CN205506834U - 一种快速检测黄曲霉毒素b1和玉米赤霉烯酮的胶体金试纸 - Google Patents

Abstract

一种快速检测黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的胶体金试纸，由背板、吸水板、硝酸纤维素膜、样品吸液板、微孔试剂组成；从硝酸纤维素膜靠近样品吸液板的那一端开始依次设置T2试验线、T1试验线、和一条控制线；T1试验线和T2试验线分别由黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮人工抗原包被；控制线由羊抗鼠多克隆抗体包被；微孔试剂为冻干后的胶体金标记黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮单克隆抗体。本实用新型在传统的胶体金免疫层析试纸基础上进行了改进，将胶体金标记抗体复合物直接冻干于微孔中，使得检测过程中待测样本与金标抗体充分反应，提高检测灵敏度，可经济、快速地检测粮食和饲料样品中的黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮残留。

Description

一种快速检测黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的胶体金试纸

技术领域

本实用新型涉及粮食和饲料中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮快速检测领域，尤其是涉及一种快速检测黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的胶体金试纸。

背景技术

黄曲霉毒素(aflatoxin，AFT)主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类有毒次生代谢物。在世界不同地区都发现了这些真菌大量存在于供人类食用的食品中，黄曲霉毒素污染已导致严重的食品安全问题。黄曲霉毒素是一类毒性极强的物质，具有强致癌性和强免疫抑制性。1993年AFT被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为I类致癌物。黄曲霉毒素广泛的分布于发霉的粮食及其制品中，特别是花生、花生油、玉米及其制品、乳及乳制品，发霉的饲料中也有发现含有较多的黄曲霉毒素。迄今为止，已经发现的黄曲霉毒素至少包含黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2等17种结构相似且特征已知的化合物。其中黄曲霉毒素B1是(AFTB1)是自然发生潜力最大、最为常见的一种毒素。是黄曲霉毒素中的主要成份，其毒性和致癌性也最强。

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)又称F-2毒素，主要成分为禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌等产生的2,4-二羟基苯甲酸内酯类化合物。ZEN主要污染玉米、麦类、谷物等作物，具有很强的雌性激素作用，可引起猪、大鼠、小鼠、家禽等动物的雌激素过多症和严重的生殖道症状及不孕症，还具有免疫毒性、基因毒性等，对人也有雌激素作用。

目前黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮常用的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)和免疫分析法。由于高效液相色谱法和气质联用法仪器昂贵，操作繁琐，很难广泛地应用到真菌毒素的检测中。免疫分析法主要包括酶联免疫法，虽然灵敏度高，但还是存在检测费用高、操作复杂的缺点，不适合基层单位大规模使用。

因此，对黄曲霉毒素B1、玉米赤酶烯酮快速检测技术的研究迫在眉睫。对玉米赤酶烯酮残留的快速检测能适时的保障粮食、饲料及其制品中的质量，将毒素超标的产品控制在市场之外，减少对人们的危害。因此，快速检测技术对于掌握粮食中黄曲霉毒素B1、玉米赤酶烯酮的残留情况，有效控制其残留量，具有非常现实的意义。近年来已有利用胶体金法检测粮食和饲料中黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮残留的报道，但只能检测单一品种，且灵敏度较低。

实用新型内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种快速检测黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的胶体金试纸。本实用新型在传统的胶体金免疫层析试纸基础上进行了改进，将胶体金标记抗体复合物直接冻干于微孔中，使得检测过程中待测样本与金标抗体充分反应，提高检测灵敏度，可经济、快速地检测粮食和饲料样品中的黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮残留。

本实用新型的技术方案如下：

一种快速检测黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的胶体金试纸，由背板(1)、吸水板(2)、硝酸纤维素膜(3)、样品吸液板(4)、微孔试剂(8)组成；

所述硝酸纤维素膜(3)叠放在背板1的中部上面；所述吸水板(2)叠放在背板(1)的其中一端的端头部分上面，所述样品吸液板(4)叠放在背板(1)的另一端的端头部分上面；

所述硝酸纤维素膜(3)两端分别与吸水板(2)和样品吸液板(4)相交叠，且所述硝酸纤维素膜(3)位于吸水板(2)和样品吸液板(4)的下方；

从所述硝酸纤维素膜(3)靠近样品吸液板(4)的那一端开始，依次设置T2试验线(6)、T1试验线(5)、和一条控制线(7)；所述T1试验线(5)和T2试验线(6)分别由黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮人工抗原包被；所述控制线(7)由羊抗鼠多克隆抗体包被；

