CN1931370A - 一种糖肽缀合物微球或微囊及其制备方法 - Google Patents
一种糖肽缀合物微球或微囊及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1931370A CN1931370A CNA2006101160624A CN200610116062A CN1931370A CN 1931370 A CN1931370 A CN 1931370A CN A2006101160624 A CNA2006101160624 A CN A2006101160624A CN 200610116062 A CN200610116062 A CN 200610116062A CN 1931370 A CN1931370 A CN 1931370A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chitosan
- microsphere
- poly
- anhydride
- acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 title claims abstract description 75
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 title claims abstract description 45
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 title claims abstract description 34
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 8
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims abstract description 59
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 claims abstract description 33
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 32
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 28
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 18
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 18
- -1 amino acid carboxylic acid Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 11
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 22
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical group CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 13
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 10
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- UCPYLLCMEDAXFR-UHFFFAOYSA-N triphosgene Chemical compound ClC(Cl)(Cl)OC(=O)OC(Cl)(Cl)Cl UCPYLLCMEDAXFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010057904 polyisoleucine Proteins 0.000 claims description 3
- 108010050934 polyleucine Proteins 0.000 claims description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 3
- XVMSFILGAMDHEY-UHFFFAOYSA-N 6-(4-aminophenyl)sulfonylpyridin-3-amine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=N1 XVMSFILGAMDHEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 claims 3
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 claims 3
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 claims 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 35
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 27
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 18
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 16
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 238000007151 ring opening polymerisation reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 abstract description 5
- 238000012695 Interfacial polymerization Methods 0.000 abstract description 4
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 abstract description 4
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 abstract description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 abstract description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 14
