CN1984679B

CN1984679B - 制备免疫原性结合物的方法

Info

Publication number: CN1984679B
Application number: CN2005800181082A
Authority: CN
Inventors: 雷切尔·斯楚内尔森; 乔安娜·库布勒尔－凯尔布; 法瑟·玛佳德莱; 斯蒂芬·H·蕾普拉; 约翰·B·罗宾斯; 刘德勇; 约瑟夫·夏伊洛阿楚
Original assignee: Goverment Of United States, AS REPRESENTED BY SECRETARY D
Current assignee: Goverment Of United States, AS REPRESENTED BY SECRETARY D
Priority date: 2004-06-04
Filing date: 2005-06-03
Publication date: 2013-05-15
Anticipated expiration: 2025-06-03
Also published as: EP1765394B1; AU2005249571B9; WO2005117965A1; CN1984679A; EP1765394A1; CA2568364C; AU2005249571B2; CA2568364A1; AU2005249571A1

Abstract

本发明公开了制备含有共价连接载体的半抗原或抗原的免疫原性结合物的方法。该方法包括：将第一试剂与二酰肼反应产生肼基修饰的第一试剂，其中第一试剂是半抗原，抗原或载体；将第二试剂与苯甲醛化合物反应产生苯甲醛修饰的第二试剂，其中第二试剂是半抗原，抗原或载体，条件是第一试剂或第二试剂是载体；将肼修饰的第一试剂与苯甲醛修饰的第二试剂反应产生含有经腙键共价连接于载体的半抗原或抗原的免疫原性结合物。

Description

制备免疫原性结合物的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2004年12月6日提交的美国专利申请11/005,851的优先权，其是2004年6月4日提交的PCT国际申请PCT/US04/017736的部分继续，二者都全文引入作为参考。

背景技术

已经通过在线性烷基醛和线性烷基胺之间形成希夫碱(Schiffbase)制备了免疫原性结合物。然而，这种结合物中的键合在生理pH(约6到约8的pH)是可逆的，除非用硼氢化钠处理将该化合物转化为二烷基胺。另外，通常使用经烷基-醛和胺通过还原氨化形成的抗原载体结合。King等，Preparation of Protein Conjugates via IntermolecularHydrazone Linkage，Biochemistry 1986，25，5774-5779描述了制备结合物蛋白的方法，包括在两个蛋白在形成腙键，但是腙键是可逆的并且必须进行还原形成更稳定的酰肼键。然而，在所有这些改善稳定性的结合方法中使用的还原反应通常包括长时间暴露于硼氢化物。然而，就含有二硫化物的载体蛋白和抗原来说，长时间暴露于硼氢化物是有隐患的，因为还可以还原载体蛋白中的二硫键并改变其结构。因此，非常需要在生理pH不可逆，而且不需要用硼氢化物还原的免疫原性结合物。

发明概述

本发明还公开了含有由下式I表示的结构的免疫原性结合物：

X-L-Z

其中X为载体；

Z为半抗原或抗原；以及

L为共价键合X和Z的连接基团，并且含有腙键，肼撑键以及亚苯甲酰基部分。

几个实施例的详细说明

I.缩写

ADH：己二酸二酰肼

AT：炭疽毒素

ATR：炭疽毒素受体

EDAC：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺-HCl

EF：水肿因子

γPGA：来自芽胞杆菌的聚-γ-谷氨酸荚膜

γDPGA：来自炭疽芽孢杆菌的聚-γ-D-谷氨酸荚膜

γLPGA：来自芽胞杆菌的聚-γ-L-谷氨酸荚膜

GLC-MS：气液色谱法-质谱

kDa：千道尔顿

LC-MS：液相色谱-质谱

LeTx：致死毒素

LF：致死因子

LPS：脂多糖

MALDI-TOF：基质辅助激光解析电离-飞行时间

μg：微克

μl：微升

PA：保护性抗原

PBS：磷酸盐缓冲盐水

rEPA：重组铜绿假单胞菌外毒素A

rPA：重组炭疽芽孢杆菌保护性抗原

SBAP：琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰氨基)丙酸酯

SFB：琥珀酰亚胺基甲酰基苯甲酸甲酯

SPDP：3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯

SLV：琥珀酰亚胺基乙酰丙酸酯

TT：破伤风类毒素

II.术语

除非另有说明，技术术语根据常规的用法使用。分子生物学通用术语的定义参见Benjamin Lewin，Genes VII，由牛津大学出版社出版，2000(ISBN 019879276X)；Kendrew等(编辑)，The Encyclopedia ofMolecular Biology，由Blackwell出版社出版，1994(ISBN 0632021829)；以及Robert A.Meyers(编辑)，Molecular Biology and Biotechnology：aComprehensive Desk Reference，由Wiley，John & Sons，Inc.出版，1995(ISBN 0471186341)；及其它类似的参考文献。

