrna se ošetřila 1 % STI v liposomech (20 mg/ml).

GDL liposomy se připravily již popsaným způsobem podle Niemiece a kol., ve kterém se provedly následující změny: neiontová liposomová formulace obsahovala glyceroldilaurát (Emulsynt GDL, ISP Van Dyk)/cholesterol (Croda)/polyoxyethylen-10-stearylether (Brij76, ICI)/polyoxyethylen-9-laurylether v poměru 37,5:12,5:33,3:16,7. Při přípravě liposomů se jako vodná fáze použil pufr Hepes, 0,05M, pH 7,4 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) . Nultý, čtvrtý a osmý týden ošetřování se při UV a viditelném světle zhotovily digitální snímky. Hodnoty L* (světlost) se z obrázků vypočetly pomocí programu Adobe Photoshop.

Jak ukazuje Obr. 14, stařecká skvrna ošetřená STI po osmitýdenním ošetření zesvětlala. Obr. 14 je kompozitem čtyř obrázků. Na levé straně jsou obrázky ruky, pořízené za viditelného světla před (horní) a po (spodní) osmitýdenním ·» ·*** ·· • 9 9

9 9

999

9

99

01-676-99 Če ošetření. Při této orientaci je horní stařecká skvrna skvrnou ošetřenou placebem, střední stařecká skvrna je neošetřenou skvrnou a spodní stařecká skvrna je skvrnou ošetřenou STI. Pravá strana ukazuje obrázky stejné ruky, pořízené ve stejných časových okamžicích za použití UV fotografie. UV světlo umožňuje zviditelnit pigment, který se nachází hlouběji v kůži, což naznačuje, že bělící účinek STI není pouze povrchový. Obr. 14 jasně demonstruje, že STI formulace je schopna zesvětlit stařecké skvrny. Pro místo ošetřené STI bylo vypočteno zvýšení o 15 L* jednotek, což dále potvrzuje schopnost tohoto ošetření zesvětlit stařecké skvrny.

Příklad 14

Depigmentační formulace obsahující sójové mléko

Při přípravě sójového mléka se zjistilo, že zvláčňující účinek mléka by mohl být žádoucí u formulací určených pro péči o pleť. Vzhledem k tomu, že převažující složku všech emulzí typu olej ve vodě a celé řady dalších formulací určených pro péči o pleť je voda, usoudili jsme, že sójové mléko by se mohlo v těchto formulacích nahradit deionizovanou vodu. Nicméně jsme očekávali, že tento typ formulace by nebyl v důsledku nemísitelnosti olejových a vodních složek sójového mléka fyzikálně stabilní. Překvapivě se zjistilo, že se nahrazením vody sójovým mlékem získala fyzikálně stabilní formulace. Formulace, ve kterých se používá sójové mléko, by měly obsahovat přibližně 1 % až 99 % sójového mléka, výhodně přibližně 80 % až 95 % sójového mléka. Výhodně by tyto a podobné formulace měly zahrnovat regulátor viskozity, jehož

01-676-99 Ce

• · · · ·· · ··· množství by mělo představovat přibližně 0 % až 5 % (výhodněji přibližně 0,1 až 2 %), alespoň jedno zvláčňující činidlo v množství přibližně až 20 % a/nebo emulgační činidlo v množství přibližně 0,1 % až 10 % (výhodněji přibližně 3 až 5 %) a, případně, smáčecí prostředek v množství přibližně 0, až 5 % (výhodněji přibližně 1 až

%), konzervační činidlo, chelatační činidlo nebo zvlhčovadlo. Konzervační činidlo by mělo být přítomno v účinném množství, které by chránilo integritu mléka a udržovalo kompozici aktivní. Formulace by měla obsahovat rovněž zahušťovadlo, a to v množství, které by této formulaci zajistilo snadné přenášení na místo aplikace a současně nebránilo jejímu roztírání na pokožce. Takovým množstvím je například 0 až 10 % a výhodněji přibližně 3 až 5 %. Do kompozic podle vynálezu mohou být rovněž zabudovány sluneční filtry, antioxidanty, vitaminy, další depigmentační činidla a další složky topických kompozic určených pro péči o pleť.

Zvláště výhodný příklad depigmentační formulace, ve které je voda nahrazena sójovým mlékem, je ukázán v níže uvedené Tabulce E.