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 14
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 13
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 12
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 12
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 12
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 12
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 description 11
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 8
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N benzene Substances C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 8
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 7
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 7
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 238000002479 acid--base titration Methods 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 6
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 6
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 5
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 4
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 4
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 4
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 4
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 description 4
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- HOKKHZGPKSLGJE-VKHMYHEASA-N (2s)-2-(methylamino)butanedioic acid Chemical compound CN[C@H](C(O)=O)CC(O)=O HOKKHZGPKSLGJE-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N Acrylic acid Chemical compound OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- XLBVNMSMFQMKEY-BYPYZUCNSA-N N-methyl-L-glutamic acid Chemical compound CN[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O XLBVNMSMFQMKEY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003005 anticarcinogenic agent Substances 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 2
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 239000011806 microball Substances 0.000 description 2
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 2
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 2
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 2
- 108010022457 polysaccharide peptide Proteins 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195573 Amycin Natural products 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 208000034530 PLAA-associated neurodevelopmental disease Diseases 0.000 description 1
- 101800001697 Saposin-B Proteins 0.000 description 1
- 102400000830 Saposin-B Human genes 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229940035674 anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 238000012653 anionic ring-opening polymerization Methods 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009141 biological interaction Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- 230000002254 contraceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 229920006037 cross link polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940020947 fluorescein sodium Drugs 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003193 general anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000004531 microgranule Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002052 molecular layer Substances 0.000 description 1
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003307 reticuloendothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000008542 thermal sensitivity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 229920006305 unsaturated polyester Polymers 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
Abstract
本发明公开了一种糖肽缀合物微球或微囊及其制备方法。糖肽缀合物微球或微囊由多糖构成糖肽缀合物的糖基部分，由聚肽构成糖肽缀合物的肽链部分，多糖和聚肽以共价键的形式连接。该方法采用界面聚合反应，首先制备水溶性壳聚糖，然后利用壳聚糖上氨基的亲核性引发多种氨基酸羧酸内酐单体开环聚合，形成以壳聚糖为主链，侧链接枝聚肽链段的多糖和聚肽以共价键相连的糖肽缀合物结构。利用水溶性壳聚糖本身具有的两亲性，在接枝共聚反应过程中可一步生成微球或微囊，并且无需添加乳化剂。本发明方法工艺简单、材料易得、聚合速率快、反应条件温和。制得的微球或微囊可用于药物缓释领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种糖肽缀合物微球或微囊及其通过界面聚合的制备方法。
背景技术
微球或微囊作为一种新型控/缓释给药体系，具有能保护药物免遭破坏、控制药物释放速度、延长药物作用时间、减少药物不良反应及降低用药量等优点，在药物释放领域受到极大关注。在临床治疗上微球属于被动靶向制剂，它能被器官组织的网状内皮系统(RES)所内吞或被细胞融合，集中于靶区逐步扩散释出药物或被溶酶体中的酶降解而释出药物。目前，微球的控缓释行为研究已进行得相当广泛。其中，对抗生素、避孕药和麻醉药等药物的控/缓释放研究较为普遍，技术也相对成熟。另外，微球用作蛋白、多肽及疫苗等大分子药物载体也越来越受到重视。
制备药物缓释用微球的材料必须具备无毒、生物相容性好和可生物降解等性质。近年来在药物释放材料研究中，生物降解高分子材料因其具备无毒、无免疫活性及不在体内积累滞留等优点而逐渐受到重视。
目前使用最多的是以聚α-羟基酸，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及其共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚原酸酯等为代表的不饱和聚酯类，凭借其良好的生物相容性以及降解产物无毒等优点，被FDA批准广泛用作药物控制载体(Uhrich，K.E.et al，Polymeric Systems forControlled Drug Release.Chem.Rev.(Review)；1999；99(11)：3181-3198)。例如，US6,551,522中制备了一种以PCL为基材的多孔药物缓释材料，并制成两端封闭的中空管，在中空管的内外表面间含有通道，使药剂填入从可以中空管通道中进出，从而达到控制释放。US7,041,320公开了一种高载药量的可注射性微球材料，由PLA、PCL及其共聚物组成。
另一种被广泛使用的天然高分子类脂质是一类分子结构中具有两亲基团(亲水基与亲油基)的化合物，能形成被称为脂质体的类脂双分子层微球，其中，磷脂与胆固醇是脂质体主要制备材料。由类脂质形成的脂质体双层分子层与生物膜极其相似，生物相容性优良，易被组织吸收。不同的细胞因子包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素(IL)-1-α，IL-2，IL-6，IFN-γ及肿瘤坏死因子(TNF)等均被制成脂质体制剂，以改变其体内的分布特性，使药物更易进入细胞发挥作用，提高受体敏感性及细胞毒活性(田瑞琴等，细胞因子类药物制剂研究进展，中国生化药物杂志，2005：26(5)：315-317)。Yuyama等(Yuyama et al，Potential usage ofthermosensitive liposomes for site-specific delivery of cytokines.Cancer Letters，2000，155(1)：71-77)用热敏性脂质体包裹的TNF在37℃血浆中是稳定的，但是在42℃时能被迅速释放，因此，具有很好的靶向性。Kedar等(Kedar E，et al.Delivery of cytokines by liposomes.III Liposome-encapsulated GM-CSFand TNF-alpha show improved pharmacokinetics and biological activity andreduced toxicity in mice.J.Immunother，1997，20(3)：180-193)将rhGM-CSF包囊于0.3～2.2μm的脂质体中，包囊后显示了较高的稳定性和活性，半衰期及药时曲线下面积是未包囊前的10-20倍，在4℃放置4个月生物活性降低不显著，且能显著提高粒细胞的数量。另外近年来日益受到瞩目的是阳性脂质体。它是由一种中性磷脂和一种或多种阳性成分组成的。其中，中性磷脂起到稳定双层膜和降低阳性成分毒性的作用，同时提供阳性脂质的细胞渗透功能，如胆固醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺以及二油酰磷脂酰乙醇胺等。阳性成分是具有不同化学结构的两性分子，多为双链季胺盐表面活性剂，为整个脂质体提供正电荷。正是由于这种性质，它可作为负电荷物质的传递载体，特别适用于蛋白质、多肽、寡核苷酸类物质、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)等(扈木荃等，荧光素钠阳离子脂质体的制备及向金黄色葡萄球菌转运的效率。华西药学杂志2003，23：199-202)。如可以用其介导基因转染，使阳性脂质体与DNA形成复合物，介导与细胞的作用，并将DNA释放到细胞中，实现基因转染，所以在基因治疗方面有独特应用。
