CN1985008A - 用于增加植物病原性防御的活性物质及其发现方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种发现诱导植物病原防御的化合物的方法，其中单个或多个植物内源性基因表达的增强被认作为诱导的标志，所述基因选自茉莉酸合成基因，植物蛋白酶抑制因子，植物木聚糖酶抑制因子，植物PR－蛋白(病原相关蛋白)和植物壳多糖酶，并且涉及这些化合物单独或与特异且直接地抵抗植物病原的化合物组合使用的用途，其能够实现同时或间隔施用。
Description
本发明涉及一种发现诱导植物病原防御的化合物的方法，其中单个或多个植物内源性基因表达的增强被认作为诱导的标志，所述基因选自茉莉酸合成基因、植物蛋白酶抑制因子、植物木聚糖酶抑制因子、植物PR-蛋白(病原相关蛋白)和植物壳多糖酶，并且涉及这些化合物单独或与特异且直接地抵抗植物病原的化合物组合使用的用途，其能够实现同时或间隔施用。
已知植物以特异性的或非特异性的防御机制应答自然界的应激条件，例如寒冷、热、干燥、创伤、病原侵袭(病毒、细菌、真菌、昆虫)等等，也应答除草剂[Pflanzenbiochemie，第393-462页，SpektrumAkademischer Verlag，Heidelberg，Berlin，Oxford，Hans W.Heldt，1996.；Biochemistry and Molecular Biology of Plants，第1102-1203页，American Society of Plant Physiologists，Rockville，Maryland，eds.Buchanan，Gruissem，Jones，2000]。其中，例如由创伤产生的细胞壁成分或特异来源于病原的信号物质，起植物信号转导链诱导物的作用，并最终导致形成直接对抗应激物的防御分子。在此，例如涉及(a)低分子量物质，如植物抗毒素，(b)非酶的蛋白，如“病原相关蛋白”(PR-蛋白)，(c)酶蛋白，如壳多糖酶、葡聚糖酶，或(d)基础蛋白的特异性抑制因子，如蛋白酶抑制因子，木聚糖酶抑制因子，这些物质直接攻击病原或阻断其繁殖(Dangl和Jones，2001，Nature 411：826-833；Kessler和Baldwin，2003，Annual Review of Plant Biology，53：299-328)。
另一种防御机制是所谓的过敏性反应(HR)，其由氧化应激介导，导致感染中心周围的植物组织死亡，阻止依赖于活细胞的植物病原扩散[Pennazio，1995，New Microbiol.18，第229-240页]。
在进一步的感染过程中，信号由植物信使物质传递到未感染组织内，在未感染组织内该信号再次激发防御应答并阻止继发性感染的形成(系统获得性抗性，SAR)[Ryals等，1996，The Plant Cell8：1809-1819]。
参与应激耐受或病原防御的一系列植物内源性信号物质是已知的。可以提及的有下列物质：水杨酸、苯甲酸、茉莉酸或乙烯[Biochemistryand Molecular Biology of Plants，第850-929页，American Societyof Plant Physiologists，Rockville，Maryland，eds.Buchanan，Gruissem，Jones，2000]。这些物质或其稳定合成衍生物和其衍生结构中的某些物质，当外部施用于植物或作种子拌种的情形下也是有效的，并激活导致植物应激增强或病原耐受的防御反应[Sembdner，和Parthier，1993，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.44：569-589]。水杨酸介导的防御能直接特异性地抵抗植物病原性真菌、细菌和病毒[Ryals等，1996，The Plant Cell 8：1809-1819]。
苯并噻重氮(商品名BionU)是一种已知具备与水杨酸可比效力的合成产品，它能介导对植物病原性真菌、细菌和病毒的保护效力[Achuo等，2004，Plant Pathology 53(1)：65-72]。
属于氧化脂类(Oxylipine)的其它化合物比如，茉莉酸和其触发的保护机制，能有效对抗有害昆虫[Walling，2000，J Plant GrowthRegul.19，195-216]。
已知，植物具备多种的内源性反应机制，所述机制能产生对各种有害生物体和/或自然非生物应激的有效防御。然而，针对何种防御反应可通过施用活性成分而引起的预测，迄今为止还不为所知。
因此需要一种针对性发现对抗有害生物体和/或自然非生物应激(比如，热、寒冷、干燥、盐渍和酸/碱应激)的植物内源性防御机制的分子激活剂的方法，通过该方法可以发现新的活性成分，鉴定出新的具有已知特性的、也包括其它作用类型的活性物质，或可以将其他已知分子或先导结构进行优化用作植物内源性防御机制的诱导剂。
