CN1995065B - 具有抑制pttg表达作用的融合蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白及其编码基因与应用。其目的是提供一种具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白及其编码基因与其在制备治疗PTTG阳性肿瘤药物中的应用。该融合蛋白是通过连接肽在PBF或由PBF羧基端的第1-30位氨基酸残基组成的多肽的氨基(N)端连接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基的融合蛋白。本发明的融合蛋白β-TrCP-PBF及其编码基因将在PTTG的功能研究和制备治疗PTTG阳性肿瘤及与PTTG过度表达有关的疾病的药物中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及由具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白及其编码基因，以及该融合蛋白的表达方法和在制备治疗PTTG阳性肿瘤及与PTTG过度表达有关的疾病的药物中的应用。

背景技术

垂体肿瘤转化基因(PTTG基因)是一个在多种肿瘤中均表达的原癌基因。近年来的研究结果表明，PTTG基因是一个强有力的肿瘤转化基因，可以通过以下多种机制参与肿瘤的形成与发展：诱导细胞转化；促进其它原癌基因及促瘤因子的表达；干扰姊妹染色单体分离；促进碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)参与的肿瘤血管生成等。其中以bFGF与PTTG的关系最为密切，有学者甚至认为PTTG的某些生物学作用是通过bFGF而实现的。bFGF能够促进肿瘤的新血管形成，在肿瘤的生长和浸润过程中发挥重要作用，而肿瘤的侵袭和转移往往是治疗失败的原因。因此，将PTTG作为研究和治疗肿瘤的靶点，具有重要意义。

选择性蛋白质降解是细胞生长发育和维持自身稳定的一个特性，蛋白酶体是负责清除细胞内指令降解蛋白的蛋白质降解系统。其中泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-Proteasome Pathway)是体内最重要的高效蛋白降解途径。此途径有两步骤：1)靶蛋白共价结合上多个泛素；2)多泛素化了的靶蛋白被26S蛋白酶体复合物降解。泛素结合到靶蛋白上这一过程至少需要三种酶的介导：泛素激活酶(E1)，泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)。Skp1-Cullin1-F-box(SCF)复合物是一种重要的E3酶，由Skp1，Cul1，Rbx1和F-box蛋白四个部件组成，前三个是不可变组件，F-box蛋白是可变组件。F-box蛋白是一个庞大的蛋白家族，目前至少发现70种以上，其共同特征是一端具有一个F-box基序与Skp1结合，另一端具有复杂的结合区域，可以与不同的底物靶蛋白结合，从而介导靶蛋白通过SCF复合型E3泛素化后被降解。

从mRNA水平抑制相关癌基因表达来对特定癌基因进行研究和治疗，是目前较常用的方法，但是对一些由于不容易降解，长期存在而导致肿瘤发生发展的相关肿瘤蛋白，从蛋白水平抑制会更迅速，更可靠。PTTG蛋白高水平长时间滞留在细胞各周期，是造成细胞不正常转化的原因之一。

β-TrCP蛋白(基因序列GenBank号为Y14153，蛋白GenBank号为CAA74572.1)是F-box蛋白家族中的一个成员，由569个氨基酸残基组成，其蛋白结构示意图见图1；自氨基端第142至194位氨基酸为F-box基序，能与skp1结合；第195至256位氨基酸为连接肽，为有效泛素化提供了有利的空间结构；第257至569位氨基酸为7个WD-40重复序列，构成复杂的空间结构，利于与不同的底物蛋白结合。β-TrCP蛋白广泛存在于多种人类细胞中，在体内涉及多个信号途径及细胞周期的调控。

PBF(基因序列GenBank号：BC019295，PBF蛋白的GenBank号：AAH19295.1)是PTTG结合因子(PTTG-binding-factor)的简称，PBF基因包含一个编码180个氨基酸的开放阅读框，PBF mRNA在人体组织中普遍表达，在体内、体外均可特异性地与PTTG相互作用。PBF在第149-166位氨基酸之间包含两个NLS(nuclear localizationsignal，核定位信号)序列，NLS介导蛋白进入细胞核；PTTG不含有NLS序列，PTTG进核并发挥功能需要PBF的NLS序列的参与。另有实验证明，PBF蛋白C端包含有核定位信号的30个氨基酸对于PBF与PTTG的结合是必需的，且足够与PTTG结合。

泛素化过程中泛素连接酶E3负责特异性识别与结合底物。近年来，多个研究小组应用重组技术构建重组嵌合泛素连接酶，成功降解了正常情况下非泛素化系统天然底物的某些蛋白。例如通过修饰泛素连接酶复合物Skp1-Cullin1-F-box(SCF)的底物结合亚单位F-box构成的嵌合F-box蛋白，可靶向性地降解pRB家族蛋白成员、β-catenin和cyclin A-Cdk2。这些研究结果表明利用重组的泛素连接酶，可靶向性地降解一些疾病相关分子。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白。

本发明所提供的具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白，命名为β-TrCP-PBF，是通过连接肽在PBF或由PBF羧基(C)端的第1-30位氨基酸残基(包含核定位序列)组成的多肽的氨基(N)端连接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基(包含F-box基序)的融合蛋白。

所述连接肽的选择是多种多样的，优选为柔性肽，其氨基酸残基序列可为序列表中SEQ ID NO：1(GSGSGSGSGS)或1-3个SEQ ID NO：2(GGGGS)等所示的重复序列。柔性肽易于弯曲，因而可使表达蛋白正确折叠，且不影响融合蛋白各自的活性结合区域。

具体来讲，所述具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：3；

2)序列表中的SEQ ID NO：4；

3)序列表中的SEQ ID NO：5；

4)序列表中的SEQ ID NO：6；

5)序列表中的SEQ ID NO：7。

序列表中的SEQ ID NO：3由446个氨基酸残基组成，自氨基端第1-256位为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列，自氨基端第257-266位为连接肽序列，自氨基端第267-446位为PBF；序列表中的SEQ ID NO：4由451个氨基酸残基组成，自氨基端第1-256位为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列，自氨基端第257-271位为连接肽序列，自氨基端第272-451位为PBF；序列表中的SEQ ID NO：5由446个氨基酸残基组成，自氨基端第1-256位为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列，自氨基端第257-266位为连接肽序列，自氨基端第267-446位为PBF；序列表中的SEQ ID NO：6由441个氨基酸残基组成，自氨基端第1-256位为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列，自氨基端第257-261位为连接肽序列，自氨基端第262-441位为PBF；序列表中的SEQ ID NO：7由296个氨基酸残基组成，自氨基端第1-256位为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列，自氨基端第257-266位为连接肽序列，自氨基端第267-296位为PBF羧基端的第1-30位氨基酸残基。

编码上述具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白的基因(β-TrCP-PBF)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：8的DNA序列；

2)序列表中SEQ ID NO：9的DNA序列；

3)序列表中SEQ ID NO：10的DNA序列；

4)序列表中SEQ ID NO：11的DNA序列；

5)序列表中SEQ ID NO：12的DNA序列；

6)编码序列表中SEQ ID NO：3-7的DNA序列。

序列表中的SEQ ID NO：8由1341个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1338位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：3的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-768位碱基为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列的编码序列，自5’端第769-798位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第799-1338位碱基为PBF的编码序列；序列表中的SEQ ID NO：9由1356个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1353位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：4的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-768位碱基为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列的编码序列，自5’端第769-813位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第814-1356位碱基为PBF的编码序列；序列表中的SEQ ID NO：10由1341个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1338位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-768位碱基为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列的编码序列，自5’端第769-798位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第799-1338位碱基为PBF的编码序列；序列表中的SEQ ID NO：11由1326个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1323位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：6的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-768位碱基为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列的编码序列，自5’端第769-783位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第784-1323位碱基为PBF的编码序列；序列表中的SEQ ID NO：12由891个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-888位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：7的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-768位碱基为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列的编码序列，自5’端第769-798位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第799-888位碱基为PBF羧基端第1-30位氨基酸残基的编码序列。