在在这里使用的单数术语“a”，“an”以及“the”包括复数对象除非上下文清楚地另有说明。类似地，单词“或”包括“和”除非上下文清楚地另有说明。同时，此处所述的术语“含有”是指“包括”。因此“含有A或B″意思指包括A，B，或A以及B。更进一步应该理解对于核酸多肽或其它化合物给出的所有的核苷酸大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子质量都是近似值，并且都是为了说明的目的提供的。尽管与这里描述的方法以及物质类似或者相当的方法以及物质可用于实践或检验本发明公开的内容，合适的方法以及材料描述如下。在本发明提及的所有出版物，专利申请，专利及其它参考文献在此处全文引入作为参考。在有侵权纠纷时本发明的说明书包括术语的解释将用来对本发明进行解释。此外，这些材料，方法以及实施例仅仅是说明性的而非限定性的目的。

为了促进本发明公开的多种实施例的评述，提供了对专用名词的下列解释：

佐剂：非-特异性针对抗原的免疫应答的物质。用于人类的疫苗助剂的开发综述于Singh等(Nat.Biotechnol.17：1075-1081，1999)，其公开了在其出版时，铝盐，诸如氢氧化铝(Amphogel，Wyeth Laboratories，Madison，NJ)，以及MF59微乳剂是唯一批准用于人使用的疫苗佐剂。铝水凝胶(获自Brentg Biosector，Copenhagen，Denmark)是另一常用的佐剂。

在一个实施方案中，佐剂包括刺激免疫激活的DNA基序，例如先天免疫应答或由T-细胞，B-细胞，单核细胞，树突状细胞以及天然杀伤细胞的获得性免疫应答。刺激免疫激活的DNA基序的特异性非-限制性实例包括CpG寡脱氧核糖核苷酸，描述于美国专利6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705以及6,429,199中。

类似物，衍生物或模拟物：类似物是在化学结构上与母化合物不同的分子，例如同系物(化学结构的增加的差异，诸如烷基链长度的差异)，分子片段，一或多个官能团不同的结构，离子化方面的改变。常常利用定量构效关系(QSAR)，诸如公开于Remington(The Science andPractice of Pharmacology，第19版(1995)，28章)的技术发现结构类似物。衍生物是衍生自碱基结构的生物学活性分子。模拟物是模拟另一分子的活性的分子，诸如生物学活性分子。生物学活性分子可以包括模拟化合物的生物学活性的化学结构。

动物：活的多-细胞脊椎动物生物，包括例如哺乳动物以及鸟的种类。术语哺乳动物包括人以及非-人哺乳动物。类似地，术语“受试者”包括人以及兽受试者，例如，人，非-人灵长类动物，狗，猫，马以及牛。

抗体：蛋白(或蛋白复合物)，包括基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的一或多种多肽。识别的免疫球蛋白基因包括κ，λ，α，γ，δ，ε，以及μ恒定区基因，以及多种免疫球蛋白可变区基因。轻链被分成κ或λ。重链被分成γ，μ，α，δ或者ε，其依次分别定义免疫球蛋白IgG，IgM，IgA，IgD以及IgE型。

碱性免疫球蛋白(抗体)结构单位通常是四聚体。每一四聚体由两个相同的多肽链对构成，每一对具有一个“轻链”(约25kDa)以及一个“重链”(约50-70kDa)。每一链的N-末端限定约100到110或更多氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语“可变的轻链”(V_L)以及“可变的重链”(V_H)分别指这些轻链以及重链。

用于本发明的方法以及装置的抗体可以是单克隆或多克隆抗体。仅仅举例来说，单克隆抗体可以根据Kohler以及Milstein的经典方法(Nature 256：495-97，1975)或其衍生法从鼠杂交瘤制备而来。用于单克隆抗体生产的详细步骤描述在Harlow以及Lane的UsingAntibodies：A Laboratory Manual，CSHL，New York，1999中。

抗原：可以由体液或细胞免疫特异性产物，诸如抗体分子或T-细胞受体特异性结合的化合物，组合物或物质。抗原可以是任意类型的生物学分子包括，例如简单的中间代谢产物，糖(例如，寡聚糖)，脂类以及激素以及大分子诸如缀合糖(例如多糖)，磷脂，核酸以及蛋白。通用种类的抗原包括但不限于，病毒抗原，细菌抗原，真菌抗原，原生动物及其它寄生物抗原，肿瘤抗原，参与自身免疫性疾病，过敏症以及移植排斥的抗原，毒素及其它多种抗原。在一个实施例中，抗原是芽胞杆菌抗原诸如γPGA。

芽胞杆菌：细菌的一个属，其共同特征包括来源于植物以及动物的大多数底物的降解，包括纤维素，淀粉，果胶蛋白，琼脂，碳氢化合物，等；抗生素生产；硝化作用；脱氮作用；固氮作用；兼生的无机营养；自养；嗜酸性；嗜碱性；嗜冷性，嗜热性以及寄生。普遍存在于该属内的孢子形成被认为是幸存于细菌占优势的土壤环境的策略。休眠孢子的气生分布可能解释了芽胞杆菌在所研究的大多数栖息地均存在的原因。

炭疽杆菌：炭疽病的病原，炭疽杆菌是较大的革兰氏阳性，不动，形成芽孢的杆菌。炭疽芽孢杆菌的毒性取决于AT，以及γDPGA荚膜。毒素以及荚膜的基因分别由命名为pX01以及pX02的质粒携带(Mikesell等，Infect.Immun.39：371-76，1983；Vodkin等，Cell 34：693-97，1983；Green等，Infect.Immun.49：291-97，1985)。