• 0 0 · • 0

0

Tabulka Ε

Složka	Funkce	% hmotn./hmotn.
Sójové mléko	Depigmentační vehikulum	84, 9
Oktenylsukcinát hlinitý škrobu	Regulátor viskozity	0,75
Cyklomethikon	Smáčecí činidlo	2
PEG 6-triglyceridy kyseliny kafrové a kaprylové	Zvláčňuj ící/emulgační činidlo	3
Fenoxyethanol	Konzervační činidlo	0, 75
Kokosát sacharózy	Zvláčňuj ící/emulgační činidlo	1
Na₂EDTA	Chelatační činidlo	0,1
Glycerin	Zvlhčovadlo	2,5
Poyakrylamid; isoparafin; laureth-7	Zahušťovadlo	5

Do těchto formulací lze zabudovat STI, sójovou pastu a další přírodní extrakty obsahující trypsinový inhibitor a zvýšit tak koncentraci serinproteázového inhibitoru. Koncentrace přidané účinné složky se mohou pohybovat v rozmezí od 0,01 % do 15 % formulace. Do této formulace lze rovněž zabudovat další depigmentační činidla, kterými jsou například PAR-2 inhibitory, inhibitory tyrosinázy, hydrochinony, sójové produkty, kyselinu askorbovou a její deriváty a rovněž další přísady, které příznivě ovlivňují stav pokožky.

• · · · • ·

01-676-99 Če φ · • · · · · · • · · · ♦ · • · · ··· · · · • · · 9

99 99

Příklad 15

Depigmentačni emulze typu olej ve vodě

Dva příklady depigmentačních emulzí typu olej ve vodě jsou uvedeny v Tabulce F. Ve sloupci 4 Tabulky F je popsána formulace s STI, ve které může být STI nahrazen libovolným serinproteázovým inhibitorem odvozeným z přírodního materiálu nebo libovolným extraktem nebo frakcí přírodního materiálu, které obsahují serinproteázové inhibitory. Podobná formulace, která však namísto STI obsahuje sloučeninu I, je uvedena ve sloupci 5 Tabulky F. Sloučenina I v této kompozici může být nahrazena podobnými sloučeninami nebo serinproteázovými inhibitory nebo libovolnými PAR-2 inhibičními materiály, které mají vysokou terapeutickou účinnost, pokud jsou zpracovány synteticky nebo přírodní cestou. Tabulka F rovněž uvádí navržená rozmezí pro jednotlivé složky těchto formulací. Deionizovaná voda může být v těchto formulacích nahrazena sójovým mlékem.

Tabulka F

Označeni CTHA	Etmkoe	% hmotn. /hmotn.	% hmotn. /hmotn.	Rozmezí, s
Cetearylglu- kosid	Povrchově aktivní činidlo	1,4	1,4	0,1-2,8
Cií-isALkyl— benzoát	Povrchově aktivní činidlo	4,0	4,0	1-6
Oktylhydroxy- stearát	Zvláčňuj ící činidlo	1,0	1,0	0-5
Dimethikon	Smáčecí činidlo	1,0	1,0	0-5

• «* 4

4 4 4 4 4 4

4 ·< 444 444

4 4 4 4 • •J 44 44 44

01-676-99 Če ι :

«4 4 pokračování

Označení CTEA	Funkce	% hmotn. /hmotn.	% hmotn./hmotn.	Rozmezí, s
Cyklomethikon	Smáčecí činidlo	1,0	1,0	0-5
Cetylalkohol	Zvláčňuj ící činidlo	2,5	2,5	0-4
Butylovaný hydroxytoluen	Antioxidant	0,1	0,1	0-0,5
Ethylmethoxy- cinnamát	Sluneční filtr	6,0	6,0	0-10
Propylparaben	Konzervační činidlo	0,5	0,1	0-0,5
Acetát vitaminu E	Antioxidant	0,5	0,5	0-0,5
Tokoferol- acetát	Antioxidant	0,5	0,5	0-0,5
Glycerin	Zvlhčuj ící činidlo	3,0	3,0	0-20
D-pantenol	Provitamin	0,5	0,5	0-5
Dinátrium EDTA	Chelatační a bělící činidlo	0,1	0,1	0,01-1
Methylparaben	Konzervační činidlo	0,2	0,2	0-0,3
Karbomer	Zahušťovadlo	0,35	0,35	0-3
Deionizovaná voda nebo sójové mléko	Nosič/bělící činidlo	76,35	77,5	50-80
STI nebo přírodní extrakt	Bělící činidlo	1,0	0	0-15
Sloučenina I	Bělící činidlo	0	0,25	0-1

Při přípravě této formulace se složky lipidové fáze smísily a míchaly při 85°C a následně ochladily na 60°C. Do samostatné nádoby obsahující vodu nebo sójové mléko se · · 4

01-676-99 Če

4· *· ·4 • · · 4 4 4 4 · « · ·

4 444 444« * 4 4 44 4 4 444444 • 4 f 444 4 4

4 4 44444 44 44 pozvolna přidal karbopol. Po desetiminutovém míchání se přidal zbytek složek vodné fáze a směs se ohřála na 60°C. Obě fáze se smísily, míchaly 10 minut a ochladily na pokojovou teplotu. V tomto příkladu a v následujících příkladech a dalších provedeních způsobů a kompozic podle vynálezu může jedna formulace samozřejmě obsahovat více depigmentačních činidel.

