CN1932015B

CN1932015B - 支链氨基酸氨基转移酶基因及其用途

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Publication number: CN1932015B
Application number: CN2006101539062A
Authority: CN
Inventors: 中尾嘉宏; 儿玉由纪子; 下永朋子
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2005-09-13
Filing date: 2006-09-12
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2026-09-12
Also published as: JP4460006B2; AU2006289718B2; JP2008530979A; CN1932015A; US20090233278A1; EP1869172B1; WO2007032522A2; KR20070122476A; AU2006289718A1; CA2602357A1; DE602006016580D1; WO2007032522A3; DK1869172T3; EP1869172A2

Abstract

本发明涉及支链氨基酸氨基转移酶基因及其用途，特别涉及制造香味优异的酒类的酿造酵母、使用该酵母制造的酒类及其制造方法等。更加具体地说，本发明涉及通过控制编码酿造酵母的支链氨基酸氨基转移酶BAT1p及BAT2p的基因BAT1及基因BAT2，特别是啤酒酵母中的特征基因nonScBAT1及nonScBAT2的表达量，来控制有助于产品香味的戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力的酵母及使用该酵母制造酒类的方法等。

Description

支链氨基酸氨基转移酶基因及其用途

技术领域

本发明涉及支链氨基酸氨基转移酶基因及其用途，特别涉及制造香味优异的酒类的酿造酵母、使用该酵母制造的酒类及其制造方法等。更具体地说，本发明涉及通过控制编码酿造酵母的支链氨基酸氨基转移酶Bat1p的基因BAT1、或编码Bat2p的基因BAT2，特别是啤酒酵母中的特征基因nonScBAT1或nonScBAT2的表达量，从而控制有助于产品香味的戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力的酵母，以及使用该酵母制造酒类的方法等。

背景技术

戊醇、异丁醇等高级醇、乙酸异戊酯等酯是酒类中重要的香味成分之一。众所周知，在清酒、葡萄酒、威士忌等中增加高级醇或酯能使酒味香浓，提高感官上的评价效果。另一方面，虽然高级醇或酯是啤酒中的重要香气成分，但过剩的高级醇或酯因其产生有机溶剂臭或酯臭而不受欢迎。因此，根据酒的种类不同而对高级醇或酯的生成量实施适当控制是重要的。

到目前为止，为提高酒中的酯含量而对能生成大量酯的酵母进行育种。已经公开报道的方法有：对酵母实施突变处理(或不实施突变处理)，为了有效分离能生成大量酯的酵母，获得对阻断浅蓝菌素等脂肪酸合成酶的药剂有抗性且大量生产己酸的菌株、及获得对5，5，5-三氟-D L-亮氨酸等的亮氨酸类似物有抗性且大量生产异戊醇、乙酸异戊酯的菌株的方法(日本特开2002-253211)，及用含有具有3位羟基化的孕烷骨架的类固醇的培养基获得繁殖菌株的方法(日本特开2002-191355)等。

另一方面，利用基因操作技术的酵母育种方法有如下报道：如使啤酒酵母(S accharomyces cerevisiae)的醇乙酰转移酶基因ATF1在酿造用酵母中高表达的例子(日本特开平06-062849)、抑制ATF1表达的例子(日本特开平06-253826)、破坏酿造用酵母的酯酶基因EST2从而增加酯的生成量的例子(日本特开平09-234077)、作为适当控制高级醇、酯的生成量的方法而增强或抑制编码啤酒酵母(S accharomyces cerevisiae)的支链氨基酸氨基转移酶的基因ScBAT1、ScBAT2的表达的例子(日本特开平11-235176)。

发明内容

如上所述，为了增加产品中的高级醇或酯的含量，获得了突变株，但有时会出现发酵迟缓、不期望要的香味成分增加等没预料到的现象，使其成为实用酵母尚存在的问题。因此，期望得到不影响发酵速度、不损坏产品的质量、能够产生足够量的高级醇或酯等的酵母的育种方法。

本发明者们为了解决上述课题进行了积极的研究，结果从啤酒酵母中成功分离·鉴定出编码比已知蛋白质更有效的支链氨基酸氨基转移酶的基因。并且确认：将获得的基因导入酵母中，制备使其表达的转化酵母，增加高级醇或酯等的生成量；制备抑制所获得的基因表达的转化酵母，减少高级醇或酯等的生成量，从而完成了本发明。

即，本发明涉及啤酒酵母中特征性存在的新型支链氨基酸氨基转移酶基因、该基因编码的蛋白质、调节了该基因表达的转化酵母、以及使用调节了该基因表达的转化酵母来控制产品中的戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成量的方法等。具体来说，本发明提供如下所示的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、导入了该载体的转化酵母、使用该转化酵母制造酒类的方法等。

[1]从以下(a)～(f)组成的组中选择的多核苷酸：

(a)一种多核苷酸，其包含具有序列号1或序列号3的碱基序列的多核苷酸；

(b)一种多核苷酸，其包含编码蛋白质的多核苷酸，该蛋白质具有序列号2或序列号4的氨基酸序列；

(c)一种多核苷酸，其包含编码蛋白质的多核苷酸，该蛋白质具有序列号2或序列号4的氨基酸序列缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列，且具有支链氨基酸氨基转移酶活性；

(d)一种多核苷酸，其包含编码蛋白质的多核苷酸，该蛋白质具有与序列号2或序列号4的氨基酸序列有60％或大于60％的同一性的氨基酸序列，且具有支链氨基酸氨基转移酶活性；

(e)一种多核苷酸，其包含一种多核苷酸，该多核苷酸在严格控制条件下，与具有同序列号1或序列号3的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有支链氨基酸氨基转移酶活性的蛋白质；及

(f)一种多核苷酸，其包含一种多核苷酸，该多核苷酸在严格控制条件下，与具有同编码含有序列号2或序列号4的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有支链氨基酸氨基转移酶活性的蛋白质。

[2]上述[1]所述的多核苷酸，其从以下(g)～(i)组成的组中选择：

(g)一种多核苷酸，其包含编码蛋白质的多核苷酸，该蛋白质具有序列号2或序列号4的氨基酸序列或具有序列号2或序列号4的氨基酸序列缺失、取代、插入及/或添加1个～10个氨基酸后的氨基酸序列，且具有支链氨基酸氨基转移酶活性；

(h)一种多核苷酸，其包含编码蛋白质的多核苷酸，该蛋白质具有与序列号2或序列号4的氨基酸序列有90％或大于90％的同一性的氨基酸序列、且具有支链氨基酸氨基转移酶活性；及

(i)一种多核苷酸，其包含一种多核苷酸，该多核苷酸在高严格控制条件下，与具有序列号1或序列号3的碱基序列的多核苷酸，或与具有同序列号1或序列号3的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有支链氨基酸氨基转移酶活性的蛋白质。

[3]上述[1]所述的多核苷酸，其包含具有序列号1或序列号3的碱基序列的多核苷酸。

[4]上述[1]所述的多核苷酸，其包含编码蛋白质的多核苷酸，该蛋白质具有序列号2或序列号4的氨基酸序列。

[5]上述[1]～[4]中任一项所述的多核苷酸，其为DNA。

[6]从以下(j)～(m)组成的组中选择的多核苷酸：

(j)一种多核苷酸，其编码RNA，该RNA具有与上述[5]所述的多核苷酸(DNA)的转录产物互补的碱基序列；

(k)一种多核苷酸，其编码RNA，该RNA通过RNAi效应抑制上述[5]所述的多核苷酸(DNA)的表达；

(l)一种多核苷酸，其编码RNA，该RNA具有对上述[5]所述的多核苷酸(DNA)的转录产物进行特异切割的活性；及

(m)一种多核苷酸，其编码RNA，该RNA通过共抑制效应抑制上述[5]所述的多核苷酸(DNA)的表达。

[7]一种蛋白质，其由上述[1]～[5]中任一项所述的多核苷酸编码。

[8]一种载体，其包含上述[1]～[5]中任一项所述的多核苷酸。

[8a]上述[8]所述的载体，其包括具有下述构成要素(x)～(z)的表达盒：

(x)在酵母细胞内能够转录的启动子；

(y)上述[1]～[5]所述的多核苷酸，其与该启动子以有义或反义方向连接；以及

(z)涉及RNA分子的转录终止及多腺苷化作用、在酵母内起作用的信号。

[9]一种载体，其包含上述[6]所述的多核苷酸。

[10]一种酵母，其导入了上述[8]或[9]所述载体。

[11]上述[10]所述的酵母，其通过导入上述[8]所述的载体，增强戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力。

