CN201053965Y

CN201053965Y - 一种流感病毒快速检测试纸

Info

Publication number: CN201053965Y
Application number: CNU2007201494803U
Authority: CN
Inventors: 万积成
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-06-06
Filing date: 2007-06-06
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2017-06-06

Abstract

本实用新型涉及一种流感病毒快速检测试纸，属于免疫层析快速检测领域。本试纸由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、流感病毒单克隆抗体储藏垫、样品吸液层组成，底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设置有一条试验线和一条多克隆抗体控制线，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和流感病毒单克隆抗体储藏垫相互交叠连接，在流感病毒单克隆抗体储藏垫上压有样品吸液层，利用颜色颗粒免疫层析法来检测流感病毒。使用上述试纸条，通过试验线显色，可方便快速的检测流感病毒，同时具有操作简便、特异性强、灵敏度高，且结果易读、成本低、无需专业人员操作等特点，真正达到复杂原理与简易操作的有机统一。

Description

一种流感病毒快速检测试纸

技术领域

本发明涉及一种可移动的、方便实用的流感病毒快速检测试纸，属于免疫层析快速检测领域。

背景技术

流感病毒作为常见呼吸道病毒的一种，抗原性复杂，根据其核心蛋白抗原性不同分为甲、乙、丙三型，根据其表面抗原血凝素(H)和神经氨酸酶(N)的不同，同型病毒又分若干亚型，各型之间无交叉免疫。由于各型病毒之间无交叉免疫，可多次感染，反复发病。流行性感冒是世界上最猖獗的传染病，曾多次席卷全球，给人类带来巨大灾难。仅仅在1957年的一次流感大传播中，全世界共有15亿人发病，数以万计的老人和小孩被折磨致死。

目前，检测流感病毒，目前国内外多采用病毒分离、间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、多重逆转录聚合酶链反应、PCR及核酸杂交等多种检测手段。病毒分离法耗时太长且成本较高；间接免疫荧光法需要昂贵的荧光显微镜且标本不易保存；PCR方法不能区别有感染毒力的病毒和死病毒；酶联免疫吸附法制成试剂盒需冷藏，运输不便，同时上述方法均需专业人员操作。

正是因为现有检测方法的落后，因此开发出使用方便，检测灵敏，价格低廉的检测产品是当务之急。

颜色颗粒免疫层析分析为流感病毒的检测提供了一个新的检测途径。免疫微粒技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的固相微粒作为载体，包被上具有特异性亲和力的各种免疫活性物质(抗原或抗体)，使其致敏为免疫微粒，用于免疫学及其他生物学检测与分离的一项技术。作为载体的微粒通常是以某种高分子有机单体为原料，经过乳液聚合、悬浮聚合及辐照聚合等高分子聚合方法制备而成。由于制备材料及工艺不同，微粒的种类繁多，现已制成惰性微粒如聚苯乙烯胶乳微粒、活性微粒如羧化聚苯乙烯微粒、磁性微粒及标记微粒(用同位素、荧光素或酶标记)等四大类微粒，数量多达几十种。将制备好的微粒与抗原(或抗体)经物理吸附、化学偶联及生物素亲合素桥联法等致敏方法形成免疫微粒。广泛应用于各种可溶性大分子物质的检测、分离与纯化、细胞标记与识别等。近年来，微粒技术在核酸分子杂交、DNA与RNA的分离及PCR等研究领域亦显示出广阔的应用前景。

乳胶微粒作为免疫微粒的一种，采用合成高分子乳胶微球，即羧化的聚苯乙烯乳胶作为载体，将抗体或抗原通过物理吸附固载于微球表面而形成免疫乳胶诊断试剂，通过胶乳凝集实验可检测对应的抗原或抗体。制备成的乳胶诊断试剂，用于诊断多种疾病，具有简便、快速、灵敏、价廉及操作容易等优点。

胶体金免疫层析技术是20世纪90年代以来在单克隆抗体技术、免疫层析技术及胶体金显色技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术，是根据免疫反应原理，利用大孔径微孔滤膜为载体，以胶体金作为固相标记物来检测样本中待测物质的一种快速免疫分析技术。

本发明在颜色颗粒免疫层析技术原理基础上，改进检测方法，建立了采用胶体金法及乳胶法检测流感病毒的方法。检测方法的改进，使检测更方便，结果更准确，具有快速、灵敏、操作简便、成本低、无需专业人员操作等特点，真正达到复杂原理与简易操作的有机统一。

发明内容

本发明针对上述存在的一些问题，提供了一种流感病毒快速检测试纸。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种流感病毒快速检测试纸，由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、流感病毒单克隆抗体储藏垫、样品吸液层组成；底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设置有一条试验线和一条多克隆抗体控制线，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和流感病毒单克隆抗体储藏垫相互交叠连接，在流感病毒单克隆抗体储藏垫上压有样品吸液层，利用颜色颗粒免疫层析法来检测流感病毒。