Příklad 16

Depigmentační kompozice (emulze typu olej ve vodě)

Dva další příklady depigmentační emulze typu olej ve vodě jsou uvedeny v Tabulce G. Ve sloupci 3 Tabulky G je popsána formulace s STI, ve které může být STI nahrazen libovolným serinproteázovým inhibitorem odvozeným z přírodního materiálu nebo libovolným extraktem nebo frakcí přírodního materiálu, které obsahují serinproteázové inhibitory. Podobná formulace, která však namísto STI obsahuje sloučeninu I, je uvedena ve sloupci 4 Tabulky G. Sloučenina I v této kompozici může být nahrazena podobnými sloučeninami nebo serinproteázovými inhibitory nebo libovolnými PAR-2 inhibičními materiály, které mají vysokou terapeutickou účinnost, pokud jsou zpracovány synteticky nebo přírodní cestou. Tabulka G rovněž uvádí navržená rozmezí pro jednotlivé složky těchto formulací. Deionizovaná voda může být v těchto formulacích nahrazena sójovým mlékem.

• 9 • · · η • ·

01-676-99 Če • ·

Tabulka G

Označení CTEA	Funkce	% hmotn./hmotn.	Výhodná rozmezí
Ethanol	Rozpouštědlo	12,0	5-20
Propylenglykol	Rozpouštědlo	3,0	1-10
Hydroxyethyl- celulóza	Zahušťovadlo/po- lymer	0,2	0-3
Akryláty/Cio-30- alkylakrylátový zesíťovaný polymer	Zahušťovadlo/po- lymer	1,0	0-3
Pantenol (98%)	Provit amin/zvlhčující činidlo	1,5	0,1-3
Vůně	Vůně	0,5	0-0,5
Isohexadekan	Smáčecí činidlo	4,0	0-5
Acetát vitaminu E	Antioxidant	1,0	0-2
Hydroxid sodný	Regulátor pH	0,35	0,1-0,5
Glycerin	Zvlhčující činidlo	3,0	0-20
Deionizovaná voda nebo sójové mléko	Nosič/bělící činidlo	71,95	60-80
Sloučenina I	Bělící činidlo	0,25	0-1
STI nebo přírodní extrakt	Bělící činidlo	0	0-15

Při přípravě této formulace se do vody nebo sójového mléka pozvolna přidala hydroxyethylcelulóza a míchala až do úplného rozpuštění. Do samostatné nádoby se přidal zesíťovaný polymer akrylátů a alkylakrylátu s 10 až 30 atomy uhlíku v alkylovém zbytku a míchal až do úplného rozpuštění. Obsah obou zásobníků se smísil a míchal 20 minut. Do získané směsi se přidal acetát vitaminu E a po promíchání isohexadekan a pantenol (98%). Po pětiminutovém • · • · · · · ♦ · β · · · • · 0 · 0 · 0···

01-676-99 Če : ί *, * : ί J * J “J ·♦ · «0 0 00 «· «0 míchání se do směsi přidal STI nebo přírodní extrakt nebo sloučenina I společně s propylenglykolem a v míchání se pokračovalo dalších 5 minut. Potom se přidal glycerin a formulace se míchala dalších 20 minut. Na závěr se pH hodnota formulace nastavila přidáním hydroxidu sodného na 8 v případě formulace obsahující STI (rozmezí 6-8,5) nebo na 7 v případě formulace obsahující sloučeninu I (rozmezí 5,58,5).

Příklad 17

Depigmentační kompozice (emulze typu voda v oleji)

Příklad depigmentační emulze typu voda v oleji je uveden v Tabulce H. Ve sloupci 4 Tabulky H je popsána formulace s STI, ve které může být STI nahrazen libovolným serinproteázovým inhibitorem odvozeným z přírodního materiálu nebo libovolným extraktem nebo frakcí přírodního materiálu, které obsahují serinproteázové inhibitory. Podobná formulace, která však namísto STI obsahuje sloučeninu I, je uvedena ve sloupci 5 Tabulky H. Sloučenina I v této kompozici může být nahrazena podobnými sloučeninami nebo serinproteázovými inhibitory nebo libovolnými PAR-2 inhibičními materiály, které mají vysokou terapeutickou účinnost, pokud jsou zpracovány synteticky nebo přírodní cestou. Tabulka H rovněž uvádí navržená rozmezí pro jednotlivé složky těchto formulací. Deionizovaná voda může být v těchto formulacích nahrazena sójovým mlékem.

