CN205898536U - 一种分离提取外泌体的叠层离心过滤装置 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种分离提取外泌体的叠层离心过滤装置，用于分子生物学及临床检验技术领域，包括过滤管、超滤管和废液收集管，过滤管的底部设有滤膜，过滤管内部形成一级过滤管腔，超滤管的底部设有超滤膜，超滤管内部于过滤管的下方形成二级过滤管腔，废液收集管内于超滤管的下方形成废液收集管腔，过滤管的顶端管口设有一级托沿，超滤管的顶端管口设有二级托沿，一级托沿和二级托沿上均设有通气道，废液收集管的顶端管口设有盖帽，盖帽盖合时可将一级托沿压紧于二级托沿、将二级托沿压紧于废液收集管的顶端管口，并通过通气道与外界连通。本实用新型价格低廉、操作便捷，时间短且能平行进行大量样本操作，能够满足临床大规模推广应用的需求。

Description

一种分离提取外泌体的叠层离心过滤装置

技术领域

本实用新型用于分子生物学及临床检验技术领域，特别是涉及一种分离提取外泌体的叠层离心过滤装置。

背景技术

外泌体(exosomes)是一种由真核细胞的多泡内涵体(multivesicular bodies，MVBs)与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的纳米量级的膜性小囊泡，具脂双层膜结构，大小约为30–150 nm，广泛分布于体液中；可由多种类型细胞分泌，其内含有不同种类的蛋白质、脂质、mRNAs、microRNAs及信号分子等具生物学活性的物质；具较强靶向性，易与靶细胞的细胞膜发生融合，将生物学活性物质选择性地递送至靶细胞，在不同细胞间进行信息传递，调节细胞间的信号传导，发挥多种生物学功能。

目前外泌体的提取方法主要可归纳为以下几种：超速离心法、多聚物沉淀法、磁珠法和超滤法。

一、超速离心法是目前应用最广的外泌体提取方法，文献中具体离心速度有些许差异，大体包含4个步骤：(1) 低速离心（约300 ×g）去除残留细胞；(2) 高速离心（约16,500 ×g）去除细胞碎片；(3) 0.22μm滤膜过滤去除大直径囊泡；(4) 超速离心（约120,000×g）沉淀外泌体，为提高纯度可选用蔗糖密度梯度离心。

超速离心提取法主要有以下缺点：

1）操作耗时长：从处理完成的生物体液至收集到外泌体全过程耗时约8-24 h；

2）分离效率低：目前学界已证明该方法对外泌体的回收率仅为约10%，要获得足够分析的样品需要较大样本量；

3）需要特定仪器：提取所用的超速离心机不属于常规实验室配置设备；

4）平行处理样本数有限：根据不同离心机转子，能够同时平行操作的样本数量一般不大于6个。

二、多聚物沉淀法是一种较新型的外泌体提取方法，由于其克服了超速离心法的不少缺陷，目前已被广泛应用于科研领域，并已有相关商品试剂销售。其实现主要是通过将样品与多聚物原液按照一定比例混合，孵育一段时间（约30 min）后用低速（约10,000 ×g）离心收集沉淀物，加入等渗缓冲液溶解沉淀后即为外泌体。

多聚物沉淀法的主要缺点如下：

1）实验成本高：以主流商业试剂，如System Biosciences (SBI)公司的产品ExoQuick-TC为例，每次提取的试剂消耗超过180元人民币，不利于大规模推广作临床应用；

2）后续处理受限：由于提取过程需要在样品中添加额外成分，收集到的外泌体后续不能直接用作细胞培养或回输等用途；

3）不适用于大体积样品：由于其原理及较高的成本导致该方法并不适用于大体积样本的处理。

三、另一种主流的外泌体提取方法是磁珠法。该方法依靠固定有特定抗体的磁珠与样品孵育，利用抗原抗体反应与样品中有对应膜表面抗原的外泌体结合，最终利用磁力将磁珠与外泌体一同吸附，实现外泌体的提取。

磁珠法同样具有明显的缺陷：

1）实验成本高：磁珠需特殊加工能力，同时提取所需的抗体及抗体与磁珠的交联更进一步增加了该方法的实现成本；

2）仅能提取样品中某一特定的外泌体亚群：由于该方法基于抗原抗体反应，故仅能从样品中特异性提取出具有某一已知膜表面抗原的外泌体亚群；

3）不适用于大体积样品：由于其原理及较高的成本导致该方法并不适用于大体积样本的处理。

四、部分研究中亦曾使用超滤法进行外泌体富集，但其报道的方法需要超速离心进一步沉淀外泌体，操作过程冗长，并不适合临床使用。且尚无能应用于血清/血浆的超滤提取外泌体的方法。