含有本发明融合蛋白基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

为方便纯化，在上述重组表达载体中具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白基因的5’端还连接有His-tag或FLAG-tag编码序列。

用于构建含有本发明融合蛋白基因的重组表达载体的出发载体为任意一种原核或真核表达载体；所述原核表达载体可为pET-32a、pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)或pET-30a等；所述真核表达载体可为pCMV5、pSilence1.0-U6(Ambion，Austin，TX，USA)、pcDNA、pEGFP-N1、pSV40、pCI-neo(购于Promega公司)、pTEF1、pPICZ a、pAM82或pAAh5等。

上述重组表达载体可按照常规方法构建。

扩增上述融合蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种表达上述具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白的方法。

本发明所提供的表达上述具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白的方法，是将上述含有具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白。

所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。

所述大肠杆菌可为E.coli DH5α、E.coli BL₂₁(DE₃)或E.coli Top10等。

所述酵母菌优选为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)。其中，所述巴氏毕赤酵母优选为巴氏毕赤酵母GS115、KM71(购自美国Invitrogen公司)或SMD1168(购自美国Invitrogen公司)。

上述重组菌可按照常规方法构建。

培养含有具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。其中，培养所述重组大肠杆菌宿主时需加入诱导剂，如IPTG等，所加入IPTG的浓度为0.5-1.0mmol/L，优选为1mmol/L，诱导温度为16-37℃，优选为28℃，诱导时间为2-4小时，优选为4小时。

本发明还提供了一种治疗PTTG阳性肿瘤及与PTTG过表达相关疾病的药物。

本发明所提供的治疗性药物，它的活性成分为上述具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白或其编码基因。

所述具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白基因可存在于真核表达载体中。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述基因药物载体包括(但不仅限于)携带基因的载体，如脂质体、重组病毒载体等；携带蛋白药物的载体，如(但不仅限于)其它的蛋白或多肽成分；所述载体还包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体等。

上述蛋白药物和基因药物的用量可采用药学领域中蛋白药物和基因药物的常规剂量，并可根据实际情况调整。

本发明提供了一种具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白β-TrCP-PBF及其编码基因。该融合蛋白保留β-TrCP蛋白N端包含F-box基序的部分而将C端的底物蛋白结合区域置换为能够特异性结合PTTG的PBF或其C端第1-30位氨基酸残基(包含核定位序列)，并用柔性连接肽(如“GSGSGSGSGS”等)把两者连结起来可以提高该融合蛋白的空间对接柔韧性。β-TrCP-PBF中的PBF区域负责对PTTG靶向性结合，F-box基序负责与Skp1结合然后形成SCF型E3，从而特异性介导PTTG蛋白泛素化、降解。实验证明，本发明的β-TrCP-PBF不仅可显著下调外源PTTG蛋白的表达水平，转染有β-TrCP-PBF基因真核表达载体的PTTG阳性细胞(如Hela细胞)内源PTTG蛋白表达水平较转染前显著下调，此外细胞的增殖能力(有一定的促调亡能力)及细胞克隆形成能力也均被抑制。本发明的融合蛋白β-TrCP-PBF及其编码基因将在PTTG的功能研究和制备治疗PTTG阳性肿瘤及与PTTG过度表达有关的疾病的药物中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为β-TrCP及本发明融合蛋白β-TrCP-PBF的结构示意图

图2为载体pCMV5的物理图谱

图3为pCMV5-β-TrCP-PBF载体的双酶切鉴定结果

图4为pCMV5-β-TrCP-PBF与pEGFP-N₃-PTTG共转染COS-7细胞以检测本发明融合蛋白β-TrCP-PBF对外源PTTG蛋白表达水平影响的实验结果

图5为本发明融合蛋白β-TrCP-PBF对PTTG阳性的宫颈癌细胞系Hela细胞内源PTTG蛋白表达水平影响的免疫印迹检测结果

图6为本发明融合蛋白β-TrCP-PBF对PTTG阳性的宫颈癌细胞系Hela细胞增殖数量影响的统计结果

图7为本发明融合蛋白β-TrCP-PBF对PTTG阳性的宫颈癌细胞系Hela细胞克隆增殖能力影响的显微镜观察结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海英俊生物技术有限公司合成。

实施例1、融合蛋白基因β-TrCP-PBF的获得及其真核表达载体的构建

一、氨基端连接Flag-tag序列的β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基编码序列的扩增

提取MCF-7细胞系(购自上海细胞所)的总RNA，反转录合成其cDNA并以此为模板，在引物TRC7(上游引物)：5’

-GTCTCTAGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAAATGGACCCGGCCGAGG-3’(带下划线碱基为Flag-tag编码序列)和TRC6(下游引物)：5’

-GTCGGATCCACTATGTCTTCCACATCTCCAATTAGATTC-3’的引导下PCR扩增氨基端连接Flag-tag序列的β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基编码序列，同时在扩增片段两端引入限制性内切酶Xba I和BamH I酶切位点。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增获得了长度为819bp的目的片段，测序结果表明获得了序列正确的5’端连接Flag-tag编码序列的β-TrCP基因自5’端第1-768位碱基构成的基因片段，即氨基端连接Flag-tag序列的β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基编码序列。回收并纯化该目的片段。

二、氨基端连接“GSGSGSGSGS”连接肽序列的PBF编码序列的克隆

以MCF-7细胞系cDNA为模板，在引物PBF3(上游引物)：5’

-CTGGGATCCGGCTCAGGCTCAGGATCAGGCTCAATGGCGCCCGGAGTGG-3’(带下划线碱基为“GSGSGSGSGS”连接肽编码序列)和PBF2(下游引物)：5’

-CTTCCCGGGTTAGTTGTTTTCAAATCTAGCATACG-3’的引导下PCR扩增氨基端连接“GSGSGSGSGS”连接肽(序列表中SEQ ID NO：1)序列的PBF编码序列，同时在扩增片段两端引入限制性内切酶BamH I和Sma I酶切位点。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增获得了长度为585bp的目的片段，测序结果表明获得了序列正确的5’端连接“GSGSGSGSGS”连接肽编码序列的PBF基因片段，即氨基端连接“GSGSGSGSGS”连接肽序列的PBF编码序列。回收并纯化该目的片段。

此外，用普通PCR扩增的方法还获得了下述DNA片段(同时在扩增片段两端引入限制性内切酶BamH I和Sma I酶切位点)：1)氨基端连接三个“GGGGS”重复序列的连接肽的PBF编码序列；2)氨基端连接二个“GGGGS”重复序列的连接肽的PBF编码序列；3)氨基端连接“GGGGS”连接肽的PBF编码序列；4)氨基端连接“GSGSGSGSGS”连接肽的PBF羧基端的第1-30位氨基酸残基组成的多肽的编码序列。