[12]一种酵母，其通过导入上述[9]所述的载体，或通过破坏上述[5]所述的多核苷酸(DNA)相关的基因，抑制上述[5]所述的多核苷酸(DNA)表达。

[13]上述[11]所述的酵母，其通过增加上述[7]所述的蛋白质的表达量，提高戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力。

[14]一种酒类的制造方法，其为使用上述[10]～[13]中任一项所述的酵母制造酒类的方法。

[15]上述[14]所述的酒类的制造方法，其酿造的酒类为麦芽饮料。

[16]上述[14]所述的酒类的制造方法，其酿造的酒类为葡萄酒。

[17]一种酒类，其根据上述[14]～[16]中任一项所述的方法制造。

[18]一种评价方法，其为使用根据具有序列号1或序列号3的碱基序列的支链氨基酸氨基转移酶基因的碱基序列设计的引物或探针，对被检酵母的戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力进行评价的方法。

[18a]一种选择酵母的方法，其为根据上述[18]所述的方法，选择出戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力高或低的酵母。

[18b]一种制造酒类(如啤酒)的方法，其使用根据上述[18a]所述的方法选择出的酵母，。

[19]一种评价方法，其为培养被检酵母，通过测定具有序列号1或序列号3的碱基序列的支链氨基酸氨基转移酶基因的表达量，对被检酵母的戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力进行评价的方法。

[20]一种选择酵母的方法，其为培养被检酵母，对上述[7]所述的蛋白质定量或测定具有序列号1或序列号3的碱基序列的支链氨基酸氨基转移酶基因的表达量，选择出与目标戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力相应的上述蛋白质的量或上述基因表达量的被检酵母。

[20a]一种选择酵母的方法，其为培养被检酵母，测定戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力或支链氨基酸氨基转移酶活性，选择目标戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力或支链氨基酸氨基转移酶活性的被检酵母。

[21]上述[20]所述的选择酵母的方法，其为培养标准酵母和被检酵母，测定具有序列号1或序列号3的碱基序列的支链氨基酸氨基转移酶基因在各酵母中的表达量，选择出与标准酵母相比，该基因高表达或低表达的被检酵母。

[22]上述[20]所述的选择酵母的方法，其为培养标准酵母和被检酵母，对各酵母中的上述[7]所述的蛋白质进行定量，选择出与标准酵母相比，该蛋白质的量多或少的被检酵母。即，培养多种酵母，对各酵母中的上述[7]所述的蛋白质进行定量，从其中选择出其蛋白质生成量多或少的被检酵母。

[23]一种酒类的制造方法，其特征在于，使用上述[10]～[13]所述的酵母及根据上述[20]～[22]所述的方法选择出的酵母中的任一种酵母，进行发酵制造酒类，调节戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成量。

根据本发明的使用转化酵母制造酒类的方法，能够控制高级醇或酯等的含量，从而能够制造香味优异的酒类。

附图说明

图1表示啤酒酿造试验中酵母增殖量的经时变化。横轴表示发酵时间，纵轴表示OD660值。

图2表示啤酒酿造试验中浸出物消耗量的经时变化。横轴表示发酵时间，纵轴表示浸出物的表观浓度(w/w％)。

图3表示啤酒酿造试验中nonScBAT1基因在酵母中的表达行为。横轴表示发酵时间，纵轴表示检出的信号亮度。

图4表示啤酒酿造试验中酵母增殖量的经时变化。横轴表示发酵时间，纵轴表示OD660值。bat1表示nonScBAT1破坏株。

图5表示啤酒酿造试验中浸出物消耗量的经时变化。横轴表示发酵时间，纵轴表示浸出物的表观浓度(w/w％)。bat1表示nonScBAT1破坏株。

图6表示啤酒酿造试验中酵母增殖量的经时变化。横轴表示发酵时间，纵轴表示OD660值。BAT1表示nonScBAT1高表达株。

图7表示啤酒酿造试验中浸出物消耗量的经时变化。横轴表示发酵时间，纵轴表示浸出物的表观浓度(w/w％)。BAT1表示nonScBAT1高表达株。

图8表示啤酒酿造试验中酵母增殖量的经时变化。横轴表示发酵时间，纵轴表示OD660值。

图9表示啤酒酿造试验中浸出物消耗量的经时变化。横轴表示发酵时间，纵轴表示浸出物的表观浓度(w/w％)。

图10表示啤酒酿造试验中nonScBAT2基因在酵母中的表达行为。横轴表示发酵时间，纵轴表示检出的信号亮度。

图11表示啤酒酿造试验中酵母增殖量的经时变化。横轴表示发酵时间，纵轴表示OD660值。bat2表示nonScBAT2破坏株。

图12表示啤酒酿造试验中浸出物消耗量的经时变化。横轴表示发酵时间，纵轴表示浸出物的表观浓度(w/w％)。bat2表示nonScBAT2破坏株。

图13表示啤酒酿造试验中酵母增殖量的经时变化。横轴表示发酵时间，纵轴表示OD660值。BAT2表示nonScBAT2高表达株。

图14表示啤酒酿造试验中浸出物消耗量的经时变化。横轴表示发酵时间，纵轴表示浸出物的表观浓度(w/w％)。BAT2表示nonScBAT2高表达株。

具体实施方式

本发明者们认为通过增大或减小酵母的支链氨基酸氨基转移酶的活性，能够控制高级醇或酯等的生成量。本发明者们以这种构思为基础进行反复研究，根据日本特开2004-283169号公报公开的方法解读的啤酒酵母基因组的信息，分离·鉴定了啤酒酵母中特有的编码支链氨基酸氨基转移酶的nonScBAT1基因及nonScBAT2基因。这些碱基序列分别用序列号1和序列号3表示。由这些基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别用序列号2和序列号4表示。

1.本发明的多核苷酸

首先，本发明提供：(a)包含具有序列号1或序列号3的碱基序列的多核苷酸的多核苷酸；及(b)包含编码蛋白质的多核苷酸的多核苷酸，该蛋白质具有序列号2或序列号4的氨基酸序列。多核苷酸可以使DNA，也可以是RNA。作为本发明对象的多核苷酸，不限于编码来自上述啤酒酵母的支链氨基酸氨基转移酶基因的多核苷酸，还包括其他的编码与该蛋白质具有同等功能的蛋白质的多核苷酸。作为具有同等功能的蛋白质，例如可以是：(c)具有序列号2或序列号4的氨基酸序列缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列，且具有支链氨基酸氨基转移酶活性的蛋白质。此类蛋白质，例如可以为：具有序列号2或序列号4的氨基酸序列缺失、取代、插入及/或添加1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个(1～数个)、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个氨基酸残基后的氨基酸序列、且具有支链氨基酸氨基转移酶活性的蛋白质。上述缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸残基的个数，一般优选小的数目。此外，此类蛋白质还可以是：(d)具有与序列号2或序列号4的氨基酸序列有约等于或大于60％、约等于或大于70％、等于或大于71％、等于或大于72％、等于或大于73％、等于或大于74％、等于或大于75％、等于或大于76％、等于或大于77％、等于或大于78％、等于或大于79％、等于或大于80％、等于或大于81％、等于或大于82％、等于或大于83％、等于或大于84％、等于或大于85％等于或大于86％、等于或大于87％、等于或大于88％、等于或大于89％、等于或大于90％、等于或大于91％、等于或大于92％、等于或大于93％、等于或大于94％、等于或大于95％、等于或大于96％、等于或大于97％、等于或大于98％、等于或大于99％、等于或大于99.1％、等于或大于99.2％、等于或大于99.3％、等于或大于99.4％、等于或大于99.5％、等于或大于99.6％、等于或大于99.7％、等于或大于99.8％、等于或大于99.9％同一性的氨基酸序列、且具有支链氨基酸氨基转移酶活性的蛋白质。上述同源性的数值一般优选大的数值。