本文所用术语的定义
本文所用的术语“Blast分析”(Blast＝基础局部对准排列查询工具(Basic Local Alignment Search Tool))描述了利用适合的计算机程序归类并发现潜在的同源序列(Altschul等，J.Mol.Biol.1990，215：403-410)，按照以“显著标准”(得分函数)形式设定的所期望的一致性，对查询序列和一个或多个数据库中的全部序列进行比对(对准排列)(R.Rauhut，Bioinformatik，第38-107页，Verlag Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim，2001)。
本文所用术语“cDNA”(互补DNA)描述互补于RNA且在体外通过酶促反转录合成的DNA单链。该cDNA相应于全长RNA或者仅表现为用作模板的RNA的部分序列。
本文中所用术语“簇分析”意思是指获取的独立数据通过开发用于簇分析的计算机程序进行总结，将编码相似功能的蛋白的基因群组，或者具有相似表达模式的基因汇总显示。从而获得以树形图形式显示的分级最小化的复合数据模式。簇分析使得对获得的数据集进行分类评价成为可能，而所述的获得的数据集明显建立于对无关联的数据的单纯的累积。
术语“DNA芯片”、“DNA阵列”和“DNA微阵列”，在本文中含义相同，应理解为意指一种支持体，该支持体的基材例如由玻璃或尼龙构成，在其基材上固着DNA片段，在此DNA的加载可以例如通过(a)光刻技术(直接在阵列的支持体上合成DNA)，(b)微点触(Microspotting)法(将外部合成的寡核苷酸或PCR产物施用到支持体上并共价键结合)，或(c)微喷射法(用墨喷印刷机不接触地将外部合成的寡核苷酸或PCR产物喷射到支持体上)进行(R.Rauhut，Bioinformatik，第197-199页，Verlag Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim，2001)。代表生物体基因组序列的DNA芯片称为“基因组DNA芯片”。使用这些“DNA芯片”获得的数据称为“DNA芯片分析”。
本文所用术语“DNA芯片杂交”意思是指两条单链的互补核酸分子配对，一个碱基配对分子固定在DNA芯片上作为DNA(脱氧核糖核酸)，优选以共价键形式，而另一个以RNA(核糖核酸)或对此相应的cDNA(互补DNA)形式存在于溶液中。结合和未结合的核酸在水性缓冲溶液中的DNA芯片上进行杂交。在存在二甲基亚砜，温度为30-60℃，优选40-50℃，特别优选在45℃下持续晃动10-20小时，优选14-18小时，特别优选16小时。所述杂交条件可以例如在杂交炉中恒定地实现。按照标准，在所述杂交炉中以60rpm(每分钟转数)晃动。
本文中的核酸序列，当使用术语“EST序列”(表达序列标记)时，意思是指200-500个碱基或碱基对的短序列。
如本文中所用，术语“表达模式”、“诱导模式”和“表达谱”含义相同，描述了植物mRNA的时间性差异的和/或组织特异的表达，该模式借助DNA芯片技术直接通过由源自该植物的RNA或其相应cDNA产生的杂交信号强度获得。所测定的“表达值”是通过对利用同义芯片与未处理的对照植物杂交而获得的相应信号直接进行计算而得到的。
如本文中所用，术语“表达状态”，是通过所进行的“基因表达谱分析”而获得的，描述了使用DNA芯片测定的所有细胞基因的转录活性。
如本文中所用，术语“全部RNA”描述了可能存在于植物细胞中的能用提取法获得的不同植物内源性RNA群组结果，如胞质rRNA(核糖体RNA)、胞质tRNA(转移RNA)、胞质mRNA(信使RNA)，和其各自的核前体，ctRNA(叶绿体RNA)和mtRNA(线粒体RNA)，还包括来源自外源生物体如病毒或寄生细菌和真菌的RNA分子。
如本文中所用，术语“有用植物”是指农作物植物，所述植物是被用作获得食物、饲料或工业目的的植物。
如本文中所用，术语“安全剂”表示非植物内源性来源的化合物，该化合物能消除或减少杀虫剂对农作物植物的植物毒性，而基本不降低杀虫剂对有害生物体如杂草、细菌、病毒和真菌的杀虫活性。
本发明涉及一种发现诱导植物病原防御的化合物的方法，其中单个或多个植物内源性基因转录或表达的增强被认作为诱导的标志，所述基因选自茉莉酸合成基因、植物蛋白酶抑制因子、植物木聚糖酶抑制因子、植物PR蛋白(病原相关蛋白)和植物壳多糖酶。
本发明尤其涉及一种发现诱导编码病原-防御植物内源性酶的基因转录的化合物的方法，其中：
a)将待测植物与合适量的一种或多种待测物质接触，
b)另外，将对照植物置于与a)的待测植物相同的条件下，但不接触待测物质，
c)从待测植物和对照植物中提取RNA，
