CN1929854A - 肺泡的分化诱导或再生诱导制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了含有HGF用于诱导骨髓细胞分化成肺泡细胞的制剂。本发明还提供了在肺泡被破坏的肺气肿等等情况中用于肺泡形成的含有HGF的制剂。

Description

肺泡的分化诱导或再生诱导制剂

技术领域

本发明涉及包括作为活性成分的肝细胞生长因子，用于诱导骨髓细胞分化成肺泡细胞的制剂，还涉及通过这样的分化诱导形成肺泡的制剂。

背景技术

肝细胞生长因子(下文中为HGF)最初是作为成熟肝细胞的生长因子鉴定出来的，其基因(cDNA)已于1989年被克隆出来(参见非专利文献1和2)。

迄今为止，HGF对多种细胞以及肝细胞发挥诸多生物学活性，例如细胞增值，促进细胞迁移，形态发生诱导，细胞死亡抑制等(参见非专利文献3-6)。

HGF的生物学活性通过其受体，即c-Met酪氨酸激酶进行表达。HGF具有多种生物学活性，并对遭受多种损伤的不同组织具有修复和保护的功能。

血管生成促进活性是HGF对组织进行再生和保护的功能之一。HGF不仅能够刺激血管内皮细胞的增殖和迁移，还在体内表现出强烈的血管生成诱导活性(参见非专利文献7-10)。

此外，HGF具有抑制血管内皮细胞的细胞死亡的活性(参见非专利文献11-13)。

肺是由大量肺泡构成的器官。通过呼吸作用摄入机体的空气先通过气管，然后再进入支气管中。支气管进一步分支，每个细支气管都与一个肺泡相连。人的肺泡是直径约为0.2mm的小囊，并由毛细血管所围绕。气体交换是在肺泡中进行的，即通过支气管进入肺泡的吸入的气体摄取氧气，而血液中的二氧化碳则作为废气释放入肺泡中。肺气肿是肺泡的生理性的进行性破坏，随着疾病的进行，用于气体交换的肺泡表面积降低。肺泡中不充分的气体交换会导致血液中氧气的短缺。随着疾病的进行，肺的弹性降低，从而导致呼吸困难。此外，由于成年肺是不能自发生长或再生的器官，肺气肿就是进行性和不可逆转的疾病。Massaro等人报告了用全反式视黄酸(ATRA)处理在肺气肿的动物模型中解剖地和生理性地再生了肺(参见非专利文献14)。此外，已知ATRA能够激活参与肺发育的基因，并且促进肺泡分隔和肺的生长。然而，在肺气肿患者中利用ATRA的临床试验并未表现出肺结构或肺功能的明显改善(参见非专利文献15)。

据报道HGF促进肺泡上皮II型细胞或支气管上皮细胞的生长，且HGF也参与肺泡上皮细胞的修复(参见非专利文献16-19)。此外，对于HGF对急性肺损伤效果的研究表明损伤后在肺中新生成了HGF，并且当向肺部受损的动物施用HGF时，刺激了肺组织中的细胞增值，并且促进了对受损肺部的修复(参见专利文献2)。

然而，以上所涉及的文献中没有任意一篇对HGF诱导骨髓细胞分化成肺泡细胞，以及通过这种分化诱导促进肺泡的再生或形成有所描述。

[专利文献1]JP-A-89869/1996

[专利文献2]JP-A-172207/1994

[非专利文献1]Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，1984，vol.122，p.1450-1459

[非专利文献2]Nature，1989，vol.342，p.440-443

[非专利文献3]The Journal of Cell Biology，1985，vol.129，p.1177-1185

[非专利文献4]The Journal of Biochemistry，1986，vol.119，p.591-600

[非专利文献5]International Review of Cytology)，1999，vol.186，p.225-260

[非专利文献6]Kidney International，2001，vol.59，p.2023-2038

[非专利文献7]The Journal of Cell Biology，1992，vol.119，p.629-641

[非专利文献8]Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America，1993，vol.90，p.1937-1941