然而这些材料还并非理想，对于聚酯类合成高分子来说，细胞亲和性差、缺乏细胞识别信号、与细胞间缺乏生物性相互作用等是它们共同的缺陷。聚酯在体内降解主要是酯键的随机、非酶性水解。由于PLA及PLGA疏水性较强，与亲水性药物，尤其是蛋白类药物亲和性较差，且在降解过程中微球内部局部酸性环境不利于药物稳定(Sood，A.et al.Peroral Route：An Opportunity for Protein and Peptide Drug Delivery，Chem.Rev.；(Review)；2001；101(11)；3275-3304，Ha，C.S.et al.Surface Chemistry ofBiodegradablePolymers for Drug Delivery Systems，Chem.Rev.；(Review)；2005；105(11)；4205-4232)。脂质体作为一种对人体无毒、无免疫原性的定向药物载体，能控制药物释放，提高药效，降低毒副作用。但在实际应用中，脂质体需要克服储存期限短、过度融合造成药物泄漏、组织专一性和靶向性差、易被吞噬细胞的网状内皮细胞系统迅速清除等困难。因此，开发性能优良的微球体系对于药剂学的发展具有重要意义。
根据微球和微囊形成的原理，常见微球(囊)的制备方法大致可分为利用反应形成微球或囊壁的化学方法、利用相分离形成微球或囊壁的物理化学方法和利用机械或其它物理作用，如喷雾干燥、空气悬浮、静电结合等形成微球或囊壁的物理方法等。上述制备微球或微囊的过程中一般都需加入表面活性剂或乳化剂。例如CN02137781.2采用油包油技术，以水溶性抗癌药物和聚乳酸及其共聚物的有机溶剂为内油相，液体石蜡或植物油为其外油相，制备了含有阿霉素、氟尿嘧啶、柔红霉素等抗肿瘤药物的微球。CN1607033A针对蛋白质、多肽、抗癌剂、激素等亲水性药物和油溶性药物，将亲水性药物溶于壳聚糖和醋酸水溶液中，将该水相用压力通过微孔膜压入油相中，得到尺寸均一的乳滴，然后采用一定的固定方法使乳滴固化，得到尺寸均一、分散稳定的壳聚糖微球或微囊药物载体；将油溶性药物溶于油性溶剂中，亲水性药物溶于壳聚糖醋酸水溶液中，先用均相乳化器制备O/W初乳，将该初乳用压力通过微孔膜压入油相中，得到尺寸均一的复乳滴，然后采用一定的固化方法使乳滴固化，得到尺寸均一、分散稳定的壳聚糖微球或微囊药物载体。
近年来，在制备微胶囊方面，又发展了许多新的制备方法，如模板组装、表面接枝聚合、分散聚合等。其中，基于弱相互作用的层-层自组装技术制备的微胶囊具有结构和性能可控、易赋予各种独特功能的特点。这些弱相互作用包括静电力、氢键、疏水力等。然而通过这种方法制备的聚合物微胶囊的稳定性常常不足，不能抵御较为苛刻的外部条件，如有机溶剂的溶解、酸碱盐的侵蚀、高温的分解等而被破坏。利用高分子聚合技术，使小分子单体在模板表面聚合成薄膜是近十几年发展起来的一种新技术。CN1772366A公开了一种制备中空微胶囊的方法，以二氧化硅微粒为模板，在其表面接枝双键，然后在另外一种分子模板聚乙烯基吡咯烷酮存在下，将丙烯酸聚合，生产含氢键的复合物，这种复合物或丙烯酸单体被捕捉或聚合到接双键的二氧化硅粒子表面，从而形成核-壳结构的微粒。最后把模板除去，得到中空微囊。CN1772365A则是基于共价键相互作用层-层组装方法，采用将两种可反应的聚合物在氨基化的二氧化硅颗粒表面进行反应，获得具有多层结构的聚合物超薄膜；然后采用氢氟酸去除无机粒子，得到囊壁为共价交联多层膜结构的中空微胶囊。但通过模板法制备微囊步骤较复杂。
发明内容
本发明的目的是提供一种糖肽缀合物微球或微囊及其制备方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明的构思是这样的：
从仿生的角度，模拟天然组织中细胞外基质对生长因子等生物活性物质的控释过程是一种设计药物缓释体系的新思路。细胞外基质(ExtracellularMatrix，ECM)是构成组织的3种主要结构单元之一，天然ECM在组织和器官中起骨架作用，同时也是生长因子的贮存器，将生长因子控制释放至相邻细胞和组织。细胞外基质中，糖不仅以多糖或寡糖的游离形式直接参与生命过程，更重要的是以糖缀合物(Glycoconjugates)，即糖链与蛋白等生物大分子以共价键相连的形式参与许多重要的生命过程。
以具有良好生物相容性并且与细胞外基质中糖胺多糖结构相似的天然高分子多糖壳聚糖为糖肽缀合物的糖基部分，以化学合成的聚肽作为糖肽缀合物中的肽链，壳聚糖和聚肽通过共价键相连，可形成仿细胞外基质结构的糖肽缀合物材料。
目前在聚肽合成中普遍使用的方法是α-氨基酸-N-羧酸内酐(NCA)的开环聚合法。该方法属于阴离子开环聚合机理，其引发剂可选用多种亲核试剂或碱类。胺是NCA法常用的引发剂，它的亲核性强于碱，可以使多种NCA单体聚合。壳聚糖分子上带有自由氨基，可作为一种大分子引发剂引发氨基酸NCA单体的开环聚合。通过壳聚糖的氨基引发氨基酸羧酸内酐单体的开环聚合，形成主链为壳聚糖，侧联为聚肽，多糖和聚肽以共价键相连的糖肽缀合物结构。
此处，发生接枝共聚反应的两种物质分别溶解于水相和油相(有机溶剂)中，利用非均相反应的特点，可以在合成糖缀合物的同时通过界面聚合方法原位制备糖肽微球材料。此外，壳聚糖经疏水化处理后，分子结构中同时具有疏水基团和亲水基团，具备了表面活性剂的两亲性特点，容易在溶液表面吸附，降低反应体系的表面张力。因此壳聚糖在引发NCA开环聚合的同时，又充当了乳化剂，使制备微球的过程中无需添加乳化剂。
本发明制备糖肽缀合物微球或微囊，采用多糖-聚肽接枝共聚的形式，由天然多糖壳聚糖构成糖肽缀合物的糖基部分，由聚(Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸)、聚(Nε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸)、聚(L-亮氨酸)、聚(L-异亮氨酸)、聚(L-丙氨酸)、聚(γ-苯甲酯-L-天冬氨酸)、聚(γ-苯甲酯-L-谷氨酸)、聚(γ-甲酯-L-谷氨酸)、聚(γ-乙酯-L-谷氨酸)、聚(O，O’-二苄氧羰基-3，4-二羟基-L-苯丙氨酸)中的一种或一种以上的均聚肽或其共聚物构成糖肽缀合物的肽链部分，多糖和聚肽以共价键相连接。所制备的微球或微囊的直径为10-1000μm。
本发明所说的糖肽缀合物微球或微囊，由多糖构成糖肽缀合物的糖基部分，由聚肽构成糖肽缀合物的肽链部分，多糖和聚肽以共价键的形式连接；