d)RNA直接进行放射性标记或非放射性标记，或在同时用酶转录为相应cDNA时RNA进行放射性标记或非放射性标记，或将先前所得的非标记的cDNA酶促转录为相应的放射性标记或非放射性标记的cRNA，
e)步骤d)所得的物质与含植物DNA序列的DNA阵列杂交，
f)以比较a)和b)中所测植物的方式建立表达茉莉酸合成基因、植物蛋白酶抑制因子、植物木聚糖酶抑制因子、植物PR蛋白(病原相关蛋白)和/或植物壳多糖酶的基因表达谱，
g)对步骤f)所测定的表达差异进行定量，和
h)利用簇分析对g)所归纳的表达谱进行最终的系统分组。
在上述步骤d)的情况下，将所得cDNA酶促转录为cRNA作为优选步骤，因为这样可以再次对杂交探针进行扩增。同样，优选用非放射性核苷酸标记，特别优选用生物素化的UTP和/或CTP来标记，一旦杂交反应开始，就可以通过作荧光团的链霉抗生物素-藻红蛋白与生物素化cRNA的结合来检测出。杂交后，在激光扫描器的帮助下，对作为测定表达差异量化基础的特异性藻红素荧光性进行检测。
本发明的优选对象是遵循上述步骤a)-h)的方法过程的方法，其中
(i)脂酶样蛋白，12-氧代植物二烯酸酯(Oxophytodienoate)还原酶(EC 1.3.1.42)，烯二烃氧化物环化酶(Allene-oxide Cyclase)，12-氧代植物二烯酸还原酶的基因表达谱，和/或
(ii)植物蛋白酶抑制剂的基因表达谱，该抑制剂与PIR蛋白数据库登记号S71555的蛋白酶抑制剂有显著同源性，和/或
(iii)植物木聚糖酶抑制蛋白的基因表达谱，和/或
(iv)植物的病原诱导的过氧化物酶(EC 1.11.1.7)的基因表达谱，该蛋白是与PIR蛋白数据库中T06168号大麦病原相关的(PR)蛋白有显著同源性的蛋白，和/或
(v)植物壳多糖酶的基因表达谱，
相比未处理的对照植物提高2倍或更多，优选提高2-100，更优选2-20，特别优选2-10，尤其非常优选2-5，其中各基因彼此独立的经改变的表达谱的提高可以在不同的上述范围之内。
本发明进一步涉及某些DNA微阵列的用途，该微阵列基于来自植物的遗传信息，优选来自有用植物的遗传信息，特别优选从有用植物如大麦、玉米、小麦、水稻、燕麦、油菜、甜菜的遗传信息中发现改变的基因表达模式。在本文中，与未处理的对照植物相比，在用待测化合物处理的植物中观察到了茉莉酸生物合成基因、植物蛋白酶抑制因子基因、植物木聚糖酶抑制因子基因、植物PR蛋白(病原相关蛋白)基因和/或植物壳多糖酶基因的基因模式的相对改变。
本发明进一步还涉及在上述方法中鉴定为阳性的化合物的用途，即在它们对作为在有用植物中提高应激耐受和/或病原防御的活性成分的茉莉酸生物合成基因、植物蛋白酶抑制因子基因、植物PR蛋白(病原相关蛋白)基因和/或植物壳多糖酶基因的诱导效力方面的表达提高。
因此，本发明还涉及化合物在植物中，如由信号转导链直接或间接赋予对植物病原性生物体的增强防御的用途，所述植物病原性生物体例如具有至少一种基因，优选选自下组蛋白中的蛋白的多个基因的昆虫、真菌、细菌或病毒，所述蛋白选自具有增强表达谱的茉莉酸生物合成、植物蛋白酶抑制因子、植物木聚糖酶抑制因子、植物PR蛋白(病原相关蛋白)和/或植物壳多糖酶蛋白。
在本文中优选已知在农作物保护中用作熟知安全剂的化合物，例如吡咯二酸二甲酯(Mefenpyr-dimethyl)、吡唑解草酯、吡咯二酸酯类似物、双苯唑乙酸、解草酯、解草酯衍生物和吡啶羧酰胺(Pyridincarboxamid)。
使用上述化合物，很可能能有效保护农作物植物防御植物病原性生物体(昆虫、真菌、细菌、病毒)，还能例如获得更高产量。对于直接针对这些生物体的活性成分而言，优势在于由于它们不会激发相应防御反应而保护了有用植物(Nützlinge)。
因此，本发明还涉及保护有用植物农作物中的有用植物抵抗植物病原性生物体，尤其是针对昆虫、真菌、细菌和病毒的方法，其通过施用借助于DNA阵列考虑茉莉酸生物合成、植物蛋白酶抑制因子、植物木聚糖酶抑制因子、植物PR蛋白(病原相关蛋白)和/或植物壳多糖酶的基因表达谱而鉴定出的化合物。特别优选所述保护针对植物病原性生物体，尤其针对昆虫，特别是针对未成熟昆虫。
通过借助于DNA阵列鉴定的化合物，例如也通过已知作为安全剂的化合物所激发的上述机制还能够导致这些化合物和特异且直接抵抗植物病原有效的其它化合物之间的协同效力，所述其它化合物诸如杀虫剂和杀真菌剂，尤其当与杀真菌剂和杀虫剂同时或间隔施用时，尤其是杀虫剂，例如来自酮-烯醇组的化合物[例如EP 528156；EP 596298中]，或烟碱乙酰胆碱受体的激动剂或拮抗剂组中的化合物。最后提及的化合物归组于术语硝基亚甲基或硝基亚胺和相关化合物内(如EP 464830中)。