[非专利文献9]Circulation，1998，vol.97，p.381-390

[非专利文献10]Hypertension，1999，vol.33，p.1379-1384

[非专利文献11]Journal of Hypertension，2000，vol.18，p.1411-1420

[非专利文献12]Hypertension，2001，vol.37，p.581-586

[非专利文献13]Diabetes，2002，vol.51，p.2604-2611

[非专利文献14]Massaro，G.D.，et.al，Nature Medicine，1997，vol.3，p.675-677

[非专利文献15]Mao，J.T.，et.al，American Journal of Respiratory &Critical Care Medicine，2002，vol.165，p.718-723

[非专利文献16]Mason RJ，et.al，American Journal of RespiratoryCell and Molecular Biology，1994，vol.11，p.561-567

[非专利文献17]Shiratori M，et.al，American Journal of RespiratoryCell and Molecular Biology，1995，vol.12，p.171-180

[非专利文献18]Ohmichi H，et.al，The American Journal ofPhysiology，1996，vol.270，p.L1031-L 1039

[非专利文献19]Sakamaki，Y，et.al，American Journal of RespiratoryCell and Molecular Biology，2002，vol.26，p.525-533.

发明内容

本发明的目的在于提供用于诱导骨髓细胞分化成肺泡细胞的制剂。本发明的另一目的在于将上述分化诱导制剂用作促进受损肺泡的再生或肺泡形成的制剂。

本发明人新近发现，在例如肺气肿中观察到的受损的肺泡是可再生的，所再生的肺泡是从骨髓细胞分化而来的，且HGF诱导这种分化。作为基于这些发现进行的深入研究的结果，本发明人完成了本发明。

换言之，本发明涉及：

(1)包含肝细胞生长因子，诱导骨髓细胞分化成肺泡细胞的制剂，

(2)上述(1)的分化诱导制剂，其中的肺泡细胞为肺泡上皮细胞，以及

(3)上述(1)或(2)的分化诱导制剂，其是促进肺泡再生或形成的制剂。

其次，本发明涉及通过对哺乳动物施用HGF来诱导骨髓细胞分化成肺泡细胞的方法，本发明还涉及HGF在生产用于诱导骨髓细胞分化成肺泡细胞的药物中的应用。此外，本发明涉及与含有HGF的诱导分化制剂一起培养骨髓细胞，以及将从骨髓细胞分化出的肺泡细胞移植入哺乳动物的方法，或者是对骨髓细胞进行培养，再将增殖的骨髓细胞移植入哺乳动物，同时施用含有HGF的诱导分化制剂，以及诱导移植的骨髓细胞分化成肺泡细胞的方法。再者，本发明包括含有引入HGF基因以及使用HGF进行受损肺泡再生或新肺泡形成的基因治疗。

因为本发明的分化诱导制剂诱导骨髓细胞分化成肺泡细胞，所以可以在诸如肺气肿，蜂窝肺的肺纤维化，肺淋巴管肌瘤病(LAM)，肺切除术之后受破坏的肺等肺泡细胞受损的疾病中形成新的肺泡。此外，当在有本发明的分化诱导制剂存在的条件下培养骨髓细胞，也可以制备由所述骨髓细胞分化而来的肺泡细胞。

此外，通过与本发明的分化诱导制剂一起培养骨髓细胞获得的从骨髓细胞分化而来的肺泡细胞可以在再生医药领域中作为用于移植的细胞。

附图说明

图1所示为肺气肿诱导的受体小鼠肺中的组织学发现。

图2所示为肺气肿诱导的受体小鼠中肺泡的平均线性截距。

图3所示为在肺气肿诱导的受体小鼠的肺中GFP阳性细胞与肺泡细胞的比率。

优选实施方式

本发明使用的HGF是公知的物质。采用多种方法制备的HGF可用于本发明中，只要其纯度足以被用作医用制剂。就HGF的生产过程而言，例如，HGF可通过培养产生HGF的原始培养细胞或已建立的细胞系的细胞，从培养上清液等中分离HGF并对所分离的HGF进行纯化得到。或者，也可以通过向合适的载体中整合编码HGF的基因，将所述载体插入适当的宿主细胞进行其转化并从所转化细胞的培养上清液中收集目的重组HGF的遗传工程技术获得重组HGF(参见，例如JP-A-111382/1993；Biochem.Biophys.Res.Commun.，1989，vol.163，p.967)。