此外，支链氨基酸氨基转移酶活性例如可以通过(J.Biol，Chem.，271，24458-24464，1996)所述的方法进行测定。

此外，本发明还包括：(e)一种多核苷酸，其包含一种多核苷酸，该多核苷酸在严格控制条件下，与具有同序列号1或序列号3的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有支链氨基酸氨基转移酶活性的蛋白质；及(f)一种多核苷酸，其包含一种多核苷酸，该多核苷酸在严格控制条件下，与具有同编码含有序列号2或序列号4的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交，且编码具有支链氨基酸氨基转移酶活性的蛋白质。

这里所述的“严格控制条件下杂交的多核苷酸”，是指以具有与序列号1或序列号3的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸、或以编码序列号2或序列号4的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分作为探针，采用菌落杂交法、噬菌斑杂交法、Southern杂交法等获得的多核苷酸(例如DNA)。杂交方法也可以采用如Molecular Cloning 3rd Ed.，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons 1987-1997等所述的方法。

本说明书所述的“严格控制条件”，可以是低严格控制条件、中严格控制条件、十分严格控制条件中的任一种。“低严格控制条件”，如5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃；此外，“中严格控制条件”，如5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃；“高严格控制条件”，如5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃。在这些条件中，认为温度越高越能有效地得到同源性高的多核苷酸(例如DNA)。当然，影响杂交控制条件的因素有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，同领域的技术人员可以通过适当选择这些要素，获得相同的控制条件。

使用市售的试剂盒进行杂交时，可以使用如Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制造)的试剂盒。这种情况下，按照试剂盒中附带的说明书，对标记探针过夜培养，在55℃条件下用含有0.1％(w/v)SDS的缓冲液冲洗膜一次，能够检出杂交过的多核苷酸(例如DNA)。

除此之外，能够杂交的多核苷酸还可以是，利用FASTA、BLAST等同源性检索软件用系统设定参数进行计算时，与编码序列号2或序列号4的氨基酸序列的多核苷酸具有下述同一性的多核苷酸，即同一性为约等于或大于60％、约等于或大于70％、等于或大于71％、等于或大于72％、等于或大于73％、等于或大于74％、等于或大于75％、等于或大于76％、等于或大于77％、等于或大于78％、等于或大于79％、等于或大于80％、等于或大于81％、等于或大于82％、等于或大于83％、等于或大于84％、等于或大于85％、等于或大于86％、等于或大于87％、等于或大于88％、等于或大于89％、等于或大于90％、等于或大于91％、等于或大于92％、等于或大于93％、等于或大于94％、等于或大于95％、等于或大于96％、等于或大于97％、等于或大于98％、等于或大于99％、等于或大于99.1％、等于或大于99.2％、等于或大于99.3％、等于或大于99.4％、等于或大于99.5％、等于或大于99.6％、等于或大于99.7％、等于或大于99.8％、等于或大于99.9％的多核苷酸。

此外可以使用Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)，确定氨基酸序列或碱基序列的同一性。以BLAST算法为基础的被称为BLASTN或BLASTX的程序正在开发(Altschul SF，et al：J Mol Biol 215：403，1990)。采用BLASTN解析碱基序列时，如其参数为score＝100、wordlength＝12；此外使用BLASTX解析氨基酸序列时，如其参数为score＝50、wordlength＝3；使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各程序的系统设定参数值。

本发明的多核苷酸还包括：(j)编码RNA的多核苷酸，该RNA具有与上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物互补的碱基序列；(k)编码RNA的多核苷酸，该RNA通过RNAi效应抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表达；(l)编码RNA的多核苷酸，该RNA具有对上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物进行特异切割的活性；以及(m)编码RNA的多核苷酸，该RNA通过共抑制效应抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表达。将这些多核苷酸整合到载体内，且在导入该载体的转化细胞内能够抑制上述(a)～(i)的多核苷酸(DNA)的表达。因此，可在需要抑制上述多核苷酸(例如DNA)表达的情况下使用。

本说明书中所述的“编码具有与DNA的转录产物互补的碱基序列的RNA的多核苷酸”，指的是反义DNA。反义技术是公知的抑制特定的内源基因表达的方法，在各种文献中都有记载(如参照：平岛及井上：新生化学实验讲座2核酸IV基因的复制和表达(日本生化学会主编，东京化学同人)pp.319-347，1993等)。反义DNA的序列，优选与内源性基因或其中的一部分互补的序列，但是只要能够有效抑制基因表达，不完全互补也可以。被转录的RNA与靶基因的转录产物之间的互补性优选等于或大于90％，更优选等于或大于95％。反义DNA的长度至少等于或大于15个碱基，优选等于或大于100个碱基，更优选等于或大于500个碱基。

本说明书中所述的“编码通过RNAi效应抑制DNA表达的RNA的多核苷酸”，指的是通过RNA干扰(RNAi)来抑制内源性基因表达的多核苷酸。“RNAi”指的是将具有与靶基因序列相同或类似序列的双链RNA导入到细胞内，导入的外源基因及靶向内源基因的表达均被抑制的现象。这里使用的RNA，例如可以是21～25碱基长的产生RNA干扰的双链RNA，如dsRNA(双链RNA)、siRNA(小分子干扰RNA)或shRNA(短发夹结构RNA)。此类RNA可以通过脂质体等传递体系局部传递到所需的部位，此外，使用可生成上述双链RNA的载体能够使其在局部表达。这种双链RNA(dsRNA、siRNA或shRNA)的制备方法、使用方法等，在多种文献中是公知的(参照日本国特表2002-516062号公报；美国公开专利第2002/086356A号；NatureGenetics，24(2)，180-183，2000Feb.；Genesis，26(4)，240-244，2000April；Nature，407：6802，319-20，2002Sep.21；Genes&Dev.，Vol.16，(8)，948-958，2002Apr.15；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，99(8)，5515-5520，2002Apr.16；Science，296(5567)，550-553，2002Apr.19；Proc Natl.Acad.Sci.USA，99：9，6047-6052，2002Apr.30；Nature Biotechnology，Vol.20(5)，497-500，2002May；Nature Biotechnology，Vol.20(5)，500-505，2002May；Nucleic Acids Res.，30：10，e46，2002May 15等)。

本说明书中所述的“编码对DNA转录产物具有特异切割活性的RNA的多核苷酸”，一般是指酶性核酸(Ribozyme)。酶性核酸指的是具有催化活性的RNA分子，通过切割靶DNA的转录产物来阻断其基因功能。关于酶性核酸的设计可以参照各种公知文献(如参照FEBS Lett.228：228，1988；FEBSLett.239：285，1988；Nucl.Acids.Res.17：7059，1989；Nature 323：349，1986；Nucl.Acids.Res.19：6751，1991；Protein Eng 3：733，1990；Nucl.Acids Res.19：3875，1991；Nucl.Acids Res.19：5125，1991；Biochem Biophys Res Commun186：1271，1992等)。此外，“编码通过共抑制效应抑制DNA表达的RNA的多核苷酸”，是通过“共抑制”来阻断靶DNA功能的多核苷酸。

本说明书中所述的“共抑制”，指的是通过转化作用向细胞内导入具有与靶向内源基因相同或类似序列的基因，导入的外源基因和靶向内源基因的表达均被抑制的现象。关于具有共抑制效应的多核苷酸的设计，也可以参照各种公知的文献(例如可参照Smyth DR：Curr.Biol.7：R793，1997、Martienssen R：Curr.Biol.6：810，1996等)。

2.本发明的蛋白质

本发明还提供由上述多核苷酸(a)～(i)中任意一项所编码的蛋白质。本发明的优选蛋白质具有序列号2或序列号4的氨基酸序列缺失、取代、插入及/或添加一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，且具有支链氨基酸氨基转移酶活性的蛋白质。