三、重组嵌合分子β-TrCP-PBF真核表达载体的构建

如图2所示，载体pCMV5(GenBank号：AF239249)包含CMV：CMV启动子，842-913位碱基；MCS：多克隆位点，902-986位碱基；SV40：SV40起始位点，1817-1894位碱基；T7：T7启动子，2023-2005位碱基；pBR322_origin：pBR322起始位点，3043-2424位碱基；Ampicillin：氨苄青霉素抗药性基因，4058-3198位碱基；f1_origin：f1起始位点，4207-4513位碱基。用限制性内切酶Xba I和Sma I对载体pCMV5进行双酶切后，用T4 DNA连接酶将实施例1步骤一扩增的5’端连接Flag-tag编码序列的β-TrCP基因自5’端第1-768位碱基构成的基因片段(两端添加有Xba I和BamH I酶切位点)和实施例1步骤二扩增的5’端连接“GSGSGSGSGS”连接肽编码序列的PBF基因片段(两端添加有BamH I和Sma I酶切位点)与线性化的pCMV5中连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性单克隆，提取质粒，分别用Xba I和Sma I，Xba I和BamH I，BamH I和Sma I对重组质粒进行双酶切鉴定，酶切鉴定结果如图3所示(泳道M为DNA Marker，泳道1为重组质粒的Xba I和Sma I的双酶切鉴定结果，泳道2为重组质粒的Xba I和BamH I的双酶切鉴定结果，泳道3为重组质粒的BamH I和Sma I的双酶切鉴定结果)，重组质粒经Xba I和Sma I双酶切获得了约1386bp的DNA片段，重组质粒经Xba I和BamHI双酶切获得了约813bp的DNA片段，重组质粒经BamH I和Sma I双酶切获得了约579bp的DNA片段，与预期结果相符。对上述重组质粒进行测序鉴定，除去Flag-tag编码序列及酶切位点外，载体中插入的外源DNA片段具有序列表中SEQ ID NO：8的核苷酸序列，由1341个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1338位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：3的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-768位碱基为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列的编码序列，自5’端第769-798位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第799-1338位碱基为PBF的编码序列。将所构建的β-TrCP-PBF的真核表达载体命名为pCMV5-β-TrCP-PBF。

此外，用上述方法将实施例1步骤一扩增的5’端连接Flag-tag编码序列的β-TrCP基因自5’端第1-768位碱基构成的基因片段(两端添加有Xba I和BamH I酶切位点)分别和实施例1步骤二扩增的5’端连接三个“GGGGS”重复序列连接肽编码序列的PBF基因片段(两端添加有BamHI和SmaI酶切位点)、5’端连接二个“GGGGS”重复序列连接肽编码序列的PBF基因片段(两端添加有BamH I和Sma I酶切位点)、5’端连接“GGGGS”重复序列连接肽编码序列的PBF基因片段(两端添加有BamH I和Sma I酶切位点)、5’端连接“GSGSGSGSGS”连接肽编码序列的PBF羧基端的第1-30位氨基酸残基组成的多肽的编码序列与线性化的pCMV5中连接，得到下述重组真核表达载体：1)含有连接肽为三个“GGGGS”重复序列的融合蛋白基因的真核表达载体，命名为pCMV5-β-TrCP-PBF3，该融合蛋白基因具有序列表中SEQ ID NO：9的核苷酸序列，由1356个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1353位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：4的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-768位碱基为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列的编码序列，自5’端第769-813位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第814-1356位碱基为PBF的编码序列；2)含有连接肽为二个“GGGGS”重复序列的融合蛋白基因的真核表达载体，命名为pCMV5-β-TrCP-PBF2，该融合蛋白基因具有序列表中SEQ ID NO：10的核苷酸序列，由1341个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1338位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-768位碱基为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列的编码序列，自5’端第769-798位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第799-1338位碱基为PBF的编码序列；3)含有连接肽为“GGGGS”的融合蛋白基因的真核表达载体，命名为pCMV5-β-TrCP-PBF1，该融合蛋白基因具有序列表中SEQ ID NO：11的核苷酸序列，由1326个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1323位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：6的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-768位碱基为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列的编码序列，自5’端第769-783位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第784-1323位碱基为PBF的编码序列；4)含有连接肽为“GSGSGSGSGS”的在由PBF羧基端的第1-30位氨基酸残基组成的多肽的氨基端连接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基的融合蛋白基因的真核表达载体，命名为pCMV5-β-TrCP-PBF30，该融合蛋白基因具有序列表中SEQ ID NO：12的核苷酸序列，由891个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-888位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：7的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-768位碱基为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列的编码序列，自5’端第769-798位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第799-888位碱基为PBF羧基端第1-30位氨基酸残基的编码序列。将本发明的融合蛋白基因统称为β-TrCP-PBF，其编码蛋白统称为β-TrCP-PBF，该蛋白的结构示意图见图1。

实施例2、检测本发明融合蛋白β-TrCP-PBF对PTTG基因表达的抑制作用

一、检测本发明融合蛋白β-TrCP-PBF对外源PTTG-EGFP融合蛋白表达情况的影响

将实施例1构建的携带有本发明融合蛋白基因的真核表达载体pCMV5-β-TrCP-PBF与携带有绿色荧光蛋白标记的PTTG蛋白基因的质粒pEGFP-N₃-PTTG(pEGFP-N₃-PTTG是PTTG-EGFP融合蛋白基因的真核表达载体，转染真核细胞后能表达出带绿色荧光蛋白标记的PTTG蛋白，此融合蛋白在蓝色激发光下能发出绿色荧光。质粒pEGFP-N₃-PTTG的构建方法：提取MCF-7细胞系的总RNA，反转录合成其cDNA并以此为模板，在引物：MP5(上游引物)：

5’-CGTCAATTCGCCACCATGGCTACTCTGATCTATGTTG-3’和MP6(下游引物)：

5’-CAGGGATCCAATATCTATGTCACAGCAAACAG-3’的引导下PCR扩增PTTG基因片段(Genbank号：AF095287)，并在扩增片段两端分别添加EcoR I和BamH I酶切为点，然后将载体pEGFP-N₃(CLONTECH生物技术公司)用限制性内切酶EcoR I和BamH I进行双酶切后，用T4DNA连接酶将上述PCR扩增的PTTG基因片段与线性化的pEGFP-N3连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性单克隆，提质粒，酶切鉴定及测序鉴定，最终得到携带PTTG-EGFP融合蛋白基因的目标质粒pEGFP-N₃-PTTG。)瞬时共转染COS-7细胞，检测本发明融合蛋白对PTTG表达的影响，具体方法为：将对数生长期的COS-7细胞以每孔1×10⁵细胞量接种于24孔培养板内，培养液为含10％胎牛血清(HYCLONE公司)的DMEM培养基(GIBCO公司)，在5％CO₂、37℃培养箱中培养。次日当细胞长至90-95％时，用脂质体Lipofectamine^TM2000试剂(Gibco公司)并参照说明书将质粒pCMV5-β-TrCP-PBF和pEGFP-N₃-PTTG按1∶1的比例共转染COS-7细胞，对照细胞以同样的方法共转染pCMV5空载体和pEGFP-N₃-PTTG(1∶1)，转染后48小时，用荧光显微镜(OLYMPUS IX51)观察和拍照，用Image-pro plus v5.02Sofeware分析转染细胞中PTTG的表达情况。结果如图4所示(A：pCMV5空载体和pEGFP-N₃-PTTG共转染细胞，B：pCMV5-β-TrCP-PBF和pEGFP-N₃-PTTG共转染细胞)，pCMV5-β-TrCP-PBF和pEGFP-N₃-PTTG共转染细胞的荧光亮度明显比空质粒pCMV5和pEGFP-N₃-PTTG共转染细胞的荧光亮度弱，表明本发明的融合蛋白β-TrCP-PBF能显著下调外源PTTG蛋白的表达。