综上所述，目前尚无价格低廉、操作便捷，时间短且能平行进行大量样本操作的外泌体提取方法和装置能够满足临床大规模推广应用的需求。

实用新型内容

为解决上述问题，本实用新型提供一种分离提取外泌体的叠层离心过滤装置，价格低廉、操作便捷，时间短且能平行进行大量样本操作。

本实用新型解决其技术问题所采用的技术方案是：一种分离提取外泌体的叠层离心过滤装置，包括过滤管、套在过滤管外侧的超滤管和套在超滤管外侧的废液收集管，所述过滤管的底部设有滤膜，过滤管内部形成一级过滤管腔，超滤管的底部设有超滤膜，超滤管内部于过滤管的下方形成二级过滤管腔，废液收集管内于超滤管的下方形成废液收集管腔，所述过滤管的顶端管口设有一级托沿，超滤管的顶端管口设有二级托沿，一级托沿和二级托沿上均设有通气道，废液收集管的顶端管口设有盖帽，盖帽盖合时可将一级托沿压紧于二级托沿、将二级托沿压紧于废液收集管的顶端管口，一级过滤管腔和二级过滤管腔均通过通气道与外界连通。

进一步作为本实用新型技术方案的改进，所述滤膜的孔径不大于1μm。

进一步作为本实用新型技术方案的改进，超滤膜为截留分子量为30-100 kDa颗粒的超滤膜。

进一步作为本实用新型技术方案的改进，超滤管于过滤管下方的左侧管壁和右侧管壁均为向中部倾斜的平面管壁，两平面管壁间形成截面呈V形的二级过滤管腔，至少一平面管壁上开设超滤膜窗口，超滤膜窗口内嵌超滤膜组件，所述超滤膜组件包括超滤膜固定板和贴附于超滤膜固定板内侧的超滤膜，所述超滤膜固定板的下端设有若干流出孔。

进一步作为本实用新型技术方案的改进，盖帽与废液收集管的顶端管口采用螺纹连接或卡扣连接。

本实用新型的有益效果：本实用新型使用时，在样品中加入0.5倍体积的孵育缓冲液，并加入0.05倍体积蛋白酶K储液，充分混匀，室温孵育8-15 min；将处理完的样品转移至本实用新型的过滤管中，离心，混匀，收集超滤管中的截留液，即完成外泌体的分离提取。本实用新型价格低廉、操作便捷，时间短且能平行进行大量样本操作，能够满足临床大规模推广应用的需求。

附图说明

下面结合附图对本实用新型作进一步说明：

图1是本实用新型结构示意图。

具体实施方式

参照图1，其显示出了本实用新型之较佳实施例的具体结构。以下将详细说明本实用新型各元件的结构特点，而如果有描述到方向( 上、下、左、右、前及后) 时，是以图1所示的结构为参考描述，但本实用新型的实际使用方向并不局限于此。

本实用新型提供了一种分离提取外泌体的叠层离心过滤装置，包括过滤管1、套在过滤管1外侧的超滤管2和套在超滤管2外侧的废液收集管3，所述过滤管1的底部设有滤膜11，过滤管1内部形成一级过滤管腔12，超滤管2的底部设有超滤膜21，超滤管2内部于过滤管1的下方形成二级过滤管腔22，废液收集管3内于超滤管2的下方形成废液收集管腔31，所述过滤管1的顶端管口设有一级托沿13，超滤管2的顶端管口设有二级托沿23，一级托沿13和二级托沿23上均设有通气道，废液收集管3为与离心设备配套使用的离心管，废液收集管3的顶端管口设有盖帽，盖帽与废液收集管3的顶端管口采用螺纹连接或卡扣连接。当盖帽盖合时可将一级托沿13压紧于二级托沿23、将二级托沿23压紧于废液收集管3的顶端管口，同时，一级过滤管腔12和二级过滤管腔22均通过通气道与外界连通，避免气压问题导致难以过滤。

超滤管2于过滤管1下方的左侧管壁和右侧管壁均为向中部倾斜的平面管壁，两平面管壁间形成截面呈V形的二级过滤管腔22，二级过滤管腔22的外壁上设有刻度。至少一平面管壁上开设超滤膜窗口，超滤膜窗口内嵌超滤膜组件，所述超滤膜组件包括超滤膜固定板和贴附于超滤膜固定板内侧的超滤膜21，所述超滤膜固定板的下端设有若干流出孔。