所述微孔试剂(8)为冻干后的胶体金标记黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮单克隆抗体。

所述背板(1)是PVC背板，样品吸液板(4)是玻璃纤维材料，微孔试剂(8)的微孔是聚苯乙烯材料。

微孔试剂(8)由冻干后的金纳米棒标记黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮单克隆抗体复合物代替。

普通的胶体金试纸在使用时容易出现显色条显色较浅，或者晕色的问题，这是由于吸水板(2)的吸水能力较差导致的。为了克服这一问题，在背板(1)和硝酸纤维素膜(3)之间设置一层润湿垫(9)；所述润湿垫(9)为3层多孔吸水布叠加而成，所述多孔吸水布上的孔的直径为20～40nm，每个孔的边缘的距离均为25～50nm。

使用时称取5g玉米、小麦、或者其他饲料样品研磨至20目，加入0.1～0.5g盐，加入10～30mL 60～80％甲醇-水溶液，振荡2～10分钟，于5000～10000rpm离心2～5分钟，弃沉淀，取100μl上清液加入50～200μL纯水混匀待检。水相待测样品，加入微孔中充分混合溶解，样品中若含有黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮，样品中的黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮将与微孔中黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮单克隆抗体-胶体金标记物发生特异性结合，插入试纸条，由于毛细管作用样品将沿着试纸条吸水板端移动，当移动至试验线T1、T2时，由于黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮单克隆抗体-胶体金标记物与样品中黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮优先结合成复合物而不能与黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮-大分子蛋白偶联物结合，因此显色的胶体金不能滞留于试验线上，试验线处没有色带显示，即只有一条控制线为阳性。T1或T2任意一条显色结果也判断为阳性。相反如果样品中没有黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮，黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮金标单克隆抗体移动到试验线上，相应的黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮单克隆抗体就会与黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮-大分子蛋白偶联物发生特异结合，使胶体金滞留于试验线上，即三条色带为阴性。

本实用新型有益的技术效果在于：

本胶体金试纸改变了以往在样品洗液板和硝酸纤维素膜之间设置胶体金结合垫的方法，而是将待测样品先放入一个微孔试剂中。这个微孔试剂是胶体金标记了待测毒素的抗体和胶体金后冻干后得到的，冷冻干燥在低温下进行，不会发生变性或失去生物活力。在冻干过程中，微生物的生长和酶的作用无法进行，因此能保持原来的性状。由于在冻结的状态下进行干燥，因此制品的体积、形状几乎不变，保持了原来的结构，不会发生浓缩现象。干燥后的物质疏松多孔，呈海绵状，加水后溶解迅速而完全，几乎立即恢复原来的性状。本实用新型具有一次检测黄曲霉毒素B1/玉米赤霉烯酮残留、灵敏度高、操作简便、方便携带、成本低、检测结果可靠等特点。

附图说明

图1为本胶体金试纸的主视结构图；

图2为本胶体金试纸的使用图；

图3为本胶体金试纸的阴性结果图；

图4～6为本胶体金试纸的阳性结果图；

图7为背板和硝酸纤维素膜之间设置一层润湿垫；

图中1、背板，2、吸水板，3、硝酸纤维素膜，4、样品吸液板，5、试验线T1，6、试验线T2，7、控制线，8、微孔试剂。

具体实施方式

下面结合附图，对本实用新型进行具体描述。

一、本快速检测黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮胶体金试纸的组成：

如图1所示，本胶体金试纸由背板1、吸水板2、硝酸纤维素膜3、样品吸液板4、微孔试剂8组成。其中硝酸纤维素膜3叠放在背板1的中部上面。

吸水板2叠放在背板1的其中一端的端头部分上面，样品吸液板4叠放在背板1的另一端的端头部分上面。

硝酸纤维素膜3两端分别与吸水板2和样品吸液板4相交叠，且硝酸纤维素膜3位于吸水板2和样品吸液板4的下方。

从硝酸纤维素膜3靠近样品吸液板4的那一端开始，依次设置T2试验线6、T1试验线5、和一条控制线(C线)7，即控制线7靠近吸水板端。

微孔试剂8为冻干后的胶体金标记黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮单克隆抗体。微孔试剂8也可以由冻干后的金纳米棒标记黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮单克隆抗体复合物代替。