用上述相同方法还将pCMV5-β-TrCP-PBF3、pCMV5-β-TrCP-PBF2、pCMV5-β-TrCP-PBF1、pCMV5-β-TrCP-PBF30分别和pEGFP-N₃-PTTG共转染COS-7细胞，以检测本发明连接肽为1-3个“GGGGS”重复序列的融合蛋白β-TrCP-PBF以及连接肽为“GSGSGSGSGS”的在由PBF羧基端的第1-30位氨基酸残基组成的多肽的氨基端连接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基的融合蛋白对外源PTTG蛋白表达的影响，结果转染有携带本发明融合蛋白基因的真核表达载体的细胞的荧光亮度明显比空质粒pCMV5和pEGFP-N₃-PTTG共转染细胞的荧光亮度弱，表明本发明的融合蛋白β-TrCP-PBF能显著下调外源PTTG蛋白的表达。

二、检测本发明融合蛋白β-TrCP-PBF对PTTG阳性癌细胞增殖及细胞内源PTTG表达水平的影响

以人宫颈癌细胞系Hela细胞为例，将实施例1构建的携带有本发明融合蛋白基因的真核表达载体pCMV5-β-TrCP-PBF转染PTTG阳性癌细胞，以检测本发明融合蛋白β-TrCP-PBF对PTTG阳性癌细胞增殖及细胞内源PTTG表达水平的影响，具体方法为：将对数生长期的Hela细胞以每孔2×10⁵细胞量接种于24孔培养板内，培养液为含10％胎牛血清的DMEM培养基，在5％CO₂、37℃培养箱中培养。次日当细胞长至90-95％时，用脂质体Lipofectamine^TM2000试剂将质粒pCMV5-β-TrCP-PBF转染Hela细胞，对照细胞以同样的方法转染pCMV5空载体。转染后48小时收获细胞，首先用免疫印迹(Western blot)检测融合蛋白β-TrCP-PBF对PTTG蛋白水平的影响，一抗为抗PTTG抗体(购自SANTA CRUZ)，二抗为羊抗兔(购自SANTA CRUZ)，检测结果如图5所示，与转染pCMV5的对照细胞比较，转染pCMV5-β-TrCP-PBF的Hela细胞中PTTG蛋白水平显著下调，表明本发明的融合蛋白β-TrCP-PBF能下调内源PTTG蛋白的表达水平。同时还统计了两组转染细胞转染后第1、2、3、4天的细胞数量，细胞数量统计结果如图6所示，与转染pCMV5的对照细胞相比，转染pCMV5-β-TrCP-PBF的Hela细胞的增殖明显受到抑制，表明本发明的融合蛋白β-TrCP-PBF能有效抑制与PTTG过度表达有关的细胞(PTTG阳性肿瘤细胞)的增殖，并有促凋亡的作用。此外，将分别转染pCMV5、pCMV5-β-TrCP-PBF的Hela细胞以每孔1×10³细胞量接种于24孔培养板内，并于第7天在显微镜下观察细胞克隆形成情况，结果如图7所示，与转染pCMV5的对照细胞相比，转染pCMV5-β-TrCP-PBF的Hela细胞细胞克隆形成明显减少，表明本发明的融合蛋白β-TrCP-PBF能有效抑制与PTTG过度表达有关的细胞(PTTG阳性肿瘤细胞)的克隆增殖能力。

用上述相同方法还将pCMV5-β-TrCP-PBF3、pCMV5-β-TrCP-PBF2、pCMV5-β-TrCP-PBF1、pCMV5-β-TrCP-PBF30分别转染Hela细胞，以检测本发明连接肽为1-3个“GGGGS”重复序列的融合蛋白β-TrCP-PBF以及连接肽为“GSGSGSGSGS”的在由PBF羧基端的第1-30位氨基酸残基组成的多肽的氨基端连接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基的融合蛋白对内源PTTG蛋白表达水平及PTTG阳性细胞增殖能力及细胞克隆形成能力的影响，结果转染有携带上述本发明融合蛋白基因的真核表达载体的Hela细胞内PTTG的表达水平明显比空质粒pCMV5转染细胞内PTTG的表达水平低，且细胞细胞增殖数量及细胞克隆形成与对照空质粒pCMV5转染细胞比也均明显减少，表明本发明的融合蛋白β-TrCP-PBF能显著下调内源PTTG蛋白的表达，PTTG阳性细胞增殖能力及细胞克隆形成能力，可用于制备治疗PTTG阳性肿瘤及与PTTG过度表达有关疾病的药物。

实施例3、本发明融合蛋白β-TrCP-PBF的原核表达

用限制性内切酶Xba I和Sma I对原核表达载体pET-32a(Novagen公司)进行双酶切后，用T4 DNA连接酶将实施例1步骤一扩增的5’端连接Flag-tag编码序列的β-TrCP基因自5’端第1-768位碱基构成的基因片段(两端添加有Xba I和BamH I酶切位点)和实施例1步骤二扩增的5’端连接“GSGSGSGSGS”连接肽编码序列的PBF基因片段(两端添加有BamH I和Sma I酶切位点)与线性化的载体pET-32a连接，得到本发明融合蛋白β-TrCP-PBF的原核表达载体，命名为pET32a-βTrCP-PBF【用同样方法还获得了含有连接肽为三个“GGGGS”重复序列的β-TrCP-PBF基因的原核表达载体(命名为pET32a-βTrCP-PBF3)，含有连接肽为二个“GGGGS”重复序列的β-TrCP-PBF基因的原核表达载体(命名为pET32a-βTrCP-PBF2)，含有连接肽为“GGGGS”的β-TrCP-PBF基因的原核表达载体(命名为pET32a-βTrCP-PBF1)，含有连接肽为“GSGSGSGSGS”的在由PBF羧基端的第1-30位氨基酸残基组成的多肽的氨基端连接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基的β-TrCP-PBF基因的原核表达载体(命名为pET32a-βTrCP-PBF30)】，再将上述原核表达载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性重组菌，然后按1∶100的比例将阳性重组菌接种至含100mg/mL氨苄青霉素的1000mL LB液体培养基中在37℃下进行大量培养，培养至对数生长期(OD₆₀₀值约为0.8)，加入化学诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L，在37℃下继续培养4小时。培养结束后，4℃、6000rpm离心15min收集菌体，用100mL TE缓冲液(20mmol/L，pH8.0)重悬菌体沉淀，加入溶菌酶(1mg/mL)于室温磁力搅拌10min；冰浴中超声波(30s/开，20s/停，15个循环)破碎菌体；4℃、12000rpm离心20min分别收集包涵体沉淀和上清。将包涵体沉淀用1mol/L的NaCl(TE配制)洗涤1次，4℃、12000rpm离心20min以去除包涵体中的杂蛋白，弃上清后再用TE缓冲液洗涤2次，4℃、12000rpm离心20min收集沉淀，利用Flag-tag对表达的上述融合蛋白β-TrCP-PBF进行纯化，得到纯化的本发明连接肽为“GSGSGSGSGS”的β-TrCP-PBF、连接肽为三个“GGGGS”重复序列的β-TrCP-PBF、连接肽为二个“GGGGS”重复序列的β-TrCP-PBF、连接肽为“GGGGS”的β-TrCP-PBF及连接肽为“GSGSGSGSGS”的在由PBF羧基端的第1-30位氨基酸残基组成的多肽的氨基端连接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基的β-TrCP-PBF。