对上述宿主细胞并没有特殊的限制，常规用于遗传工程技术中的多种宿主细胞，例如大肠杆菌，酵母，动物细胞等都可以使用。所得到的HGF，只要其具有与天然HGF基本相同的作用，就可以在其氨基酸序列中包含一个或多个(例如几个)氨基酸的替换，缺失，添加和/或插入。类似地，HGF也可以包含糖链的替换，缺失和/或添加。在本文中，在氨基酸序列中的“一个或多个氨基酸的缺失，替换，添加或插入”是指某一数量的天然存在(一个至若干个氨基酸)的氨基酸可以通过诸如遗传工程技术，位点特异性突变诱导等公知的技术方法缺失，替换，添加和/或插入所述氨基酸序列中。

同样，“包含糖链的替换，缺失和/或添加的HGF”是指，例如，(1)通过用酶对天然糖基化的HGF进行处理从而去除糖链获得的糖基化缺失的HGF，(2)其氨基酸序列在糖基化位点发生了突变从而抑制糖基化的HGF，或(3)其氨基酸序列以在不同于天然糖基化位点的位点发生糖基化的方式进行突变的HGF。

此外，HGF还包括与HGF的氨基酸序列具有至少60％或更高同源性，优选为80％或更高同源性，更优选为90％或更高同源性，以及更优选95％或更高同源性的蛋白质，并且具有诱导骨髓细胞分化成肺泡细胞的活性。上述的氨基酸序列之间的“同源性”通常是指当对所述蛋白质的一级结构进行比较时，组成氨基酸序列的氨基酸残基之间的同源性水平。

只要其具有与天然HGF基本相同的作用，应用于本发明中的HGF可以具有在其C末端的羧酸根(-COO-)，酰胺基(-CONH₂)或酯基(-COOR)以及羧基(-COOH)。在本文中，涉及到通常用作口服给药的酯等，可被低级烷基(例如，甲基，乙基，丙基，环戊基，苯甲基，苯乙基等)，芳基(例如，苯基，α-萘基等)，新戊酰基氧甲基任选地取代酯中的R。此外，可用于本发明中的HGF可以包括在其N-末端的甲硫氨酸残基的氨基被保护基团(例如，诸如甲酰基，乙酰基等的酰基)保护的HGF，其中通过体内对N-末端进行剪切产生的谷氨酰基变成焦谷氨酸的HGF等等。

在本发明中，肺泡的再生或形成是指新肺泡的形成或受损肺泡的再生。肺泡是由肺泡上皮细胞，含有肺毛细管内皮细胞的毛细血管等以及结缔组织构成的气体交换器官。此外，本发明中的肺泡包括与所述肺泡相连接的分支的支气管部分。

本发明的分化诱导制剂可用于对患有诸如肺气肿，蜂窝肺的肺纤维化，肺淋巴管肌瘤病(LAM)，肺切除术之后的受损肺等肺泡受损的动物(例如，牛，马，猪，羊，狗，猫)包括人肺泡再生或形成的目的。

本发明的分化诱导制剂可具有多种剂型，例如液体制剂，固体制剂，胶囊等，然而，通常都是单独与HGF，或与HGF以及常规载体一起配制成注射剂，吸入剂，栓剂或口服给药的制剂。上述注射剂可以是水性注射剂或油性注射剂。

