CN1985777B - 生物型人工脊髓 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物型人工脊髓，由人工髓质(1)、包裹在人工髓质(1)外的人工软脊膜(2)、固定在人工软脊膜(2)外的螺旋支架(6)、依次包裹在螺旋支架(6)外的人工蛛网膜(3)、包裹在人工蛛网膜(3)外的胶原凝胶层(5)和包裹在胶原凝胶层(5)外的人工硬脊膜(4)组成，人工髓质(1)是由通过非醛类固定剂交联固定和活泼试剂及强氢键试剂去除抗原处理的动物脊髓制成，人工软脊膜(2)、人工蛛网膜(3)及人工硬脊膜(4)分别是由通过非醛类固定剂交联固定和活泼试剂及强氢键试剂去除抗原处理的动物膜组织制成。本发明仿照人体脊髓的组成和结构设计，所有的构件都是天然生物材料制成，生物相容性好，无免疫排异原性。

Description

生物型人工脊髓

技术领域

本发明涉及一种供脊髓损伤者用于脊髓重建的医疗装置，属植入类医疗器械。

背景技术

脊髓损伤常引起瘫痪，是严重伤患之一，虽不马上危及生命，但会令患者终生残废，生不如死。至今未找到有效治疗方法。以往一直认为脊髓神经是不能再生的，脊髓损伤是不治之症。近年来发现，在适宜条件下，包括脊髓神经在内的中枢神经是可以再生的，关键是要有适于神经组织再生和重建的临时性基质和良好的微环境。这里所谓临时性基质就是供神经干细胞以及其分化形成的神经元细胞及神经胶质细胞分裂、增殖、迁移的温床，它可被降解吸收，为神经细胞提供养分。所谓优良微环境是指有利于诱导神经干细胞定向分化为神经元细胞及胶质细胞和促进这些细胞分裂、增殖和迁移的物质环境和新组织生长的空间。但现有技术还没有这样的装置。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物相容性好、可被降解吸收的生物型人工脊髓及其制备方法。

本发明的技术解决方案是：生物型人工脊髓，由人工髓质、包裹在人工髓质外的人工软脊膜、固定在人工软脊膜外的螺旋支架、依次包裹在螺旋支架外的人工蛛网膜、包裹在人工蛛网膜外的胶原凝胶层和包裹在胶原凝胶层外的人工硬脊膜组成，人工髓质是由通过非醛类固定剂交联固定和活泼试剂及强氢键试剂去除抗原处理的动物脊髓制成，人工软脊膜、人工蛛网膜及人工硬脊膜分别是由通过非醛类固定剂交联固定和活泼试剂及强氢键试剂去除抗原处理的动物膜组织制成。

动物组织易被微生物降解或分解，需用固定剂使之交联固定，传统上使用戊二醛作固定剂，有残留毒性，我们选用非醛类固定剂，如环氧化物、二元胺、二异氰酸酯、聚乙二醇或碳化二亚胺，就没有这一缺点，以环氧化物为例，当应用环氧化物来代替醛类作固定试剂时，由于环氧化物很不稳定，易发生开环交联反应，控制其反应条件可使其与胶原蛋白的交联产物很稳定，不轻易降解，只有在再生组织生长、增殖需对其蚕蚀时，分泌出激肽释放酶、纤溶酶、糖皮质激素协同胶原酶作用下，才能将其缓慢分解为多肽及氨基酸，并被吸收利用。这样一种被动式降解与组织的再生是同步的，是最有利于组织的再生性修复的，而且无醛类的残留毒性；根据现代免疫学理论，动物组织的抗原性主要是由蛋白质中某些特殊位置的活性基团及特异构象引起的，这些活性基团主要是-OH，-NH₂，-SH等，而特异构象则主要是由于蛋白质分子螺旋链的某些特殊氢键引起，在处理动物组织时，用一种或多种易与这些基团起反应的活泼试剂(如酸酐、酰氯、酰胺、环氧化物等)与这些基团结合，将其封闭起来，去除其抗原，同时，还应用强氢键试剂(如胍类化合物)，置换引起特异构象的氢键，改变其构象，这样，双管齐下就能有效的消除其抗原性。本发明中的人工髓质是用去抗原的异种脊髓基质制成，无抗原型，生物相容性好，可以作为神经干细胞以及神经元细胞、胶质细胞寄居、分裂、增殖和迁移的优良基质和载体。人工软脊膜、人工蛛网膜和人工硬脊膜是用猪、牛、羊、猴等动物的膜组织经系列生化处理得到的，具有脊髓软、硬脊膜相似的组成和特性，生物相容性好。螺旋支架可以由硬、人工软脊膜或人工蛛网膜裁成细长片条，在人工软脊膜外螺旋盘绕粘贴多层而形成，除对管体起到支撑作用外，所形成的螺旋凹坑，还起到临时性脑脊液通道腔的作用，类似于脊髓蛛网膜下腔的作用那样。胶原凝胶层在植入初期会溶胀形成软滑的凝胶，类似润滑液的作用，植入后较易被降解吸收，既可以为新生组织提供养份，又可为硬膜下腔的形成让出空间。在胶原凝胶中可以加入多肽、透明质酸、硫酸皮质素、肝素等活性物质，以诱导有关组织的生长。