这样的蛋白质可以是具有序列号2或序列号4的氨基酸序列缺失、取代、插入及/或添加上述数目氨基酸残基后的氨基酸序列，且具有支链氨基酸氨基转移酶活性的蛋白质。这样的蛋白质还可以是具有与序列号2或序列号4氨基酸序列有上述同源性的氨基酸序列，且具有支链氨基酸氨基转移酶活性的蛋白质。

这样的蛋白质可通过《Molecular Cloning第三版》、《Current Protocolsin Molecular Biology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等记载的定点突变导入法获得。

本发明的蛋白质的氨基酸序列缺失、取代、插入及/或添加一个或一个以上氨基酸残基，指的是在同一序列中的任意且一个或多个氨基酸序列中的位置上缺失、取代、插入及/或添加一个或多个氨基酸残基，在缺失、取代、插入及添加中，可2种或2种以上同时发生。

下面例举可互相取代的氨基酸残基。包含在同一组中的氨基酸残基可互相取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、邻-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己丙氨酸；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯基丙氨酸、酪氨酸。

本发明的蛋白质也可以通过Fmoc法(芴基甲氧基羰基法)、tBoc法(叔丁氧基羰基法)等化学合成法制得。还可利用Advanced Chem Tech公司、Parkin Elmer公司、Pharmacia公司、Protein Technology Installment公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、岛津制作所公司等制造的肽合成仪进行化学合成。

3.本发明的载体及导入该载体的转化酵母

本发明提供含有上述多核苷酸的载体。本发明的载体含有上述(a)～(i)任意一项所述的多核苷酸(例如DNA)或上述(j)～(m)任意一项所述的多核苷酸。而且，本发明的载体通常包含表达盒，该表达盒的结构要素包括(x)在酵母细胞内能够转录的启动子；(y)上述(a)～(i)任意一项所述的多核苷酸(DNA)，其连接在上述启动子的有义或反义方向；以及(z)与RNA分子的转录终止及多腺苷化作用相关且在酵母中起作用的信号。在本发明后述的酒类(如啤酒)酿造中，要高表达上述本发明的蛋白质时，将上述(a)～(i)任意一项所述的多核苷酸(DNA)针对该启动子以有义方向导入，以促进上述多核苷酸(DNA)的表达。此外，在后述的酒类(如啤酒)酿造中，要抑制上述本发明的蛋白质表达时，将上述(a)～(i)任意一项所述的多核苷酸(DNA)针对该启动子以反义方向导入，以抑制上述多核苷酸(DNA)的表达。此外，要抑制上述本发明的蛋白质表达时，还可向载体中导入上述(j)～(m)任意一项所述的多核苷酸且使其能够表达。另外，在本发明中，通过破坏作为靶基因的上述基因(DNA)，可抑制上述多核苷酸(例如DNA)的表达或上述蛋白质的表达。基因的破坏可通过使与靶基因的基因产物表达相关的区域如编码区或启动子区的区域内添加或缺失一个或多个碱基，或使上述区域整体缺失来进行。上述破坏基因的方法可参照公知文献(例如参照Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，4951(1979)、Methods in Enzymology，101，202(1983)、日本特开平6-253826号公报等)。

向酵母中导入时使用的载体可利用多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp型)、染色体整合型(YIp型)中的任意一种。例如，已知YEp型载体YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，AcademicPress，New York，83，1983)、YCp型载体YCp50(M.D.Rose et al.，gene，60，237，1987)、YIp型载体YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035，1979)，且容易获得。

用于调节酵母中基因表达的启动子/终止子，只要在酿造用酵母中起作用，同时不受醪液中氨基酸或糖、高级醇、酯等成分的影响，任意组合都可以。例如，可使用3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子等。这些基因都已经被克隆，如在M.F.Tuiteet al.，EMBO J.，1，603(1982)中有详细记载，可通过已知的方法很容易就获得。

转化时使用的选择性标记，因酿造用酵母不能利用营养缺陷型标记，所以，可利用氨基糖苷类抗生素(Geneticin)抗性基因(G418r)、耐铜基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，3371984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(猪腰淳嗣等，生化学，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)等。

上述方法构建的载体被导入宿主酵母。宿主酵母可以是任何用于酿造的酵母，如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体地说，如酵母(Saccharomyces)属等的酵母，在本发明中，可使用啤酒酵母，如巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等、卡氏酵母(Saccharomycescarlsbergensis)NCYC453、NCYC456等、酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。还可使用威士忌酵母，如酒酵母NCYC90等、葡萄酒酵母，如协会葡萄酒用1号、协会葡萄酒用3号、协会葡萄酒用4号等、清酒酵母，如协会酵母清酒用7号、清酒用9号等，但不限于此。在本发明中，优选啤酒酵母，例如巴氏酵母。

酵母的转化方法可采用一般使用的公知方法。如电穿孔法“Meth.Enzym.，194，p182(1990)”、原生质体法“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)”、乙酸锂法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75p 1929(1978)、Methods in yeast genetics，2000 Edition：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等记载的方法，但并不限于此。

更具体地说，将宿主酵母在标准酵母营养培养基(如YEPD培养基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培养至OD600nm值为1～6。将上述培养酵母离心分离并收集，洗净，用浓度约为1M～2M的碱金属离子，优选用锂离子进行前处理。上述细胞在约30℃下，静置60分钟左右后，与导入的DNA(约1μg～20μg)一起，在约30℃下，静置60分钟左右。添加聚乙二醇，优选约4,000道尔顿的聚乙二醇，使其最终浓度约为20％～50％。于约30℃下，静置30分钟左右后，将上述细胞在约42℃下加热处理5分钟左右。优选将上述细胞悬浮液用标准酵母营养培养基洗净，倒入规定量的新鲜标准酵母营养培养基中，在约30℃下，静置60分钟左右。然后，将其接种于含有作为选择性标记使用的抗生素等的标准琼脂培养基上，获得转化体。

此外，一般的克隆技术可参照《Molecular Cloning第三版》、“Methodsin Yeast Genetics，A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)”等。

4.本发明的酒类的制造方法以及根据该方法制造的酒类

将上述本发明的载体导入适于酿造目标酒类的酵母中，通过使用该酵母，可制得所期望的酒类且戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯含量增加、香味增加的酒类。另外，通过下述本发明的酵母评价方法选择的酵母也可同样使用。目标酒类可以是啤酒、发泡酒等啤酒味饮料、葡萄酒、威士忌、清酒等，但并不限于这些。另外，在本发明中，可根据需要，通过使用靶基因的表达受到抑制的酿造用酵母，制得所期望的酒类且戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯含量减少的酒类。即，采用导入了上述本发明载体的酵母、上述本发明多核苷酸(DNA)的表达受到抑制的酵母或根据下述本发明酵母的评价方法选择的酵母，进行制造酒类的发酵，通过调节(增加或减少)戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成量，可获得所期望的酒类且戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯含量得到调节(增加或减少)的酒类。

制造上述酒类时，除了用本发明得到的酿造酵母代替亲株之外，其他可利用公知的方法。因此，原料、制造设备、制造管理等可与以往的方法完全相同，不会因制造控制了戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯含量的酒类而增加成本。即，根据本发明，可用已有的设备，在不增加成本的情况下制造香味优异的酒类。

5.本发明的酵母的评价方法

本发明涉及一种评价方法，其采用根据具有序列号1或序列号3碱基序列的支链氨基酸氨基转移酶基因的碱基序列设计的引物或探针，评价被检酵母的戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力。上述评价方法的一般方法为公知，例如在WO01/040514号公报、日本特开平8-205900号公报等中有记载。下面，对上述评价方法进行简单说明。

首先，制备被检酵母的基因组。制备方法可采用Hereford法或乙酸钾法等任何一种公知方法(如Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990))。以获得的基因组为对象，用根据支链氨基酸氨基转移酶基因的碱基序列(优选ORF序列)设计的引物或探针，检测被检酵母的基因组中是否存在其基因或其基因中是否存在特异序列。引物或探针的设计可采用公知的方法。