所说的多糖为天然多糖壳聚糖，所说的天然多糖壳聚糖为水溶性壳聚糖；
所说的聚肽为均聚肽或共聚肽，所说的均聚肽或共聚肽为通过化学方法合成的氨基酸聚合物；
所说的聚肽选自聚(Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸)、聚(Nε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸)、聚(L-亮氨酸)、聚(L-异亮氨酸)、聚(L-丙氨酸)、聚(γ-苯甲酯-L-天冬氨酸)、聚(γ-苯甲酯-L-谷氨酸)、聚(γ-甲酯-L-谷氨酸)、聚(γ-乙酯-L-谷氨酸)、聚(O，O’-二苄氧羰基-3，4-二羟基-L-苯丙氨酸)中的一种以上；
制备糖肽缀合物微球或微囊的方法，包括以下几个步骤：
1)将乙醇和吡啶依次加入重量浓度为0.5～10％的壳聚糖/醋酸溶液，然后加入乙酸酐，反应1～4小时，将反应液倒入乙醇中，过滤，得到壳聚糖凝胶，干燥，并经水/乙醇提纯得到水溶性壳聚糖，脱乙酰度为40～60％；
乙醇和吡啶的体积比为：乙醇∶吡啶＝2～5∶1；
吡啶在壳聚糖/醋酸溶液中的浓度为1～5mol/L；
乙酸酐的体积用量为壳聚糖/醋酸溶液的1～5％；
2)将α-氨基酸单体加入溶剂四氢呋喃溶液中，在氩气保护下，加入三光气，并升温至50～60℃反应，直至溶液变为澄清，将反应液倒入正己烷中，在0～25℃下静置8～15小时，过滤，得到白色固体结晶：α-氨基酸-N-羧酸内酐单体；
α-氨基酸单体与三光气的摩尔比例为，α-氨基酸单体∶三光气＝1∶0.3～3；
所说的α-氨基酸-N-羧酸内酐单体选自Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸-羧酸内酐、Nε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-羧酸内酐、L-亮氨酸-羧酸内酐、L-异亮氨酸-羧酸内酐、L-丙氨酸-羧酸内酐、γ-苯甲酯-L-天冬氨酸-羧酸内酐、γ-苯甲酯-L-谷氨酸-羧酸内酐、γ-甲酯-L-谷氨酸-羧酸内酐、γ-乙酯-L-谷氨酸-羧酸内酐或O，O’-二苄氧羰基-3，4-二羟基-L-苯丙氨酸-羧酸内酐；
3)将步骤1)得到的水溶性壳聚糖溶解在水中，配成浓度为0.01g/ml～5g/ml的壳聚糖水溶液；将步骤2)得到的α-氨基酸-N-羧酸内酐单体溶解在与水互不相溶的有机溶剂中，使单体浓度为0.01mol/l～10.0mol/l，在氩气保护下，将α-氨基酸-N-羧酸内酐溶液加入壳聚糖水溶液中，α-氨基酸-N-羧酸内酐单体与壳聚糖中氨基多糖单元的摩尔比为0.5～20，有机溶剂与水的比例为0.1～5，反应2小时；
所说的有机溶剂选自醋酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或甲苯等或它们的混合物；
4)将反应产物倒入N，N-二甲基甲酰胺/水混合溶液中，过滤，并依次用水、二甲基甲酰胺、丙酮溶液洗涤，经冷冻干燥得到糖肽缀合物微球或微囊。
本发明是建立在反应体系中水/油两相存在下，通过界面聚合，使壳聚糖上的氨基攻击α-氨基酸-N-羧酸内酐环状单体的开环聚合，形成壳聚糖-接枝聚肽材料。并利用水溶性壳聚糖本身具有一定乳化能力的特点，使在合成糖肽缀合物的同时，原位制备了微球或微囊。
本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种新型的以糖肽缀合物为主体材料的微球和微囊的制备方法。本发明以生物相容性良好的壳聚糖-接枝聚肽为主体材料，具有良好的组织相容性和可降解性，在体内不会造成组织的不良反应。
(2)本发明中，多糖和聚肽通过共价键形成高度交联的聚合物网络，相比通过弱相互作用的自组装技术形成的微囊，本发明提供的微球或微囊结构更为稳定，一旦反应完成，就不能被大部分有机溶剂溶解，也不能被一般浓度的酸、碱和盐破坏。
(3)本发明方法制备工艺简单、材料易得、聚合速率快、制备微球和微囊的过程在合成糖肽缀合物材料的过程中一步完成，并且无需外加乳化剂，反应条件温和，可望能够保持生物活性药物的活性。
(4)适用范围广。本发明制备的微球和微囊在酸性溶液和有机溶剂中均具有一定的溶胀性，制作工艺可适用于包埋蛋白类生长因子、抗癌剂、激素等多种酸溶性药物和油溶性药物。
(5)可控性。通过简单控制反应的组分比可以控制材料的糖基和聚肽的比例，并调控微球和微囊的降解性和溶胀性。通过控制反应条件可控制制备微球或微囊并控制微囊的壁厚。
附图说明
图1是实施例1的产物在光学显微镜下观察的微球在湿态下的图像。
图2是实施例1的产物冷冻干燥后在扫描电镜下观察的图像。
图3是实施例1的产物扫描电镜观察下的微球表面形貌。
图4是实施例2的产物冷冻干燥后在扫描电镜下观察的微囊图像。
图5是实施例2的产物扫描电镜下观察的微囊断面图像。
图6是实施例1和实施例3的产物微球在不同介质中的溶胀情况。
具体实施方式
下面通过本发明方法的具体实施例的详细描述来进一步阐述本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
实施例1
取4克壳聚糖溶解于100ml去离子水(含2.8ml冰乙酸)，全部溶解后加入100ml无水乙醇、32ml吡啶，搅拌至澄清，然后加入3.6ml乙酸酐，室温下搅拌2小时。将反应液倒入乙醇中，抽滤，得到白色沉淀。粗产物用水溶解，离心除去不溶物，滤液加入200ml无水乙醇，离心分离后弃去上清液，沉淀物依次用丙酮和无水乙醚洗涤，室温真空干燥24h，得白色絮状固体。采用酸碱滴定法测定产物的脱乙酰度为43％。
在Ar保护下，在100ml三口烧瓶中配制0.1g/10ml上述壳聚糖水溶液。称取0.6825gL-亮氨酸-N-羧酸内酐单体溶于干燥的乙酸乙酯中配成0.5mol/l溶液，并转移至反应瓶中，使L-亮氨酸-N-羧酸内酐单体与壳聚糖中氨基多糖单元的摩尔比为8，并且体系中的油/水相体积比例为0.8。控制搅拌速度为800r/min，反应2h。将反应混合液倒入DMF中，生成白色沉淀，抽滤，依次用DMF/H2O混合溶液、丙酮洗涤沉淀，冷冻干燥得白色微球。显微镜下观察所制备的微球在湿态时外观圆整，球形较好，尺寸较均匀，如图1。冷冻干燥后在扫描电镜下可见，所得微球能基本保持球形，直径在几十到一百微米之间(图2)，微球表面致密但不光滑(图3)。
实施例2
取4克壳聚糖溶解于100ml去离子水(含2.8ml冰乙酸)，全部溶解后依次加入100ml无水乙醇、32ml吡啶，搅拌至澄清，然后加入3.6ml乙酸酐，室温下搅拌3小时。将反应液倒入乙醇中，抽滤，得到白色沉淀。粗产物用适量去离子水溶解，离心除去不溶物，滤液加入200ml无水乙醇，离心分离后弃去上清液，沉淀物依次用丙酮和无水乙醚洗涤，室温真空干燥24h，得白色絮状固体。采用酸碱滴定法测定产物的脱乙酰度为43％。