因此，本发明还涉及通过借助DNA阵列考虑茉莉酸生物合成、植物蛋白酶抑制因子、植物木聚糖酶抑制因子、植物PR蛋白(病原相关蛋白)和/或植物壳多糖酶的基因表达谱而筛选鉴定出的化合物与特异且直接对抗植物病原的现有技术化合物组合的用途，例如吡咯二酸衍生物(如“农药手册，第13版，2003”中所列Nr.506化合物)和直接作用于有害生物体的杀虫剂组合，特别优选和来自酮-烯醇组或硝基亚甲基/硝基亚胺组的杀虫剂组合，或者使用双苯唑酸衍生物(如“农药手册，第13版，2003”中所列Nr.478化合物)和直接作用于有害生物体的杀虫剂的用途，在此可同时或间隔施用。当不采用同时施用时，可在施用采用本文所述DNA阵列方式鉴定出的化合物之前或之后施用直接作用于有害生物体的杀虫剂，优选随后施用直接作用于有害生物体的杀虫剂。
下面将通过实施例进一步详细描述本发明。
实施例1
安全剂通过进行基因表达谱(GEP)对植物中防御机制的作用的验证：
在有土的盆内(直径：10cm)，在环境柜内，于设定的光照、湿度和温度条件下(白光、70％大气湿度、24℃)种植大麦植物(Baronesse变种)10天。在进行喷洒时，幼苗大小约15cm。本实施例中选定的待测物质是结构显著不同且具备良好安全剂效应的分子，和从文献已知具备植物应激和病原耐受效应的其它分子(表1)。以DMSO(二甲基亚砜)为c＝10mg/ml制备待测物质原液。用该原液制备含作湿润剂的0.2％Agrotin(包含聚乙烯醇、硅酮、多糖和pH调节剂，生产商：BayerCropScience AG，Monheim，德国)的水稀释液，以获得表中所示的施用量。喷洒施用的液体量相应于800l/ha是每盆800μl。每800μl喷洒混合物中，另外添加16μl的EC预混物∶二丙酮醇＝1∶6作辅助制剂。用气压喷枪将表1所列物质施于叶片上。分别以2倍剂量喷洒，所有实验都重复实施(每种物质喷洒2盆)。用无活性成分的空白制剂喷洒作为对照。6小时后，采集叶片，在液氮中骤冻，-80℃保存备用。按照Affymetrix(Affymetrix Inc.，3380 Central Expressway，SantaClara，CA，USA)的方案(Expression Analysis，Technical Manual)制备DNA芯片杂交所用的经标记的RNA探针。首先，从各500mg采集叶片中分离总RNA。各10μg总RNA用于第一链和第二链cDNA合成。用T7聚合酶进行cDNA扩增，同时用生物素-UTP进行标记。各20μg所述生物素化的cDNA用于Affymetrix的大麦基因组阵列(基因芯片大麦1，编号：511012)的杂交。该DNA微阵列包含22840个基因的DNA序列，所述基因组成了总共400000个EST序列。然后，在AffymetrixFluidicsStation中洗涤该DNA微阵列，用链霉抗生物素/藻红蛋白(分子探针，P/N S-866)染色，并用匹配的Agilent激光扫描仪扫描(Agilent基因阵列扫描仪)。用Affymetrix的Microarray Suite 5软件分析获得的荧光数据。在核实特性后，将所有DNA芯片分析都存于数据库中。为了测定基因的相对表达值(诱导因素，抑制因素)，将检测芯片和对照芯片相互进行对比，以Affymetrix软件设定的显著标准为依据。用各2个对照芯片(空白制剂)对一个实验中的生物重复的两个样品进行比较，所获得的每个基因各4个表达值通过中值计算表示。这些中值在表格中作为诱导因素给出。利用Applied Maths的GeneMaths通过1.5软件(Applied Maths，Keistraat 120，9830 Sint-Martens-Latem，Belgium)进行不同实验的表达谱的相似性比较和簇分析。
来自特定代谢途径和信号传导链的基因群组通过在Affymetrix提供的基因注释中的关键词搜索以及DNA靶序列的Blast分析而被整理在一起，所述DNA靶序列，即在DNA芯片上鉴定出的阳性(通过表达谱的改变而被鉴定出来)序列来自其它生物体，优选植物生物体的具有功能性特征的基因序列。
表1
| 检测物质(编号)： | 施加速度[g a.i./ha]： | 已知特性： |
| 吡啶二酸二甲酯(1) | 150 | 安全剂 |
| 吡啶二酸类似物(2) | 150 | 安全剂 |
| 双苯唑乙酸(3) | 150 | 安全剂 |
| 解草酯(4) | 150 | 安全剂 |
| 解草酯衍生物(5) | 150 | 安全剂 |
| 吡啶羧酰胺(6) | 150 | 安全剂 |
| 水杨基异羟肟酸(7) | 500 | 抗性诱导剂 |
| Bion(＝噻二唑素-S-甲基)(8) | 150 | 抗性诱导剂 |
| 二氯异烟酸(9) | 150 | 抗性诱导剂 |
| 二氯水杨酸(10) | 150 | 抗性诱导剂 |
上述表1中所用检测物质的结构式
对源自与应激耐受和病原防御相关的信号传导链和代谢途径的基因群组的检查，揭示了至今已知作用为安全剂(S1-S6)的一组化合物尤其针对蛋白酶和木聚糖酶的抑制因子的基因和茉莉酸生物合成基因(表2a)，以及PR蛋白和壳多糖酶基因(表2b)的高水平诱导。