所述人工髓质、人工软脊膜、人工蛛网膜和人工硬脊膜分别由通过偶联剂偶合多肽及糖胺聚糖类活性组分的动物脊髓、动物膜组织构成。考虑到一些膜组织，力学强度还不能满足应用要求，而且在生化处理中常会引起力学性能的损失，所以对用作人工软脊膜、人工硬脊膜及人工蛛网膜的膜材还设计了一个增韧改性处理，就是通过对胶原蛋白分子进行合理接枝，如在胶原蛋白分子中适当接上聚氨酯、聚酰胺、聚酯、聚乳酸、聚羟乙酸等链段的方法，来提高基材的力学强度和韧性，接枝的原料是用它们的预聚体，方法可以选用缩合、引发、辐射等高聚物接枝方法。

所述的多肽之一是由16个赖氨酸(K16)、甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)、脯氨酸(P)及半胱氨酸(C)缩聚而成的，所述的糖胺聚糖是透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素、硫酸乙酰肝素或硫酸角质素。这些多肽或糖胺聚糖对生长因子有广谱粘附和富集作用，能激发未分化细胞定向分化，具有诱导机体组织的再生性修复的功能。

所述的人工软脊膜选用动物的软脊膜、肠膜或者其它经过机械薄化处理的动物膜组织；所述人工蛛网膜、人工硬脊膜选用动物心包膜、膈膜、脂肪网膜、胸膜、腹膜或肠膜按下述步骤制得；所述的螺旋支架材料是由人工软脊膜或人工蛛网膜或人工硬脊膜按一定宽度裁剪成细长片条而成。

本发明的生物型人工脊髓的制备方法包括以下步骤：

(1)、选料：收集新鲜动物的脊髓以及膜组织，对于脊髓剪去全部外膜取髓质，并小心剔除血管，对于膜组织小心修剪去除多余杂质及不规整部分，张力定型；

(2)、碱处理：使用碱溶液浸泡髓质和膜组织；

(3)、脱脂：使用有机溶剂抽提髓质及膜组织中的脂肪及脂溶性杂质；

(4)、交联固定：使用非醛类固定剂交联固定髓质及膜组织中的胶原蛋白分子；

(5)、去除抗原：使用活泼试剂封闭髓质及膜组织的胶原蛋白中引起抗原的特异活性基团-OH，-NH₂，-SH，并用强氢键试剂置换膜材胶原蛋白分子螺旋链中引起特异构象的特殊氢键。

(6)、整体制备：在棒状模具上，用医用胶将相应尺寸的人工软脊膜粘合成管状体；另取上述任一膜材裁成规定宽度的长片条，按一定间距螺旋盘绕粘合在人工软脊膜上，形成螺旋支架；再将人工蛛网膜粘合在螺旋支架的凸梁上形成管状体；取医用胶原溶于水形成的溶胶，涂布于人工蛛网膜上，真空干燥，如此涂布多次，形成胶原凝胶层；凝胶层外包裹人工硬脊膜并粘接成管状体；取出模具，将制好的人工髓质小心填充管心，便得到生物型人工脊髓。