在水性注射剂的情况下，可以以下方式进行制备：将HGF溶于，例如，将适当的诸如如下物质的药用载体加入水性溶剂(例如，可注射的水，纯净水等)制备的溶液中，然后按公知的方法将所述溶液经过滤器等过滤，灭菌，并填充于无菌容器中：等渗制剂(例如氯化钠，氯化钾，甘油，甘露醇，山梨醇，硼酸，硼砂，葡萄糖，丙二醇等)，缓冲液(例如，磷酸缓冲液，乙酸缓冲液，硼酸缓冲液，碳酸缓冲液，柠檬酸缓冲液，Tris缓冲液，谷氨酸缓冲液，ε-氨基己酸(aminocarproic)缓冲液等)，防腐剂(例如，对-羟苯甲酸甲酯，对羟苯甲酸乙酯，对-羟苯甲酸丙酯，对-羟苯甲酸丁酯，氯丁醇，苯甲醇，苯扎氯铵，脱氢乙酸钠，乙二胺四乙酸钠，硼酸，硼砂等)，增稠剂(例如，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，聚乙烯醇，聚乙二醇等)，稳定剂(例如，亚硫酸氢钠，硫代硫酸钠，乙二胺四乙酸钠，柠檬酸钠，抗坏血酸，二丁基羟基甲苯等)，pH调节剂(例如，盐酸，氢氧化钠，磷酸，乙酸等)。此外，也可以使用诸如醇(例如，乙醇等)，多元醇(例如，丙二醇，聚乙二醇等)，或非离子表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80，聚氧乙烯氢化蓖麻油50等)的适当的增溶剂。

在油性制剂的情况下，可将蓖麻油，大豆油等用作油性溶剂，并可将苯甲酸苄酯，苯甲醇等用作增溶剂。所得的可注射溶液通常填充于安瓿或小管中。在所述注射制剂中，HGF的含量一般调节为约0.0002-0.2W/V％，优选为约0.001-0.1W/V％。优选地可将诸如注射液的液体制剂在经过冷冻保存或冷冻干燥去除水分后进行保存。在使用之前，可将冷冻干燥的制剂在可注射用的蒸馏水中重新溶解。

在可口服给药制剂的情况中，所述剂型包括，例如，片剂，粒剂，细粒剂，粉剂，胶囊，液剂，乳剂，悬剂，糖浆等。这些制剂可通过常规方法制备。在粒剂和片剂的情况中，可通过使用诸如赋型剂(例如，乳糖，白砂糖，葡萄糖，淀粉，结晶纤维素等)，润滑剂(例如，硬脂酸镁，滑石，硬脂酸，硬脂酸钙等)，崩解剂(例如，淀粉，羧甲基纤维素钠，碳酸钙等)，粘合剂(例如，淀粉糊，羟丙基纤维素溶液，羧甲基纤维素溶液，阿拉伯树胶溶液，明胶溶液，海藻酸钠溶液等)等的药用添加剂进行制备。同样，粒剂或片剂可用适当的包衣剂(例如，明胶，白砂糖，阿拉伯树胶，巴西棕榈蜡等)，肠衣剂(例如，醋酸邻苯二甲酸纤维素，甲基丙烯酸共聚物，邻苯二甲酸羟丙基纤维素，羧甲基乙基纤维素等)等进行包衣。

在胶囊的情况中，可以适当地选择增强流动性和润滑性的诸如硬脂酸镁，硬脂酸钙，滑石和轻质无水硅酸的公知赋型剂；在压力下增加流动性的结晶纤维素或乳糖；以及上述的崩解剂。可将HGF与上述的赋型剂均匀地混合或成粒，或者可将所述颗粒用适当的包衣剂进行包衣，然后填充入胶囊中，或者可将所述颗粒用加入甘油，山梨醇等赋予塑性增加的胶囊基质(例如，明胶)进行封装。如果需要，可向所述胶囊制剂中加入着色剂或防腐剂(例如，二氧化硫，对-羟苯甲酸甲酯，对羟苯甲酸乙酯，对-羟苯甲酸丙酯，对-羟苯甲酸丁酯等)。除了常规的胶囊制剂，所述胶囊制剂还可采用肠衣胶囊，抗胃酸的胶囊，控释胶囊等形式。