颜色颗粒可以是一种金属溶胶颗粒，可包括胶体金颗粒、银颗粒、铁颗粒、磁性颗粒等；一种标记颗粒，可包括染料颗粒、乳胶颗粒、荧光颗粒等。其中，胶体金颗粒的颗粒直径大小为纳米级，乳胶颗粒直径大小0.01～10μm；金属溶胶颗粒的吸附机理是利用它在碱性条件下带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团，靠静电吸引而结合；乳胶颗粒是利用化学结合的方式与蛋白质分子结合，形成免疫诊断试剂。

样品吸液层由三层材料叠加组成，依次为10～25g/m²无纺布层、玻璃纤维层、10～25g/m²无纺布层，上述物质均需经过表面活性剂缓冲液浸泡处理，干燥后备用，上述装置除有毛细管作用原理外，还有虹吸作用原理，大大加快吸水移动速度。

用流感疫苗(活性成分为甲/新喀里多尼亚/20/99(HIN1)-类似株；甲/新喀里多尼亚/20/99重配毒株IVR-116；甲/威斯康星/67/2005(H3N2)-类似株；甲/广岛/52/2005重配毒株IVR-142；乙/马来西亚/2506/2004-类似株；乙/马来西亚/2506/2004)免疫小鼠，细胞株注射鼠腹腔，提取腹水进行纯化，在筛选出的杂交瘤细胞株中，获得两株高纯度、配对的流感单克隆抗体细胞株Flu4G3F12和Flu23C7H8，一株用于试验线包被，一株可用于颜色颗粒标记。

把试纸样品吸液层放入待测样本中(液面不得超过MAX线)，由于毛细管作用样品将沿着试纸条向吸水板移动，当移动至单克隆抗体储藏垫时，样品中流感病毒抗原与流感病毒单克隆抗体标记探针发生特异结合，当移动至试验线时，样品中流感病毒抗原又与试验线中的流感病毒单克隆抗体相结合，因此其颜色颗粒滞留于试验线上，试验线处显示红色为阳性；相反如果待测样本中没有流感病毒，流感病毒单克隆抗体标记探针就不会与试验线上的流感病毒单克隆抗体发生特异结合，没有颜色颗粒滞留，即仅有一条红色控制线为阴性，这就是采用的本试纸双抗夹心法原理。根据此原理，两条线为阳性，一条线为阴性得出判断。

硝酸纤维素膜上设置的控制线是由羊抗鼠多克隆抗体包被而成，当样品通过颜色颗粒标记的流感病毒单克隆抗体移动至羊抗鼠多克隆抗体控制线时，无论样品中有无流感病毒，都会与已设定好的羊抗鼠多克隆抗体结合滞留，使控制线显示红色。因此控制线无色带产生则代表操作有误，检测时样品液面超过MAX线或试纸已经过期。

由于采用上述技术方案，本发明所提供的流感病毒快速检测试纸具有这样的有益效果，即方便快速、可移动、便于流感病毒的现场筛查工作，且特异性强，灵敏度高，无须专门技术人员操作，而且结果易读。

附图说明

图1为本发明的外观图。

图2为本发明的分解图。

图3为本发明的阴性结果图。

图4为本发明的阳性结果图。

图中1、吸水板，2、硝酸纤维素膜，3、控制线，4、试验线，5、单克隆抗体储藏垫，6、样品吸液层，7、底板，8、MAX线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进一步解释：

一种流感病毒快速检测试纸，包括底板(7)、吸水板(1)、硝酸纤维素膜(2)、流感病毒单克隆抗体储藏垫(5)、样品吸液层(6)；底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设置有一条试验线(4)和一条多克隆抗体控制线(3)，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和流感病毒单克隆抗体储藏垫相互交叠连接，在流感病毒单克隆抗体储藏垫上压有样品吸液层，利用颜色颗粒免疫层析法来检测流感病毒。

实施例1：

一种流感病毒胶体金检测试纸，包括底板(7)、吸水板(1)、硝酸纤维素膜(2)、流感病毒单克隆抗体金标垫(5)、样品吸液层(6)；底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设置有一条试验线(4)和一条多克隆抗体控制线(3)，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和流感病毒单克隆抗体金标垫相互交叠连接，在流感病毒单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层，利用胶体金免疫层析法来检测流感病毒。

试纸制法：

1.流感单克隆抗体的制备：用流感疫苗(活性成分为甲/新喀里多尼亚/20/99(HIN1)-类似株；甲/新喀里多尼亚/20/99重配毒株IVR-116；甲/威斯康星/67/2005(H3N2)-类似株；甲/广岛/52/2005重配毒株IVR-142；乙/马来西亚/2506/2004-类似株；乙/马来西亚/2506/2004)免疫小鼠，细胞株注射鼠腹腔，提取腹水进行纯化，在筛选出的杂交瘤细胞株中，获得两株高纯度、配对的流感单克隆抗体细胞株Flu4G3F12和Flu23C7H8，一株用于试验线包被，一株可用于胶体金标记。