表2a
| “探针组”编号 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | S9 | S10 |
| 1.1 Contig2631_at | 1.00 | 1.00 | 97.68 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 1.2 HI02E21u_s_at | 1.00 | 1.00 | 40.79 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 3.03 | 4.66 |
| 1.3 Contig3097_at | 1.00 | 1.00 | 8.51 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 2.11 | 1.00 | 1.00 |
| 1.4 Contig5146_at | 7.73 | 4.47 | 4.50 | 4.72 | 5.35 | 6.77 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 1.5 Contig4986_at | 1.00 | 1.00 | 3.76 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 1.6 HV_Ceb0020D05r2_s_at | 1.00 | 1.00 | 3.68 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 1.7 Contig6194_a_at | 12.91 | 4.14 | 3.25 | 2.17 | 2.81 | 3.16 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 1.8 Contig9556_at | 1.00 | 1.00 | 3.03 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 1.9 Contig15_a_at | 0.35 | 1.00 | 2.97 | 1.00 | 0.46 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 1.10 Contig1736_at | 1.00 | 1.00 | 2.91 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 1.11 Contig12574_at | 0.50 | 1.00 | 2.81 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 2.11 | 1.00 | 1.00 |
| 1.12 Contig6611_at | 1.00 | 1.00 | 2.41 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 2.31 | 3.61 | 2.00 | 2.38 |
| 1.13 Contig10030_at | 1.00 | 1.00 | 2.25 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 1.14 Contig2305_at | 1.00 | 1.00 | 2.14 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 41.07 | 81.57 | 12.55 | 18.13 |
| 1.15 Contig1737_at | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 1.16 Contig3096_s_at | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 2.06 | 2.68 | 1.00 | 1.00 |
| 1.17 Contig13413_at | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 2.17 | 1.00 | 1.00 |