在肠衣胶囊制剂的情况下，将用肠衣剂包衣的HGF，或加入了适当赋型剂的HGF填充至常规的胶囊中。或者，可将HGF单独，或加入了上述适当赋型剂的HGF封装入肠衣胶囊，或封装入由含有肠聚合物的基质材料形成的胶囊中。

在糖浆的情况中，可适当的选择并使用稳定剂(例如，乙二酸四乙酸钠等)，悬剂(例如，阿拉伯树胶，羧甲基纤维素等)，矫正剂(例如，简单糖浆，葡萄糖等)，香味剂等。

此外，可使用常规的栓剂基质(例如，可可脂，月桂油，甘油明胶，大粒凝胶(macrpgol)，Witepsol等)通过常规的配置方法等制备栓剂。

再者，可采用常规的配制方法生产吸入制剂。在吸入制剂的配制中，可以采用任意的添加剂，只要其通常被应用于吸入制剂中。例如，除了促进剂，还可以使用以上所述的赋型剂，粘合剂，润滑剂，防腐剂，稳定剂，等渗剂，pH调节剂和矫正剂(例如，柠檬酸，薄荷醇，甘草酸铵，甘氨酸，香料等)。作为促进剂，液化气体促进剂，压缩气体等也可以使用。液化气体促进剂包括，例如，诸如选择性的含氯氟烃(例如，HCFC-22，HCFC-123，HCFC-134a，HCFC-142等)，液化石油醚，二甲醚等的氟化烃。所述压缩气体包括，例如，可溶性气体(例如，二氧化碳气体，一氧化二氮气体等)和惰性气体(例如氮气等)。

此外，用于本发明中的HGF可与生物可降解的聚合物一起配制成缓释制剂。在HGF的缓释制剂中，可以期待维持血液水平，减少给药频率，缓解副作用等的效果。可以根据，例如，在药物传递系统(DrugDelivery System)第3章1986(CMC出版，日本)中描述的常规方法制备这种缓释制剂。用于本发明的生物可降解聚合物可适当地从公知的生物可降解聚合物中选择，其包括，例如，多糖(例如，淀粉，葡聚糖，脱乙酰壳多糖等)，蛋白质(例如，胶原，明胶等)，聚氨基酸(例如，聚谷氨酸，聚赖氨酸，聚亮氨酸，聚丙氨酸，聚甲硫氨酸等)，聚酯(例如，聚乳酸，聚乙醇酸，乳酸/乙醇酸聚合物或共聚物，聚己酸内酯，聚β-羟基丁酸，聚苹果酸，聚酸酐，延胡索酸-聚乙二醇-乙烯吡咯烷酮共聚物等)，聚(原酸酯)，聚烷基氰基丙烯酸(例如，聚甲基-α-氰基丙烯酸等)，聚碳酸酯(例如，聚碳酸亚乙基酯，聚碳酸亚丙基酯等)，其中优选聚酯，并更优选聚乳酸，乳酸/乙醇酸聚合物或共聚物。当使用聚乳酸/乙醇酸聚合物或共聚物时，在为期两周至三个月的缓释时间，优选为两周至一个月的情况中，乳酸/乙醇酸的成分比(mol％)为约100/0-50/50，尽管这样的比例会随缓释时间的变化而变化。这些聚乳酸/乙醇酸聚合物或共聚物的平均分子量通常为5,000-20,000。可参照公知的方法，例如JP-A-28521/1986描述的方法，制备聚乳酸/乙醇酸均聚物或共聚物。虽然对HGF与生物可降解聚合物的混合比例没有限制，但一般而言，所使用的HGF与所述生物可降解聚合物的比例为约0.01W/W％至30W/W％。