AT由三个实体组成：PA(AT的结合亚基)，以及2个被称为LF以及EF的酶(Mikesell等，Infect.Immun.39：371-76，1983；Vodkin等，Cell 34：693-97，1983)。PA是作为炭疽病疫苗的主要保护性组分的83kDa蛋白。PA结合于细胞上的炭疽毒素受体(ATR)，然后由弗林蛋白酶蛋白分解性裂解，释放20kDa片段(Bradley等，Nature 414：225-29，2001；Klimpel等，PNAS 89：10277-81，1992)。63kDa PA残余物(PA₆₃)特征在于第二结合功能域以及结合于89kDa蛋白EF形成水肿毒素，或者90kDa蛋白LF形成致死毒素(LeTx)(Leppla等，Salisbury Med.Bull Suppl 68：41-43，1990)。产生的复合物被内在化在内涵体以内的细胞中(Singh等，Infect.Immun.67：1853-59，1999；Friedlander，J.Biol.Chem.261：7123-26，1986)。

炭疽芽孢杆菌的γDPGA荚膜作为炭疽病感染期间的必需毒力因子，通过抑制巨噬细胞对营养型细胞的噬菌作用抑制宿主防御机制。虽然其它芽胞杆菌产生D-以及L-型混合物形式的γPGA，仅仅炭疽芽孢杆菌已知合成D-构象(Kovács等，J.Chem.Soc.4255-59，1952)。当注射时，γDPGA已经被证明是较弱的免疫原(Eisner，Schweiz.Z.PatholBakteriol.22：129-44，1959；Ostroff等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.99：345-47，1958)。荚膜也保护营养型炭疽芽孢杆菌免于由单克隆抗体凝集到其细胞壁多糖(Ezzell等，J.Clin.Microbiol.28：223-，1990)。

载体：可以结合半抗原或抗原诸如γPGA的均聚物的免疫原性分子。结合的分子结合于载体时可以更具免疫原性。选择载体增加结合的分子的免疫原性和/或引发针对载体的抗体，所述抗体具有诊断，分析和/或治疗上的益处。分子与载体的共价连接赋予提高的免疫原性以及T-细胞依赖性(Pozsgay等，PNAS 96：5194-97，1999；Lee等，J.Immunol.116：1711-18，1976；Dintzis等，PNAS 73：3671-75，1976)。有用的载体包括聚合物载体，其可以是天然的(例如，来自细菌或病毒的蛋白)，半合成的或合成的物质，含有可以连接反应物部分的一或多个官能团。

用作载体的细菌产物的实例包括细菌毒素，诸如炭疽芽孢杆菌PA(包括含有至少一个能够引发免疫应答的抗原表位以及类似物或衍生物的片段)，LF以及LeTx，及其它细菌毒素以及类毒素，诸如破伤风毒素/类毒素，白喉毒素/类毒素，P.aeruginosa外毒素/类毒素/，百日咳毒素/类毒素以及C.perfringens外毒素/类毒素。病毒蛋白，诸如乙型肝炎表面抗原以及核心抗原也可用作载体。

共价键：两个原子之间的原子间键，特征在于共用一或多个原子的电子对。术语“共价结合的”或“共价连接的”指使两个单独的分子制备成一个连续分子。该术语包括用插入接头分子将半抗原或抗原间接连接到载体分子。

表位：抗原决定簇。他们是抗原分子上的特定的化学基团或非-连续的肽序列，也就是引发特异性免疫应答。抗体结合基于抗体以及匹配(或同源)表位的三维结构的特定抗原表位。

γPGA：由γ肽键连接的谷氨酸残基的均聚物。构成γPGA均聚物的谷氨酸残基可以只是L型(γLPGA)或只是D型(γDPGA)。当构成γPGA均聚物的谷氨酸残基的形式可以是L型或D型，或者当两个形式混合在一个单一的分子中时，使用术语γPGA。许多种芽胞杆菌上发现的弱免疫原性以及抗吞噬荚膜由γPGA组成，所述荚膜使芽胞杆菌免于免疫监视。

γPGA结合物：由炭疽芽孢杆菌或另一芽胞杆菌种或菌株产生的天然存在的γPGA多肽，其以共价连接于载体，以及具有多肽片段的载体的结合物，合成的多肽，或γPGA多肽的化学修饰的衍生物。在一些实施方案中，γPGA结合物将包含载体蛋白与合成的γPGA多肽的结合物，所述合成的γPGA多肽具有选择的肽长并对应于来自具有γPGA荚膜的炭疽芽孢杆菌或另一芽胞杆菌种或菌株的γPGA多肽的一部分。

半抗原：通常是小分子的分子，其本身不是免疫原，但可以与抗体特异性结合，而且不是免疫原性的，除非与载体分子结合。

均聚物：该术语是指由多个单位的单一类型的分子，诸如单个单体(例如，氨基酸)结合在一起形成的聚合物。

免疫应答：免疫系统的细胞，诸如B-细胞，T-细胞，巨噬细胞或多形核细胞对刺激物的应答。免疫应答可以包括参与宿主防御应答的身体任何一种细胞，例如分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于先天的免疫应答或炎症。