在Ar保护下，在100ml三口烧瓶中配制0.1g/10ml上述壳聚糖水溶液。称取0.4263g L-亮氨酸-N-羧酸内酐单体溶于干燥的乙酸乙酯中配成0.14mol/l溶液，并转移至反应瓶中，使L-亮氨酸-N-羧酸内酐单体与壳聚糖中氨基多糖单元的摩尔比为5，并且体系中的油/水相的体积比例为2。
控制搅拌速度为800r/min，反应2h。将反应混合液倒入DMF中，生成白色沉淀，抽滤，依次用DMF/H2O混合溶液、丙酮洗涤沉淀，冷冻干燥得白色粉末。显微镜下观察所制备的微球在湿态时外观圆整，球形较好，尺寸较均匀，形貌类似于实施例1制备的微球。冷冻干燥后在扫描电镜下可见出现明显凹凸和塌陷，如图4，将其在冷冻状态下粉碎可见其内部为中空结构，如图5，壁厚为50μm左右。
实施例3
取4克壳聚糖溶解于100ml去离子水(含2.8ml冰乙酸)，全部溶解后依次加入100ml无水乙醇、32ml吡啶，搅拌至澄清，然后加入3.4ml乙酸酐，室温下搅拌4小时。将反应液倒入乙醇中，抽滤，得到白色沉淀。粗产物用适量去离子水溶解，离心除去不溶物，滤液加入200ml无水乙醇，离心分离后弃去上清液，沉淀物依次用丙酮和无水乙醚洗涤，室温真空干燥24h，得白色絮状固体。采用酸碱滴定法测定产物的脱乙酰度为50％。
在Ar保护下，在100ml三口烧瓶中配制0.1g/10ml上述壳聚糖水溶液。称取1.3382g Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酐单体溶于干燥的乙酸乙酯中配成0.87mol/l溶液，并转移至反应瓶中，使Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酐单体与壳聚糖中氨基多糖单元的摩尔比为8，并且体系中的油/水相体积比例为0.5。控制搅拌速度为800r/min，反应2h。将反应混合液倒入DMF中，生成白色沉淀，抽滤，依次用DMF/H2O混合溶液、丙酮洗涤沉淀，冷冻干燥得白色微球。显微镜下观察所制备的微球外观圆整，球形较好，尺寸较均匀，形貌类似于实施例1制备的微球，直径在200到500μm。
实施例4
取4克壳聚糖溶解于100ml去离子水(含2.8ml冰乙酸)，全部溶解后依次加入100ml无水乙醇、32ml吡啶，搅拌至澄清，然后加入3.4ml乙酸酐，室温下搅拌1小时。将反应液倒入乙醇中，抽滤，得到白色沉淀。粗产物用适量去离子水溶解，离心除去不溶物，滤液加入200ml无水乙醇，离心分离后弃去上清液，沉淀物依次用丙酮和无水乙醚洗涤，室温真空干燥24h，得白色絮状固体。采用酸碱滴定法测定产物的脱乙酰度为50％。
在Ar保护下，在100ml三口烧瓶中配制0.1g/10ml上述壳聚糖水溶液。称取0.8315g Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酐单体溶于干燥的乙酸乙酯中配成0.11mol/l溶液，并转移至反应瓶中，使Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酐单体与壳聚糖中氨基多糖单元的摩尔比为5，并且体系中的油/水相体积比例为2.5。控制搅拌速度为800r/min，反应2h。将反应混合液倒入DMF中，生成白色沉淀，抽滤，依次用DMF/H2O混合溶液、丙酮洗涤沉淀，冷冻干燥得白色粉末。显微镜下观察所制备的微球在湿态时外观圆整，球形较好，尺寸较均匀，形貌类似于实施例1制备的微球。冷冻干燥后在扫描电镜下可见出现明显凹凸和塌陷，类似于实施例2制备的微囊。
实施例5
取4克壳聚糖溶解于100ml去离子水(含2.8ml冰乙酸)，全部溶解后依次加入100ml无水乙醇、32ml吡啶，搅拌至澄清，然后加入3.6ml乙酸酐，室温下搅拌2小时。将反应液倒入乙醇中，抽滤，得到白色沉淀。粗产物用适量去离子水溶解，离心除去不溶物，滤液加入200ml无水乙醇，离心分离后弃去上清液，沉淀物依次用丙酮和无水乙醚洗涤，室温真空干燥24h，得白色絮状固体。采用酸碱滴定法测定产物的脱乙酰度为43％。
在Ar保护下，在100ml三口烧瓶中配制0.1g/10ml上述壳聚糖水溶液。称取0.6825gL-亮氨酸-N-羧酸内酐单体溶于干燥的二氯甲烷中配成0.5mol/l溶液，并转移至反应瓶中，使L-亮氨酸-N-羧酸内酐单体与壳聚糖中氨基多糖单元的摩尔比为8，并且体系中的油/水相体积比例为0.8。控制搅拌速度为800r/min，反应2h。将反应混合液倒入DMF中，生成白色沉淀，抽滤，依次用DMF/H2O混合溶液、丙酮洗涤沉淀，冷冻干燥得白色微球。显微镜下观察所制备的微球外观圆整，球形较好，尺寸较均匀，形貌类似于实施例1所制备的微球。
实施例6
取4克壳聚糖溶解于100ml去离子水(含2.8ml冰乙酸)，全部溶解后依次加入100ml无水乙醇、32ml吡啶，搅拌至澄清，然后加入3.2ml乙酸酐，室温下强烈搅拌3小时。将反应液倒入乙醇中，抽滤，得到白色沉淀。粗产物用适量去离子水溶解，离心除去不溶物，滤液加入200ml无水乙醇，离心分离后弃去上清液，沉淀物依次用丙酮和无水乙醚洗涤，室温真空干燥24h，得白色絮状固体。采用酸碱滴定法测定产物的脱乙酰度为53％。
在Ar保护下，在100ml三口烧瓶中配制0.1g/10ml上述壳聚糖水溶液。称取0.6825gγ-苯甲酯-L-天冬氨酸-N-羧酸内酐单体溶于干燥的醋酸乙酯中配成0.14mol/l溶液，并转移至反应瓶中，使γ-苯甲酯-L-天冬氨酸-N-羧酸内酐单体与壳聚糖中氨基多糖单元的摩尔比为8，并且体系中的油/水相体积比例为2。控制搅拌速度为800r/min，反应2h。将反应混合液倒入DMF中，生成白色沉淀，抽滤，依次用DMF/H2O混合溶液、丙酮洗涤沉淀，冷冻干燥得白色微球。显微镜下观察所制备的微球在湿态时外观圆整，球形较好，尺寸较均匀，形貌类似于实施例1所制备的微球，冷冻干燥后在扫描电镜下可见出现明显凹凸和塌陷，类似于实施例2制备的微囊。
实施例7
本实验主要用于研究微球在酸溶液和有机溶剂中的溶胀性。
将按照实施例1和实施例3制备好的微球称取适量，分别记作微球1和微球2。将其分别放入去离子水、pH＝5，pH＝3的盐酸溶液、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中浸泡48h，取出洗涤后吸干表面水份，称重。按照下式计算出其溶胀率：
其中，Wwet-溶胀前微球质量Wdry-溶胀后微球质量
结果如图6所示。由图6不难发现，两种微球在水、不同pH的盐酸溶液以及有机溶剂(DMF)均有一定的溶胀性，其中在DMF中的溶胀率最高；并且接枝聚Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸的微球比接枝L-亮氨酸的微球溶胀率更高，在DMF中可达到560％。实验说明通过调节不同的聚肽组分，可以控制微球的溶胀性能。
Claims (10)