| 1.18 Contig2326_s_at | 2.31 | 1.00 | 1.00 | 2.45 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 1.19 Contig2330_x_at | 4.03 | 2.39 | 1.00 | 2.83 | 1.00 | 2.55 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 1.20 Contig2337_at | 4.89 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 2.1 Contig2088_s_at | 1.00 | 1.00 | 4.26 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 4.79 | 7.36 | 2.36 | 2.41 |
| 2.2 Contig34_s_at | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 4.50 | 3.68 | 1.00 | 2.08 |
| 2.3 Contig88_x_at | 1.00 | 1.00 | 4.53 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 21.86 | 22.94 | 4.59 | 4.41 |
| 2.4 HD07M22r_s_at | 6.32 | 1.00 | 2.71 | 1.00 | 7.84 | 5.10 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 3.1 Contig8905_at | 3.10 | 2.53 | 2.99 | 2.73 | 3.01 | 2.45 | 1.00 | 1.00 | 2.53 | 1.00 |
对以下经测定的表达值(未处理对照表达值的x倍)：
(a)植物茉莉酸生物合成基因(1.1-1.20)
(b)编码植物蛋白酶抑制因子的基因(2.1-2.4)
(c)编码植物木聚糖酶抑制因子的基因(3.1)
“探针组”编号对应于Affymetrix芯片上的相应DNA芯片位置。
利用Blast分析，可将最可能来自其它注释序列数据库的相应已知序列顺序赋值给“探针组”编号。Blast分析中所示数据显示如下。
“探针组”编号 来自公开DNA或蛋白数据库具备注释功能的相应序列
1.1脂酶样蛋白(稻(Oryza sativa)；japonica cultivar组)
1.2脂肪氧化酶(EC 1.13.11.12)大麦gbAAB70865
1.3烯二烃氧化物合酶(大麦亚属大麦(Horedeum vulgaresubsp.vulgare))
1.4可能的12-氧代植物二烯酸酯还原酶(EC 1.3.1.42)
1.5烯二烃氧化物环化酶(稻；japonica cultivar组)
1.6烯二烃氧化物环化酶(稻；japonica cultivar组)
1.712-氧代植物二烯酸还原酶(稻)
1.812-氧代植物二烯酸酯还原酶3(番茄(Lycopersiconesculentum))
1.9GDSL-基元脂酶/类水解酶蛋白，At5g55050.1
1.10脂肪氧化酶1pir T05941(EC 1.13.11.12)大麦
1.11推定的脂肪氧化酶(稻；japonica cultivar组)
1.12类似于脂酶(拟南芥(Arabidopsis thaliana)；gbAAM20450.1)
1.13推定的脂酶同系物(稻；japonica cultivar组)
1.14茉莉酸甲酯诱导的脂肪氧化酶gbAAC12951.1
1.15可能的脂肪氧化酶gbAAB60715.1
1.16烯二烃氧化物合酶(大麦亚属大麦(Hordeum vulgaresubsp.vulgare))
1.17类似于脂酶(拟南芥；gb AAM20450.1)
1.1812-氧代植物二烯酸还原酶(稻)
1.1912-氧代植物二烯酸还原酶(稻)
1.2012-氧代植物二烯酯还原酶(OPR1)At1g76680.1
“探针组”编号 来自公开DNA或蛋白数据库具备注释功能的相应序列
2.1Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂
2.2推定的蛋白酶抑制剂(大麦亚属大麦(Hordeum vulgaresubsp.Vulgare))
2.3推定的蛋白酶抑制剂(大麦亚属大麦(Hordeum vulgaresubsp.Vulgare))
2.4蛋白酶-抑制剂(pir S71555，大麦)
3.1木聚糖酶抑制剂蛋白(小麦(Triticum aestivum))
表2b
| “探针组”编号 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | S9 | S10 |