免疫原性结合物或组合物：该术语是指可用于刺激或引发脊椎动物特异性免疫应答(免疫原性应答)的组合物。在一些实施方案中，免疫原性应答是保护性的或提供保护性免疫，因为它能使脊椎动物更好地抗免疫原性组合物所针对的生物的感染或者抗疾病的发展。一种类型的免疫原性组合物的一个具体实例是疫苗。

免疫原：能在合适的条件下刺激抗体的产生或者动物的T-细胞应答的化合物，组合物或者物质，包括注射或者被动物吸收的组合物。

免疫有效剂量：本发明的γPGA结合物的免疫有效量是治疗有效并将预防，治疗，减轻或者缓解严重性，程度或者在疾病或者病症期间例如由炭疽芽孢杆菌的感染。

抑制或者治疗疾病：抑制在患诸如炭疽病的疾病的危险中的受试者疾病或者病症的全面发展。“治疗”是指开始进行以后改善疾病或者病理学病症的信号或者病征的治疗性干预。此处使用的关于，病理学病症或者病征的术语“改善”是指治疗任何一种看得见的有益的效果。有益的效果可以例如由易感受试者临床症状的延迟发病，疾病减慢发展，疾病复发次数的减少，受试者总体健康状态或者舒适感的改进，或者其它本领域已知的特异于特定疾病的参数井证明。

分离的：“分离的”微生物(诸如病毒，细菌，真菌或者原生动物)已经基本上与不同类型的微生物，菌株，或者种分离或者纯化。可以通过各种技术，包括连续稀释和培养分离微生物。

“分离的”生物学组分(诸如核酸分子，蛋白或者细胞器)已经基本上与生物体细胞中的其它生物学组分分离或者纯化，在生物体的细胞中天然存在组分，诸如其它染色体的和染色体外的DNA和RNA，蛋白和细胞器。已经“分离的”核酸和蛋白包括通过标准的纯化方法纯化的核酸和蛋白。该术语也包括由宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白，以及化学合成的核酸或者蛋白或者其片段。

调理素：大分子，结合于微生物表面，并可以由嗜中性粒细胞和巨噬细胞的表面受体识别而且提高了微生物的噬菌作用的效率。调理素包括IgG抗体，其由吞噬细胞上的Fcγ受体识别，补体蛋白的片段，其由CRl(CD35)并由白细胞整联蛋白Mac-1识别。

调理吞噬作用：将调理素与微生物表面连接来靶向用于噬菌作用的微生物。

基于PA的免疫原：在这里使用的该术语是指所有形式的PA，其可用于免疫原性组合物和/或公开的方法，包括未修饰的天然或者重组炭疽芽孢杆菌PA，或者其变体或者片段。PA的变体和片段可有效引发施用其的受试者抗-PA的免疫应答。

药用载体：用于本发明公开中的药用载体(介质)是常规的。Remington′s Pharmaceutical Sciences，by E.W.Martin，Publishing Co.，Easton，PA，15th版(1975)，描述了适于一或多种治疗性化合物或者分子，诸如一或多种SARS-CoV核酸分子，蛋白或者结合这些蛋白的抗体以及其他的药物试剂的药物递送的组合物和制剂。术语“药用载体”应该与如上所述的“载体”在半抗原/载体结合物或者抗原载体结合物方面区分开来。

通常，载体的性质将取决于所采用的施用的特定方式。例如，非肠道制剂通常包括含有药学以及生理学用液体诸如水，生理盐水，平衡盐溶液，水葡萄糖，甘油等等作为载体的可注射液体。对于固体组合物(例如，粉末，丸剂，片剂或者胶囊形式)而言，常规的无毒固体载体可以包括，例如药物级甘露醇，乳糖，淀粉或者硬脂酸镁。除生物学上中性的载体之外，待施用的药物组合物可以含有少量的无毒的助剂，诸如润湿或者乳化剂，防腐剂，以及pH缓冲剂等等，例如乙酸钠或者单月桂酸山梨醇酐酯。

多肽：单体是氨基酸残基的聚合物，所述氨基酸残基通过酰胺键相连。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-旋光异构体或者D-旋光异构体。在这里使用的术语“多肽”或者“蛋白”是指包括任一氨基酸序列并包括修饰的序列诸如糖蛋白。术语“多肽”具体是指包括天然存在的蛋白以及重组或者合成产生的蛋白。

术语“残基”或者“氨基酸残基”包括整合入蛋白，多肽或者肽的氨基酸。

保护性抗原(PA)：炭疽毒素的三个组分之一。PA分泌的无毒的蛋白，分子量83kDa并且是炭疽病疫苗的主要保护性的组分。PA结合于细胞上的ATR然后由弗林蛋白酶蛋白分解性裂解，释放20kDa的片段(Bradley等，Nature 414：225-29，2001；Klimpel等，PNAS 89：10277-81，1992)。63kDa PA残余物(PA₆₃)的特征在于第二结合功能域以及结合于89kDa蛋白的EF形成水肿毒素，或者90kDa蛋白的LF，形成致死毒素(LeTx)。PA的序列已知例如由GenBank登录号NC 007322(质粒pXO1；SEQ ID NOs：2和3，分别为核酸以及氨基酸序列)的碱基143779到146073编码。