序列表

<160>12

<210>1

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1               5                   10

<210>2

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Gly Gly Gly Gly Ser

1               5

<210>3

<211>446

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

Met Asp Pro Ala Glu Ala Val Leu Gln Glu Lys Ala Leu Lys Phe Met

1               5                   10                  15

Asn Ser Ser Glu Arg Glu Asp Cys Asn Asn Gly Glu Pro Pro Arg Lys

            20                  25                  30

Ile Ile Pro Glu Lys Asn Ser Leu Arg Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Ala

        35                  40                  45

Arg Leu Cys Leu Asn Gln Glu Thr Val Cys Leu Ala Ser Thr Ala Met

    50                  55                  60

Lys Thr Glu Asn Cys Val Ala Lys Thr Lys Leu Ala Asn Gly Thr Ser

65                  70                  75                  80

Ser Met Ile Val Pro Lys Gln Arg Lys Leu Ser Ala Ser Tyr Glu Lys

                85                  90                  95

Glu Lys Glu Leu Cys Val Lys Tyr Phe Glu Gln Trp Ser Glu Ser Asp

            100                 105                 110

Gln Val Glu Phe Val Glu His Leu Ile Ser Gln Met Cys His Tyr Gln

        115                 120                 125

His Gly His Ile Asn Ser Tyr Leu Lys Pro Met Leu Gln Arg Asp Phe

    130                 135                 140

Ile Thr Ala Leu Pro Ala Arg Gly Leu Asp His Ile Ala Glu Asn Ile

145                 150                 155                 160

Leu Ser Tyr Leu Asp Ala Lys Ser Leu Cys Ala Ala Glu Leu Val Cys

                165                 170                 175

Lys Glu Trp Tyr Arg Val Thr Ser Asp Gly Met Leu Trp Lys Lys Leu

            180                 185                 190

Ile Glu Arg Met Val Arg Thr Asp Ser Leu Trp Arg Gly Leu Ala Glu

        195                 200                 205

Arg Arg Gly Trp Gly Gln Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Pro Pro Asp Gly

    210                 215                 220

Asn Ala Pro Pro Asn Ser Phe Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Lys Ile Ile

225                 230                 235                 240

Gln Asp Ile Glu Thr Ile Glu Ser Asn Trp Arg Cys Gly Arg His Ser

                245                 250                 255

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Met Ala Pro Gly Val Ala

            260                 265                 270

Arg Gly Pro Thr Pro Tyr Trp Arg Leu Arg Leu Gly Gly Ala Ala Leu

        275                 280                 285

Leu Leu Leu Leu Ile Pro Val Ala Ala Ala Gln Glu Pro Pro Gly Ala

    290                 295                 300

Ala Cys Ser Gln Asn Thr Asn Lys Thr Cys Glu Glu Cys Leu Lys Asn

305                 310                 315                 320

Val Ser Cys Leu Trp Cys Asn Thr Asn Lys Ala Cys Leu Asp Tyr Pro

                325                 330                 335

Val Thr Ser Val Leu Pro Pro Ala Ser Leu Cys Lys Leu Ser Ser Ala

            340                 345                 350

Arg Trp Gly Val Cys Trp Val Asn Phe Glu Ala Leu Ile Ile Thr Met

        355                 360                 365

Ser Val Val Gly Gly Thr Leu Leu Leu Gly Ile Ala Ile Cys Cys Cys

    370                 375                 380

Cys Cys Cys Arg Arg Lys Arg Ser Arg Lys Pro Asp Arg Ser Glu Glu

385                 390                 395                 400

Lys Ala Met Arg Glu Arg Glu Glu Arg Arg Ile Arg Gln Glu Glu Arg

                405                 410                 415

Arg Ala Glu Met Lys Thr Arg His Asp Glu Ile Arg Lys Lys Tyr Gly

            420                 425                 430

Leu Phe Lys Glu Glu Asn Pro Tyr Ala Arg Phe Glu Asn Asn

        435                 440                 445

<210>4

<211>451

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

Met Asp Pro Ala Glu Ala Val Leu Gln Glu Lys Ala Leu Lys Phe Met

1               5                   10                  15

Asn Ser Ser Glu Arg Glu Asp Cys Asn Asn Gly Glu Pro Pro Arg Lys

            20                  25                  30

Ile Ile Pro Glu Lys Asn Ser Leu Arg Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Ala

        35                  40                  45

Arg Leu Cys Leu Asn Gln Glu Thr Val Cys Leu Ala Ser Thr Ala Met

    50                  55                  60

Lys Thr Glu Asn Cys Val Ala Lys Thr Lys Leu Ala Asn Gly Thr Ser

65                  70                  75                  80

Ser Met Ile Val Pro Lys Gln Arg Lys Leu Ser Ala Ser Tyr Glu Lys

                85                  90                  95

Glu Lys Glu Leu Cys Val Lys Tyr Phe Glu Gln Trp Ser Glu Ser Asp

            100                 105                 110

Gln Val Glu Phe Val Glu His Leu Ile Ser Gln Met Cys His Tyr Gln

        115                 120                 125

His Gly His Ile Asn Ser Tyr Leu Lys Pro Met Leu Gln Arg Asp Phe

    130                 135                 140

Ile Thr Ala Leu Pro Ala Arg Gly Leu Asp His Ile Ala Glu Asn Ile

145                 150                 155                 160

Leu Ser Tyr Leu Asp Ala Lys Ser Leu Cys Ala Ala Glu Leu Val Cys

                165                 170                 175

Lys Glu Trp Tyr Arg Val Thr Ser Asp Gly Met Leu Trp Lys Lys Leu

            180                 185                 190

Ile Glu Arg Met Val Arg Thr Asp Ser Leu Trp Arg Gly Leu Ala Glu

        195                 200                 205

Arg Arg Gly Trp Gly Gln Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Pro Pro Asp Gly

    210                 215                 220

Asn Ala Pro Pro Asn Ser Phe Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Lys Ile Ile

225                 230                 235                 240

Gln Asp Ile Glu Thr Ile Glu Ser Asn Trp Arg Cys Gly Arg His Ser

                245                 250                 255

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met

            260                 265                 270

Ala Pro Gly Val Ala Arg Gly Pro Thr Pro Tyr Trp Arg Leu Arg Leu

        275                 280                 285

Gly Gly Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ile Pro Val Ala Ala Ala Gln

    290                 295                 300

Glu Pro Pro Gly Ala Ala Cys Ser Gln Asn Thr Asn Lys Thr Cys Glu

305                 310                 315                 320

Glu Cys Leu Lys Asn Val Ser Cys Leu Trp Cys Asn Thr Asn Lys Ala

                325                 330                 335

Cys Leu Asp Tyr Pro Val Thr Ser Val Leu Pro Pro Ala Ser Leu Cys

            340                 345                 350

Lys Leu Ser Ser Ala Arg Trp Gly Val Cys Trp Val Asn Phe Glu Ala

        355                 360                 365

Leu Ile Ile Thr Met Ser Val Val Gly Gly Thr Leu Leu Leu Gly Ile

    370                 375                 380

Ala Ile Cys Cys Cys Cys Cys Cys Arg Arg Lys Arg Ser Arg Lys Pro

385                 390                 395                 400

Asp Arg Ser Glu Glu Lys Ala Met Arg Glu Arg Glu Glu Arg Arg Ile

                405                 410                 415

Arg Gln Glu Glu Arg Arg Ala Glu Met Lys Thr Arg His Asp Glu Ile

            420                 425                 430

Arg Lys Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Glu Glu Asn Pro Tyr Ala Arg Phe