| 4.1 Contig2118_at4.2 Contig5369_at4.3 Contig5607_s_at5.1 Contig2990_at5.2 Contig2992_s_at5.3 Contig5023_at | 8.692.3518.644.176.509.51 | 1.001.0015.561.001.003.18 | 4.864.7613.362.772.191.00 | 1.001.0018.381.001.001.00 | 2.331.008.751.003.122.73 | 2.201.009.991.002.271.00 | 1.001.001.001.001.001.00 | 1.001.001.001.001.001.00 | 1.001.001.002.392.144.56 | 1.001.001.001.001.001.00 |
对以下经测定的表达值(未处理对照表达值的x倍)：
(a)编码植物PR蛋白的基因(4.1-4.3)
(b)编码植物壳多糖酶的基因(5.1-5.3)
“探针组”编号对应Affymetrix芯片上的相应DNA芯片位置。利用Blast分析，可将最可能来自其它注释序列数据库的相应已知序列顺序赋值给“探针组”编号。Blast分析中所示数据显示如下。
“探针组”编号 来自公开DNA或蛋白数据库具备注释功能的相应序列
4.1过氧化物酶(EC 1.1 1.1.7)，病原诱导的(大麦)
4.2病原-相关蛋白；(稻；gbAAL74406.1)
4.3病原-相关蛋白(大麦；PirT06168)
5.1壳多糖酶(EC 3.2.1.14)(大麦；embCAA55344.1)
5.2壳多糖酶(EC 3.2.1.14)(大麦；embCAA55344.1)
5.3III类壳多糖酶(稻亚属粳稻；gbAAM08773.1)
由这些表格衍生而成并且直接以所得表达值显示的诱导模式显示了安全剂和抗性诱导剂之间的特性区别，在双苯唑酸情况下最能判断对茉莉酸生物合成酶的作用。建立的表达模式能够发现具有相似特征的物质，并且能够预见这些物质具备植物病原防御活性方面的相似效力。
实施例2
安全剂处理的植物对植物病原性昆虫的驱避效力：
如实施例1所述培养大麦植物(Baronesse种)，10天后，以150ga.i./ha双苯唑乙酸(S3)或空白制剂喷施处理。每次实验重复处理各10盆。
施用物质6小时或24小时后，统一用植物病原性蚜虫禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)群侵袭每盆植物。7天和14天后通过计算叶片上的动物数量对实验进行评价。
7天后，安全剂处理的植物上的蚜虫数量比对照平均少50％，14天后少70％。
在未处理植物Sachez试验中，未检测到双苯唑乙酸(S3)对蚜虫的直接毒性。
实施例3
在双苯唑酸-处理的植物中提高氧代植物二烯酸酯(OPDA)和茉莉
酸酯(JA)浓度的验证
在如实施例1所述条件下培养大麦植物(Baronesse变种)，并用安全剂双苯唑乙酸(S3)喷施处理。
施用量选择如下：
(1)30[g a.i./ha]；(2)150[g a.i./ha]；(3)空白制剂(无活性成分)
在处理(h＝小时)，即1h，2h，4h，6h，12h，24h和48h后，在各时间点采集植物叶片。将所有样品各重复3盆。
按照文献(Müller A，Düchting P and Weiler EW(2002)，Amultiplex GC-MS/MS technique for the sensitive and quantitativesingle-run analysis of acidic phytohormones and relatedcompounds，and its application to Arabidopsis thaliana.Planta，216，44-56))中所述步骤从叶片中加工获得十八烷酸盐(Octadecanoide)和茉莉酸酯。
从各测定点提取300mg植物材料。
50pmol[13C]2-JA和100pmol[17，17，17，18，18-2H]-顺-OPDA用于内标准化。提取物通过在内部制备的微型固相交换柱中的氨丙基阴离子交换层析进行纯化。
结果示于表3a至3d，所示各值是3次重复的平均值。
表3a
叶组织中的氧代植物二烯酸酯(OPDA)浓度pmol/g
| 时间/小时 | 对照 | 双苯唑酸(S3)30g a.i/ha |
| 0 | 2500 | 2500 |
| 1 | 1500 | 6500 |
| 2 | 1000 | 3750 |
| 4 | 2500 | 7000 |
| 6 | 2500 | 9000 |
表3b
叶组织中的氧代植物二烯酸酯(OPDA)浓度pmol/g
| 时间/小时 | 对照 | 双苯唑酸(S3)150g a.i./ha |
| 0 | 2600 | 2600 |
| 1 | 1600 | 2800 |
| 2 | 1200 | 1800 |
| 4 | 2600 | 2200 |
| 6 | 2700 | 5100 |