蛋白：分子，尤其是多肽，由氨基酸组成。

纯化的：术语“纯化的”不需要绝对的纯度；而是表示相对术语。因此，例如纯化的肽，蛋白，γPGA结合物或者其它活性物质是全部或者部分与蛋白或者其它污染物分离的。通常，用于本发明的基本上纯化的肽，蛋白，γPGA结合物或者其它活性物质包含在用于治疗性给药的完全药物制剂中超过80％的肽，蛋白，γPGA结合物或者其它活性物质与药物载体，赋形剂，缓冲液，促吸收剂，稳定剂，防腐剂，佐剂或者其它辅助组分混合或者配制之前存在于制剂中的所有的大分子。更典型地，纯化肽，蛋白，γPGA结合物或者其它活性物质表示在与其它制剂成份混合之前纯化的制剂中存在的大于90％，常常大于95％的所有的大分子。在其它情况下，纯化的制剂实质上是均质的，其中由传统方法未测出其它大分子。

治疗有效量：足以实现待用该药剂治疗的受试者预期效果的具体药剂的量。例如，这可以是用于提高受试者对炭疽芽孢杆菌感染所引起的疾病的抗性，预防，改善和/或治疗感染以及疾病的γDPGA结合物的量。理想地，药剂的治疗有效量是足以提高受试者对炭疽芽孢杆菌感染引起的感染以及疾病的抗性，预防，改善和/或治疗感染以及疾病的量，同时不引起受试者显著的细胞毒性效果。可用于提高针对受试者由炭疽芽孢杆菌感染引起的感染以及疾病的抗性，预防，改善和/或治疗感染以及疾病的药剂的有效量将取决于治疗的受试者，病痛的严重性，以及治疗性组合物的给药方法。

类毒素：细菌外毒素的无毒衍生物，例如由甲醛或者其它化学处理产生。类毒素可用于配制免疫原性组合物，因为它们保持了他们所衍生的毒素的大多数的抗原特性。

疫苗：疫苗是引发受试者预防或者治疗性免疫应答的组合物。有时，免疫应答是保护性的应答。典型地，疫苗引发针对病原体例如细菌或者病毒病原体的抗原，或者与病理学状态相关的细胞组分的抗原-特异性免疫应答。疫苗可以包括多核苷酸，肽或者多肽，多糖，病毒，细菌，细胞或者一或多种细胞组分。有时，可以灭活细菌或者细胞或者对其减毒预防或者降低感染的可能性，同时维持疫苗组分的免疫原性。

如上详述，在这里公开的免疫原性结合物具有下式I表示的结构。结合物可以是半抗原/载体结合物或者抗原/载体结合物。半抗原，抗原，载体以及连接基团(L)将在以下更详细地描述。任意特定组成的半抗原/抗原，载体以及连接基团(L)可以选自列于如下的具体的半抗原，抗原，载体以及连接基团。

结合结构的实例显示在如下的式II以及III中，其中载体是蛋白(显示于式II或III中的抗原，但是半抗原可以代替抗原)：

Pr-NH-C(O)-(R²)_y-C₆H₄-CH＝N-NH-C(O)-(C(R⁶)₂)_z-C(O)-NH-NH-抗原

抗原

-NH-C(O)-(R²)_y-C₆H₄-CH＝N-NH-C(O)-(C(R⁶)₂)_z-C(O)-NH-NH-Pr

其中R²是-(CH₂)_n-C(O)-，或-(CH₂)_n-N(H)-C(O)-；y是0或1；C₆H₄是苯环；n是1到6；Pr是蛋白；z是1到10；并且每一R⁶独立地是氢或烷基。

结合物结构包括腙键(＝N-NH-)，肼撑键(-NH-NH-)以及亚苯甲酰基部分-C(O)-C₆H₄-。

结合物的特定实例显示在如下的式IV中(己二酸二酰肼是载体蛋白的衍生基团，琥珀酰亚胺基甲酰基苯甲酸甲酯是抗原的衍生基团)：

抗原-NH-C(O)-C₆H₄-CH＝N-NH-C(O)-(CH₂)₄-C(O)-NH-NH-Pr

半抗原或抗原可以是通常如上所述的任意半抗原或抗原。半抗原或抗原的示例性例子包括肽，蛋白，多糖，糖脂，糖蛋白或其片段。半抗原可以是亚基，片段或来源于抗原的元件。例如，半抗原或抗原可以是致病生物，诸如病毒或细菌因子的抗原多肽的病原体，所述病原体在暴露于受试者之后产生不希望的病征。半抗原或抗原可以例如是减毒病毒，细菌和/或寄生物。其混合物也包含在本发明的范围内。半抗原或抗原可以另外包含仅仅一部分选自病毒，细菌以及寄生物的微生物的一部分。例如这种一部分可以是病毒衣壳。或者，该半抗原或抗原可以仅仅包含一或多种分子，其已经来源于病毒，细菌以及寄生物，诸如例如多肽，肽或核酸序列。此外，半抗原或抗原可以包含分子诸如例如多肽，肽或核酸序列，其仅仅包含病毒，细菌以及寄生虫衍生的多肽，肽或核酸序列的片段。这种分子可以包含超过一个片段。