根据所述剂型，适应症，疾病的程度，年龄等等，可对上述制剂中的HGF含量进行适当的调节。

本发明的分化诱导剂可包含适当的其它药用活性成分，只要这些成分不与本发明的目的相抵触。这些活性成分的实例包括，例如，抗胆碱能药物(例如，异丙托溴铵(ipratropium bromide)，氟托溴铵(flutropium bromide)，氧托溴铵(oxitropium bromide)，噻托溴铵(tiotropium bromide)等)，吸入性β2兴奋剂(例如，非诺特罗(fenoterol)，沙丁胺醇(sabutamol)，福莫特罗(formoterol)，沙美特罗(salmeterol)等)，吸入型类固醇(例如，倍氯米松(beclomethasone)，氟替卡松(fluticasone)，布地奈德(budesonide)等)，平喘药(例如，胆茶碱(theophylline)，丙卡特罗(procaterol)，酮替芬(ketotifen)，氮卓斯汀(azelastine)等)，抗过敏药(例如，酮替芬(ketotifen)，特非那定(terfenadine)，氮卓斯汀(azelastine)，依匹那丁等(epinastine))，抗炎药(例如，双氯灭痛(diclofenac sodium)，布洛芬(ibuprofen)，茚甲新(indomethacin)等)，抗生素(例如，头孢甲肟(cefmenoxime)，头孢地尼(cefdinir)，氧氟沙星(ofloxacin)，tosfloxacin，氟哌酸(norfloxacin)等)，抗真菌药(例如，氟康唑(fluconazole)，伊曲康唑(itraconazole)等)，等等。同样，含有这些药物活性成分的制剂可以与本发明的制剂组合使用。只要可以实现本发明的目的，对这些药物活性成分就没有限制，且可以适当的混合比例或组合比例对这些活性成分进行使用。

根据其剂型，可通过适当地给药途径对本发明的分化诱导剂进行给药。例如，可通过静脉内，动脉内，皮下或肌内等途径进行注射给药。注射剂量为通常基于HGF为0.001mg至1000mg，优选0.01mg至100mg，其可以通过分开的方式，以每天一次或每天几次的方式进行适当给药，尽管可根据患者的病症，年龄，体重等进行适当的调节。

本发明的分化诱导剂可用于诱导骨髓细胞分化成肺泡细胞。至于骨髓细胞，任意哺乳动物包括人类的骨髓细胞都可以使用，尽管优选地是使用游走的骨髓细胞。例如，可通过公知的方法收获人骨髓细胞，将其悬浮于细胞培养液中，接种于塑料培养皿中，并进行培养从中仅收集游走细胞。随后，将所述游走的骨髓细胞与本发明的分化诱导剂共培养。至于细胞培养液，可以使用常规的培养液，例如，DMEM，MEM，RPMI1640，IMDM等。尽管可以向上述的细胞培养液中加入诸如胎牛血清的常用于细胞培养的添加剂，从移植免疫学的方面考虑优选使用无血清的细胞培养液。在分化诱导剂中，HGF的浓度为约1ng/mL至约100ng/mL。培养条件采用的是在常规细胞培养中的条件，例如，在约35℃±2℃，5％二氧化碳存在的条件。将如此培养的骨髓细胞培养一至五周，使其分化成肺泡细胞。根据以上获得的来自骨髓细胞的诱导分化的肺泡细胞可用作器官移植所需要的细胞。更具体地，通过给患者静脉内注射从肺气肿患者的骨髓细胞分化和增殖而来的肺泡细胞，实现向肺的移植。根据这一过程，有可能从患者本身的骨髓细胞获得大量肺气肿患者所需要移植的肺泡细胞。

此外，还有另一实施方案，包括培养骨髓细胞，将所获得的增殖、未分化的骨髓细胞作为用于移植的细胞，以及给受体施用本发明的分化诱导剂。根据本发明，由于从肺气肿患者收集的少量骨髓细胞被培养和增殖，并且大量所得的骨髓细胞可在施用本发明的分化诱导剂的同时返回患者，因此可在患者体内有效地发生所移植的骨髓细胞向肺泡细胞的分化诱导。