2.胶体金的制备及与流感单克隆抗体Flu4G3F12的结合

(1)取双蒸水加适量的氯金酸磁力搅拌加温到90℃，加入适量柠檬酸三纳继续加热搅拌至沸腾3～10分钟，优选5分钟，冷却后避光保存备用。

(2)把流感病毒单克隆抗体Flu4G3F12标记的胶体金液，吸附纤维材料上，干燥后备用。

3.膜的制备：机器制膜，利用电脑控制传动速度，保证每单位膜上包被的抗体量相等。

检测线：流感单克隆抗体Flu23C7H8

控制线：羊抗鼠多克隆抗体

4.试纸条按公知技术组合。

5.使用方法及结果判断：使用时，把试纸样品吸液层放入待测样本中(液面不得超过MAX线)，5分钟时观察结果。若检测流感病毒浓度高于检出量，观察窗处出现两条红线为阳性；低于界限值，出现一条红线为阴性；控制线无色带产生代表操作有误，检测时样品液面超过MAX线或试纸已经过期。

实施例2：

一种流感病毒乳胶检测试纸，包括底板(7)、吸水板(1)、硝酸纤维素膜(2)、流感病毒单克隆抗体储藏垫(5)、样品吸液层(6)；底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设置有一条试验线(4)和一条多克隆抗体控制线(3)，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和流感病毒单克隆抗体储藏垫相互交叠连接，在流感病毒单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层，利用胶体金免疫层析法来检测流感病毒。

试纸制法：

1.流感单克隆抗体的制备：用流感疫苗(活性成分为甲/新喀里多尼亚/20/99(HIN1)-类似株；甲/新喀里多尼亚/20/99重配毒株IVR-116；甲/威斯康星/67/2005(H3N2)-类似株；甲/广岛/52/2005重配毒株IVR-142；乙/马来西亚/2506/2004-类似株；乙/马来西亚/2506/2004)免疫小鼠，细胞株注射鼠腹腔，提取腹水进行纯化，在筛选出的杂交瘤细胞株中，获得两株高纯度、配对的流感单克隆抗体细胞株Flu4G3F12和Flu23C7H8，一株用于试验线包被，一株可用乳胶微粒标记。

2.乳胶微粒的制备：

1)取10％乳胶溶液100ul，加入硼砂缓冲液900ul，高速离心10min；

2)弃上清，加入硼砂缓冲液洗涤，再次高速离心10min；

3)弃上清，加入硼砂缓冲液悬浮沉淀，加入抗体，体积定容至1ml；

4)向“3”所得溶液中加入10ulEDC(15mg/ml)，孵育4h，高速离心10min；

5)弃上清，用封闭液(5％ BSA)悬浮沉淀，封闭过夜；次日，划线。

3.乳胶微粒与流感单克隆抗体Flu4G3F12结合：把流感病毒单克隆抗体Flu4G3F12标记的乳胶微粒，吸附纤维材料上，干燥后备用。

4.膜的制备：机器制膜，利用电脑控制传动速度，保证每单位膜上包被的抗体量相等。

检测线：流感单克隆抗体Flu23C7H8

控制线：羊抗鼠多克隆抗体

5.试纸条按公知技术组合。

6.使用方法及结果判断：使用时，把试纸样品吸液层放入待测样本中(液面不得超过MAX线)，5分钟时观察结果。若检测流感病毒浓度高于检出量，观察窗处出现两条红线为阳性；低于界限值，出现一条红线为阴性；控制线无色带产生代表操作有误，检测时样品液面超过MAX线或试纸已经过期。

Claims

1.一种流感病毒快速检测试纸，其特征在于是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纤维素膜(2)、流感病毒单克隆抗体储藏垫(5)、样品吸液层(6)组成；底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设置有一条试验线(4)和一条多克隆抗体控制线(3)，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和流感病毒单克隆抗体储藏垫相互交叠连接，在流感病毒单克隆抗体储藏垫上压有样品吸液层，利用颜色颗粒免疫层析法来检测流感病毒。

2.根据权利要求1所述的一种流感病毒快速检测试纸，其特征在于颜色颗粒可以是一种金属溶胶颗粒，可包括胶体金颗粒、银颗粒、铁颗粒、磁性颗粒；一种标记颗粒，可包括染料颗粒、乳胶颗粒、荧光颗粒。

3.根据权力要求1所述的一种流感病毒快速检测试纸，其特征在于胶体金颗粒的颗粒直径大小为纳米级，乳胶颗粒直径大小0.01～10μm；金属溶胶颗粒的吸附机理是利用它在碱性条件下带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团，靠静电吸引而结合；乳胶颗粒是利用化学结合的方式与蛋白质分子结合，形成免疫诊断试剂。

4.根据权利要求1所述的一种流感病毒胶体金快速检测试纸，其特征在于所述的样品吸液层是由三层材料叠加组成，第一层为无纺布层，规格为10～25g/m²；第二层为玻璃纤维层；第三层为无纺布层，其规格为10～25g/m²。