抗原多肽可以是轮状病毒，或不同于轮状病毒的病毒的多肽。这种其它病毒的非限制性并且远非详细的实例包括腺病毒相关病毒，腺病毒，禽传染性支气管炎病毒，杆状病毒，水痘，冠状病毒，Cytomegaloviruis，Distemper，肠道病毒，Epstein Barr病毒，猫白血病毒(Feline leukemia virus)，黄病毒，口蹄疫病毒，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，肝炎E，Herpes，单纯性疱疹，流感病毒，HIV-I，HIV-2，HTLV1，流感A和B，Kunjin virus，Lassa发热病毒，LCMV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus))，慢病毒，囊虫，门果病毒(Mengo virus)，Morbillivirus，粘病毒，乳头状瘤病毒，Parovirus，副流感病毒，副粘病毒，细小病毒，Poko病毒，Polio病毒，多形瘤肿瘤病毒，伪狂犬病(pseudorabies)，狂犬病病毒，呼肠弧病毒，呼吸道合胞病毒，逆转录病毒，鼻病毒，Rinderpest，轮状病毒，西门利克森林病毒(Semliki forest virus)，仙台病毒，猿猴病毒40(Simian Virus 40)，辛德毕斯病毒(Sindbis virus)，SV5，蜱传脑炎病毒，Togavirus(风疹，黄热病，登革热)，牛痘病毒，委内瑞拉马脑脊髓炎，泡囊状斯托马季病毒(Vesicular stomatas)，metapneumovirus，norovirus，SARS病毒，天花病毒，微小RNA病毒，水痘带状疱疹以及West Nile病毒。

或者，抗原多肽可以细菌或其它病原体的多肽。示范性的细菌多肽包括无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)，醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)，优选A.anitratus，A.haemolyticus，A.alcaligenes以及A.lwoffii，伊氏放线菌(Actinomyces israelii)，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，产碱杆菌，优选A.faecalis，A.odorans以及A.denitrificans，Arizona hinshawii，炭疽杆菌，蜡状芽胞杆菌，脆弱拟杆菌，产黑素拟杆菌，百日咳杆菌，包氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)，回归热螺旋体，布鲁氏菌，优选B.abortus，B.suis，B.melitensis以及B.canis，肉芽肿荚膜杆菌，大肠弯曲菌(Campylobacter coli)(例如，CjaA多肽)，胎儿弯曲杆菌ssp.intestinalis，胎儿弯曲杆菌ssp.jejuni，衣原体，优选C.psittaci以及C.trachomatis，紫色菌，柠檬细菌，优选C.freundii以及C.diversus，肉毒杆菌，产气荚膜梭菌，Clostridium difficile，破伤风杆菌，白喉棒杆菌，棒状杆菌，优选C.ulcerans，C.haemolyticum以及C.pseudotuberculosis，伯氏考克斯氏体，Edwardsiella tarda，eikenella corrodens，肠杆菌，优选E.cloacae，E.aerogenes，E.hafhiae(也称作Hafhia alvei)以及E.agglomerans，红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，大肠杆菌，Flavobacterium meningosepticum，土拉热弗朗西丝氏菌(Francisellatularensis)，Fusobacterium nucleatum，Gardnerella vaginalis，Haemophilusducreyi，流感嗜血杆菌，Helicobacter(例如，H.pylori的UreB多肽)，克雷伯氏杆菌，优选K.pneumoniae，K.ozaenae或K.rhinoscleromatis，Legionella，问号钩端螺旋体，单核细胞增生利斯特氏菌，摩拉克氏菌，优选M.lacunata以及M.osloensis，牛结核杆菌，麻风分枝杆菌，结核分枝杆菌(例如，CFPlO多肽)，支原体，优选M.pneumoniae，淋病奈瑟氏菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，诺卡氏菌，优选N.asteroides以及N.brasiliensis，Pasteurella haemolytica，多杀性巴氏杆菌，Peptococcusmagnus，Plesiomonas shigelloides，Pneumococci，变形杆菌，优选P.mirabilis，P.vulgaris，P.rettgeri以及P.morganii(也分别称作Providenciarettgeri以及Morganella morganii)，Providencia，优选P.alcalifaciens，P.stuartii以及P.rettgeri(也称作雷氏变形菌(Proteus rettgeri)，铜绿假单胞菌，鼻疽假单胞菌，伪鼻疽假单胞菌，立克次氏体，Rochalimaiahenselae，沙门氏菌，优选S.enteridis，S.typhi以及S.derby，并且最优选Salmonella DT104类型的沙门氏菌，沙雷菌，优选S.marcescens，痢疾志贺氏菌，S.flexneri，S.boydii以及S.sonnei，鼠咬热小螺菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌，念珠状链杆菌，链球菌，优选S.faecalis，S.faecium以及S.durans，无乳链球菌，肺炎链球菌，酿脓链球菌μg例如，Sfbl多肽)，品他病密螺旋体(Treponemacarateum)，苍白密螺旋体(Treponema pallidum)，雅司螺旋体(Treponema pertenue)，优选T.pallidum，Ureaplasma urealyticum，霍乱弧菌，副溶血弧菌，小肠结肠子尔赞氏菌以及鼠疫耶尔森氏菌。