至于那些用于上述适应性移植中的骨髓细胞，从移植免疫学的角度考虑，优选那些从待移植的个体自身收集来的细胞。

近年来，已有关于使用HGF进行基因治疗的报道(参见Circulation，1997，vol.96，No.3459；Nature Medicine，1999，vol.5，p.226-230；Circulation，1999，vol.100，No.1672；Gene Therapy，2000，vol.7，p.417-427)，并建立了这种基因治疗的技术。本发明包括基因治疗制剂，包括为了肺泡的再生或形成以及为了诱导骨髓细胞分化成肺泡细胞，导入HGF基因，以及施用以上所述的HGF。下文，将对HGF基因治疗进行详细描述。

在本文中，“HGF基因”是指能够表达HGF的基因。更具体地，本发明列举了一种基因，其中HGF的cDNA被整合入合适表达载体(非病毒载体，病毒载体)中，如非专利文献2；日本专利2,777,678；Biochem.Biophys.Res.Commun.，1989，vol.163，p.967；或Biochem.Biophys.Res.Commun.，1990，vol.172，p.321.所述。编码HGF的cDNA碱基序列在以上文献中已有描述，且也在诸如Genebank的数据库中进行了注册。根据以上序列数据，例如，可以通过使用适当的DNA片段作为PCR引物，对来自肝脏等的mRNA进行RT-PCR，从而进行HGF的cDNA克隆。本领域所属技术人员基于诸如Molecular Cloning，第二版，冷泉港实验室出版(1989)的基础书籍可以很容易完成这样的克隆。

此外，用于本发明中的HGF不仅限于上述的基因，任意的HGF基因都可以用作本发明的HGF基因，只要其表达与HGF具有基本相同活性的蛋白质。换言之，在可与上述cDNA在严谨条件下杂交的DNA，和编码由上述cDNA所编码的氨基酸序列中一至多个氨基酸(优选几个氨基酸)被替换，缺失，添加和/或插入的蛋白质的DNA中，任意编码具有HGF活性的蛋白的DNA都包含在本发明所使用的HGF基因的范围中。这样的DNA可方便地通过常规的杂交方法，PCR方法等获得，尤其是参考诸如以上所述的Molecular Cloning的基础文献。

应用于本发明中HGF基因可采用与上述HGF蛋白相同的方式，用来再生或形成肺泡细胞以及诱导骨髓细胞分化成肺泡细胞。

当给患者施用含有作为活性成分的HGF基因的基因治疗剂时，可以采用诸如在Basic Technology of Gene Therapy，Separate Volume ofExperimental Medicine published by Yodosha，，日本，1996；GeneIntroduction and Expression Analysis Method，Separate Volume ofExperimental Medicine，Yodosha出版，日本，1997；Gene TherapyDevelopment Research Handbook，The Japan Society of Gene Therapy编，NTS出版，日本，1999中描述的常规方式进行这种施用。

剂型可包括多种适用于上述每种给药方式的公知形式。根据患者的目标疾病，年龄和体重等，可以对所述制剂中的DNA含量进行适当的控制，通常，本发明中的DNA含量为0.0001至100mg，优选为0.001至10mg。

此外，HGF基因和HGF可以各自独立地使用或组合使用。

下面，通过以下实施例对本发明进行说明，但并非是对本发明的限制。除非另有说明，百分数(％)是指重量百分数％。

实施例

骨髓的重建

在日本大阪大学，建立了转有增强绿色荧光蛋白(GFP)的C57BL/6转基因小鼠品系。根据Morishita等人在Hypertension，1999，vol.33，p.1379-1384中的描述，将收集到的13.5天GFP胚胎的胎肝的肝细胞移植入在移植前用12Gy剂量辐射过的C57BL/6雄性小鼠体内。移植三周之后，超过95％的循环白细胞(外周白细胞)都完全被GFP小鼠来源的骨髓细胞所替换的那些小鼠被用作该实验中的受体小鼠。