基因或特异序列的检出可采用公知的方法。例如，以含有特异序列的一部分或全部的多核苷酸或含有与其碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸作为一种引物，以含有该序列上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或含有与其碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸作为另一种引物，通过PCR法扩增酵母的核酸，测定扩增产物的有无、扩增产物分子量大小等。引物使用的多核苷酸的碱基数通常为10bp或大于10bp，优选15bp～25bp。此外，插入部分的碱基数通常以300bp～2000bp为宜。

PCR法的反应条件并无特别限定，如可采用变性温度：90℃～95℃，退火温度：40℃～60℃，延伸温度：60℃～75℃，循环数：10次或大于10次等条件。获得的反应产物可通过琼脂糖凝胶电泳法等进行分离，测定扩增产物的分子量。上述方法根据扩增产物的分子量是否包含特定DNA分子的大小，预测和评价该酵母的戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力。而且，可通过分析扩增产物的碱基序列，更加准确地预测·评价上述能力。

在本发明中，还可培养被检酵母，通过测定具有序列号1或序列号3碱基序列的支链氨基酸氨基转移酶基因的表达量，评价被检酵母的戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力。这种情况下，培养被检酵母，通过对支链氨基酸氨基转移酶基因的产物mRNA或蛋白质定量，进行评价。mRNA或蛋白质的定量可采用公知的方法。例如，mRNA的定量可采用如Northern杂交法或定量RT-PCR等，蛋白质的定量可采用如Western印迹法进行(CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons 1994-2003)。

培养被检酵母，测定具有序列号1或序列号3碱基序列的支链氨基酸氨基转移酶基因的表达量，通过选择与目标戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力相应的上述基因表达量的被检酵母，可选择适于酿造所期望的酒类的酵母。还可以通过培养标准酵母及被检酵母，测定上述基因在各酵母中的表达量，比较上述基因在标准酵母和被检酵母中的表达量，选择所期望的被检酵母。具体地说，例如可通过培养标准酵母及被检酵母，测定具有序列号1或序列号3碱基序列的支链氨基酸氨基转移酶基因在各酵母中的表达量，选择该基因比标准酵母高表达的被检酵母，从而选择出适于酒类酿造的酵母。

或者，可通过培养被检酵母，选择戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力高或低的酵母，或选择支链氨基酸氨基转移酶活性高或低的酵母，从而选择出适于酿造所期望的酒类的被检酵母。

这样的情况下，作为被检酵母或标准酵母，可采用例如导入了上述本发明载体的酵母、上述调节了本发明的多核苷酸(DNA)表达的酵母、经突变处理的酵母、发生了自发突变的酵母等。戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力可通过顶空气相色谱法(J.Am.Soc.Brew.Chem.49：152-157，1991)测定，支链氨基酸氨基转移酶活性可通过(J.Biol，Chem.，271，24458-24464，1996)中记载的方法测定。突变处理，例如可使用紫外线照射、放射线照射等的物理方法，通过甲磺酸乙酯(EMS：Ethylmethanesulfonate)、N-甲基-N-亚硝基胍(N-methyl-N-nitrosoguanidine)等药剂处理的化学方法等的任何方法进行(例如，参照大岛泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、p67-75、学会出版中心等)。

还有，可作为标准酵母、被检酵母使用的酵母，可例举为酿造时可使用的任意的酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体地说，可例举为酵母属(Saccharomyces)等的酵母(例如巴氏酵母(Saccharomycespastorianus)、酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、卡氏酵母(Saccharomycescarlsbergensis)，但在本发明中，可使用啤酒酵母例如巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等，卡氏酵母(Saccharomycescarlsbergensis)NCYC453、NCYC456等，酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且还可使用，例如协会葡萄酒用1号、同3号、同4号等的葡萄酒酵母；例如协会酵母、清酒用7号、同9号等的清酒酵母，但不限于此。本发明中，啤酒酵母例如可优选使用巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)。标准酵母、被检酵母可从上述酵母中以任意组合选择。

实施例

下面，结合实施例详细描述本发明，但本发明不限于以下实施例。

实施例1：新型支链氨基酸氨基转移酶基因(nonScBAT1)的克隆

用日本特开2004-283169号公报中所述的比较数据库检索后，结果发现了啤酒酵母中特有的新型支链氨基酸氨基转移酶基因nonScBAT1(序列号1)。根据获得的碱基序列信息，分别设计了用于扩增全长基因的引物nonScBAT1_for(序列号5)/nonScBAT1_rv(序列号6)，通过以基因组解读株Saccharomyces pastorianus Weihenstephaner34/70株(有时简写为“W34/70株”)的染色体DNA为模板的PCR，获得了含有nonScBAT1全长基因的DNA片段(约1.2kb)。

将上述方法获得的nonScBAT1基因片段，通过TA克隆插入pCR2.1-TOPO(Invitrogen公司制造)载体。用双脱氧测序法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)分析并确定了nonScBAT1基因的碱基序列。

实施例2：啤酒试酿中nonScBAT1基因表达的分析

用啤酒酵母巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70株进行试酿，从发酵中的啤酒酵母菌体提取的mRNA通过啤酒酵母DNA微阵列检测。

麦汁浸出物浓度 12.69％

麦汁体积 70L

麦汁中溶解氧浓度 8.6ppm

发酵温度 15℃

酵母添加量 12.8×10⁶cells/mL

对发酵液进行经时采样，观察酵母增殖量(图1)、浸出物表观浓度(图2)的经时变化。与此同时对酵母菌体进行采样，用生物素标记制备好的mRNA，在啤酒酵母DNA微阵列上杂交。用GeneChip Operating System(GCOS；GeneChip Operating Software 1.0，Affymetrix公司制造)进行信号检出。在图3中显示nonScBAT1基因的表达模式。根据其结果，确认了nonScBAT1基因在一般的啤酒发酵中表达。

实施例3：nonScBAT1基因的破坏

按照文献(Goldstein et al.，yeast.151541(1999))的方法，通过以含有抗药性标记的质粒(pFA6a(G418r))为模板的PCR，制备用于破坏基因的片段。以nonScBAT1_delta_for(序列号9)、nonScBAT1_delta_rv(序列号10)作为PCR的引物。

用上述方法制备的用于破坏基因的片段转化来自啤酒酵母巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70株的孢子克隆株(W34/70-2)。转化采用日本特开平07-303475中所述的方法，用含氨基糖苷类抗生素(Geneticin)300mg/L的YPD平板培养基(1％酵母提取物，2％多聚蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)选择转化体。

实施例4：啤酒酿造试验中戊醇、异丁醇及乙酸异戊酯生成量的分析

在下述条件下，使用亲株及实施例3中获得的nonScBAT1破坏株进行发酵试验。

麦汁浸出物浓度 12％

麦汁体积 1L

麦汁中溶解氧浓度 10ppm

发酵温度 15℃

酵母添加量 5g/L

对发酵醪液进行经时采样，分析酵母增殖量(OD660)(图4)、浸出物消耗量的经时变化(图5)。发酵结束时戊醇、异丁醇及乙酸异戊酯的浓度用顶空气相色谱法(J.Am.Soc.Brew.Chem.49：152-157，1991)进行定量。

由表1可知，发酵结束时亲株的异丁醇生成量为22.3ppm，而nonScBAT1破坏株为14.9ppm。亲株的戊醇生成量为95.2ppm，而nonScBAT1破坏株为77.6ppm。亲株的乙酸异戊酯生成量为3ppm，而nonScBAT1破坏株为1.8ppm。上述结果表明，因nonScBAT1破坏，使异丁醇、戊醇及乙酸异戊酯生成量减少约20～40％。而且，此时，亲株与破坏株在增殖速度及浸出物消耗速度上几乎没有差别。