寄生物半抗原或抗原可以例如选自疟原虫(恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)，间日疟原虫(Plasmodium vivax)，三日疟原虫(Plasmodium malariae)，血吸虫，Trypanosonmes，利什曼原虫，血丝虫(Filarial nematodes)，滴虫，肉孢子虫，绦虫(牛带绦虫(Taeniasaginata)，猪带绦虫(Taenia solium))，利什曼原虫，龚地弓形虫，Trichinelosis(旋毛虫)或球虫(艾美耳属球虫)。

示例性的真菌半抗原或抗原可以得自选自新型隐球菌，白色念珠菌，烟曲霉以及球孢子菌的真菌。

半抗原或抗原也可以来源于任何一种动物，包括例如脊椎动物。例如半抗原或抗原可以包含来源于卵清蛋白，钥孔血兰素以及精子-鲸肌肉球蛋白的组分。

在具体的实例中，由本发明公开的方法制备的芽胞杆菌荚膜γPGA多肽-载体结合物(γPGA结合物)。γPGA结合物引发受试者的免疫应答并抑制或治疗由炭疽芽孢杆菌或其它芽胞杆菌所引起的感染和/或疾病。

由经γ肽键连接的谷氨酸残基组成的弱免疫原性和抗吞噬作用的γPGA胶囊使芽胞杆菌逃避免疫监视。在这里公开的芽胞杆菌荚膜γPGA多肽包括但不限于炭疽芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)以及枯草芽孢杆菌γPGA多肽。所有除炭疽芽孢杆菌之外的已知产生γPGA的芽胞杆菌制备D-和L-型的混合物，而炭疽芽孢杆菌仅仅产生γDPGA。在一个实施方案中，在这里公开的γPGA结合物是γLPGA结合。在另一实施方案中，γPGA结合物是γDPGA结合物。在一具体的非-限制性实例中，γDPGA结合物是炭疽芽孢杆菌γDPGA结合物。

芽胞杆菌荚膜γPGA多肽可以经本领域众所周知的众多方法分离，诸如分级盐析，苯酚提取，用有机溶剂(例如，十六烷基三甲基溴化铵(塞太弗伦)或乙醇)，亲和层析，离子交换层析，疏水层析，高效液相色谱法，凝胶过滤，等电点聚焦等等。在一个具体的非-限制性实例中，芽胞杆菌荚膜γPGA多肽经塞太弗伦沉淀，酸化到pH1.5，用乙醇沉淀以及通过0.2M NaCl中的2.5×100cm琼脂糖CL-4B柱提取自生长的芽胞杆菌的培养上清液。经本领域众所周知的方法，诸如¹H-核磁共振(NMR)波谱学和¹³C-NMR波谱学确定提取的γPGA多肽的组成；虽然可以经气液色谱法-质谱法(GLC-MS)确定其光学异构构型。

具有D-或L-构型的合成的改变长度(例如，约5，10，15或20个残基)的γPGA多肽可以经本领域众所周知的自动固相方法很容易地合成。合适的合成可以通过利用“T-boc”或“F-moc”法进行。固相合成的技术以及方法描述在Solid Phase Peptide Synthesis：A PracticalApproach，E.Atherton以及R.C.Sheppard，由IRL出版，牛津大学出版社，1989中。在具体的非-限制性实例中，合成的γPGA多肽包括约1到约20个谷氨酸残基，诸如约10到15个谷氨酸残基，或者约10个谷氨酸残基。合成的γPGA多肽的组成以及纯度可以经GLC-MS与基质辅助激光解析-电离飞行时间(MALDI-TOF)光谱测定法进行确定。

在另一个实例中，半抗原或抗原也可以包含超过一种不同的多肽和/或肽，诸如2，例如3，诸如4，例如5，诸如6，例如7，诸如8，例如9，诸如10，例如超过10种不同的多肽。在另一个实例中，半抗原或抗原含有或基本上由生物体优选微生物，或优选微生物的生物体的一部分组成，因此半抗原或抗原可以包含非常大量的不同的多肽，诸如超过100，例如超过500，诸如超过1000，例如超过2500种多肽。在本发明公开的内容中也包含半抗原或抗原可以基本上由一或多种多肽和/或肽组成。

合适的抗原或半抗原的实例包括用作单一疾病(“单一抗原”)或同时两种或多种疾病(“混合抗原”)的疫苗的任何一种抗原半抗原。混合抗原可以是两种或多种抗原或半抗原的混合物，或同时对两种或多种疾病具有抗原性的抗原，例如重组蛋白。作为抗原，可能使用整个生物体，例如病毒或细菌全细胞，或生物体的一部分，例如某种具有抗原性的蛋白。