1.一种糖肽缀合物微球或微囊，其特征在于，由多糖构成糖肽缀合物的糖基部分，由聚肽构成糖肽缀合物的肽链部分，多糖和聚肽以共价键的形式连接。
2.根据权利要求1所述的糖肽缀合物微球或微囊，其特征在于，所说的多糖为天然多糖壳聚糖。
3.根据权利要求2所述的糖肽缀合物微球或微囊，其特征在于，所说的天然多糖壳聚糖为水溶性壳聚糖。
4.根据权利要求1所述的糖肽缀合物微球或微囊，其特征在于，所说的聚肽为均聚肽或共聚肽。
5.根据权利要求4所述的糖肽缀合物微球或微囊，其特征在于，所说的聚肽选自聚(Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸)、聚(Nε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸)、聚(L-亮氨酸)、聚(L-异亮氨酸)、聚(L-丙氨酸)、聚(γ-苯甲酯-L-天冬氨酸)、聚(γ-苯甲酯-L-谷氨酸)、聚(γ-甲酯-L-谷氨酸)、聚(γ-乙酯-L-谷氨酸)、聚(O，O’-二苄氧羰基-3，4-二羟基-L-苯丙氨酸)中的一种以上。
6.制备糖肽缀合物微球或微囊的方法，包括以下几个步骤：
1)将乙醇和吡啶依次加入壳聚糖/醋酸溶液，然后加入乙酸酐反应，将反应液倒入乙醇中，过滤，得到壳聚糖凝胶，干燥，并经水/乙醇提纯得到水溶性壳聚糖；
2)将α-氨基酸单体加入溶剂四氢呋喃溶液中，在氩气保护下，加入三光气，并升温至50～60℃反应，将反应液倒入正己烷中，在0～25℃下静置，过滤，得到白色固体结晶：α-氨基酸-N-羧酸内酐单体；
3)将步骤1)得到的水溶性壳聚糖溶解在水中，配成浓度为0.01g/ml～5g/ml的壳聚糖水溶液；将步骤2)得到的α-氨基酸-N-羧酸内酐单体溶解在与水互不相溶的有机溶剂中，使单体浓度为0.01mol/l～10.0mol/l，在氩气保护下，将α-氨基酸-N-羧酸内酐溶液加入壳聚糖水溶液中，α-氨基酸-N-羧酸内酐单体与壳聚糖中氨基多糖单元的摩尔比为0.5～20，有机溶剂与水的比例为0.1～5，反应2小时；
4)将反应产物倒入N，N-二甲基甲酰胺/水混合溶液中，过滤，并依次用水、二甲基甲酰胺、丙酮溶液洗涤，经冷冻干燥得到糖肽缀合物微球或微囊。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)中，乙醇和吡啶的体积比为：乙醇∶吡啶＝2～5∶1；吡啶在壳聚糖/醋酸溶液中的浓度为1～5mol/L；乙酸酐的体积用量为壳聚糖/醋酸溶液的1～5％，反应时间为1～4小时。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，α-氨基酸单体与三光气的摩尔比例为，α-氨基酸单体∶三光气＝1∶0.3～3。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所说的α-氨基酸-N-羧酸内酐单体选自Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸-羧酸内酐、Nε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-羧酸内酐、L-亮氨酸-羧酸内酐、L-异亮氨酸-羧酸内酐、L-丙氨酸-羧酸内酐、γ-苯甲酯-L-天冬氨酸-羧酸内酐、γ-苯甲酯-L-谷氨酸-羧酸内酐、γ-甲酯-L-谷氨酸-羧酸内酐、γ-乙酯-L-谷氨酸-羧酸内酐或O，O’-二苄氧羰基-3，4-二羟基-L-苯丙氨酸-羧酸内酐。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所说的有机溶剂选自醋酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或甲苯等或它们的混合物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2006101160624A CN1931370B (zh) | 2006-09-14 | 2006-09-14 | 一种糖肽缀合物微球或微囊及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2006101160624A CN1931370B (zh) | 2006-09-14 | 2006-09-14 | 一种糖肽缀合物微球或微囊及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1931370A true CN1931370A (zh) | 2007-03-21 |
| CN1931370B CN1931370B (zh) | 2010-09-15 |
Family
ID=37877492
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2006101160624A Expired - Fee Related CN1931370B (zh) | 2006-09-14 | 2006-09-14 | 一种糖肽缀合物微球或微囊及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1931370B (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101747450B (zh) * | 2008-11-28 | 2012-12-05 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种在壳聚糖羟基上光化学交联细胞粘附性肽的方法 |
| CN107022088A (zh) * | 2017-02-15 | 2017-08-08 | 胡彦锋 | 一种两亲性丝胶蛋白聚合物及其制备方法与应用 |
| CN107404921A (zh) * | 2015-03-19 | 2017-11-28 | 雀巢产品技术援助有限公司 | 糖‑二肽缀合物 |
| CN108929387A (zh) * | 2018-08-08 | 2018-12-04 | 烟台浩忆生物科技有限公司 | 一种壳聚糖-g-抗菌肽聚合物的制备方法 |
| CN113583236A (zh) * | 2021-07-22 | 2021-11-02 | 江苏大学 | 一种模拟天然抗冻蛋白结构的两亲性含糖聚类肽的制备方法 |
| WO2022233165A1 (zh) * | 2021-05-07 | 2022-11-10 | 北京大学 | 水相引发氨基酸n-羧基环内酸酐聚合的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1247263C (zh) * | 2003-07-08 | 2006-03-29 | 中国科学院过程工程研究所 | 壳聚糖微囊及其制备方法和用途 |