作为一种优化方案，就是在制备人工软脊膜、人工蛛网膜及人工硬脊膜时还经过增韧改性的处理步骤，即使用缩合、引发或辐射接枝的方法，在软脊膜、蛛网膜及硬脊膜的胶原蛋白分子中适当接上聚氨酯、聚酰胺、聚酯、聚乳酸或聚羟乙酸链段，以增加其强度和韧性。

作为另一优化方案，就是对于人工髓质、人工软脊膜、人工蛛网膜及人工硬脊膜，还增加了一个通过偶联剂偶联特定多肽或糖胺聚糖活性组分的处理步骤，即在人工髓质、人工软脊膜、人工蛛网膜及人工硬脊膜的表面上通过偶联剂偶联可粘附生长因子的多肽或糖胺聚糖活性组分。

生物型人工脊髓的制备方法中所使用的碱溶液为NaOH、KOH或Ca(OH)₂溶液。

生物型人工脊髓的制备方法中所述的非醛类固定剂为易与蛋白质分子发生交联反应的试剂如环氧化物、二酰二胺、二异氰酸酯、聚乙二醇或碳化二亚胺试剂中的一种或两种，这里的环氧化物可以是单环氧化物

也可以是双环氧化物

这里R＝C_nH_2n+1-，n＝0-10，还可以是低聚环氧化物如聚环氧丙烷。

生物型人工脊髓的制备方法中所述的活泼试剂可以是小分子有机酸酐、酰氯、酰胺、环氧化物等；强氢键试剂为胍类化合物。

生物型人工脊髓的制备方法中所述的偶联剂为二酰二胺、二酸酐、双环氧化物或其它能与-NH₂，-OH，-COOH等起缩合反应的双官能团试剂。

本发明的优点是：仿照人体脊髓的组成和结构设计，人工髓质类似于人脊髓的髓质(灰质和白质)，它是用去抗原异种脊髓基质，引入可粘附神经干细胞及有关生长因子的活性组分制成，可征集生长因子及神经干细胞，并诱导其定向分化，促进脊髓组织的再生。人工软脊膜类似于脊髓的软脊膜，可透过脑脊液中的营养物质。螺旋支架除起支撑作用外，所形成的螺旋凹坑起到脑脊液流动腔的作用。人工蛛网膜与人工硬脊膜之间留有空间可形成硬脊膜下腔。所有的构件都是天然生物材料制成，生物相容性好，无免疫排异原性，可被降解吸收，可诱导组织再生，从而为脊髓损伤的修复提供良好的基质和微环境。

附图说明

附图1为本发明实施例的结构示意图；

1、人工髓质，2、人工软脊膜，3、人工蛛网膜，4、人工硬脊膜，5、胶原凝胶层，6、螺旋支架。

具体实施方式

实施例：如图1所示，生物型人工脊髓，由人工髓质1、包裹在人工髓质1外的人工软脊膜2、固定在人工软脊膜2外的螺旋支架6、依次包裹在螺旋支架6外的人工蛛网膜3、包裹人工蛛网膜3的胶原凝胶层5和包裹在凝胶层5外的人工硬脊膜4组成。人工髓质1、人工软脊膜2、人工蛛网膜3及人工硬脊膜4分别由通过非醛类固定剂交联固定和活泼试剂及强氢键试剂去除抗原的动物脊髓、动物膜组织制成。其制备步骤为：