表1

单位：ppm

( )内的值表示与亲株的相对值

实施例5：nonScBAT1高表达株的制备

将实施例1中所述的nonScBAT1/pCR2.1-TOPO用限制酶SacI及NotI酶解，制备含有蛋白质编码区全长的DNA片段。将该片段连接于经限制酶SacI及NotI处理后的pYCGPYNot上，构建了nonScBAT1高表达载体nonScBAT1/pYCGPYNot。pYCGPYNot为YCp型酵母表达载体，导入的基因通过丙酮酸激酶基因PYK1的启动子进行高表达。酵母的选择性标记包括Geneticin抗性基因G418r，大肠杆菌的选择性标记包括氨苄青霉素抗性基因Ampr。

用上述方法制备的高表达载体，根据日本特开平07-303475中所述的方法，转化Saccharomyces pastorianus Weihenstephaner34/70株。用含氨基糖苷类抗生素(Geneticin)300mg/L的YPD平板培养基(1％酵母提取物，2％多聚蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)选择转化体。

实施例6：啤酒酿造试验中戊醇、异丁醇及乙酸异戊酯生成量的分析

在下述条件下，使用亲株及实施例5中获得的nonScBAT1高表达株进行发酵试验。

麦汁浸出物浓度 12％

麦汁体积 1L

麦汁中溶解氧浓度 10ppm

发酵温度 15℃

酵母添加量 5g/L

对发酵醪液进行经时采样，分析酵母增殖量(OD660)(图6)、浸出物消耗量(图7)的经时变化。发酵结束时高级醇及酯的浓度用顶空气相色谱法(J.Am.Soc.Brew.Chem.49：152-157，1991)进行定量。

根据表2，发酵结束时亲株的异丁醇生成量为11.1ppm，而nonScBAT1高表达株为12.6ppm。亲株的戊醇生成量为61ppm，而nonScBAT1高表达株为65.7ppm。亲株的乙酸异戊酯生成量为1.8ppm，而nonScBAT1高表达株为2ppm。上述结果表明nonScBAT1高表达使异丁醇、戊醇及乙酸异戊酯生成量增大约1.1倍。而且此时，亲株与组成性表达株在增殖速度及浸出物消耗速度上几乎没有差别。

表2

单位：ppm

( )内的值表示与亲株的相对值

实施例7：新型支链氨基酸氨基转移酶(nonScBAT2)基因的克隆

用日本特开2004-283169号公报中所述的比较数据库检索后，结果发现了啤酒酵母中特有的新型支链氨基酸氨基转移酶基因nonScBAT2(序列号3)。根据获得的碱基序列信息，分别设计了用于扩增全长基因的引物nonScBAT2_for(序列号7)/nonScBAT2_rv(序列号8)，通过以基因组解读株Saccharomyces pastorianus Weihenstephaner34/70株的染色体DNA为模板的PCR，获得了含有nonScBAT2全长基因的DNA片段(约1.2kb)。

将上述方法获得的nonScBAT2基因片段，通过TA克隆插入pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen公司制造)。用双脱氧测序法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)分析并确定了nonScBAT2基因的碱基序列。

实施例8：啤酒试酿中nonScBAT2基因表达的分析

用啤酒酵母巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70株进行啤酒试酿，从发酵中的啤酒酵母菌体中提取的mRNA通过啤酒酵母DNA微阵列检出。

麦汁浸出物浓度 12.69％

麦汁体积 70L

麦汁中溶解氧浓度 8.6ppm

发酵温度 15℃

酵母添加量 12.8×10⁶cells/mL

对发酵液进行经时采样，观察酵母增殖量(图8)、浸出物表观浓度(图9)的经时变化。与此同时对酵母菌体进行采样，用生物素标记制备好的mRNA，在啤酒酵母DNA微阵列上杂交。用GeneChip Operating System(GCOS；GeneChip Operating Software 1.0，Affymetrix公司制造)进行信号检出。在图10显示nonScBAT2基因的表达模式。根据其结果，确认了nonScBAT2基因在一般的啤酒发酵中表达。

实施例9：nonScBAT2基因的破坏

按照文献(Goldstein et al.，yeast.15 1541(1999))的方法，通过以含有抗药性标记的质粒(pFA6a(G418r)，pAG25(nat1)，pAG32(hph))为模板的PCR，制备用于破坏基因的片段。以nonScBAT2_delta_for(序列号11)、nonScBAT2_delta_rv(序列号12)作为PCR的引物。

用上述方法制备的用于破坏基因的片段，转化啤酒酵母巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70株或来自W34/70的孢子克隆株(W34/70-2)。转化采用日本特开平07-303475中所述的方法，用含氨基糖苷类抗生素(Geneticin)300mg/L或Nourseothricin 50mg/L或Hygromycin B200mg/L的YPD平板培养基(1％酵母提取物，2％多聚蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)选择转化体。

实施例10：啤酒酿造试验中戊醇、异丁醇及乙酸异戊酯生成量的分析

在下述条件下，使用亲株及实施例9中获得的nonScBAT2破坏株进行发酵试验。

麦汁浸出物浓度 11.85％

麦汁体积 1L

麦汁中溶解氧浓度 8ppm

发酵温度 15℃

酵母添加量 5g/L

对发酵醪液进行经时采样，分析酵母增殖量(OD660)(图11)、浸出物消耗量(图12)的经时变化。发酵结束时高级醇及酯的浓度用顶空气相色谱法(J.Am.Soc.Brew.Chem.49：152-157，1991)进行定量。

由表3可知，发酵结束时亲株的异丁醇生成量为18.5ppm，而nonScBAT2破坏株为7.3ppm。亲株的戊醇生成量为86.2ppm，而nonScBAT2破坏株为50.8ppm。亲株的乙酸异戊酯生成量为2.3ppm，而nonScBAT2破坏株为1.3ppm。上述结果表明nonScBAT2破坏使异丁醇、戊醇及乙酸异戊酯生成量减少约40％～60％。而且此时，亲株与破坏株在增殖速度及浸出物消耗速度上几乎没有差别。

表3

单位：ppm

( )内的值表示与亲株的相对值

实施例11：nonScBAT2高表达株的制备

将实施例7中所述的nonScBAT2/pCR2.1-TOPO用限制酶SacI及NotI酶解，制备含有蛋白质编码区全长的DNA片段。将该片段连接于经限制酶SacI及NotI处理后的pYCGPYNot上，构建了nonScBAT2高表达载体nonScBAT2/pYCGPYNot。pYCGPYNot为YCp型酵母表达载体，导入的基因通过丙酮酸激酶基因PYK1的启动子进行高表达。酵母的选择性标记包括Geneticin抗性基因G418^r，大肠杆菌的选择性标记包括氨苄青霉素抗性基因Amp^r。

用上述方法制备的高表达载体，根据日本特开平07-303475号公报中所述的方法，转化Saccharomyces pastorianus Weihenstephaner 34/70株。用含Geneticin 300mg/L的YPD平板培养基(1％酵母提取物，2％聚蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)选择转化体。

实施例12：啤酒酿造试验中戊醇、异丁醇及乙酸异戊酯生成量的分析

在下述条件下，进行亲株及实施例11中获得的nonScBAT2高表达株的发酵实验。

麦汁浸出物浓度 12％

麦汁体积 1L

麦汁中溶解氧浓度 10ppm

发酵温度 15℃

酵母添加量 5g/L

对发酵醪液进行经时采样，分析酵母增殖量(OD660)(图13)、浸出物消耗量(图14)的经时变化。发酵结束时高级醇及酯的浓度用顶空气相色谱法(J.Am.Soc.Brew.Chem.49：152-157，1991)进行定量。

由表4可知，发酵结束时亲株的异丁醇生成量为11.1ppm，而nonScBAT2高表达株为29.4ppm。亲株的戊醇生成量为61ppm，而nonScBAT2高表达株为103.9ppm。亲株的乙酸异戊酯生成量为1.8ppm，而nonScBAT2高表达株为3.6ppm。上述结果表明nonScBAT2高表达使异丁醇、戊醇及乙酸异戊酯生成量增大1.7～2.7倍。而且此时，亲株与组成性表达株在增殖速度及浸出物消耗速度上几乎没有差别。

表4

单位：ppm

( )内的值表示与亲株的相对值

由上述结果可知，本发明中揭示的酵母，其通过控制啤酒酵母特有的支链氨基酸氨基转移酶的表达量来控制高级醇及其酯的生成能力，其可在不改变发酵工程或发酵期间的情况下，根据目的控制戊醇、异丁醇及乙酸异戊酯的生成量。因此可制造香味优异的酒类。

根据本发明的酒类制造方法，因赋予产品沁人香味的高级醇或酯的含量增加，所以可制造香味优异的酒类。而对于不期望含有过剩高级醇或酯的啤酒等麦芽饮料，高级醇或酯的含量减少，可制造香味更好的酒类。

[序列表]

<110>三得利株式会社(Suntory Limited)

<120>支链氨基酸氨基转移酶基因及其用途(Branched amino acid aminotransferase gene anduse thereof)

<130>G06-0066CN

<150>JP 2005-266076

<151>2005-09-13

<150>JP 2005-371820

<151>2005-12-26

<160>12

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1182

<212>DNA

<213>酵母(Saccharomyces sp.)