01-676-99 Če

Tabulka H

Fáze	Označeni CTEA	Funkce	% hmotn. /hmotn.	% hmotn. /hnotn.	Výhodná rozmezí
OLEJOVÁ	Minerální olej	Zvláčňuj ící činidlo	25,0	25,0	40-80
	Sorbitan- monooleát	Povrchově aktivní činidlo	5,0	5,0	1-6
	Stearyl- alkohol	Zvláčňuj ící činidlo	25,0	25,0	20-60
	Dimethikon	Smáčecí činidlo	1,0	1,0	1-5
	Cetyl- alkohol	Zvláčňuj ící činidlo	2,0	2,0	0,1-10
	Hydrogeno- vaný lecitin	Antioxidant	3,0	3,0	0-10
	Parsol MCX	Sluneční filtr	3,0	3,0	0-10
	Propyl- paraben	Konzervační činidlo	0,5	0,5	0,01-0,5
	Acetát vitaminu E	Antioxidant	0,5	0,5	0,01-0,5
VODNÁ	Glycerin	Zvlhčuj ící činidlo	3,0	3,0	0-20
	Methyl- paráben	Konzervační činidlo	0,2	0,2	0,01-0,3
	Voda nebo sójové mléko	Nosič/bělící činidlo	30,8	31,55	20-45
	STI	Bělící činidlo	1,0	0	0-10
	Sloučenina I	Bělící činidlo	0	0,25	0-1

Při přípravě této formulace se stearylalkohol a minerální olej nechaly roztát při 70°C. Potom se přidaly zbývající složky olejové fáze a směs se ohřála na 75°C. Přidaly se

01-676-99 Ce ·« ·· »· • · 9 9 9 9

9 9 9 9 9

99 999 999 « 9 9 9

99 φ9 9 9 složky vodné fáze, které se předtím rozpustily ve vodě nebo sójovém mléku a ohřály na 70°C a získaná směs se míchala až do úplného ztuhnutí.

Příklad 18

Depigmentační kompozice (vodný gel)

Dva další příklady depigmentační formulace s vodným gelem jsou uvedeny v Tabulce J. Ve sloupci 3 Tabulky J je popsána formulace s STI, ve které může být STI nahrazen libovolným serinproteázovým inhibitorem odvozeným z přírodního materiálu nebo libovolným extraktem nebo frakcí přírodního materiálu, které obsahují serinproteázové inhibitory. Podobná formulace, která však namísto STI obsahuje sloučeninu I, je uvedena ve sloupci 4 Tabulky J. Sloučenina I v této kompozici může být nahrazena podobnými sloučeninami nebo serinproteázovými inhibitory nebo libovolnými PAR-2 inhibičními materiály, které mají vysokou terapeutickou účinnost, pokud jsou zpracovány synteticky nebo přírodní cestou. Tabulka J rovněž uvádí navržená rozmezí pro jednotlivé složky těchto formulací. Deionizovaná voda může být v těchto formulacích nahrazena sójovým mlékem.

01-676-99 Če · · 9 * 9 · 4 4 ·

9 9 9 9 9 · < «44 444 « ♦ 4 9 » ·· «9 44

Tabulka J

Označení CTEA	Funkce	% hmotn./hmotn.	% hmotn./hmotn.	Rozmezí
Oktoxynol-13	Povrchově aktivní činidlo	0,2	0,2	0,05-0,5
Kyselina 2,4hexadienová	Konzervační činidlo	0,1	0,1	0-0,3
Benzen- methanol	Konzervační činidlo	1,0	1,0	0-2
Dinátrium EDTA	Chelatační/ konzervační činidlo	0,05	0,05	0,01-0,2
Kyselina askorbová	Antioxidační činidlo	0,1	0,1	0-0,2
Metabisulfit sodný	Antioxidační činidlo	0,2	0,2	0-0,3
Karbomer	Zahušťovadlo	1,5	1,5	0-3,0
20% Roztok NaOH	Regulátor pH	2,45	2,45	0,1-5
Deionizovaná voda nebo sójové mléko	Nosič/bělící činidlo	93,4	94,15	85-98
STI nebo přírodní extrakt	Bělící činidlo	1,0	0	0-15
Sloučenina I	Bělící činidlo	0	0,25	0-1

01-676-99 Če

9 9 9 99 • 9 9 9 9 • 9 9 9 9 « « · · « · · • · · * » « · 9 ·

Deionizovaná voda může být v těchto formulacích nahrazena sójovým mlékem.