| 12 | 3600 | 2400 |
| 24 | 2800 | 5100 |
| 48 | 1800 | 1900 |
表3c
叶组织中的茉莉酸酯(JA)浓度pmol/g
| 时间/小时 | 对照 | 双苯唑酸(S3)30g a.i/ha |
| 0 | 140 | 140 |
| 1 | 180 | 600 |
| 2 | 70 | 320 |
| 4 | 190 | 790 |
| 6 | 130 | 620 |
表3d
叶组织中的茉莉酸酯(JA)浓度pmol/g
| 时间/小时 | 对照 | 双苯唑酸(S3)150g a.i./ha |
| 0 | 140 | 140 |
| 1 | 175 | 290 |
| 2 | 70 | 280 |
| 4 | 190 | 270 |
| 6 | 135 | 275 |
| 12 | 220 | 155 |
| 24 | 145 | 265 |
| 48 | 135 | 320 |
当叶片组织中的茉莉酸酯(JA)浓度在70-800pmol/g范围内时，叶片组织中的氧代植物二烯酸酯(OPDA)浓度在1800-9000pmol/g范围内。用双苯唑酸(S3)处理后，测定的两物质浓度都显著提升至约为无活性成分的空白制剂样品的5倍。
Claims (12)
1.一种发现诱导植物病原防御的化合物的方法，其中单个或多个植物内源性基因表达的增强被认作为诱导的标志，所述基因选自茉莉酸合成基因、植物蛋白酶抑制因子、植物木聚糖酶抑制因子、植物PR蛋白(病原相关蛋白)和植物壳多糖酶。
2.权利要求1所述的方法，其中，
a) 将待测植物与合适量的一种或多种待测物质接触，
b) 另外，将对照植物置于与a)的待测植物相同的条件下，但不接触待测物质，
c) 从待测植物和对照植物中提取RNA，
d) RNA直接进行放射性标记或非放射性标记，或RNA在同时用酶转录为相应cDNA时进行放射性标记或非放射性标记，或将先前所得的非标记的cDNA酶促转录为相应的放射性标记或非放射性标记的cRNA，
e) 步骤d)所得的物质与含植物DNA序列的DNA阵列杂交，
f) 以比较a)和b)中所测植物的方式建立表达茉莉酸合成基因、植物蛋白酶抑制因子、植物木聚糖酶抑制因子、植物PR蛋白(病原相关蛋白)和/或植物壳多糖酶的基因表达谱，
g) 对步骤f)所测定的表达差异进行定量，和
h) 利用簇分析对g)所归纳的表达谱进行最终的系统分组。
3.权利要求2所述的方法，其中：
(i)脂酶样蛋白，12-氧代植物二烯酸酯还原酶(EC 1.3.1.42)，烯二烃氧化物环化酶，12-氧代植物二烯酸还原酶的基因表达谱，和/或
(ii)植物蛋白酶抑制剂的基因表达谱，该抑制剂与PIR蛋白数据库登记号S71555的蛋白酶抑制剂有显著同源性，和/或
(iii)植物木聚糖酶抑制蛋白的基因表达谱，和/或
(iv)植物病原诱导的过氧化物酶(EC 1.11.1.7)的基因表达谱，该蛋白是与PIR蛋白数据库中T06168号大麦病原相关蛋白有显著同源性的蛋白，和/或
(v)植物壳多糖酶的基因表达谱，
相比未处理的对照植物被提高2倍或更多。
4.权利要求3所述的方法，其中(i)-(v)中所述的一种或多种基因的表达谱被提高2-20倍。
5.在植物中直接或间接有助于针对植物病原性生物体的防御力增强的化合物的用途，其中至少一种，优选多种编码下述蛋白的基因具有增强的表达谱：茉莉酸合成蛋白、植物蛋白酶抑制因子、植物木聚糖酶抑制因子、植物PR蛋白(病原相关蛋白)和/或植物壳多糖酶。
6.权利要求5所述的化合物用途，所述化合物已知在农作物保护中用作所谓的安全剂。
7.权利要求5或6所述的用途，其中所述化合物由权利要求2-4所述方法鉴定出。
8.权利要求6所述的化合物用途，其中所述化合物是吡咯二酸二甲酯、吡唑解草酯、吡咯二酸酯类似物、双苯唑乙酸、解草酯、解草酯衍生物和吡啶羧酰胺。
9.权利要求5-8中任一项所述的用途，其中所述化合物在有用植作物中与针对植物病原特异且直接有效的已知化合物组合施用，以改善对植物病原性生物体的防御力，且所述施用可以同时或间隔进行。
10.权利要求9所述的用途，其中吡咯二酸酯衍生物或双苯唑酸衍生物与直接对有害生物体起作用的杀虫剂组合。
11.权利要求10所述的用途，其中，在吡咯二酸酯衍生物的情况下，直接对有害生物体起作用的杀虫剂相应于酮-烯醇或硝基亚甲基/硝基亚胺。
12.通过施用用于在植物中直接或间接提高对抗植物病原性生物体的防御力的化合物，保护有用植物农作物中的有用植物抵抗植物病原性生物体的方法，所述至少一种，优选多种编码下述蛋白的基因具有增强的表达谱：茉莉酸合成蛋白、植物木聚糖酶抑制因子、植物蛋白酶抑制因子、植物PR蛋白(病原相关蛋白)和/或植物壳多糖酶。
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