一、人工髓质1的制备：取新鲜的猪脊髓，小心剪除其硬脊膜、蛛网膜及软脊膜，取髓质，小心剔除微血管，放入0.2～2％的NaOH溶液中浸泡2小时，取出，用水漂洗三次。取出沥干水分，用有机溶剂抽取其中脂肪。取出，除去溶剂后，用碳链环氧化物与之进行交联固定反应。取出，洗净，冷冻干燥，用乙酸酐或丁酸酐与之反应，封闭抗原基因；再用盐酸胍的Tris缓冲溶液处理，改变引起抗原的特异构象。取出，洗净，用碳化二亚胺(R-N＝C＝N-R)作偶联剂将由16个赖氨酸(K16)、甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)、脯氨酸(P)及半胱氨酸(C)缩聚而成的多肽偶合到人工髓质1的胶原分子上，洗净，置于生理盐水中低温保存备用。

二、人工软脊膜2、人工蛛网膜3和人工硬脊膜4的制备：分别取牛心包、猪心包、猪肠膜或猪隔膜，洗净，小心除去多余组织和杂质，取坚实平整的膜体，洗净，用0.1～2％浓度的KOH溶液浸泡处理2小时。取出，用水漂洗三次以上，取出沥干水分，用有机溶剂抽取其中脂肪及脂溶性杂质。取出，除去溶剂后，用碳链环氧化物与之进行交联固定反应。取出，洗净，冷冻干燥，用乙酸酐或丁酸酐与之反应，封闭抗原基因；再用盐酸胍的Tris缓冲溶液处理，改变引起抗原的特异构象。取出洗净，冷冻干燥，用P₂O₅作脱水缩合剂将聚羟基乙酸的预聚体接枝到膜材的胶原分子上。用碳化二亚胺(R-N＝C＝N-R)作偶联剂将由16个赖氨酸(K16)、甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)、脯氨酸(P)及半胱氨酸(C)缩聚而成的多肽及透明质酸或硫酸软骨素或硫酸皮肤素或肝素或硫酸乙酰肝素或硫酸角质素偶合到上述膜材的胶原分子上，洗净，置于生理盐水中低温保存备用。人工软脊膜2选用最薄渗透性最好的猪肠膜，人工蛛网膜3选用猪心包，人工硬脊膜4选用较厚的牛心包或猪隔膜。

三、生物型人工脊髓的制备：在设定直径的圆棒模具上，用医用胶将相应尺寸的人工软脊膜2边边粘合形成圆管状体。另取上述任一膜裁成宽度为0.5-2.0mm的长片条，用医用胶将长片条按一定间距螺旋盘绕粘合到人工软脊膜2的管壁上，绕粘数层，形成有一定支撑力的螺旋支架6，再用医用胶将人工蛛网膜3粘合到螺旋支架6的凸梁上，自身再边边粘合成圆管状体，即得圆管状体得人工蛛网膜3。另用医用级胶原，用温水溶解，搅匀成溶胶，再均匀涂布于人工蛛网膜3上，真空干燥，如此涂布多次，得胶原凝胶层5，将处理好的牛心包紧紧包裹凝胶层，并边边粘合成圆管状体得到人工硬脊膜4。脱出圆棒模具，小心将制好的人工髓质1充填管心的圆柱腔，必要时加少量医用胶原或医用蛋白胶作赋形剂。充填密度不宜太紧，也不宜太松，以适中为好，填好后冷冻干燥以定型。用生理盐水作保存液密封包装，用钴-60辐射灭菌，即得到产品。

Claims (10)

1.一种生物型人工脊髓，其特征在于：由人工髓质(1)、包裹在人工髓质(1)外的人工软脊膜(2)、固定在人工软脊膜(2)外的螺旋支架(6)、依次包裹在螺旋支架(6)外的人工蛛网膜(3)、包裹在人工蛛网膜(3)外的胶原凝胶层(5)和包裹在胶原凝胶层(5)外的人工硬脊膜(4)组成，人工髓质(1)是由通过非醛类固定剂交联固定和活泼试剂及强氢键试剂去除抗原处理的动物脊髓制成，人工软脊膜(2)、人工蛛网膜(3)及人工硬脊膜(4)分别是由通过非醛类固定剂交联固定和活泼试剂及强氢键试剂去除抗原处理的动物膜组织制成。