Tabulka K

Označení CTEA	Funkce	% hmotn./hmotn.	Rozmezí
Ethanol	Rozpouštědlo (1)	70	40-90
Propylenglykol	Rozpouštědlo (2)	29	1-40
Deionizovaná voda	Nosič	dle potřeby	1-40
STI	Bělící činidlo	0
Sloučenina I	Bělící činidlo	1 μΜ	0,00001-1

Při přípravě této formulace se sloučenina I rozpustila ve vodě. Ethanol a propylenglykol se smísily a sloučily s vodným roztokem obsahujícím sloučeninu I.

Na výše uvedených příkladech jsme demonstrovali, že aktivace keratinocytového receptoru PAR-2 má za následek zvýšení pigmentace. Výhodně lze této aktivace dosáhnout použitím trypsinu nebo SLIGRL nebo SLIGKVD nebo dalších SLIGRL nebo SLIGKVD derivátů. Rovněž jsme demonstrovali, že bělení lze dosáhnout použitím serinproteázových inhibitorů nebo PAR-2 antagonizujících činidel a rovněž blokátorů melanosomového přenosu. Jako depigmentační činidla mohou

01-676-99 Če • » « 9 9 9

9 · « · * • · 9 9 9 9 » 9« 999 9 9 9

9 9 9 ·· «» 9 9 být rovněž použity další sloučeniny, o nichž je v daném obru známo, že inhibují přenos melanosomů do keratinocytů.

Přenos melanosomů do keratinocytů inhibuje například trypsinový a trombinový inhibitor, kterým je sloučenina I. Na základě stejného mechanizmu pracuje rovněž STI. Akumulace nedopravených melanosomů v melanocytech by mohla indukovat negativní zpětný mechanizmus, který zpomaluje novou tvorbu melanosomů. Produkce TRP-1, což je hlavní glykoprotein v melanocytech se snižuje, což vede k destabilizaci tyrosinázy. To má za následek snížení tvorby melaninu a barevnou změnu na světle hnědou v důsledku snížení poměru TRP-1:TRP-2. Akumulace melanosomů v melanocytu po ošetření sloučeninou I nebo po ošetření sloučeninou STI se proto zredukovala a pozměnila obsah melaninu, což napomohlo bělícímu účinku sloučeniny I nebo STI.

01-676-99 Ce • · · · * · · · • · · · « · · · · · • «

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob ovlivnění pigmentace kůže u savců, vyznačený tím, že zahrnuje podání účinného množství sloučeniny, která ovlivňuje dráhu PAR-2, pro vyvolání pigmentační změny savci.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že uvedená sloučenina inhibuje dráhu PAR-2.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím, že uvedená sloučenina je antagonizujícím činidlem PAR-2.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačený tím, že se uvedená sloučenina váže na PAR-2 nebo blokuje, ale neaktivuje PAR-2.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačený tím, že se sloučenina zvolí ze skupiny sestávající z antagonizujících činidel na bázi SLIGRL, která se váží na PAR-2 nebo blokují, ale neaktivují PAR-2, antagonizujících činidel na bázi SLIGKVD, která se váží na PAR-2 nebo blokují, ale neaktivují PAR-2, a jejich směsí.

• 4 · * * * · · » * «·· ·

01-676-99 Ce „
6. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím, že uvedenou sloučeninou je proteázový inhibitor.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačený tím, že uvedenou sloučeninou je serinproteázový inhibitor.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačený tím, že uvedenou sloučeninou je trombinový a/nebo tryptázový a/nebo trypsinový inhibitor.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačený že uvedenou sloučeninou je sloučenina I:

tím, ve kterém:

A se zvolí z množiny zahrnující alkylovou skupinu s 1 až 8 atomy uhlíku, karboxyalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, alkoxykarbonylalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku a v alkylovém zbytku, fenylalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovanou fenylalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku (ve které se fenylové

9 ·

01-676-99 Če ·· · substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), formylovou skupinu, alkoxykarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku, alkylkarbonylovou skupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, fenylalkoxykarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku, cykloalkylkarbonylovou skupinu se 3 až 7 atomy uhlíku v cykloalkylovém zbytku, fenylkarbonylovou skupinu, substituovanou fenylkarbonylovou skupinu (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), alkylsulfonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxysulfonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylsulfonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, fenylsulfonylovou skupinu, substituovanou fenylsulfonylovou skupinu (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin,

01-676-99 Če φ

ΦΦ φφφφ ·· φφ φ φ φ · φ φ φ φ φφφ φφφ φ φ • φ φ φ aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), 10-kafrosulfonylovou skupinu, fenylalkylsulfonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovanou fenylalkylsulfonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, alkylsulfinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroakylsulfinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, fenylsulfinylovou skupinu, substituovanou fenylsulfinylovou skupinu (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), fenylalkylsulfinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovanou fenylalkylsulfinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, 1-naftylsulfonylovou skupinu, 2-naftylsulfonylovou skupinu nebo substituovanou naftylsulfonylovou skupinu (ve které se naftylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), 1-naftylsulfinylovou skupinu, 2-naftylsulfinylovou skupinu nebo substituovanou naftylsulfinylovou skupinu (ve které se naftylové • · • * ·