        435                 440                 445

Glu Asn Asn

    450

<210>5

<211>446

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

Met Asp Pro Ala Glu Ala Val Leu Gln Glu Lys Ala Leu Lys Phe Met

1               5                   10                  15

Asn Ser Ser Glu Arg Glu Asp Cys Asn Asn Gly Glu Pro Pro Arg Lys

            20                  25                  30

Ile Ile Pro Glu Lys Asn Ser Leu Arg Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Ala

        35                  40                  45

Arg Leu Cys Leu Asn Gln Glu Thr Val Cys Leu Ala Ser Thr Ala Met

    50                  55                  60

Lys Thr Glu Asn Cys Val Ala Lys Thr Lys Leu Ala Asn Gly Thr Ser

65                  70                  75                  80

Ser Met Ile Val Pro Lys Gln Arg Lys Leu Ser Ala Ser Tyr Glu Lys

                85                  90                  95

Glu Lys Glu Leu Cys Val Lys Tyr Phe Glu Gln Trp Ser Glu Ser Asp

            100                 105                 110

Gln Val Glu Phe Val Glu His Leu Ile Ser Gln Met Cys His Tyr Gln

        115                 120                 125

His Gly His Ile Asn Ser Tyr Leu Lys Pro Met Leu Gln Arg Asp Phe

    130                 135                 140

Ile Thr Ala Leu Pro Ala Arg Gly Leu Asp His Ile Ala Glu Asn Ile

145                 150                 155                 160

Leu Ser Tyr Leu Asp Ala Lys Ser Leu Cys Ala Ala Glu Leu Val Cys

                165                 170                 175

Lys Glu Trp Tyr Arg Val Thr Ser Asp Gly Met Leu Trp Lys Lys Leu

            180                 185                 190

Ile Glu Arg Met Val Arg Thr Asp Ser Leu Trp Arg Gly Leu Ala Glu

        195                 200                 205

Arg Arg Gly Trp Gly Gln Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Pro Pro Asp Gly

    210                 215                 220

Asn Ala Pro Pro Asn Ser Phe Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Lys Ile Ile

225                 230                 235                 240

Gln Asp Ile Glu Thr Ile Glu Ser Asn Trp Arg Cys Gly Arg His Ser

                245                 250                 255

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Pro Gly Val Ala

            260                 265                 270

Arg Gly Pro Thr Pro Tyr Trp Arg Leu Arg Leu Gly Gly Ala Ala Leu

        275                 280                 285

Leu Leu Leu Leu Ile Pro Val Ala Ala Ala Gln Glu Pro Pro Gly Ala

    290                 295                 300

Ala Cys Ser Gln Asn Thr Asn Lys Thr Cys Glu Glu Cys Leu Lys Asn

305                 310                 315                 320

Val Ser Cys Leu Trp Cys Asn Thr Asn Lys Ala Cys Leu Asp Tyr Pro

                325                 330                 335

Val Thr Ser Val Leu Pro Pro Ala Ser Leu Cys Lys Leu Ser Ser Ala

            340                 345                 350

Arg Trp Gly Val Cys Trp Val Asn Phe Glu Ala Leu Ile Ile Thr Met

        355                 360                 365

Ser Val Val Gly Gly Thr Leu Leu Leu Gly Ile Ala Ile Cys Cys Cys

    370                 375                 380

Cys Cys Cys Arg Arg Lys Arg Ser Arg Lys Pro Asp Arg Ser Glu Glu

385                 390                 395                 400

Lys Ala Met Arg Glu Arg Glu Glu Arg Arg Ile Arg Gln Glu Glu Arg

                405                 410                 415

Arg Ala Glu Met Lys Thr Arg His Asp Glu Ile Arg Lys Lys Tyr Gly

            420                 425                 430

Leu Phe Lys Glu Glu Asn Pro Tyr Ala Arg Phe Glu Asn Asn

        435                 440                 445

<210>6

<211>441

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

Met Asp Pro Ala Glu Ala Val Leu Gln Glu Lys Ala Leu Lys Phe Met

1               5                   10                  15

Asn Ser Ser Glu Arg Glu Asp Cys Asn Asn Gly Glu Pro Pro Arg Lys

            20                  25                  30

Ile Ile Pro Glu Lys Asn Ser Leu Arg Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Ala

        35                  40                  45

Arg Leu Cys Leu Asn Gln Glu Thr Val Cys Leu Ala Ser Thr Ala Met

    50                  55                  60

Lys Thr Glu Asn Cys Val Ala Lys Thr Lys Leu Ala Asn Gly Thr Ser

65                  70                  75                  80

Ser Met Ile Val Pro Lys Gln Arg Lys Leu Ser Ala Ser Tyr Glu Lys

                85                  90                  95

Glu Lys Glu Leu Cys Val Lys Tyr Phe Glu Gln Trp Ser Glu Ser Asp

            100                 105                 110

Gln Val Glu Phe Val Glu His Leu Ile Ser Gln Met Cys His Tyr Gln

        115                 120                 125

His Gly His Ile Asn Ser Tyr Leu Lys Pro Met Leu Gln Arg Asp Phe

    130                 135                 140

Ile Thr Ala Leu Pro Ala Arg Gly Leu Asp His Ile Ala Glu Asn Ile

145                 150                 155                 160

Leu Ser Tyr Leu Asp Ala Lys Ser Leu Cys Ala Ala Glu Leu Val Cys

                165                 170                 175

Lys Glu Trp Tyr Arg Val Thr Ser Asp Gly Met Leu Trp Lys Lys Leu

            180                 185                 190

Ile Glu Arg Met Val Arg Thr Asp Ser Leu Trp Arg Gly Leu Ala Glu

        195                 200                 205

Arg Arg Gly Trp Gly Gln Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Pro Pro Asp Gly

    210                 215                 220

Asn Ala Pro Pro Asn Ser Phe Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Lys Ile Ile

225                 230                 235                 240

Gln Asp Ile Glu Thr Ile Glu Ser Asn Trp Arg Cys Gly Arg His Ser

                245                 250                 255

Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Pro Gly Val Ala Arg Gly Pro Thr Pro

            260                 265                 270

Tyr Trp Arg Leu Arg Leu Gly Gly Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ile

        275                 280                 285

Pro Val Ala Ala Ala Gln Glu Pro Pro Gly Ala Ala Cys Ser Gln Asn

    290                 295                 300

Thr Asn Lys Thr Cys Glu Glu Cys Leu Lys Asn Val Ser Cys Leu Trp

305                 310                 315                 320

Cys Asn Thr Asn Lys Ala Cys Leu Asp Tyr Pro Val Thr Ser Val Leu

                325                 330                 335

Pro Pro Ala Ser Leu Cys Lys Leu Ser Ser Ala Arg Trp Gly Val Cys

            340                 345                 350

Trp Val Asn Phe Glu Ala Leu Ile Ile Thr Met Ser Val Val Gly Gly

        355                 360                 365

Thr Leu Leu Leu Gly Ile Ala Ile Cys Cys Cys Cys Cys Cys Arg Arg

    370                 375                 380

Lys Arg Ser Arg Lys Pro Asp Arg Ser Glu Glu Lys Ala Met Arg Glu

385                 390                 395                 400

Arg Glu Glu Arg Arg Ile Arg Gln Glu Glu Arg Arg Ala Glu Met Lys

                405                 410                 415

Thr Arg His Asp Glu Ile Arg Lys Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Glu Glu

            420                 425                 430

Asn Pro Tyr Ala Arg Phe Glu Asn Asn

        435                 440

<210>7

<211>296

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

Met Asp Pro Ala Glu Ala Val Leu Gln Glu Lys Ala Leu Lys Phe Met

1               5                   10                  15

Asn Ser Ser Glu Arg Glu Asp Cys Asn Asn Gly Glu Pro Pro Arg Lys

            20                  25                  30

Ile Ile Pro Glu Lys Asn Ser Leu Arg Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Ala

        35                  40                  45

Arg Leu Cys Leu Asn Gln Glu Thr Val Cys Leu Ala Ser Thr Ala Met

    50                  55                  60

Lys Thr Glu Asn Cys Val Ala Lys Thr Lys Leu Ala Asn Gly Thr Ser

65                  70                  75                  80

Ser Met Ile Val Pro Lys Gln Arg Lys Leu Ser Ala Ser Tyr Glu Lys

                85                  90                  95

Glu Lys Glu Leu Cys Val Lys Tyr Phe Glu Gln Trp Ser Glu Ser Asp

            100                 105                 110

Gln Val Glu Phe Val Glu His Leu Ile Ser Gln Met Cys His Tyr Gln

        115                 120                 125

His Gly His Ile Asn Ser Tyr Leu Lys Pro Met Leu Gln Arg Asp Phe

    130                 135                 140

Ile Thr Ala Leu Pro Ala Arg Gly Leu Asp His Ile Ala Glu Asn Ile

145                 150                 155                 160

Leu Ser Tyr Leu Asp Ala Lys Ser Leu Cys Ala Ala Glu Leu Val Cys

                165                 170                 175

Lys Glu Trp Tyr Arg Val Thr Ser Asp Gly Met Leu Trp Lys Lys Leu

            180                 185                 190

Ile Glu Arg Met Val Arg Thr Asp Ser Leu Trp Arg Gly Leu Ala Glu

        195                 200                 205

Arg Arg Gly Trp Gly Gln Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Pro Pro Asp Gly

    210                 215                 220

Asn Ala Pro Pro Asn Ser Phe Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Lys Ile Ile

225                 230                 235                 240

Gln Asp Ile Glu Thr Ile Glu Ser Asn Trp Arg Cys Gly Arg His Ser

                245                 250                 255

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Arg Ala Glu Met Lys Thr

            260                 265                 270

Arg His Asp Glu Ile Arg Lys Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Glu Glu Asn

        275                 280                 285

Pro Tyr Ala Arg Phe Glu Asn Asn

    290                 295

<210>8

<211>1341

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

atggacccgg ccgaggcggt gctgcaagag aaggcactca agtttatgaa ttcctcagag     60

agagaagact gtaataatgg cgaaccccct aggaagataa taccagagaa gaattcactt    120

agacagacat acaacagctg tgccagactc tgcttaaacc aagaaacagt atgtttagca    180

agcactgcta tgaagactga gaattgtgtg gccaaaacaa aacttgccaa tggcacttcc    240

agtatgattg tgcccaagca acggaaactc tcagcaagct atgaaaagga aaaggaactg    300

tgtgtcaaat actttgagca gtggtcagag tcagatcaag tggaatttgt ggaacatctt    360

atatcccaaa tgtgtcatta ccaacatggg cacataaact cgtatcttaa acctatgttg    420

cagagagatt tcataactgc tctgccagct cggggattgg atcatatcgc tgagaacatt    480

ctgtcatacc tggatgccaa atcactatgt gctgctgaac ttgtgtgcaa ggaatggtac     540

cgagtgacct ctgatggcat gctgtggaag aagcttatcg agagaatggt caggacagat     600

tctctgtgga gaggcctggc agaacgaaga ggatggggac agtatttatt caaaaacaaa     660

cctcctgacg ggaatgctcc tcccaactct ttttatagag cactttatcc taaaattata     720

caagacattg agacaataga atctaattgg agatgtggaa gacatagtgg atccggctca     780

ggctcaggat caggctcaat ggcgcccgga gtggcccgcg ggccgacgcc gtactggagg     840

ttgcgcctcg gtggcgccgc gctgctcctg ctgctcatcc cggtggccgc cgcgcaggag     900

cctcccggag ctgcttgttc tcagaacaca aacaaaacct gtgaagagtg cctgaagaac     960

gtctcctgtc tttggtgcaa cactaacaag gcttgtctgg actacccagt tacaagcgtc    1020

ttgccaccgg cttccctttg taaattgagc tctgcacgct ggggagtttg ttgggtgaac    1080

tttgaggcgc tgatcatcac catgtcggta gtcgggggaa ccctcctcct gggcattgcc    1140

atctgctgct gctgctgctg caggaggaag aggagccgga agccggacag gagtgaggag    1200

aaggccatgc gtgagcggga ggagaggcgg atacggcagg aggaacggag agcagagatg    1260

aagacaagac atgatgaaat cagaaaaaaa tatggcctgt ttaaagaaga aaacccgtat    1320

gctagatttg aaaacaacta a                                              1341

<210>9

<211>1356

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

atggacccgg ccgaggcggt gctgcaagag aaggcactca agtttatgaa ttcctcagag     60

agagaagact gtaataatgg cgaaccccct aggaagataa taccagagaa gaattcactt    120

agacagacat acaacagctg tgccagactc tgcttaaacc aagaaacagt atgtttagca    180

agcactgcta tgaagactga gaattgtgtg gccaaaacaa aacttgccaa tggcacttcc    240

agtatgattg tgcccaagca acggaaactc tcagcaagct atgaaaagga aaaggaactg    300

tgtgtcaaat actttgagca gtggtcagag tcagatcaag tggaatttgt ggaacatctt    360

atatcccaaa tgtgtcatta ccaacatggg cacataaact cgtatcttaa acctatgttg    420

cagagagatt tcataactgc tctgccagct cggggattgg atcatatcgc tgagaacatt    480

ctgtcatacc tggatgccaa atcactatgt gctgctgaac ttgtgtgcaa ggaatggtac    540

cgagtgacct ctgatggcat gctgtggaag aagcttatcg agagaatggt caggacagat    600

tctctgtgga gaggcctggc agaacgaaga ggatggggac agtatttatt caaaaacaaa     660

cctcctgacg ggaatgctcc tcccaactct ttttatagag cactttatcc taaaattata     720

caagacattg agacaataga atctaattgg agatgtggaa gacatagtgg cggaggtgga     780

tctggtggcg gaggaagcgg aggtggcgga tctatggcgc ccggagtggc ccgcgggccg     840

acgccgtact ggaggttgcg cctcggtggc gccgcgctgc tcctgctgct catcccggtg     900

gccgccgcgc aggagcctcc cggagctgct tgttctcaga acacaaacaa aacctgtgaa     960

gagtgcctga agaacgtctc ctgtctttgg tgcaacacta acaaggcttg tctggactac    1020

ccagttacaa gcgtcttgcc accggcttcc ctttgtaaat tgagctctgc acgctgggga    1080

gtttgttggg tgaactttga ggcgctgatc atcaccatgt cggtagtcgg gggaaccctc    1140

ctcctgggca ttgccatctg ctgctgctgc tgctgcagga ggaagaggag ccggaagccg    1200

gacaggagtg aggagaaggc catgcgtgag cgggaggaga ggcggatacg gcaggaggaa    1260

cggagagcag agatgaagac aagacatgat gaaatcagaa aaaaatatgg cctgtttaaa    1320

gaagaaaacc cgtatgctag atttgaaaac aactaa                              1356

<210>10

<211>1341

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

atggacccgg ccgaggcggt gctgcaagag aaggcactca agtttatgaa ttcctcagag     60

agagaagact gtaataatgg cgaaccccct aggaagataa taccagagaa gaattcactt    120

agacagacat acaacagctg tgccagactc tgcttaaacc aagaaacagt atgtttagca    180

agcactgcta tgaagactga gaattgtgtg gccaaaacaa aacttgccaa tggcacttcc    240

agtatgattg tgcccaagca acggaaactc tcagcaagct atgaaaagga aaaggaactg    300

tgtgtcaaat actttgagca gtggtcagag tcagatcaag tggaatttgt ggaacatctt    360

atatcccaaa tgtgtcatta ccaacatggg cacataaact cgtatcttaa acctatgttg    420

cagagagatt tcataactgc tctgccagct cggggattgg atcatatcgc tgagaacatt    480

ctgtcatacc tggatgccaa atcactatgt gctgctgaac ttgtgtgcaa ggaatggtac    540

cgagtgacct ctgatggcat gctgtggaag aagcttatcg agagaatggt caggacagat    600

tctctgtgga gaggcctggc agaacgaaga ggatggggac agtatttatt caaaaacaaa    660

cctcctgacg ggaatgctcc tcccaactct ttttatagag cactttatcc taaaattata    720

caagacattg agacaataga atctaattgg agatgtggaa gacatagtgg cggaggtgga     780

tctggtggcg gaggaagcat ggcgcccgga gtggcccgcg ggccgacgcc gtactggagg     840

ttgcgcctcg gtggcgccgc gctgctcctg ctgctcatcc cggtggccgc cgcgcaggag     900

cctcccggag ctgcttgttc tcagaacaca aacaaaacct gtgaagagtg cctgaagaac     960

gtctcctgtc tttggtgcaa cactaacaag gcttgtctgg actacccagt tacaagcgtc    1020

ttgccaccgg cttccctttg taaattgagc tctgcacgct ggggagtttg ttgggtgaac    1080

tttgaggcgc tgatcatcac catgtcggta gtcgggggaa ccctcctcct gggcattgcc    1140

atctgctgct gctgctgctg caggaggaag aggagccgga agccggacag gagtgaggag    1200

aaggccatgc gtgagcggga ggagaggcgg atacggcagg aggaacggag agcagagatg    1260

aagacaagac atgatgaaat cagaaaaaaa tatggcctgt ttaaagaaga aaacccgtat    1320

gctagatttg aaaacaacta a                                              1341

<210>11

<211>1326

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

atggacccgg ccgaggcggt gctgcaagag aaggcactca agtttatgaa ttcctcagag     60

agagaagact gtaataatgg cgaaccccct aggaagataa taccagagaa gaattcactt    120

agacagacat acaacagctg tgccagactc tgcttaaacc aagaaacagt atgtttagca    180

agcactgcta tgaagactga gaattgtgtg gccaaaacaa aacttgccaa tggcacttcc    240

agtatgattg tgcccaagca acggaaactc tcagcaagct atgaaaagga aaaggaactg    300

tgtgtcaaat actttgagca gtggtcagag tcagatcaag tggaatttgt ggaacatctt    360

atatcccaaa tgtgtcatta ccaacatggg cacataaact cgtatcttaa acctatgttg    420

cagagagatt tcataactgc tctgccagct cggggattgg atcatatcgc tgagaacatt    480

ctgtcatacc tggatgccaa atcactatgt gctgctgaac ttgtgtgcaa ggaatggtac    540

cgagtgacct ctgatggcat gctgtggaag aagcttatcg agagaatggt caggacagat    600

tctctgtgga gaggcctggc agaacgaaga ggatggggac agtatttatt caaaaacaaa    660

cctcctgacg ggaatgctcc tcccaactct ttttatagag cactttatcc taaaattata    720

caagacattg agacaataga atctaattgg agatgtggaa gacatagtgg cggaggtgga    780

tctatggcgc ccggagtggc ccgcgggccg acgccgtact ggaggttgcg cctcggtggc    840

gccgcgctgc tcctgctgct catcccggtg gccgccgcgc aggagcctcc cggagctgct    900

tgttctcaga acacaaacaa aacctgtgaa gagtgcctga agaacgtctc ctgtctttgg    960

tgcaacacta acaaggcttg tctggactac ccagttacaa gcgtcttgcc accggcttcc   1020

ctttgtaaat tgagctctgc acgctgggga gtttgttggg tgaactttga ggcgctgatc   1080

atcaccatgt cggtagtcgg gggaaccctc ctcctgggca ttgccatctg ctgctgctgc   1140

tgctgcagga ggaagaggag ccggaagccg gacaggagtg aggagaaggc catgcgtgag   1200

cgggaggaga ggcggatacg gcaggaggaa cggagagcag agatgaagac aagacatgat   1260

gaaatcagaa aaaaatatgg cctgtttaaa gaagaaaacc cgtatgctag atttgaaaac   1320

aactaa                                                              1326

<210>12

<211>891

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

atggacccgg ccgaggcggt gctgcaagag aaggcactca agtttatgaa ttcctcagag     60

agagaagact gtaataatgg cgaaccccct aggaagataa taccagagaa gaattcactt    120

agacagacat acaacagctg tgccagactc tgcttaaacc aagaaacagt atgtttagca    180

agcactgcta tgaagactga gaattgtgtg gccaaaacaa aacttgccaa tggcacttcc    240

agtatgattg tgcccaagca acggaaactc tcagcaagct atgaaaagga aaaggaactg    300

tgtgtcaaat actttgagca gtggtcagag tcagatcaag tggaatttgt ggaacatctt    360

atatcccaaa tgtgtcatta ccaacatggg cacataaact cgtatcttaa acctatgttg    420

cagagagatt tcataactgc tctgccagct cggggattgg atcatatcgc tgagaacatt    480

ctgtcatacc tggatgccaa atcactatgt gctgctgaac ttgtgtgcaa ggaatggtac    540

cgagtgacct ctgatggcat gctgtggaag aagcttatcg agagaatggt caggacagat    600

tctctgtgga gaggcctggc agaacgaaga ggatggggac agtatttatt caaaaacaaa    660

cctcctgacg ggaatgctcc tcccaactct ttttatagag cactttatcc taaaattata    720

caagacattg agacaataga atctaattgg agatgtggaa gacatagtgg atccggctca    780

ggctcaggat caggctcaag agcagagatg aagacaagac atgatgaaat cagaaaaaaa    840

tatggcctgt ttaaagaaga aaacccgtat gctagatttg aaaacaacta a             891

Claims (7)

1.具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：3；

2)序列表中的SEQ ID NO：4；

3)序列表中的SEQ ID NO：5；

4)序列表中的SEQ ID NO：6；

5)序列表中的SEQ ID NO：7。

2.编码权利要求1所述具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：8的DNA序列；

2)序列表中SEQ ID NO：9的DNA序列；

3)序列表中SEQ ID NO：10的DNA序列；

4)序列表中SEQ ID NO：11的DNA序列；

5)序列表中SEQ ID NO：12的DNA序列。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

6.含有权利要求2或3所述基因的宿主菌。

7.一种表达权利要求1所述的具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白的方法，是将权利要求4所述的表达载体导入宿主细胞，表达得到具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白；所述宿主为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌。

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