二、黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮胶体金检测试纸的制作：

1、免疫原合成：利用活泼酯法合成玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1免疫原。

2、黄曲霉毒素B1/玉米赤霉烯酮单克隆抗体采用如下步骤取得：

(1)免疫动物

选择6周龄雌性BALB/C小鼠，将抗原与福氏完全佐剂等量混合、乳化，经腹部皮下多点注射进行基础免疫。分别隔4周，进行第二、三次免疫。第三次免疫后第7～10天，断尾取血，分离血清，用ELISA方法检测血清效价。用生理盐水稀释免疫原对高效价小鼠进行连续加强免疫。

(2)细胞融合

将50％PEG 4000、无血清培养液、HAT筛选培养液置37℃CO₂培养箱中预热。收获对数生长期的Sp2/0细胞，用无血清培养液洗涤3次，作活细胞计数。无菌条件下分离脾细胞，作活细胞计数。将1×10⁸脾细胞与1×10⁷Sp2/0细胞在50mL尖底离心管中混匀，离心弃去上清液。将含有脾细胞和Sp2/0瘤细胞的50mL尖底离心管放于水杯中，用1mL吸管吸取0.7mL PEG 4000缓慢加入到细胞混悬液中，静置90秒，加15mL 37℃预热的无血清培养液，离心弃去上清液，加入37℃预温HAT培养液充分混匀。接种于含有饲养细胞的96孔培养板中，置37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养。

(3)杂交瘤细胞的筛选和杂交瘤细胞的克隆

融合5天观察有小集落后，用HAT筛选培养液换液，10天后换HT培养液。集落长至1/3～1/2孔时，取培养上清液，用间接ELISA法检测阳性孔。OD₄₅₀值大于1时，判定为阳性孔。将阳性孔细胞转至24孔含有巨噬细胞的培养板，待集落长至1/3～1/2孔时，取培养上清液，用间接ELISA法检测特异性。检出无交叉阳性株，进行克隆化培养，同时转入培养瓶。

采用有限稀释法分别对阳性的杂交瘤细胞株进行了3次克隆，用ELISA法筛选阳性率达到100％的细胞株，且OD₄₅₀值最高的细胞株。扩大培养，冻存，建立细胞株系。

(4)腹水获得

将筛选得到的细胞株生产细胞复苏后，培养扩增。于两周前给小鼠腹腔注射降植烷。然后将扩增的杂交瘤细胞接种于用降植烷处理过的BALB/C小鼠腹腔内。7～11天后小鼠开始产生腹水。采用一次收集的方法收集腹水，离心，弃去上层油脂，吸取淡黄色腹水，分装，-20℃冻存备用。

(5)抗体的分离纯化和鉴定

纯化抗体；SDS-PAGE电泳法鉴定抗体纯度，抗体纯度良好；ELISA方法鉴定抗体活性，OD₄₅₀值大于1，均合格；ELISA方法鉴定抗体特异性，检测单抗只针对该毒素抗原特异，与其它抗原不发生反应，具有较好的特异性；抗体亲和力测定。

采用上述步骤获得黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮单克隆抗体，该抗体可用于胶体金标记。

3、微孔试剂的制备

把黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮单克隆抗体混合，标记胶体金液，吸附微孔上，冻干后备用。

微孔试剂8也可以由冻干后的金纳米棒标记黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮单克隆抗体复合物代替，金纳米棒的制备方法如下：

2.5ml 2.5×10⁴的HAuCl₄溶液与2.5ml 2.5×10⁴的CTAB溶液混合，然后加入0.6ml的冰冻的0.01M NaBH₄溶液并搅拌10min得到种子溶液。5ml的0.08M十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)水溶液与4ml的0.25ml的5×10⁴的氯金酸水溶液混合，加入0～50微升的0.01M硝酸银(AgNO₃)溶液，搅拌均匀然后加入20微升0.1M抗坏血酸，搅拌2min得到无色透明的生长溶液。1ml种子溶液加入到9ml的生长溶液中，搅拌1min，然后静置一周，得到深紫蓝色纳米金棒溶液。

把黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮单克隆抗体标记的金纳米棒液，加入微孔上，冻干后得到金纳米棒标记的微孔试剂8备用。