采用本实用新型分离提取外泌体的方法如下：

1)在样品中加入0.5倍体积的孵育缓冲液，并加入0.05倍体积蛋白酶K储液，充分混匀，室温孵育8-15 min；

2)将步骤1）处理完的样品转移至叠层离心过滤装置的过滤管1中，离心，混匀，收集超滤管2中的截留液。

当待测血清样本加入到过滤管中，在离心作用下，血清样本通过过滤管1底部的滤膜11，常用的滤膜11为微孔滤膜，孔径为0.22 μm。绝大部分微囊泡被截留在过滤管1中。而外泌体、可溶性蛋白、高丰度蛋白酶解片段等则通过了这层滤膜进入到超滤管2中。由于超滤管2管壁的下方是超滤膜21，而底部具二级过滤管腔22，在离心过程中，血清中可溶性部分、高丰度蛋白酶解片段及更微小的颗粒从侧壁的超滤膜21渗出，进入废液收集管3。由于超滤管2的底部具二级过滤管腔22，离心过程中将保留部分液体，外泌体即可在此溶液中保存。离心完后，取出超滤管2，用移液器吹打使保留腔中液体混匀，收集截留液即为终产物外泌体溶液。

优选的，若需要提高外泌体纯度，可往超滤管2中加入DBPS，3,000×g离心10 min，用于除去一些可溶性蛋白，弃滤出液并重复一次。

优选的，混匀并收集截留液即为外泌体溶液，可进行后续处理。

其中，所述滤膜11的孔径不大于1μm，本实施例中优选为0.22 μm。超滤膜21为截留分子量为30-100 kDa颗粒的超滤膜。常用的滤膜孔径有0.1-100μm。血清中常见的干扰物是高丰度蛋白及微囊泡（microvesicles, MVs），经过预处理，大量高丰度蛋白可被蛋白酶K酶解成小片段。而微囊泡直径约为200-1000 nm，此处用0.22 μm滤膜可去除绝大部分的微囊泡的干扰。微囊泡被滤膜截留于过滤管内的一级过滤腔中，进入二级过滤腔中的主要杂质主要为血清中的高丰度蛋白被蛋白酶K酶切的多肽片段。由于多肽片段多为分子量约为5-10 kDa的线性分子，故选用30 kDa以上的超滤膜能够将其滤过。同时，该范围内的超滤膜孔径大大小于外泌体直径，外泌体将被截留于一级过滤腔内。

方法与超速离心法相比：

a)本方法能够获得与超速离心法相当纯度的外泌体；

b)本方法全部操作能够在30 min内完成，大大缩短操作时间；

c)全部过程可室温操作，操作简便；

d)本方法能在任何配备有桌面小型离心机的实验室完成，对其他实验设备基本无需求；

e)根据离心机型号，本发明能同时处理多个样本，实验室常见小型桌面离心机配备的转子就能同时完成多达24个样本的提取。

与多聚物沉淀法相比：

a)本方法能够获得与多聚物沉淀法相当纯度的外泌体；

b)本方法耗材成本更为低廉；

c)获得的外泌体产物基本无需进一步处理即可为细胞培养或回输等用途。

与磁珠法相比：

a)本实用新型耗材成本更为低廉；

b)本实用新型可提取样本中外泌体的全部亚群，不依赖于特定的膜表面抗原。

当然，本发明创造并不局限于上述实施方式，熟悉本领域的技术人员在不违背本实用新型精神的前提下还可作出等同变形或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (5)

1.一种分离提取外泌体的叠层离心过滤装置，其特征在于：包括过滤管、套在过滤管外侧的超滤管和套在超滤管外侧的废液收集管，所述过滤管的底部设有滤膜，过滤管内部形成一级过滤管腔，超滤管的底部设有超滤膜，超滤管内部于过滤管的下方形成二级过滤管腔，废液收集管内于超滤管的下方形成废液收集管腔，所述过滤管的顶端管口设有一级托沿，超滤管的顶端管口设有二级托沿，一级托沿和二级托沿上均设有通气道，废液收集管的顶端管口设有盖帽，盖帽盖合时可将一级托沿压紧于二级托沿、将二级托沿压紧于废液收集管的顶端管口，一级过滤管腔和二级过滤管腔均通过通气道与外界连通。

2.根据权利要求1所述的分离提取外泌体的叠层离心过滤装置，其特征在于：所述滤膜的孔径不大于1μm。

3.根据权利要求1所述的分离提取外泌体的叠层离心过滤装置，其特征在于：超滤膜为截留分子量为30-100 kDa颗粒的超滤膜。

4.根据权利要求1所述的分离提取外泌体的叠层离心过滤装置，其特征在于：超滤管于过滤管下方的左侧管壁和右侧管壁均为向中部倾斜的平面管壁，两平面管壁间形成截面呈V形的二级过滤管腔，至少一平面管壁上开设超滤膜窗口，超滤膜窗口内嵌超滤膜组件，所述超滤膜组件包括超滤膜固定板和贴附于超滤膜固定板内侧的超滤膜，所述超滤膜固定板的下端设有若干流出孔。

5.根据权利要求1所述的分离提取外泌体的叠层离心过滤装置，其特征在于：盖帽与废液收集管的顶端管口采用螺纹连接或卡扣连接。