<400>1

atgttacaaa ggaattcttt gaaatggggg aaattctcca tcagaacgct agccactggt 60

gctccattgg atgcctctaa attgaaaatt acaagaaacc caaatccttc caagccaaga 120

ccaaatgacg aattagtgtt tggtcaaaca ttcacagacc acatgttgac cattccatgg 180

actgccaaag aagggtgggg tgttcctcat atcaagcctt atgctaattt atcgcttgac 240

ccatcatctt gtgtattcca ctatgcattt gaactgttcg aaggtttgaa agcctacaga 300

acccctcaaa ataccattac catgttccgt tctgacaaga acatggttcg tatgaacaaa 360

tccgcagcta gaatctgttt acccaccttc gactctgagg aattgatcaa gcttactggg 420

aagttgatcg aacaagataa acatttagtt cctgaaggga atggttactc tttatacatc 480

agaccaacaa tgatcggtac ctctaaaggt ttaggtgtcg gcactccttc cgaagctctt 540

ctttacgtga tcacttctcc agttggtcct tattacaaga ccggtttcaa ggccgttcgt 600

cttgaagcaa cagactatgc cactagagct tggccaggtg gtgttggtga caagaagttg 660

ggtgctaact atgctccatg tatcttacct caattgcaag ctgctaaaag aggataccaa 720

caaaacctat ggttgtttgg tcctgaaaaa aacattactg aagtcggcac catgaacgtg 780

ttcttcgtct tcctcaacaa agtcaccggt aagaaagagt tggttactgc cccattagac 840

ggtactatct tggaaggtgt cactagagat tctgttttga gtttggctcg tgagaaacta 900

gatcctcaag aatgggacat caacgaacgt tattacacta tcactgaagt tgctactaga 960

gctcaacaag gtgaactatt ggaagcattc ggttctggta ctgctgctgt tgtctcacca 1020

atcaaggaaa ttggctggaa agatcaagat atcaatgttc cattattgcc tggtgagcaa 1080

tctggtgctt tgaccaagca agtcgcccaa tggattgctg atattcaata cggtagaact 1140

aagcacggta actggtcgag aactgttgct gacttgaact aa 1182

<210>2

<211>393

<212>PRT

<213>酵母(Saccharomyces sp.)

<400>2

Met Leu Gln Arg Asn Ser Leu Lys Trp Gly Lys Phe Ser Ile Arg Thr

1 5 10 15

Leu Ala Thr Gly Ala Pro Leu Asp Ala Ser Lys Leu Lys Ile Thr Arg

20 25 30

Asn Pro Asn Pro Ser Lys Pro Arg Pro Asn Asp Glu Leu Val Phe Gly

35 40 45

Gln Thr Phe Thr Asp His Met Leu Thr Ile Pro Trp Thr Ala Lys Glu

50 55 60

Gly Trp Gly Val Pro His Ile Lys Pro Tyr Ala Asn Leu Ser Leu Asp

65 70 75 80

Pro Ser Ser Cys Val Phe His Tyr Ala Phe Glu Leu Phe Glu Gly Leu

85 90 95

Lys Ala Tyr Arg Thr Pro Gln Asn Thr Ile Thr Met Phe Arg Ser Asp

100 105 110

Lys Asn Met Val Arg Met Asn Lys Ser Ala Ala Arg Ile Cys Leu Pro

115 120 125

Thr Phe Asp Ser Glu Glu Leu Ile Lys Leu Thr Gly Lys Leu Ile Glu

130 135 140

Gln Asp Lys His Leu Val Pro Glu Gly Asn Gly Tyr Ser Leu Tyr Ile

145 150 155 160

Arg Pro Thr Met Ile Gly Thr Ser Lys Gly Leu Gly Val Gly Thr Pro

165 170 175

Ser Glu Ala Leu Leu Tyr Val Ile Thr Ser Pro Val Gly Pro Tyr Tyr

180 185 190

Lys Thr Gly Phe Lys Ala Val Arg Leu Glu Ala Thr Asp Tyr Ala Thr

195 200 205

Arg Ala Trp Pro Gly Gly Val Gly Asp Lys Lys Leu Gly Ala Asn Tyr

210 215 220

Ala Pro Cys Ile Leu Pro Gln Leu Gln Ala Ala Lys Arg Gly Tyr Gln

225 230 235 240

Gln Asn Leu Trp Leu Phe Gly Pro Glu Lys Asn Ile Thr Glu Val Gly

245 250 255

Thr Met Asn Val Phe Phe Val Phe Leu Asn Lys Val Thr Gly Lys Lys

260 265 270

Glu Leu Val Thr Ala Pro Leu Asp Gly Thr Ile Leu Glu Gly Val Thr

275 280 285

Arg Asp Ser Val Leu Ser Leu Ala Arg Glu Lys Leu Asp Pro Gln Glu

290 295 300

Trp Asp Ile Asn Glu Arg Tyr Tyr Thr Ile Thr Glu Val Ala Thr Arg

305 310 315 320

Ala Gln Gln Gly Glu Leu Leu Glu Ala Phe Gly Ser Gly Thr Ala Ala

325 330 335

Val Val Ser Pro Ile Lys Glu Ile Gly Trp Lys Asp Gln Asp Ile Asn

340 345 350

Val Pro Leu Leu Pro Gly Glu Gln Ser Gly Ala Leu Thr Lys Gln Val

355 360 365

Ala Gln Trp Ile Ala Asp Ile Gln Tyr Gly Arg Thr Lys His Gly Asn

370 375 380

Trp Ser Arg Thr Val Ala Asp Leu Asn

385 390

<210>3

<211>1131

<212>DNA

<213>酵母(Saccharomyces sp.)

<400>3

atgaccttag cgcccttaga tgcctccaaa gtcaagatta ccaccaccga acacccatcg 60

gagccaaaac caaacgacca gctggtcttt ggtagaagct tcaccgacca catgctaact 120

gcggagtgga ctgcggcaaa cgggtgggac gtcccggaga tcaagcccta ccagaatctg 180

tcactggacc catccgcgta cgtgttccac tatgcttttg agctgtttga aggtatgaag 240

gcttacagga cagttgacaa taaaatcaca atgttccgcc cagacatgaa catgaagcgt 300

atgaataagt ctgcccgacg aatttgtctg ccagctttcg actcggagga gttaattgcc 360

ttgattgcaa agctgatcca acaagataag cgtttgattc cggagggaaa gggctactct 420

ttgtacatca ggccaactat gattggcact acggccggcc tgggtgtctc cacgccagac 480

agagccttgc tatatgtcat ttgttccccc gtgggccctt actacaagac cggtttcaaa 540

gcggttaggc tggaagccac tgattacgcc acaagggctt ggccgggcgg ctgtggtgac 600

aagaaattgg gcgccaacta tgctccttgc gtcctaccac agttgcaggc cgcctcaaga 660

ggttaccaac agaacttgtg gttgtttggc ccagagaata atatcactga agtaggcacc 720

atgaacgcat tctttgtctt caaaaacacc gaaacaggca agaaggaact ggtcactgcc 780

ccattggacg gcaccattct ggaaggtgtc acgagagatt ccatattaac cctcgccaag 840

gaaaggctcg atttaaatga gtggactatt agtgaacgct actgcaccat aggcgaagtt 900

tctgagagat ccaaaaaagg cgaactagta gaggcttttg gttctggtac agccgcgatc 960

gtttctccca tcaaagaaat cggctggaag ggcgaaccta tcaacatccc attactgccc 1020

ggcgagcaaa cgggaccatt gaccaaggaa gttgcccaat ggattaacca aatccaatac 1080

ggcgaagttg aacatggcaa ttggtcaagg gtcatcaccg atttgaactg a 1131

<210>4

<211>376

<212>PRT

<213>酵母(Saccharomyces sp.)