2.根据权利要求1所述的生物型人工脊髓，其特征在于：所述人工髓质(1)由通过偶联剂偶合多肽及糖胺聚糖类活性组分处理的动物脊髓制成，人工软脊膜(2)、人工蛛网膜(3)及人工硬脊膜(4)分别由通过偶联剂偶合多肽及糖胺聚糖类活性组分处理的动物膜组织制成，且增加了一个增韧改性步骤。

3.根据权利要求2所述的生物型人工脊髓，其特征在于：所述的多肽之一是由16个赖氨酸(K16)、甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)、脯氨酸(P)及半胱氨酸(C)缩聚而成的，所述的糖胺聚糖是透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素、硫酸乙酰肝素或硫酸角质素。

4.根据权利要求1或2或3所述的生物型人工脊髓，其特征在于：所述的人工软脊膜(2)为动物的软脊膜、肠膜或者其它经过机械薄化处理的动物膜组织制成；所述人工蛛网膜(3)和人工硬脊膜(4)为动物心包膜、膈膜、脂肪网膜、胸膜、腹膜或肠膜制成；所述螺旋支架(3)由所述人工软脊膜(2)或人工蛛网膜(3)、人工硬脊膜(4)的膜材剪裁成长片条盘绕粘合而制成。

5.一种权利要求1所述的生物型人工脊髓的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：

a、选料：收集新鲜动物的脊髓以及膜组织，小心剪去脊髓全部外膜取髓质，并小心剔除血管，对于膜组织小心修剪去除多余杂质及不规整部分，张力定型；

b、碱处理：使用碱溶液浸泡髓质和膜组织；

c、脱脂：使用有机溶剂抽提髓质及膜组织中的脂肪及脂溶性杂质；

d、交联固定：使用非醛类固定剂交联固定髓质及膜组织中的胶原蛋白分子；

e、去除抗原：使用活泼试剂封闭髓质及膜组织蛋白质中引起抗原的特异活性基团-OH，-NH₂，-SH，并用强氢键试剂置换基材蛋白质分子螺旋链中引起特异构象的特殊氢键；

f、整体制备：在棒状模具上，用医用胶将相应尺寸的人工软脊膜(2)粘合成管状体；另取上述任一膜裁成规定宽度的长片条，按一定间距盘绕粘合在人工软脊膜(2)外，形成螺旋支架(6)；再将人工蛛网膜(3)粘合在螺旋支架(6)的凸梁上形成管状体；取医用胶原溶于水制成溶胶，涂布于人工蛛网膜(3)外，涂布多层并真空干燥形成胶原凝胶层(5)；胶原凝胶层(5)外包裹人工硬脊膜(4)并粘接成管状体；取出模具，小心向空腔填充人工髓质(1)。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：它在e和f步骤之间还设有增韧改性的处理步骤，即使用缩合、引发或辐射接枝的方法，在所述人工软脊膜(2)、人工蛛网膜(3)和人工硬脊膜(4)的胶原蛋白分子中适当接上聚氨酯、聚酰胺、聚酯、聚乳酸或聚羟乙酸链段。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：它在e和f步骤之间还设有通过偶联剂偶联特定多肽或糖胺聚糖活性组分的处理步骤，即在所述人工髓质(1)、人工软脊膜(2)、人工蛛网膜(3)和人工硬脊膜(4)的表面上通过偶联剂偶联可粘附生长因子的多肽或糖胺聚糖活性组分。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的活泼试剂是小分子有机酸酐、酰氯、酰胺或环氧化物；强氢键试剂为胍类化合物。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的非醛类固定剂为易与蛋白质分子发生交联反应的试剂：环氧化物、二酰二胺、二异氰酸酯、聚乙二醇或碳化二亚胺试剂中的一种或两种，其中的环氧化物为单环氧化物或者双环氧化物

其中R＝C_nH_2n+1-，n＝0-10，或者是低聚环氧化物的聚环氧丙烷。

10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述的偶联剂为能与-NH₂，-OH，-COOH起缩合反应的双官能团试剂中的二酰二胺、二酸酐或双环氧化物。

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