01-676-99 Če substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku);

D nebo L aminokyselina, která se naváže svým karboxylovým koncem na dusík v obecném vzorci I, se zvolí ze skupiny tvořené alaninem, asparaginem, kyselinou 2-azetidinkarboxylovou, glycinem, N-alkylglycinem s 1 až 8 atomy uhlíku, prolinem, kyselinou 1-amino-l-cykloalkylkarboxylovou se 3 až 8 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, kyselinou thiazolidin-4-karboxylovou, kyselinou 5,5-dimethylthiazolidin-4-karboxylovou, kyselinou oxadolidin-4-karboxylovou, kyselinou pipekolinovou, valinem, methioninem, cysteinem, serinem, threoninem, norleucinem, leucinem, terč.-leucinem, isoleucinem, fenylalaninem, 1-naftalaninem, 2-naftalaminem, 2-thienylalaninem, 3-thienylalaninem, kyselinou [1, 2,3, 4]tetrahydroisochinolin-l-karboxylovou a kyselinou [1,2,3,4]tetrahydroisochinolin-2-karboxylovou, přičemž dusíkový konec uvedené aminokyseliny se naváže na člen zvolený z množiny zahrnující alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, 5-tetrazolylalkylovou skupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, karboxyalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, alkoxykarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku a v alkylovém zbytku, fenylalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovanou fenylalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku (ve které se fenylové

01-676-99 Če φφ φφ • φ φ ♦ φ · φ · φφφ φφφ φ φ « φ φ φ substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), 1,1-difenylalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, 3-fenyl2-hydroxypropionylovou skupinu, 2,2-difenyl-l-hydroxyethylkarbonylovou skupinu, [1,2,3,4]tetrahydroisochinolin-1karbonylovou skupinu, [1,2,3,4]tetrahydroisochinolin-3karbonylovou skupinu, 1-methylamino-l-cyklohexankarbonylovou skupinu, 1-hydroxy-l-cyklohexankarbonylovou skupinu, 1hydroxy-l-fenylacetylovou skupinu, 1-cyklohexyl-l-hydr'oxyacetylovou skupinu, 3-fenyl-2-hydroxypropionylovou skupinu, 3,3-difenyl-2-hydroxypropionylovou skupinu, 3-cyklohexyl-2hydroxypropionylovou skupinu, formylovou skupinu, alkoxykarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku, alkylkarbonylovou skupinu s 1 až 12 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, perfluoroalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, alkylkarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, fenylalkylkarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovanou fenylalkylkarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, • 0

01-676-99 Ce

0 « 0 0 000 000 «· 0· alkylsulfonylovou skupinu alkoxysulfonylovou skupinu karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku) , 1,1-difenylalkylkarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovanou 1,1-difenylalkylkarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), perfluoroalkylsulfonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, s 1 až 4 atomy uhlíku, s 1 až 4 atomy uhlíku, fenylsulfonylovou skupinu, substituovanou fenylsulfonylovou skupinu (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), 10-kafrosulfonylovou skupinu, fenylalkylsulfonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovanou fenylalkylsulfonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, perfluoroalkylsulfinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, alkylsulfinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, fenylsulfinylovou skupinu, substituovanou fenylsulfinylovou skupinu (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku,

01-676-99 Če perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), 1-naftylsulfonylovou skupinu, 2-naftylsulfonylovou skupinu, substituovanou naftylsulfonylovou skupinu (ve které se naftylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), 1naftylsulfinylovou skupinu, 2-naftylsulfinylovou skupinu a substituovanou naftylsulfinylovou skupinu (ve které se naftylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 alkylovém zbytku, alkoxyskupin s 1 až hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku) ;

atomy uhlíku v 4 atomy uhlíku, nebo je polypeptid tvořen dvěma aminokyselinami, přičemž první aminokyselinou je D nebo L aminokyselina, která je navázána svým karboxylovým zakončením na atom dusíku v

01-676-99 Če ·· 4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4 · • 4 4 4 4 4 4 4 • · 4 44 44 4 444