<400>4

Met Thr Leu Ala Pro Leu Asp Ala Ser Lys Val Lys Ile Thr Thr Thr

1 5 10 15

Glu His Pro Ser Glu Pro Lys Pro Asn Asp Gln Leu Val Phe Gly Arg

20 25 30

Ser Phe Thr Asp His Met Leu Thr Ala Glu Trp Thr Ala Ala Asn Gly

35 40 45

Trp Asp Val Pro Glu Ile Lys Pro Tyr Gln Asn Leu Ser Leu Asp Pro

50 55 60

Ser Ala Tyr Val Phe His Tyr Ala Phe Glu Leu Phe Glu Gly Met Lys

65 70 75 80

Ala Tyr Arg Thr Val Asp Asn Lys Ile Thr Met Phe Arg Pro Asp Met

85 90 95

Asn Met Lys Arg Met Asn Lys Ser Ala Arg Arg Ile Cys Leu Pro Ala

100 105 110

Phe Asp Ser Glu Glu Leu Ile Ala Leu Ile Ala Lys Leu Ile Gln Gln

115 120 125

Asp Lys Arg Leu Ile Pro Glu Gly Lys Gly Tyr Ser Leu Tyr Ile Arg

130 135 140

Pro Thr Met Ile Gly Thr Thr Ala Gly Leu Gly Val Ser Thr Pro Asp

145 150 155 160

Arg Ala Leu Leu Tyr Val Ile Cys Ser Pro Val Gly Pro Tyr Tyr Lys

165 170 175

Thr Gly Phe Lys Ala Val Arg Leu Glu Ala Thr Asp Tyr Ala Thr Arg

180 185 190

Ala Trp Pro Gly Gly Cys Gly Asp Lys Lys Leu Gly Ala Asn Tyr Ala

195 200 205

Pro Cys Val Leu Pro Gln Leu Gln Ala Ala Ser Arg Gly Tyr Gln Gln

210 215 220

Asn Leu Trp Leu Phe Gly Pro Glu Asn Asn Ile Thr Glu Val Gly Thr

225 230 235 240

Met Asn Ala Phe Phe Val Phe Lys Asn Thr Glu Thr Gly Lys Lys Glu

245 250 255

Leu Val Thr Ala Pro Leu Asp Gly Thr Ile Leu Glu Gly Val Thr Arg

260 265 270

Asp Ser Ile Leu Thr Leu Ala Lys Glu Arg Leu Asp Leu Asn Glu Trp

275 280 285

Thr Ile Ser Glu Arg Tyr Cys Thr Ile Gly Glu Val Ser Glu Arg Ser

290 295 300

Lys Lys Gly Glu Leu Val Glu Ala Phe Gly Ser Gly Thr Ala Ala Ile

305 310 315 320

Val Ser Pro Ile Lys Glu Ile Gly Trp Lys Gly Glu Pro Ile Asn Ile

325 330 335

Pro Leu Leu Pro Gly Glu Gln Thr Gly Pro Leu Thr Lys Glu Val Ala

340 345 350

Gln Trp Ile Asn Gln Ile Gln Tyr Gly Glu Val Glu His Gly Asn Trp

355 360 365

Ser Arg Val Ile Thr Asp Leu Asn

370 375

<210>5

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>nonScBAT1_for

<400>5

gagctcatag cggccatgtt acaaaggaat tctttgaaat 40

<210>6

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>nonScBAT1_rv

<400>6

ggatcctatg cggccgcatg tgaattataa aatatgtatc ta 42

<210>7

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>nonScBAT2_for

<400>7

gagctcatag cggccatgac cttagcgccc ttagatgcct 40

<210>8

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>nonScBAT2_rv

<400>8

ggatcctatg cggccgctag aatatggaaa aaaaaatgct gc 42

<210>9

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>nonScBAT1_delta_for

<400>9

ttaccctttt tctcctaagt acgtataagt tcagcccaac gtactaaaac ccttgacagt 60

cttgacgtgc 70

<210>10

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>nonScBAT1_delta_rv

<400>10

ttgttgttcg tttttttagc attagttcaa gtcagcaaca gttctcgacc cgcacttaac 60

ttcgcatctg 70

<210>11

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>nonScBAT2_delta_for

<400>11

acatcagtaa catctttaca cacttaaaaa caacaacaac aacaacaaca ccttgacagt 60

cttgacgtgc 70

<210>12

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>nonScBAT2_delta_rv

<400>12

aaagagaatg cttttgtgtt ggctttttta tggtttgatg tagcagtact cgcacttaac 60

ttcgcatctg 70

Claims

1.一种多核苷酸，其从以下(a)～(b)组成的组中选择：

(a)由序列号1或序列号3的碱基序列组成的多核苷酸；

(b)编码由序列号2或序列号4的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其为DNA。

3.一种蛋白质，其为由权利要求1或2所述的多核苷酸编码的蛋白质。

4.一种载体，其包含权利要求1或2所述的多核苷酸。

5.一种酵母，其导入了权利要求4所述的载体。

6.根据权利要求5所述的酵母，其通过导入权利要求4所述的载体，增强戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力。

7.一种酵母，其通过破坏与权利要求2所述的多核苷酸相关的基因，抑制权利要求2所述的多核苷酸的表达，该多核苷酸为DNA。

8.根据权利要求6所述的酵母，其通过增加权利要求3所述的蛋白质的表达量，提高戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力。

9.一种酒类的制造方法，其为使用权利要求5～8中任一项所述的酵母制造酒类的方法。

10.根据权利要求9所述的酒类的制造方法，其酿造的酒类为麦芽饮料。

11.根据权利要求9所述的酒类的制造方法，其酿造的酒类为葡萄酒。

12.一种评价方法，其为使用根据由序列号1或序列号3的碱基序列组成的支链氨基酸氨基转移酶基因的碱基序列设计的引物或探针，对被检酵母的戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力进行评价的方法。

13.一种评价方法，其为培养被检酵母，通过测定由序列号1或序列号3的碱基序列组成的支链氨基酸氨基转移酶基因的表达量，对被检酵母的戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力进行评价的方法。

14.一种选择酵母的方法，其为培养被检酵母，对权利要求3所述的蛋白质定量或测定由序列号1或序列号3的碱基序列组成的支链氨基酸氨基转移酶基因的表达量，选择与目标戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成能力相应的上述蛋白质的量或上述基因表达量的被检酵母的选择方法。

15.根据权利要求14所述的选择酵母的方法，其为培养标准酵母和被检酵母，测定由序列号1或序列号3的碱基序列组成的支链氨基酸氨基转移酶基因在各酵母中的表达量，选择出与标准酵母相比，该基因高表达或低表达的被检酵母的选择方法。

16.根据权利要求14所述的选择酵母的方法，其为培养标准酵母和被检酵母，对各酵母中的权利要求3所述的蛋白质进行定量，选择出与标准酵母相比，该蛋白质的量多或少的被检酵母的选择方法。

17.一种制造酒类的方法，其特征在于，使用权利要求5～8所述的酵母及根据权利要求14～16所述的方法选择出的酵母中的任一种酵母，进行发酵制造酒类，调节戊醇及/或异丁醇及/或乙酸异戊酯的生成量。