肺气肿的诱导和治疗

向受体小鼠鼻内灌注猪胰腺弹性蛋白酶诱导实验性的肺气肿。弹性蛋白酶灌注三周之后，受体小鼠在其肺部表现出了气肿性变化。此时，将诱导成肺气肿的受体小鼠随机分成两组，即介质给药组和HGF给药组，对这两组小鼠分别腹膜内注射均衡饮食和每天一次，每次1mg/kg的剂量的HGF，共12天。

组织学解剖

在20cm H₂O的压力下，用4％的低聚甲醛-PBS(磷酸缓冲盐水)对所述受体小鼠的肺进行固定，根据常规方法制备石蜡切片。用苏木精-曙红(HE)对石蜡切片染色。使用抗-GFP抗体(Abcam，剑桥，英国)检测GFP并用3，3’-二氨基联苯胺显色。对从每只小鼠分离到的200个肺泡中GFP-阳性细胞进行计数(每组n＝5)。根据Thurlbeck的方法(参见，Ono，M.et.al，Circulation 2002，vol.106，p.1264-1269)，通过测定肺泡分隔得平均线性截距(下文中简称为Lm)对气肿性损伤的程度进行评价。换言之，在400倍放大倍数下，对每只小鼠两张载玻片上的20个随机取的视野中肺泡细胞的Lm进行测定。总的距离除以肺泡截距的数量得到Lm。由三位观察者(K.I.，T.S.和H.K.)互盲(blindly)进行组织学评价。

可对冷冻切片进行免疫荧光染色来鉴定GFP-阳性细胞的表型。从Chemicon(Temecula，CA，USA)购买了抗细胞角蛋白5和8抗体，从Pharmingen(San Diego，CA，USA)购买抗-CD34和抗-CD45抗体。

统计分析

所述数据表达为平均值±标准差。使用方差分析进行比较，并且当总差异得以确定之时，将利用Bonferroni校正的多重比较用来鉴定哪一组具有显著性差异。统计显著性定义为p＜0.05。

结果

使用光学显微镜对组织切片进行观察，发现在患有弹性蛋白酶诱导的肺气肿受体小鼠的肺泡被破坏，与未使用弹性蛋白酶处理的小鼠相比，每个肺泡都扩大约3-5倍。在另一方面，在HGF给药组中的肺泡与没有弹性蛋白酶处理组的肺泡几乎相同(参见图1)。在肺气肿诱导的受体小鼠中的平均线性截距如图2所示。患有弹性蛋白酶诱导的肺气肿的受体小鼠的平均线性截距增大了约1.7倍，而与未进行弹性蛋白酶处理组相比，HGF给药组中的平均线性截距几乎相同。

受体小鼠肺中GFP阳性肺泡与总肺泡的比率如图3所示。没有进行弹性蛋白酶处理的受体小鼠的GFP阳性细胞的比率为约1％。弹性蛋白酶诱导的肺气肿受体小鼠的GFP阳性细胞的比率增加约10％，而HGF给药组的该比率增加了约17.5％。此外，免疫荧光染色得到的组织学观察结果说明这些来自于GFP小鼠源骨髓细胞的GFP阳性细胞分化成了肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞。这些结果说明HGF能够促进诱导骨髓细胞分化成肺泡(肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞等)。

工业实用性

本发明的分化诱导剂诱导骨髓细胞分化成肺泡细胞，且可用作由于肺气肿破坏等的肺泡的再生剂。而且，从骨髓细胞诱导分化而来的肺泡可用作再生药物领域中用于移植的细胞。

Claims (3)

1.用于诱导骨髓细胞分化成肺泡细胞的制剂，包含肝细胞生长因子。

2.权利要求1的分化诱导制剂，其中的肺泡细胞为肺泡上皮细胞。

3.权利要求1或2的分化诱导制剂，其是用于促进肺泡再生/形成的制剂。

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