4 4 4 4 4

444 44 ·4 44 obecném vzorci I a která se zvolí z množiny zahrnující glycin, N-alkylglycin s 1 až 8 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, alanin, kyselinu 2-azetidinkarboxylovou, prolin, kyselinu thiazolidin-4-karboxylovou, kyselinu 5,5-dimethylthiazolidin-4-karboxylovou, kyselinu oxazolidin-4-karboxylovou, kyselinu 1-amino-l-cykloalkylkarboxylovou se 3 až 8 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, 3-hydroxypropolin, 4hydroxyprolin, 3-alkoxyprolin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku, 4-alkoxyprolin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku, 3,4-dehydroprolin, kyselinu 2,2-dimethyl-4thiazolidinkarboxylovou, kyselinu 2,2-dimethyl-4-oxadolidinkarboxylovou, kyselinu pipekolinovou, valin, methionin, cystein, asparagin, serin, threonin, leucin, terč.-leucin, isoleucin, fenylalanin, 1-naftalanin, 2-naftalanin, 2-thienylalanin, 3-thienylalanin, kyselinu [1,2,3,4]tetrahydroisochinolin-2-karboxylovou, alkylester kyseliny 4-aspartové s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku a alkylester kyseliny 5-glutamové s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku;

a druhá D nebo L aminokyselina je navázána na dusíkový konec uvedené první aminokyseliny a zvolí se z množiny zahrnující fenylalanin, 4-benzoylfenylalanin, 4-karboxyfenylalanin, 4-karboxyalkylfenylalanin s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovaný fenylalanin (ve kterém se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku,

0 0

01-676-99 Ce

00 0 0 0 • 0 00 karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), 3-benžotliienylalanin, 4bifenylalanin, homofenylalanin, kyselinu oktahydroindol-2karboxylovou, 2-pyridylalanin, 3-pyridylalanin, 4-thiazolylalanin, 2-thienylalanin, 3- (3-benzothienyl)alanin, 3thienylalanin, tryptofan, tyrosin, asparágin, 3-trialkylsilylalanin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, cyklohexylglycin, difenylglycin, fenylglycin, methioninsulfoxid, methioninsulfon, 2,2-dicyklohexylalanin, 2-(1-naftylalanin), 2-(2-naftylalanin), fenylem substituovaný fenylalanin (ve kterém se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), kyselinu aspartovou, alkýlester kyseliny 4-aspartové s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, kyselinu glutamovou, alkýlester kyseliny 5-glutamové s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, cykloalkylalanin se 3 až 8 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovaný cykloalkylalanin se 3 až 8 atomy uhlíku v alkylovém zbytku (ve kterém je kruh substituován karboxyskupinou, alkylkarboxyskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxykarbonylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku nebo aminokarbonylovou skupinou), 2,2-difenylalanin a všechny alfa alkylové skupiny s 1 až 5 atomy uhlíku všech derivátů těchto aminokyselin, přičemž dusíkový konec uvedené druhé aminokyseliny je nesubstituovaný nebo monosubstituovaný členem množiny zahrnující formylovou • * * · · · • * · * · · • · · • · »

01-676-99 Če • ·· 99 99 • 9 9 9 » t · « • · » 9 · 9 9 • 9 9 9 999 9 99

9 9 9 9 9

999 99 99 99 skupinu, alkylovou skupinu s 1 až 12 atomy uhlíku, 5tetrazolylalkylovou skupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, karboxyalkylovou skupinu s 1 až 8 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, karboalkoxyalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, fenylalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovanou fenylalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), 1,1-difenylalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, alkoxykarbonylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxyzbytku, fenylalkoxykarbonylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxyzbytku, alkylkarbonylovou skupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, perfluoroalkylalkylkarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v prvním alkylovém zbytku a s 0 až 4 atomy uhlíku ve druhém alkylovém zbytku, fenylalkylkarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovanou fenylalkylkarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin

44 444« • ·* ·· ·· ·· * · 4 4 4 4 • 4 · 4 4 4 4

4 4 44 444 44«

4 4 4 4 4 «444» 44 44

01-676-99 Če s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), perfluoroalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxykarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, 10-kafrosulfonylovou skupinu, fenylalkylsulfonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, substituovanou fenylalkylsulfonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, alkylsulfinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, perfluoroalkylsulfinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, fenylsulfinylovou skupinu, substituovanou fenylsulfinylovou skupinu (ve které se fenylové substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupin, halogenoskupin, amidoskupin, nitroskupin, aminoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupin nebo alkoxykarbonylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), fenylalkylsulfinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, substituovanou fenylalkylsulfinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, 1-naftylsulfonylovou skupinu, 2-naftylsulfonylovou skupinu, substituovanou naftylsulfonylovou skupinu (ve které se naftylový substituent zvolí z alkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupiny, halogenoskupiny, amidoskupiny, nitroskupiny, aminoskupiny, alkylaminoskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupiny nebo alkoxykarbonylové skupiny s 1 • 4 4444