4、试验线和控制线的制备

试纸的试验线和控制线平行于硝酸纤维素膜上。试纸的T2试验线6、T1试验线5和控制线7平行于硝酸纤维素膜3上。T1试验线5和T2试验线6分别由黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮人工抗原包被。控制线7由羊抗鼠多克隆抗体包被制成。

5、检测试纸的组合

试纸在背板1一端端头为吸水板2，另一端头为样品吸液板4，背板中部为硝酸纤维素膜3，硝酸纤维素膜上有三条检测线，分别为T2试验线6、T1试验线5和控制线7，控制线7靠近吸水板2端，硝酸纤维素膜3两端分别与吸水板2和样品吸液板4相交叠，且位于它们下方。背板1是PVC背板，样品吸液板4是玻璃纤维材料，微孔试剂8的微孔是聚苯乙烯材料。

6、普通的胶体金试纸在使用时容易出现显色条显色较浅，或者晕色的问题，这是由于吸水板2的吸水能力较差导致的。为了克服这一问题，在背板1和硝酸纤维素膜3之间设置一层润湿垫9；所述润湿垫9为3层多孔吸水布叠加而成，所述多孔吸水布上的孔的直径为20～40nm，每个孔的边缘的距离均为25～50nm。这一设计的原理是通过吸水布上与黄曲霉素和胶体金的尺寸适配的空洞，多层叠加，可以很好的吸附并存留住试样中的黄曲霉素和胶体金，使其与试验线6更好的接触，从而显色更深、更清晰。

三、使用方法

(1)使用时称取5g玉米、小麦、饲料样品研磨至20目，加入0.1～0.5g盐，加入10～30mL 60～80％甲醇-水溶液，振荡2～10分钟，于5000～10000rpm离心2～5分钟，弃沉淀，取100μl上清液加入50～200μL纯水混匀待检。

(2)用移液枪移取40μl待检液加入微孔试剂8后反复吹打直至金标孔中红色固体充分溶解混匀；插入本检测试纸的样品吸液端4，如图2所示，同时开始计时；3分钟读取结果，5分钟后结果无效。

四、结果判读

(1)阴性：T1、T2线色度比C线深或一样深，表示样品中待检物浓度低于检测限，或不含待检物，即三条色带为阴性，如图3所示。

(2)阳性：只有一条控制线显色为阳性。T1或T2任意一条显色结果也判断为阳性，如图4～6所示。

(3)无效：未出现质控线C线显色，表明操作过程不正确或检测卡已失效。

8、测试结果

本实用新型可测出待测毒素的最低浓度如表1所示：

表1

Claims (4)

1.一种快速检测黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的胶体金试纸，其特征在于由背板(1)、吸水板(2)、硝酸纤维素膜(3)、样品吸液板(4)、微孔试剂(8)组成；

所述硝酸纤维素膜(3)叠放在背板1的中部上面；所述吸水板(2)叠放在背板(1)的其中一端的端头部分上面，所述样品吸液板(4)叠放在背板(1)的另一端的端头部分上面；

所述硝酸纤维素膜(3)两端分别与吸水板(2)和样品吸液板(4)相交叠，且所述硝酸纤维素膜(3)位于吸水板(2)和样品吸液板(4)的下方；

从所述硝酸纤维素膜(3)靠近样品吸液板(4)的那一端开始，依次设置T2试验线(6)、T1试验线(5)、和一条控制线(7)；所述T1试验线(5)和T2试验线(6)分别由黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮人工抗原包被；所述控制线(7)由羊抗鼠多克隆抗体包被；

所述微孔试剂(8)为冻干后的胶体金标记黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的快速检测测黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的胶体金试纸，其特征在于所述背板(1)是PVC背板，样品吸液板(4)是玻璃纤维材料，微孔试剂(8)的微孔是聚苯乙烯材料。

3.根据权利要求1所述的快速检测测黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的胶体金试纸，其特征在于所述微孔试剂(8)由冻干后的金纳米棒标记黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮单克隆抗体复合物代替。

4.根据权利要求1所述的快速检测测黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的胶体金试纸，其特征在于：在背板(1)和硝酸纤维素膜(3)之间设置一层润湿垫(9)；所述润湿垫(9)为3层多孔吸水布叠加而成，所述多孔吸水布上的孔的直径为20～40nm，每个孔的边缘的距离均为25～50nm。