| CN1319637C (zh) * | 2003-10-15 | 2007-06-06 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种尺寸均一的壳聚糖微球和微囊及其制备方法 |
| CN1268668C (zh) * | 2004-11-09 | 2006-08-09 | 华东理工大学 | 一种用于制备纳米载药胶束的聚肽接枝共聚物 |
-
2006
- 2006-09-14 CN CN2006101160624A patent/CN1931370B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101747450B (zh) * | 2008-11-28 | 2012-12-05 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种在壳聚糖羟基上光化学交联细胞粘附性肽的方法 |
| CN107404921A (zh) * | 2015-03-19 | 2017-11-28 | 雀巢产品技术援助有限公司 | 糖‑二肽缀合物 |
| CN107404921B (zh) * | 2015-03-19 | 2020-12-25 | 雀巢产品有限公司 | 糖-二肽缀合物 |
| CN107022088A (zh) * | 2017-02-15 | 2017-08-08 | 胡彦锋 | 一种两亲性丝胶蛋白聚合物及其制备方法与应用 |
| CN108929387A (zh) * | 2018-08-08 | 2018-12-04 | 烟台浩忆生物科技有限公司 | 一种壳聚糖-g-抗菌肽聚合物的制备方法 |
| CN108929387B (zh) * | 2018-08-08 | 2019-08-23 | 烟台浩忆生物科技有限公司 | 一种壳聚糖-g-抗菌肽聚合物的制备方法 |
| WO2022233165A1 (zh) * | 2021-05-07 | 2022-11-10 | 北京大学 | 水相引发氨基酸n-羧基环内酸酐聚合的方法 |
| CN113583236A (zh) * | 2021-07-22 | 2021-11-02 | 江苏大学 | 一种模拟天然抗冻蛋白结构的两亲性含糖聚类肽的制备方法 |
| CN113583236B (zh) * | 2021-07-22 | 2022-07-22 | 江苏大学 | 一种模拟天然抗冻蛋白结构的两亲性含糖聚类肽的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1931370B (zh) | 2010-09-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Panos et al. | New drug delivery systems based on chitosan | |
| TWI306869B (en) | Amphiphilic block copolymers and nano particles comprising the same | |
| Prabaharan et al. | Chitosan-based particles as controlled drug delivery systems | |
| JP3955759B2 (ja) | 有機溶媒に溶解可能なポリ（アルキレンオキサイド）及びポリ（ｐ−ジオキサノン）の生分解性ブロック共重合体及びこれを含有するドラッグデリバリー組成物 | |
| JP6408469B2 (ja) | ヒアルロン酸をベースとする薬物送達システム | |
| US11045429B2 (en) | Shear-thinning self-healing networks | |
| CN1607033A (zh) | 一种尺寸均一的壳聚糖微球和微囊及其制备方法 | |
| Ebara | Biomaterials nanoarchitectonics | |
| Aminabhavi et al. | Production of chitosan-based hydrogels for biomedical applications | |
| WO2001088019A1 (fr) | Materiau a base de polymeres biodegradables et son procede de preparation | |
| CN103242519B (zh) | 两亲性聚合物及其制备方法和应用 | |
| CN102604065B (zh) | 交联的生物可降解载体聚合物、胶束、囊泡及其制备方法和应用 | |
| CN1425706A (zh) | 聚乙二醇嵌段修饰的聚己内酯及其制备方法 | |
| CN102796236A (zh) | 基于生物可降解聚磷酸酯的阳离子型三嵌段共聚物及其应用 | |
| CN100566708C (zh) | 一种肝靶向性药物微胶囊的制备方法 | |
| CN1931370A (zh) | 一种糖肽缀合物微球或微囊及其制备方法 | |
| Moscovici1 et al. | Nanocellulose and nanogels as modern drug delivery systems | |
| CN1698899A (zh) | 以壳聚糖或其衍生物作为药物载体的新型药物组合物 | |
| Misra et al. | Microscale and nanoscale chitosan-based particles for biomedical use | |
| CN101314041B (zh) | 一种聚合物胶束载药系统及其制备方法 | |
| CN101181273A (zh) | 壳聚糖-聚天冬氨酸-5氟尿嘧啶纳米粒子的制备方法 | |
| CN100434120C (zh) | 两亲性荧光靶向纳米胶束及其制备方法 | |
| Bharti et al. | pH-responsive biomaterials in drug delivery | |
| Verma et al. | Synthesis of chitosan-based nanomaterials | |
| Pathak et al. | Polysaccharides for drug delivery |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20100915 Termination date: 20140914 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |