CN1993467B - 与前列腺疾病相关的基因及其编码的多肽以及它们的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种编码如SEQ ID NO：2所示的多肽(称为CKLFSF5-v1)的多核苷酸、包含该多核苷酸的基因工程载体、宿主细胞以及利用所述宿主细胞生产由本发明的多核苷酸编码的多肽的方法。本发明还涉及一种多肽，其包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明还涉及一种药物组合物，其含有本发明所述的多核苷酸、基因工程载体和/或宿主细胞。本发明还涉及所述多核苷酸在制备预防和/或诊断和/或治疗前列腺疾病的药剂中的应用、和治疗前列腺肿瘤或诊断前列腺肿瘤危险性的方法等。本发明的CKLFSF5-vl基因可作为预防和/或诊断和/或治疗前列腺疾病的新的候选基因，具有重要的潜在应用前景。

Description

与前列腺疾病相关的基因及其编码的多肽以及它们的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域和制药领域，尤其涉及一种与前列腺疾病相关的基因及其编码的多肽，以及它们的应用。 

背景技术

当今男性及其家庭所面临的三种最常见的前列腺疾病是前列腺增生、前列腺癌和前列腺炎。这些疾病对前列腺的影响各不相同。其中前列腺癌是老年男性的易发病，在欧美是男性癌症死亡的主要原因；在我国发病率虽比欧美国家低，但近年来其发病呈上升趋势。关于前列腺癌的治疗，可选用手术、放疗、内分泌治疗和化疗等不同方法。上述疗法对于改善患者远期预后，提高生存率并不理想。近年来，针对前列腺癌的基因治疗逐步显示出其良好疗效，目的基因包括：癌基因、抑癌基因、自杀基因、程序性细胞死亡基因等，最终通过抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞程序性死亡，达到治疗目的。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种多核苷酸。 

本发明的另一目的是提供一种含有本发明的多核苷酸的载体。 

本发明的另一目的是提供一种含有本发明的载体的宿主细胞。 

本发明的另一目的是提供一种利用含有本发明的载体生产多肽的方法。 

本发明的另一目的是提供一种本发明的多核苷酸片段。 

本发明的另一目的是提供一种多肽。 

本发明的另一目的是提供一种药物组合物，该药物组合物含有：本发明的多核苷酸或其药物可接受的盐、和/或包含本发明的多核苷酸的载体，和/或包含本发明的多核苷酸的宿主细胞，以及一种或一种以上药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。 

本发明的另一目的是提供本发明的多核苷酸在制备预防和/或诊断和/或治疗前列腺疾病的药剂中的应用。 

本发明的另一目的是提供一种检测本发明的多核苷酸的表达水平的方法。 

本发明的另一目的是提供检测待测样品中本发明的多核苷酸的表达水平是否变化的方法。 

本发明的另一目的是提供一种单克隆或多克隆抗体，其与本发明的多肽或其具有抗原性的片段特异性结合。 

本发明的另一目的是提供一种治疗前列腺肿瘤的方法。 

本发明的另一目的是提供一种诊断前列腺肿瘤的方法。 

本发明提供一种多核苷酸，该多核苷酸包含： 

(1)编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多核苷酸；或 

(2)与(1)具有至少90％同源性的多核苷酸，该多核苷酸编码的多肽与(1)编码的多肽具有相同的功能。 

如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列为趋化素样因子超家族(chemokine-like factorsuper family)的一个成员，本文定义为CKLFSF5-v1，全长156个氨基酸。prosite计算机软件分析，其具有4个跨膜区，分别位于氨基酸残基35-56，60-82，95-114，119-136。 

本发明的多核苷酸序列可以只编码SEQ ID NO：2所示的多肽，也可以在上述多肽的编码序列的基础上，增加非编码序列，例如内含子、编码序列5′或3′端的非编码序列等。本发明的多核苷酸序列最好是以分离形式提供的。本发明的多核苷酸是“分离”形式的，其不仅已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开，而且已从天然状态下位于其两侧的序列分离出来。 

本发明的多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA，DNA可以是双链或是单链形式，单链DNA可以是编码链或是非编码链(反义链)。本发明所述的反义链可以为如SEQ ID NO：1所示的序列的互补序列。本领域普通技术人员已知，反义链或者其一部分(反义寡核苷酸)可用于抑制细胞内本发明CKLFSF5-v1的表达。本发明的CKLFSF5-v1的核苷酸序列可以来自任何物种，特别是哺乳动物，包括牛、羊、猪、鼠、马，优选人类。 

本发明还包括与编码CKLFSF5-v1的多核苷酸具有至少70％，至少80％，优选至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，更优选至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，进一步优选至少99％，最优选至少99.5％同源性或同一性的多核苷酸序列。这样的序列可以是天然存在或人工产生的，可以包括CKLFSF5-v1多核苷酸序列的等位基因变异体、也可以包括CKLFSF5-v1多核苷酸序列中碱基的缺失、插入及置换。这样的序列编码的多肽可以在功能上与本发明的CKLFSF5-v1相同、相似、或不同，但最好是编码与CKLFSF5-v1生物学活性基本相同的多肽。 

本发明多核苷酸优选包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。其中如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列来源于人前列腺癌cDNA文库，全长988个核苷酸，其包含编码 CKLFSF5-v1多肽的序列(即编码序列(CDS)或完整开放读码框架(ORF)：核苷酸191-661)和5′非编码区(核苷酸1-190)及3′非编码区(核苷酸662-988)。或者，更优选一种核苷酸序列，其只包含编码CKLFSF5-v1多肽的序列，例如SEQ ID NO：1所示的编码序列：核苷酸191-661。本发明如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列在Genbank中的登录号为：AF479262。本发明的基因，或者各种DNA片段的核苷酸序列可以用常规方法，如双脱氧链终止法(Sanger等人，PNAS，1977，74：5463-5467)测定。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。 

本发明还提供一种含有编码本发明CKLFSF5-v1多肽的多核苷酸的基因工程载体。所述基因工程载体可以是普通载体或表达载体。具体地说，适用于原核细胞的市售表达载体一般均带有可选择标志和细胞复制原点，带有lacI、T7、λPL和trp等细菌启动子，以及已知克隆载体pBR322(ATCC37017)的其他遗传元件。这样的市售载体包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)。可根据所选用的适当启动子和待表达的结构基因序列来选择衍生于pBR322的适当载体。GST原核表达系统也可用于本发明。适用于真核细胞的载体带有真核细胞启动子如CMV、SV40等，这样的载体包括pMT-hIL-3(马大龙，狄春辉，庞健等(1991)高技术通讯11：26-29)、pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)，以及pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)。在本发明的一个实施方式中(参见实施例1)，本发明的CKLFSF5-v1的多核苷酸序列是利用将PCR产物克隆至pGEM-T Easy质粒(Promega)中，获得测序质粒pGEM-T Easy-CKLFSF5-v1；在本发明的另一实施方式中(参见实施例2)，构建本发明携带CKLFSF5-v1的真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(-)-CKLFSF5-v1。 

本发明的载体可以是质粒、粘粒，还可以是病毒载体。许多基于病毒的系统已用作基因递送。例如，逆转录病毒系统，代表性的逆转录病毒载体包括但不限于美国专利第5,219,740号描述的LHL、N2、LNSAL、LSHL和LHL2载体，这些载体已全部引入本文作为参考。逆转录病毒载体可以使用本领域熟知的技术构建。参见，例如，美国专利第5,219,740号；Mann等，(1983)Cell 33：153-159。另外，病毒载体还可以例如是腺病毒载体系统。人的腺病毒是双链的DNA病毒，通过受体介导的内吞作用进入细胞。因为腺病毒可将自身的基因组递送到细胞核中，并且高效率地复制，所以本发明将腺病毒作为表达和传递治疗基因的主要载体，并证明其为有效的携带本发明的多核苷酸的载体。目前可将腺病毒分为三个属，进一步可分为6个种(或称为亚属或亚群)，编号从A到F。主要基于免疫学标准的人血清型的划分，已经由于历史原因而成为腺病毒分类的基础( et al.，1999； Lukashok & Horwitz，1998；Mautner，1989)。因为他们容易生长和操作，并且在体内和体外表现出宽阔的宿主范围，例如，腺病毒可以感染人的造血、淋巴和骨髓起源的细胞。此外，腺病毒可以感染静态和复制的靶细胞。不像逆转录病毒整合进入宿主基因组之内，腺病毒在染色体外存留，因此将和插入突变关联的危险减到最小。腺病毒容易以高的滴度产生并且是稳定的，以至于它可以被纯化和储存。甚至在有复制能力的情况下，腺病毒仅仅引起低水平的发病率并且不与人的肿瘤相关联。因此，本发明优选腺病毒载体。对于腺病毒载体的描述和它们的用途，参见，例如，Haj-Ahmad和Graham(1986)J.Virol.57：267-274；Bett等，(1993)J.Virol.67：5911-5921；Mittereder等，(1994)Human GeneTherapy 5：717-729；Seth等，(1994)J.Virol.68：933-940；Barr等，(1994)Gene Therapy1：51-58；Berkner，K.L.(1988)BioTechniques 6：616-629；Rich等，(1993)Human GeneTherapy 4：461-476。在本发明的实施方式中(参见实施例10)，采用腺病毒为载体。腺相关病毒载体(AAV)也可以用来施用本文描述的多核苷酸序列。AAV载体可以来自任何AAV血清类型，包括但不限于，AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7等。 

本发明同时提供一种含有本发明的载体的宿主细胞，该宿主细胞可以用于表达本发明多肽，所述宿主包括但不限于：原核宿主，诸如大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等；真核宿主，诸如：酵母属、曲霉属、昆虫细胞如果蝇S2和草地夜蛾Sf9，动物细胞如CHO、COS(猴肾成纤维细胞系，Gluzman(Cell 23：175，1981)人类细胞系如PC-3细胞系，DU145细胞系及其它能表达相容载体的细胞系。本发明的宿主细胞也可以是来自待治疗个体自身并回输给该个体的细胞。本领域技术人员周知将含有本发明的多核苷酸的构建体导入上述宿主细胞的方法，包括但不限于：病毒感染、氯化钙介导的转化、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔(电击)、显微注射、粒子轰击法或基因枪方法(Sambrook，J.(1989)，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press；Plainview，N.Y.；Ausubel，F.M.(1989)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.；Hobbs，S.等人，McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992)，McGraw Hill，N.Y.191-196；Engelhard，E.K.等人，PNAS，91：3224-3227；Logan，J.等人，PNAS，81：3655-3659)。在适当的培养条件与培养基中培养经转化的宿主菌株或细胞，使其生长到恰当的细胞密度之后，用适当的方法(例如温度转变或化学药品诱导)诱导所选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。针对不同的宿主菌株或细胞以及所表达的目的多肽的性质选择相应的培养条件和培养基在本领域技术人员知识范围之内。在本发明的一个实施方式中(参见实施例2)，采用的大肠杆菌XL-1Blue菌作为宿主细胞，在本发明的另一实施方式中(参见实施例3、10)，采用PC-3细胞(ATCC-CRL-1435)、DU145细胞(ATCC-HTB-B1)作为宿主细胞， 可以直接利用腺病毒感染的方法进行转化或可以利用电击法进行转化。 

本发明还提供一种生产多肽的方法，其包括以下步骤： 

(1)在适于表达的条件下，培养含有编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞； 

(2)从所述细胞培养物中获得多核苷酸编码的多肽。 

具体地说，在转化宿主细胞并在被转化的宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法(如温度变动或化学特质诱导)诱导启动子，然后继续培养。培养完成后，可用离心法收集细胞，并用任何已知的方法，如冻融法、超声处理法、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。可以用各种已知的方法从宿主细胞培养物中回收和纯化本发明的CKLFSF5-v1的多肽或其片段或融合多肽，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取法、超滤法、离子交换层析法、磷酸纤维层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法及高压液柱层析法。 

本发明CKLFSF5-v1多核苷酸序列的片段也应包含在本发明范围内，这些多核苷酸片段为本发明多核苷酸的至少10个，例如至少20个，至少30个，至少50个连续核苷酸序列的片段。这些片段可以用作引物或者杂交探针，用于检测编码本发明的多核苷酸序列。此外，本发明的多核苷酸的片段，也可以是如SEQ ID NO：1所示的多核苷酸或其互补序列的一部分，例如，小分子干扰核糖核酸(iRNA)或反义寡核苷酸可用于抑制细胞内本发明CKLFSF5-v1的表达。 

另一方面，本发明提供一种多肽，该多肽包含： 

(1)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或 

(2)与(1)具有至少90％同源性的多肽，该多肽的功能与(1)的功能相同。 

本发明还包括与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少70％，至少80％，优选至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，更优选至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，进一步优选至少99％，最优选至少99.5％同源性或同一性的多肽。其中如SEQ ID NO：2所示序列全长156个氨基酸。prosite计算机软件分析，其具有4个跨膜区，分别位于氨基酸残基35-56，60-82，95-114，119-136。 

本发明CKLFSF5-v1多肽可以是天然的、合成的、半合成的、或者重组产生。本发明CKLFSF5-v1多肽可按常规的生物工程方法由宿主细胞中的重组DNA序列编码产生多肽产物(具体参见实施例1)。也可按照Steward和Young(Steward，J.M.和Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd Ed.，Pierce Chemical Company，Rockford，I11.，(1984))描述的方法用Applied Biosystem合成仪或PioneerTM肽合成仪按固相化学技术合成，或者可使用衍生于本发明的DNA构建体的mRNA，在无细胞翻译系统中产生所需的多肽。 

本领域普通技术人员已知，本发明所述的多肽可以同其它的多肽或多肽的编码序列形成融合多肽。其它多肽或多肽的编码序列一般是已知的，有些可以以载体形式购买得到，或者可以按常规方法合成或从已知生物体中克隆得到。 

本发明提供一种药物组合物，其含有本发明治疗有效量的多核苷酸、载体、宿主细胞；和必要时药学上可接受的载体或赋形剂。 

在所述药物组合物中，可以含有本发明治疗有效量的CKLFSF5-v1多核苷酸、含有其的载体、含有其的宿主细胞，也可以含有本发明的多核苷酸的药物可接受的盐。“药物可接受的盐”指适于与人或动物的组织接触，而无过多的毒性、刺激、变态反应等的盐。本发明的药物可接受的盐是本领域药剂学常规组分。这种盐可以在本发明多核苷酸的最终分离和纯化的过程中制备，也可以将多核苷酸与适当的有机或无机酸或碱反应单独制备。药学上可接受的载体或赋形剂指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料。 

本发明还提供所述多核苷酸在制备预防和/或诊断和/或治疗前列腺疾病的药剂中的应用。 

本发明人通过大量的实验，以充分地证据证明本发明的多核苷酸可以用于预防和/或诊断和/或治疗前列腺疾病，尤其可以用于预防和/或诊断和/或治疗前列腺肿瘤，例如前列腺增生或前列腺癌。在本发明的具体实施方案中，利用RT-PCR方法和免疫组织化学方法检测，均发现CKLFSF5-v1在正常前列腺中高表达，而在前列腺肿瘤组织中不表达或表达量低，二者具有显著差异。在此基础上，以充分的实验证据证明了本发明CKLFSF5-v1具有使肿瘤细胞发生增殖抑制、迁移能力降低、对细胞外基质粘附能力降低等功能。 

在直接反映细胞的增殖的[³H]-TdR掺入实验中，三个CKLFSF5-v1/PC-3克隆的[³H]-TdR掺入值普遍低于空载体对照，结果具有统计学意义(P＜0.05)，具体参见实施例4。 

肿瘤细胞的侵袭性生长与其迁移能力密切相关，PC-3细胞是来源于前列腺癌骨转移部位的肿瘤细胞系，具有很强的迁移及浸润能力。CKLFSF5-v1/PC-3的三个克隆，细胞迁移能力比空载体的两个克隆及野生型PC-3细胞均明显降低，发生迁移的细胞数量明显减少，结果具有统计学意义(P＜0.05)，具体参见实施例5。 

粘附实验(参见实施例6)用于检测细胞对胞外基质的粘附能力，稳定表达CKLFSF5-v1的PC-3细胞，对纤粘连蛋白(Fibronectin，FN)和层连粘蛋白(Laminin，LN)的粘附能力降低，结果具有统计学意义(P＜0.05)。 

从上述功能研究可以看出，在前列腺肿瘤细胞中超表达CKLFSF5-v1，可以使肿瘤细胞发生增殖抑制、迁移能力降低、对细胞外基质粘附能力降低等良性化改变，说明在前 列腺癌细胞中恢复CKLFSF5-v1的表达，可以抑制其恶性行为。而且，对于腺病毒介导的CKLFSF5-v1，其同样具有使肿瘤细胞发生增殖抑制(实施例11)、对细胞外基质粘附能力降低(实施例12)、迁移能力降低(实施例13)等良性化改变而且效果更明显。尤其重要的是，在动物实验中，腺病毒介导的CKLFSF5-v1过表达能抑制前列腺癌细胞系(例如PC-3细胞，DU145细胞)在裸鼠体内的成瘤(实施例14)。对前列腺疾病细胞系的上述作用显示本发明的CKLFSF5-v1基因可作为治疗和/或预防和/或诊断前列腺疾病的新的候选基因，具有重要的潜在应用前景。本发明的多核苷酸在制备预防和/或诊断和/或治疗前列腺疾病的药剂中具有重要应用，尤其在预防和/或诊断和/或治疗前列腺肿瘤中具有重要应用。 

本发明还提供一种检测本发明多核苷酸表达水平的方法，该方法为利用RT-PCR方法检测本发明的CKLFSF5-v1多核苷酸在核酸水平的表达水平；或利用CKLFSF5-v1特异性单克隆或多克隆抗体检测所述多核苷酸在蛋白质水平的表达水平。 

可以利用本领域已知的任何方法检测本发明的核苷酸在核酸水平的表达水平，例如经与用放射性同位素标记的反义RNA或DNA探针与扩增后的DNA序列杂交，这样可根据放射性的有无及强度来定性或定量检测CKLFSF5-v1的表达水平。也可以采用非放射性标记物例如生物素、异羟洋地黄毒苷配基、二硝基苯甲醛、光生物素、乙酰氨基芴等。当上述方法与PCR(聚合酶链式反应)方法结合后，其检测的灵敏度和特异性显著提高，也可使用衍生于PCR方法检测，例如反转录PCR(RT-PCR)。反转录PCR不仅可以检测DNA，也能对RNA进行分析和研究。反应的第一步是提取总RNA，加入一个与mRNA 3’端互补的引物，在反转录酶作用下合成cDNA；第二步是以cDNA为模板，再加入与cDNA互补的另一引物(两引物应位于不同的外显子上，以避免基因组DNA的污染)进行PCR扩增。在本发明的一个优选实施方式中，提供一种利用半定量RT-PCR的方法检测本发明的多核苷酸CKLFSF5-v1在核酸水平的表达水平。作为选择，可以原位直接在从活组织检查或切除术得到的患者组织的组织切片(固定和/或冰冻)上来检测本发明CKLFSF5-v1多核苷酸的表达，此时不需要纯化核酸。这些分析技术包括DNA或RNA印迹分析、单链构象多态性分析、原位杂交分析以及聚合酶链反应分析。这些分析既可揭示CKLFSF5-v1表达模式的定量方面的情况，也可揭示CKLFSF5-v1表达和/或组合物的定性方面的情况。例如可以采用Southern杂交分析检测任何方法检测本发明的多核苷酸在核酸水平的表达水平。Southern杂交的主要方法是：用一种或多种限制酶消化基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离所得的片段，随后使DNA在原位发生变性，并从凝胶转移到一固相支持体(通常是硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。将DNA转移至固相支持体的过程中，DNA片段的相对位置保持不变，用放射性标记的DNA或RNA与固着 于滤膜的DNA杂交，经放射性自显影确定与探针互补的电泳条带的位置，从而确定待测多核苷酸的表达水平。 

也可以在蛋白质水平检测所述的多核苷酸的表达水平。检测方法也可以采用本领域已知的方法，例如利用本发明CKLFSF5-v1多肽的特异性单克隆抗体或多克隆抗体利用直接或间接酶联免疫吸附试验(直接或间接ELISA法)、免疫荧光法、Western Blot等检测。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horserad-ish Peroxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatease，AP)。也可以使用葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。本领域普通技术人员已知，针对不同的酶，可使用不同的底物，HRP作用的底物包括，但不限于邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS等。免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。Western Blot是检测基因能否有效表达及表达活性的常用方法。该法常通过聚丙烯酰胺凝胶电泳区分不同组分，并转移至硝酸纤维素膜上，通过特异性试剂(例如特异性抗体)作为探针对表达产物进行检测。 

本发明提供一种检测待测样品中本发明所述的多核苷酸的表达水平是否变化的方法，该方法包括： 

(1)检测待测样品中所述多核苷酸的表达水平； 

(2)将待测样品中所述多核苷酸的表达水平与正常样品的多核苷酸的表达水平进行比较； 

(3)确定待测样品中多核苷酸的表达水平是否变化。 

所述待测样品可以从来自受试者的细胞获得，如来自血液、尿、唾液、胃液、头发，活组织检查和尸体解剖材料的细胞。优选来自前列腺活组织的细胞。所述正常样品可以从已知未患病的正常人的细胞获得，该细胞应与待测样品细胞的组织来源一致；正常样品的多核苷酸的表达水平可以是从所述正常人的细胞获得的具有统计学意义的多核苷酸的表达水平。其中所述检测待测样品中多核苷酸水平的方法可以为上述任何检测方法，优选利用RT-PCR检测所述多核苷酸在核酸水平的表达水平；或利用特异性单克隆或多克隆抗体检测所述多核苷酸在蛋白质水平的表达水平。 

本发明还提供对本发明CKLFSF5-v1多肽或其片段具有特异性的多克隆和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里所述的“特异性”是指抗体能结合于本发明的CKLFSF5-v1基因产 物或片段。优选那些能与本发明的CKLFSF5-v1的基因产物结合但不识别并不与其它非相关抗原分子结合的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制本发明CKLFSF5-v1多肽基因产物的抗体，也包括那些并不影响本发明CKLFSF5-v1多肽功能的抗体。上述抗体不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。 

本发明的抗体可以通过本领域普通技术人员已知的各种方法来制备。例如，纯化的本发明CKLFSF5-v1多肽基因产物或其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。在本发明的一个实施例(参见实施例7)中，提供一种本发明具有抗原性的片段：N-IYRTE MAPGASQGDQQ-C(SEQ ID NO：2的氨基酸序列141-156)。本发明的抗体优选单克隆抗体，其可利用杂交瘤技术制备(见Kohler等人，Nature 256：495；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T cellHybridaomad，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的各类抗体可以利用本发明的CKLFSF5-v1基因产物或其片段或功能区，通过常规免疫技术获得，这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与本发明CKLFSF5-v1多肽的基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如，E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的多肽或多肽片段)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。 

本发明还提供了一种治疗前列腺疾病的方法，该方法包括给病人施用治疗有效量的本发明的多核苷酸或其药物可接受的盐、和/或本发明的载体、和/或本发明的宿主细胞。施用本发明的多核苷酸或其药物可接受的盐、和/或本发明的载体、和/或本发明的宿主细胞的方法可以采用本领域已知的任何方法，例如包括但不限于，注射、灌注、口服等。所述方法适合治疗前列腺疾病，更适合治疗前列腺肿瘤，例如前列腺癌和前列腺增生；最适合治疗前列腺癌。 

本发明还提供一种诊断前列腺肿瘤危险性的方法，该方法包括： 

(1)检测待测个体的前列腺组织中本发明的多核苷酸的表达水平； 

(2)将(1)所述多核苷酸的表达水平与正常个体前列腺组织中的多核苷酸的表达水平进行比较； 

前列腺组织中多核苷酸的表达水平在统计学上显著低于正常个体的前列腺组织中多核苷酸的表达水平的个体患前列腺肿瘤的危险性增高。所述方法尤其适于诊断前列腺癌的危险性。 

附图说明

图1显示PC-3/CKLFSF5-v1细胞克隆的筛选和鉴定。其中，图1A为RT-PCR法检测结果，图1B为Western印迹检测结果。 

图2显示细胞的[³H]-TdR掺入。 

图3显示迁移实验结果。 

图4显示粘附实验结果统计。其中，图4A为对纤粘连蛋白(FN)粘附能力；图4B为对层粘连蛋白(LN)的粘附能力。 

图5为CKLFSF5-v1一级结构生物信息学分析图。 

图6显示ELISA检测抗CKLFSF5-v1多克隆抗体效价。 

图7显示Western blot检测抗CKLFSF5-v1多克隆抗体特异性。 

图8显示RT-PCR检测CKLFSF5-v1的表达。 

图9为免疫组织化学方法检测CKLFSF5-v1的表达。其中，A、B为正常前列腺；C、D为高分化的前列腺癌；E、F为低分化的前列腺癌。 

图10为Western b1ot检测腺病毒介导的CKLFSF5-v1在肿瘤细胞内的表达，其中，A为在PC-3细胞中的表达，B为DU145细胞中的表达。 

图11为MTT法检测Ad-CKLFSF5-v1感染后细胞的增殖。其中，A为PC-3细胞；B为DU145细胞。 

图12为腺病毒介导的CKLFSF5-v1超表达抑制肿瘤细胞对细胞外基质的粘附作用。其中，A为PC-3细胞；B为DU145细胞。 

图13为腺病毒介导的CKLFSF5-v1超表达抑制肿瘤细胞的迁移能力。其中，A为PC-3细胞；B为DU145细胞。 

图14为腺病毒介导的CKLFSF5-v1超表达抑制肿瘤细胞的体内成瘤(ex vivotumorigenesis)。其中，A为PC-3细胞，B为DU145细胞。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

实施例1、全长cDNA的克隆化和特性分析 

1、CKLFSF5-v1全长cDNA的EST拼接 

利用CKLF2(Genbank登记号：AF135380)多肽序列对多肽数据库(NCBI的blastp)和人的表达序列标签(Expression Sequence Tag，简称EST)进行数据检索和同源性比较，发现多组EST序列(BF530674，BF346190，AI147740，AA452430，AI553750，AI567497，AW296102，AA452257，AI471151)，通过EST Assembly machine(网址为http://www.tigem.it)进行EST拼接，形成重叠群(contig)再次进行BLAST拼接，找到完整的读码框架。 

2、CKLFSF5-v1的cDNA克隆化 

利用引物：上游引物：GCCTCCATCTCTGCCTACATG(SEQ ID NO：3) 

下游引物：GGCTCCACTGTCCTCTCTGC(SEQ ID NO：4) 

对前列腺癌的单链cDNA文库(购自Clontech)，进行PCR扩增，(94℃，5分钟；94℃，20秒，58℃，20秒，72℃，30秒，35循环；72℃，7分钟)。纯化PCR产物，克隆至pGEM-TEasy载体中(Promega)，连接产物转化XL-1 Blue菌，用蓝白斑筛选阳性克隆获得pGEM-T-Easy-CKLFSF5-v1。pGEM-T-Easy-CKLFSF5-v1测序质粒用Tip-20Mini-preparation试剂盒(Qiagen)进行纯化，用3100测序仪进行DNA序列分析，证明EST拼接正确。 

实施例2、CKLFSF5-v1真核表达质粒pcDNA3.1/Myc-HisB(-)-CKLFSF5-v1的质粒构建 

1、EcoRI酶切CKLFSF5-v1的测序质粒pGEM-T easy-CKLFSF5-v1，释放CKLFSF5-v1的完整ORF(开放读码框架，即SEQ ID NO：1所示序列的191-661)； 

2、电泳(垂直板蛋白电泳装置，购自美国Bio-Rad公司)，回收、纯化CKLFSF5-v1片段，连接至EcoRI，CIAP处理的pcDNA3.1/Myc-HisB(-)载体(购自Invitrogen公司)中，获得真核表达质粒pcDNA3.1/Myc-HisB(-)-CKLFSF5-v1； 

3、连接产物转化大肠杆菌XL-1 Blue，挑单克隆菌落，提取质粒，用载体多克隆位点上游的T7引物(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’(SEQ ID NO：5))和CKLFSF5-v1的下游引物(即SEQ ID NO：4)进行PCR筛选正向插入的克隆，测序验证后，以Qiagen Tip 100提取重组质粒，用于瞬时转染。 

实施例3、细胞的稳定转染和单细胞克隆的筛选 

1、PC-3细胞(ATCC号：CRL-1435)是来源于人前列腺癌骨转移腺癌的传代细胞系，以10％FCS，RPMI 1640(4.5g/L葡萄糖，4mM L-谷氨酸(L-glutamine)，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)(购自Invitrogen公司)培养。 

2、PC-3细胞在转染前一天以1-2×10⁵/ml的密度接种于100mm细胞培养皿中，18-24小时以后，消化液(胰蛋白酶+EDTA)消化细胞，无血清RPMI 1640洗细胞3遍，调细胞密度为6-10×10⁶/ml，300μl/样品。 

3、线性化质粒量为5μg，采用2mm电转杯，140v，20ms。 

4、电击后，室温静置5-10分钟，将细胞以1×10⁵/100mm dish铺碟。 

5、36小时后，加入800ug/ml的G418(购自Invitrogen公司)进行筛选。筛选过程持续16天，中间每3天更换一次新鲜培养基。 

6、2周以后，细胞克隆形成，挑取单个细胞克隆进行培养，建立稳定高表达CKLFSF5-v1的单克隆PC-3细胞株。 

克隆筛选过程中，随机挑选10个pcDNA3.1/Myc-HisB(-)/PC-3的单细胞克隆，分别命名为5B1至5B10，10个克隆顺利获得，在后继的实验中，随机挑选5B1、5B2这两个载体克隆作为对照。同时随机挑选12个CKLFSF5-v1/PC-3的单细胞克隆，分别命名为5A1至5A12，其中4个克隆(5A1，5A6，5A9，5A11)未能成功增殖，1个克隆(5A3)污染，所余7个克隆以半定量RT-PCR和Western印迹分析CKLFSF5-v1的表达(方法见下)： 

a)RNA提取和半定量RT-PCR 

利用TRIZOL^TM试剂提取细胞总RNA，利用Invitrogen公司的SuperScript II试剂盒合成单链cDNA。利用以下引物进行PCR扩增： 

上游引物：GCCTCCATCTCTGCCTACATG(SEQ ID NO：3)， 

下游引物：GGCTCCACTGTCCTCTCTGC(SEQ ID NO：4)。 

PCR条件为：94℃，5分钟；94℃，20秒，56℃，20秒，72℃，30秒，35循环；72℃，7分钟。纯化PCR产物，3100测序仪进行DNA序列分析，证明PCR产物的正确性。 

b)Western Blot方法 

收取全细胞裂解液，将蛋白进行12.5％SDS-PAGE，按照常规方法在Bio-Rad电转移系统中将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用5％脱脂奶粉/0.1％TBS-T在室温封闭1h，加入用5％脱脂奶粉/0.1％TBS-T进行1∶2000稀释后的多克隆抗体(制备方法参见实施例7)，室温作用2h，0.1％TBS-T洗膜3次，每次5-10min，随后加入IRDye800标记的anti-chickenIgY二抗，室温避光反应1h，0.1％TBS-T洗膜3次后，用 Infrared Imaging System观察结果。 

结果：半定量RT-PC检测结果(如图1A所示)和Westeren blot的检测结果(图1B所示)表明，克隆5A2、5A4、5A10能够稳定高表达CKLFSF5-v1。 

实施例4、细胞增殖指标的测定 

1、方法：[³H]-TdR掺入的测定 

将稳定转染的细胞以2500细胞/孔的密度接种于96孔板，48小时后，加入[³H]-TdR(购自Amersham Biosciences公司)，浓度为1μCi/ml，继续培养6小时后，收集细胞至96-孔Filtermat上，MicroBeta Windows Workstation(Wallac)测定[³H]-TdR的掺入情况。 

2、结果：CKLFSF5-v1的过量表达抑制了细胞的增殖 

如图2所示，[³H]-TdR掺入实验表明，三个CKLFSF5-v1/PC-3克隆的[³H]-TdR掺入值普遍低于空载体对照，结果具有统计学意义(P＜0.05)。 

实施例5、迁移试验(Migration assay) 

1、方法：采用Boyden小室(NP公司)法进行迁移实验。用NIH 3T3条件培养基(由对数生长期的NIH 3T3细胞(ATCC number：CRL-1658)用无血清DMEM培养基培养24小时获得)作为趋化物(chemoattractant)，采用8μm孔径的PVPF膜。消化液消化收获对数生长期的细胞，0.1％BSA/RPMI 1640洗细胞2遍，调整细胞密度至5×10⁵/ml，50μl/孔，每种细胞3个平行复孔。37℃，5％CO₂孵育24小时后，收膜，甲醇固定细胞，用棉签轻轻刮去上层未迁移的细胞，HE染色后在光学显微镜下观察。每孔随机选取3个高倍镜视野进行计数，将每种细胞3孔9个高倍镜视野的计数值取算术平均数进行统计。 

2、结果：CKLFSF5-v1的过量表达抑制了细胞的迁移能力 

肿瘤细胞的侵袭性生长与其迁移能力密切相关，PC-3细胞是来源于前列腺癌骨转移部位的肿瘤细胞系，具有很强的迁移及浸润能力。如图3所示，CKLFSF5-v1/PC-3的三个克隆，细胞迁移能力比空载体的两个克隆及野生型PC-3细胞(PC-3wt)均明显降低，发生迁移的细胞数量明显减少，结果具有统计学意义(P＜0.05)。 

实施例6、粘附实验(Adhesion Assay) 

1、方法：分别检测细胞对纤粘连蛋白(Fibronectin，FN)和层粘连蛋白(Laminin，LN)两种不同细胞外基质的粘附能力，二者采用不同的方法包被。对于层粘连蛋白，实验前一天，分别用25μg/ml和50μg/ml层连粘蛋白(LN)(购自BD公司)于4℃过夜包被96孔板，实验前用PBS洗板后，再用1％BSA/PBS于室温封闭30分钟，用前再用大量PBS洗板2次。对于纤粘连蛋白，实验当天，分别用5μg/ml和10μg/ml的纤粘连蛋白(FN)(购自BD公司)于室温包被96孔板1小时，PBS洗板后，用1％BSA/PBS于室温封闭30分钟，用前再用大量PBS洗板2次。以多聚赖氨酸(poly-L-lysine，PLL)作为阳性对照，于室温包被96孔板5分钟，晾干后备用。调细胞密度至5×10⁵细胞/ml，100μl/孔，每种细胞设8 个复孔。加入细胞后，于37℃，5％CO₂孵育10分钟后，PBS 100μl/孔洗板4次，3.7％甲醛/PBS室温固定10分钟后，直接计数；或结晶紫室温染色10分钟，大量PBS洗板后，1％SDS裂解细胞，ELISA Reader 570nm测量光密度值。 

2、结果：CKLFSF5-v1的过量表达降低了PC-3细胞对纤粘连蛋白(Fibronectin，FN)和层连粘蛋白(Laminin，LN)等细胞外基质的粘附 

粘附实验用于检测细胞对胞外基质的粘附能力，本实施例检测了稳定株细胞对两种胞外基质纤粘连蛋白和层连粘蛋白的粘附能力。统计结果以不同组与阳性对照PLL相比后的百分数表示。如图4所示，稳定表达CKLFSF5-v1的PC-3细胞，对纤粘连蛋白(Fibronectin，FN)和层连粘蛋白(Laminin，LN)的粘附能力降低，结果具有统计学意义(P＜0.05)。其中，在FN(5μg/ml)和LN(50μg/ml)包被浓度下，粘附降低尤为明显。 

实施例7、CKLFSF5-v1多克隆抗体的制备及其鉴定 

1、方法： 

1.1多克隆抗体的制备 

利用DNAStar软件对CKLFSF5-v1蛋白质的一级结构进行生物信息学分析(如图5所示)。 

综合考虑氨基酸组成、疏水性、抗原性、表面暴露性等因素，本发明选取了CKLFSF5-v1羧基端的16个氨基酸(N-IYRTEMAPGASQGDQQ-C)(SEQ ID NO：2的氨基酸序列141-156)合成多肽(图5中黑色标记部分)，偶联KLH(keyhole limpethemocyanin，钥孔蝛血蓝蛋白)后与弗氏完全佐剂混合，免疫鸡，制备多克隆抗体。 

初次免疫用1mg KLH-CKLFSF5-v1完全抗原，每2-3周用0.5mg进行增强免疫。抽取鸡翅根浅表静脉血，制备多克隆抗体，倍比稀释后进行ELISA检测抗体效价，Westernblot检测特异性。 

1.2抗CKLFSF5-v1多克隆抗体的鉴定 

用偶联OVA的CKLFSF5-v1羧基端多肽作为抗原，包被96孔板，进行ELISA检测效价。ELISA实验方法：将OVA偶联的CKLFSF5-v1羧基端多肽用磷酸盐缓冲液稀释至2-5μg/ml，按照100μl/孔的量包被NUNC 96孔酶标板，4℃包被过夜。用PBS-T(0.05％Tween 20)洗涤3次，然后按照200μl/孔的量加入封闭液(3％BSA+PBS)，4℃封闭24-36小时，用PBS-T洗涤3次。将多克隆抗体及正常鸡血清阴性对照，用0.1％BSA/PBS进行1∶500、1∶1000、1∶5000、1∶10000稀释，每孔加入100μl倍比稀释后的样品，每个样品设3个平行复孔，37℃孵育1h。用PBS-T洗涤3次，每孔加入100μl用0.1％BSA/PBS稀释的anti-chicken IgY-HRP-conjugated二抗，37℃孵育1h。用PBS-T洗涤3次，加入100μl OPD显色液，室温避光显色10-15min， 用50μl 2M的硫酸终止反应。在490nm波长下用EL-311SX ELISA Reader读数。 

选取滴度较高的抗体，用pcDNA3.1/Myc-HisB(-)-CKLFSF5-v1瞬时转染真核细胞的全细胞裂解液作为抗原，进行Western blot(具体方法参见实施例3中b)所述的方法)，检测抗CKLFSF5-v抗体的特异性。 

2、结果：ELISA检测抗CKLFSF5-v1多克隆抗体效价结果如图6所示，与阴性对照相比，抗体893和894效价均很高，893滴度达1∶2500，894滴度可达1∶5000。选取滴度较高的抗体894，利用Western blot检测抗CKLFSF5-v1多克隆抗体特异性的结果如图7所示，在各种稀释度下，空载体转染组均未检测到特异的阳性条带，而CKLFSF5-v1转染组均可在17kDa处观察到特异的条带，与预计大小一致。 

实施例8、利用RT-PCR检测CKLFSF5在正常前列腺和PC-3、DU145、LNCaP等前列腺癌来源的细胞系中的表达。 

1、方法： 

利用引物：上游引物：GCCTCCATCTCTGCCTACATG(SEQ ID NO：3) 

下游引物：GGCTCCACTGTCCTCTCTGC(SEQ ID NO：4) 

分别对正常前列腺(购自Clontech)和PC-3细胞、DU145细胞和LNCap细胞(ATCC号：CRL-1740)的单链cDNA文库进行PCR扩增(RNA提取、RT-PCR的具体方法详见实施例3)。纯化PCR产物，3100测序仪进行DNA序列分析，证明PCR产物的正确性。 

2、结果：如图8所示，在正常前列腺文库可获得与预计大小一致的PCR扩增条带，而在PC-3、DU145、LNCaP细胞文库中未见扩增条带(阳性条带)。回收PCR产物，测序证实为CKLFSF5-v1。 

实施例9、免疫组织化学方法检测CKLFSF5-v1的表达 

1、方法：人前列腺正常及肿瘤组织石蜡切片购自西安超英生物芯片公司。二甲苯脱蜡后，逐级用100％-95％-90％-80％-70％的乙醇进行水化，PBS洗后，H₂O₂室温作用10分钟去除内源性过氧化物酶，用柠檬酸缓冲液进行抗原修复，羊血清工作液室温封闭20分钟，然后加入1∶100稀释的抗CKLFSF5-v1多克隆抗体，4℃反应过夜，PBS充分洗后，加入1∶200稀释的二抗，37℃反应40-45分钟，PBS洗，DAB显色，镜下观察。自来水终止反应，苏木精复染细胞核，70％-80％-90％-95％-100％乙醇-二甲苯逐级脱水，树胶封片。 

2、结果：用免疫组织化学方法检测CKLFSF5-v1的表达，如图9所示，在多数正常前列腺组织中，可以见到明确的阳性信号，而在大部分前列腺癌组织，未见阳性信号。用Fisher’s精确双尾法(Fisher’s exact two-tailed test)分析免疫组织化学实验的结果。可以 发现，如表1所示，在前列腺肿瘤组织中CKLFSF5-v1的表达比正常前列腺组织明显降低，阳性率仅为48.39％，而正常前列腺组织中CKLFSF5-v1的表达阳性率为100％，二者具有明显的差异，结果具有统计学意义(p＜0.001)。 

表1免疫组织化学方法检测CKLFSF5-v1表达结果统计 

	阳性(+～++)	阴性(-～±)
			正常前列腺组织(10例)	10例(100％)	0例(0％)
前列腺肿瘤组织(31例)	15例(48.39％)	16例(51.61％)

在上表中，“-～±”信号强度计为阴性；“+～++”信号强度计为阳性。 

实施例10、腺病毒介导的CKLFSF5-v1的表达 

1、方法： 

1)Ad-CKLFSF5-v1病毒的制备： 

AdMax^TM腺病毒表达系统(包括穿梭质粒pDC315、AdMax病毒DNA等)为加拿大Microbix Biosystems Inc.公司产品。用EcoRI酶切穿梭质粒pDC315，将同样用EcoRI酶切处理的CKLFSF5-v1CDS序列克隆至穿梭质粒中，转化大肠杆菌，PCR筛选正相插入的阳性克隆，(上游引物序列为5′ACGTGGGTATAAGAGGCG 3′(SEQ ID NO：6)，下游引物序列为5′GGCTCCACTGTCCTCTCTGC 3′(SEQ ID NO：4)，PCR反应条件94℃，5分钟；94℃，20秒，56℃，20秒，72℃，30秒，30循环；72℃，7分钟)。获得重组质粒pDC315-CKLFSF5-v1，以Qiagen Tip 100纯化重组质粒，与AdMax病毒DNA共转染293细胞出毒后，制备Ad-CKLFSF5-v1重组腺病毒，将不含有插入片段的Ad-null病毒作为对照。 

2)病毒感染细胞 

PC-3及DU145细胞(ATCC号：HTB-B1，用10％FCS/RPMI1640培养)在感染前一天以1×10⁵/ml的密度接种于100mm细胞培养皿中，18-22小时以后，用Ad-CKLFSF5-v1按照不同MOI分别感染细胞。吸去原细胞培养上清，加入4ml新鲜完全培养基，在加入病毒的第一小时里每15分钟轻轻晃动培养皿，一小时后补足培养基至10ml，48小时后进行功能实验。 

3)病毒感染后CKLFSF5-v1表达水平的鉴定 

不同MOI(MOI＝30，60，120，240)感染后48小时收细胞，用实施例2所述的Westernblot检测CKLFSF5-v1的表达水平。 

2、结果：如图10所示，在MOI＝30时未见明确蛋白条带，从MOI＝60起，随病毒剂量的增加，目的蛋白的表达量逐渐增加。 

实施例11、腺病毒介导的CKLFSF5-v1超表达抑制肿瘤细胞的增殖 

1、方法：将分别用上述Ad-CKLFSF5-v1以MOI-120感染PC-3细胞和DU145细胞，将所得的细胞按照2500细胞/孔的密度接种于96孔板中，每种细胞5个平行复孔，连续培养6天。培养期间，每24小时加入MTT(购自Invitrogen公司)，37℃，5％CO₂孵育4-6小时后，加入细胞裂解液，第二日于ELISA Reader(EL-311SX ELISA Reader，购自美国Bio-TEK公司)570nm测量光密度值。将不同组、各时间点结果进行统计后绘制细胞的生长曲线。 

2、结果：与对照组细胞相比，Ad-CKLFSF5-v1感染后，增殖抑制作用非常明显，而在相同培养条件下，对照组细胞生长正常，两组间的差异具有统计学意义(p＜0.05)，参见图11。 

实施例12、腺病毒介导的CKLFSF5-v1超表达抑制肿瘤细胞对细胞外基质的粘附 

1、方法：参照实施例6所述的粘附实验方法，检测Ad-CKLFSF5-v1感染48小时的PC-3细胞和DU145细胞对LN和FN的粘附能力。 

2、结果：与稳定株的结果一致，如图12所示，感染Ad-CKLFSF5-v1后，PC-3和DU145细胞对FN和LN的粘附能力明显降低，结果具有统计学意义(P＜0.05)。 

实施例13、腺病毒介导的CKLFSF5-v1超表达抑制肿瘤细胞的迁移能力 

1、方法：参照实施例5所述的迁移实验方法，检测Ad-CKLFSF5-v1感染48小时的PC-3细胞和DU145细胞的迁移能力。 

2、结果：如图13所示，Ad-CKLFSF5-v1感染后，PC-3和DU145细胞的迁移能力均明显降低，结果具有统计学意义(P＜0.001)。 

实施例14、腺病毒介导的CKLFSF5-v1超表达抑制肿瘤细胞的体内成瘤(ex vivotumorigenesis) 

1、方法：选用SPF(specific pathogen free)级裸鼠，4-6周龄，体重15-16克，每组12只。用Ad-CKLFSF5-v1以MOI＝120分别感染PC-3细胞和DU145细胞，48小时后收获细胞，无血清培养基洗细胞三遍后，调整浓度重悬于无血清培养基，PC-3细胞按1×10⁶(50μl)/位点、DU145细胞按2×10⁶(50μl)/位点裸鼠皮下注射。每只裸鼠左前肢腋下注射Ad-null对照组感染细胞，右前肢腋下注射Ad-CKLFSF5-v1组感染细胞。每3-5天观察成瘤情况，6周后取瘤体。 

2、结果：如图14所示，CKLFSF5-v1超表达明显抑制了PC-3和DU145细胞在裸鼠体内的成瘤能力，12个PC-3/CKLFSF5-v1细胞注射部位和12个DU145/CKLFSF5-v1细胞注射部位均无肿瘤形成，而对照组细胞的所有注射部位全部成瘤。序列表 

<110>北京大学 

<120>与前列腺疾病相关的基因及其编码的多肽以及它们的应用 

<130>GPI05CN0027 

<160>6 

<170>PatentIn version 3.1 

<210>1 

<211>988 

<212>DNA 

<213>智人(Homo sapiens) 

<220> 

<221>CDS 

<222>(191)..(661) 

<400>1 

ggagggccca tctgggcaag gcccccagcg cctgccttct ctcccggggc cctgtgggca     60 

agcctcctgc ttcactttca ggtttctcga agtgccttct tgctcctgtc tgtttcccca    120 

tcctgccaga tttctgtttc tcttgctggg cttttggcag tagggggctg tgttggtggg    180 

ccctacgaag atg ctc agt gct cga gat cgc cgg gac cgg cac cct gag       229 

           Met Leu Ser Ala Arg Asp Arg Arg Asp Arg His Pro Glu 

           1               5                   10 

gag ggg gta gtt gca gag ctc cag ggc ttc gcg gtg gac aag gcc ttc      277 

Glu Gly Val Val Ala Glu Leu Gln Gly Phe Ala Val Asp Lys Ala Phe 

    15                  20                  25 

ctc acc tcc cac aag ggc atc ctg ctg gaa acc gag ctg gcc ctg acc      325 

Leu Thr Ser His Lys Gly Ile Leu Leu Glu Thr Glu Leu Ala Leu Thr 

30                  35                  40                  45 

ctc atc atc ttc atc tgc ttc acg gcc tcc atc tct gcc tac atg gcc      373 

Leu Ile Ile Phe Ile Cys Phe Thr Ala Ser Ile Ser Ala Tyr Met Ala 

                50                  55                  60 

gcg gcg cta ctg gag ttc ttc atc aca ctt gcc ttc ctc ttc ctc tat      421 

Ala Ala Leu Leu Glu Phe Phe Ile Thr Leu Ala Phe Leu Phe Leu Tyr 

            65                  70                  75 

gcc acc cag tac tac cag cgc ttc gac cga att aac tgg ccc tgt ctg      469 

Ala Thr Gln Tyr Tyr Gln Arg Phe Asp Arg Ile Asn Trp Pro Cys Leu 

        80                  85                  90 

gac ttc ctg cgc tgt gtc agt gcc atc atc atc ttc ctg gtg gtc tcc      517 

Asp Phe Leu Arg Cys Val Ser Ala Ile Ile Ile Phe Leu Val Val Ser 

    95                  100                 105 

ttt gca gct gtg acc tcc cgg gac gga gct gcc att gct gct ttt gtt    565 

Phe Ala Ala Val Thr Ser Arg Asp Gly Ala Ala Ile Ala Ala Phe Val 

110                 115                 120                 125 

ttt ggc atc atc ctg gtt tcc atc ttt gcc tat gat gcc ttc aag atc    613 

Phe Gly Ile Ile Leu Val Ser Ile Phe Ala Tyr Asp Ala Phe Lys Ile 

                130                 135                 140 

tac cgg act gag atg gca ccc ggg gcc agc cag ggg gac cag cag tga    661 

Tyr Arg Thr Glu Met Ala Pro Gly Ala Ser Gln Gly Asp Gln Gln 

            145                 150                 155 

ctctggggct acctggctcc taggcccagc cagccagaga ggacagtgga gcccagacac    721 

gtctcttgat tattatagcc cagcgctaaa cccaaccaag cctaaagagt tggctggagt    781 

actgggaatt atcttggagc tgtgtcagga ttggtatcat gaatttgcaa gagggacatg    841 

ggggggggga gggagaaatt gacctagctc ccataattat taaaaaaagg ggcctaatct    901 

caggccatac cacttttaag gctaataggt taataaggga aaggaaaagt tgactgttag    961 

acaaccagat ttttgttata tatccgc                                        988 

<210>2 

<211>156 

<212>PRT 

<213>智人 

<400>2 

Met Leu Ser Ala Arg Asp Arg Arg Asp Arg His Pro Glu Glu Gly Val 

1               5                   10                  15 

Val Ala Glu Leu Gln Gly Phe Ala Val Asp Lys Ala Phe Leu Thr Ser 

            20                  25                  30 

His Lys Gly Ile Leu Leu Glu Thr Glu Leu Ala Leu Thr Leu Ile Ile 

        35                  40                  45 

Phe Ile Cys Phe Thr Ala Ser Ile Ser Ala Tyr Met Ala Ala Ala Leu 

    50                  55                  60 

Leu Glu Phe Phe Ile Thr Leu Ala Phe Leu Phe Leu Tyr Ala Thr Gln 

65                  70                  75                  80 

Tyr Tyr Gln Arg Phe Asp Arg Ile Asn Trp Pro Cys Leu Asp Phe Leu 

                85                  90                  95 

Arg Cys Val Ser Ala Ile Ile Ile Phe Leu Val Val Ser Phe Ala Ala 

            100                 105                 110 

Val Thr Ser Arg Asp Gly Ala Ala Ile Ala Ala Phe Val Phe Gly Ile 

        115                 120                 125 

Ile Leu Val Ser Ile Phe Ala Tyr Asp Ala Phe Lys Ile Tyr Arg Thr 

    130                 135                 140 

Glu Met Ala Pro Gly Ala Ser Gln Gly Asp Gln Gln 

145                 150                 155 

<210>3 

<211>21 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>引物 

<400>3 

gcctccatct ctgcctacat g                                                          21 

<210>4 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>引物 

<400>4 

ggctccactg tcctctctgc                                                            20 

<210>5 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>引物 

<400>5 

taatacgact cactataggg                                                            20 

<210>6 

<211>18 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>引物 

<400>6 

acgtgggtat aagaggcg                                                              18 

Claims (6)

1.编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多核苷酸在制备预防和/或诊断和/或治疗前列腺疾病的药剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述的多核苷酸为如SEQ ID NO：1所示的多核苷酸或如SEQ ID NO：1所示的多核苷酸191-661。

3.如权利要求1或2所述的应用，其中所述的多核苷酸包含于基因工程载体中。

4.如权利要求3所述的应用，其中所述的基因工程载体为质粒或腺病毒载体。

5.如权利要求1或2所述的应用，其中所述的多核苷酸包含于宿主细胞中。

6.如权利要求1所述的应用，其中所述的前列腺疾病为前列腺癌或前列腺增生。

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