01-676-99 Ce • · · • · ·

4 4 4 4 • · ·

44 · • · · • · · • 4 4 • 4

4 ·· až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku), 1-naftylsulfinylovou skupinu, 2-naftylsulfinylovou skupinu a substituovanou naftylsulfinylovou skupinu (ve které se naftylový substituent zvolí z alkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupiny, halogenoskupiny, amidoskupiny, nitroskupiny, aminoskupiny, alkylaminoskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupiny nebo alkoxykarbonylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku);

Ri se zvolí z množiny zahrnující atom vodíku a alkylovou skupinu;

R₂ se zvolí z množiny zahrnující aminoalkylovou skupinu se 2 až 5 atomy uhlíku, guanidinoalkylovou skupinu se 2 až 5 atomy uhlíku, alkylguanidinoalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v prvním alkylovém zbytku a se 2 až 5 atomy uhlíku ve druhém alkylovém zbytku, dialkylguanidinoalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v každém prvním alkylovém zbytku a se 2 až 5 atomy uhlíku ve druhém alkylovém zbytku, amidinoalkylovou skupinu se 2 až 5 atomy uhlíku, alkylamidinoalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v prvním alkylovém zbytku a se 2 až 5 atomy uhlíku ve druhém alkylovém zbytku, dialkylamidinoalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v každém z prvních alkylových zbytků a se 2 až 5 atomy uhlíku ve druhém alkylovém zbytku, alkoxyalkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku v alkoxyzbytku a se 2 až 5 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, fenylovou skupinu, substituovanou fenylovou skupinu (ve které se substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více aminoskupin, amidinoskupin, guanidinoskupin, alkylamino01-676-99 Če skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, atomů halogenu, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 3 atomy uhlíku nebo nitroskupin), benzylovou skupinu, substituovanou benzylovou skupinu (ve které se substituenty nezávisle zvolí z jedné nebo více aminoskupin, amidinoskupin, guanidinoskupin, alkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupin s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, atomů halogenu, perfluoroalkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupin s 1 až 3 atomy uhlíku nebo nitroskupin) , hydroxyalkylovou skupinu se 2 až 5 atomy uhlíku, alkylaminoalkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku v prvním alkylovém zbytku a se 2 až 5 atomy uhlíku ve druhém alkylovém zbytku, dialkylaminoalkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku v každém prvním alkylovém zbytku a se 2 až 5 atomy uhlíku ve druhém alkylovém zbytku, 4-aminocyklohexylalkylovou skupinu s 0 až 2 atomy uhlíku v alkylovém zbytku a alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku;

p znamená 0 nebo 1;

B znamená

R₃

Z ve kterém n znamená 0 až 3, R₃ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, přičemž

01-676-99 Čí a 77 • · · · · · · • · · · · • · · · • · · · · • · · · • · · · · · • · · · • · · · • · · · • c · ·· · • · · • · · · karbonylová část substituentu B je navázána na substi- tuent E; E znamená heterocyklickou skupinu zvolenou z množiny zahrnuj ící 2-oxazolinylovou skupinu, 2-oxazolylovou sku-

pinu, 2-thiazolylovou skupinu, 5-thiazolylovou skupinu, 4thiazolylovou skupinu, 2-thiazolinylovou skupinu, 2-imidazolylovou skupinu, 4-oxo-2-chinoxalin-2-ylovou skupinu, 2-pyridylovou skupinu, 3-pyridylovou skupinu, benzo[b]-2thiofenylovou skupinu, 4-triazolylovou skupinu, 6-triazolylovou skupinu, 2-pyrazolylovou skupinu, 4,5,6,7-tetrahydrobenzo-2-thiazolylovou skupinu, nafto[2,1-d]-2-thiazolylovou skupinu, nafto[1,2-d]-2-thiazolylovou skupinu, 2chinoxalinylovou skupinu, 1-isochinolinylovou skupinu, 3isochinolinylovou skupinu, benzo[b]-2-furanylovou skupinu, 2-pyrazinylovou skupinu, 2-chinazolinylovou skupinu, 5-isothiazolylovou skupinu, 3-isothiazolylovou skupinu, 8-purinylovou skupinu a substituovanou heterocyklickou skupinu, ve které se substituenty zvolí z množiny zahrnující alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, perfluoroalkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupinu, halogenoskupinu, amidoskupinu, nitroskupinu, aminoskupinu, alkylaminoskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, dialkylaminoskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v každém alkylovém zbytku, karboxyskupinu, alkoxykarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkoxyzbytku, hydroxy- nebo fenylalkylaminokarbonylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku;

a její farmaceuticky přijatelné soli.

01-676-99 Če
10. Kompozice pro ovlivnění pigmentace kůže u savců, vyznačená tím, že obsahuje účinné množství sloučeniny, která ovlivňuje dráhu PAR-2.