合适的载体的实例是那些可以提高结合物的免疫原性和/或引发针对诊断，分析和/或治疗有益的载体的抗体的载体。有用的载体包括聚合物载体，其可以是包含一或多种官能团的天然的，半合成的或合成物质，所述官能团为例如可以连接反应物部分的伯和/或仲氨基，叠氮基，羟基或羧基。载体可以水溶性或不溶性的，并且在一些实施方案中是蛋白或多肽。满足这些标准的载体通常是本领域已知的(参见，例如，Fattom et al，Infect.Immun.58：2309-12，1990；Devi等，PNAS88：7175-79，1991；Szu等，Infect.Immun.59：4555-61，1991；Szu等，J.Exp.Med.166：1510-24，1987；以及Pavliakova等，Infect.Immun.68：2161-66，2000)。即使其所诱导的抗体对本身没有益处载体也可以是有用的。

水溶性多肽载体的具体的，非-限制性实例包括但不限于来自细菌或病毒的天然的，半合成的或合成的多肽。在一个实施方案中，用作载体的细菌产物包括细菌壁蛋白及其它产物(例如，链球菌或葡萄球菌细胞壁)，以及细菌的可溶性抗原。在另一实施方案中，用作载体的细菌产物包括细菌毒素。细菌毒素包括介导易感寄主的毒性效应，炎性应答，压力，休克，慢性后遗症或死亡的细菌产物。细菌毒素的特异性非-限制性实例包括但不限于炭疽芽孢杆菌PA(例如，由在这里引入作为参考的GenBank登录号NC 007322的143779到146073碱基编码)，包括与PA，包含至少一个抗原表位的片段，以及能够引发免疫应答的类似物或衍生物共用至少90％，至少95％或至少98％氨基酸序列同源性的变体；炭疽芽孢杆菌LF(例如，由GenBank登录号NC 007322的149357到151786碱基的互补序列编码)；细菌毒素以及类毒素，诸如破伤风毒素/类毒素(例如，美国专利5,601,826以及6,696,065描述的)；白喉毒素/类毒素(例如，美国专利4,709,017以及6,696,065描述)P.aeruginosa外毒素/类毒素(例如，如美国专利4,428,931，4,488,991以及5,602,095的描述)；百日咳毒素/类毒素(例如，如美国专利4,997,915，6,399,076和6,696,065的描述)。病毒蛋白，诸如乙型肝炎表面抗原(例如，如美国专利5,151,023和6,013,264的描述)以及核心抗原(例如，如美国专利4,547,367和4,547,368的描述)以及来自高等生物体的蛋白，诸如钥孔血兰素，马蹄蟹血蓝蛋白，麻仁球蛋白，哺乳动物血清白蛋白以及哺乳动物免疫球蛋白也可以用作载体。

水不溶性载体的具体非-限制性实例包括但不限于可以连接活性部分的氨基烷基琼脂糖(例如，氨基丙基或氨基己基琼脂糖；PharmaciaInc.，Piscataway，N.J.)，氨基丙基玻璃，交联的葡聚糖等等。也可以使用其他的载体，条件是官能团可用于共价连接活性基团。

连接基团(L)来源于由二酰肼衍生化作用以及苯甲醛衍生化作用形成的共价键。根据某些实施例，连接基团可以具有由下式V表示的结构：

-C(O)-(R²)_y-C₆H₄-CH＝N-NH-C(O)-(C(R⁶)₂)_z-C(O)-NH-NH-

其中R²，R⁶，z和y与上式II和III中的含义相同。

连接基团可以包括位于腙键和肼撑键之间的间隔基部分。间隔基部分通常具有线性主链结构。线性主链可以包括，例如，3-10个碳原子。尤其是，线性主链可以是6个碳原子长度。在特定实施例中，间隔基部分具有由下式VI表示的结构：

-C(O)-(C(R⁶)₂)_z-C(O)-

其中R⁶和z与上式II和III中的含义相同。

连接基团也包括亚苯甲酰基部分(-C₆H₄-C(O)-)。亚苯甲酰基部分来源于如下更详细描述的苯甲醛接头化合物。

尽管并不受任何一种理论的约束，人们相信二酰肼反应物提供了对产生的结合物赋予提高的免疫原性的间隔基部分。尽管并不受任何一种理论的约束，人们还相信从苯甲醛化合物键形成希夫-碱部分可以通过基本上减少腙键的可逆性改善产生的结合物的稳定性。尤其是，芳香环和键合到苯环的羰基(-C(O)-)的广泛共振系统有助于结合物的稳定化。例如，由所公开的方法产生的免疫原性结合物在室温下或以下，甘油(0.1-10％)的存在下，约6约7.5的pH的环境中是稳定的。免疫原性结合物的腙键可以由高浓度(超过1M)的乙酰肼逆转，并且腙键当在100℃于6N HCl或2N NaOH中加热1小时时裂解。此外，在这里公开的免疫原性结合物可以提供与由现有技术方法制备的免疫原性结合物相比优越的免疫原性。

本发明还公开了用于将半抗原或抗原结合到载体分子的方法，包括最初衍生或“激活”半抗原或抗原以及载体，然后将所产生的修饰半抗原或抗原与修饰的载体一起反应形成结合物。一个衍生化作用包括将二酰肼与半抗原，抗原载体反应。其它衍生化作用包括将苯甲醛化合物与半抗原，抗原或载体反应。在一个实施例中，半抗原或抗原与二酰肼反应，并且载体与苯甲醛化合物反应。在另一实施例中，半抗原或抗原与苯甲醛化合物反应，载体与二酰肼反应。修饰的半抗原或抗原与修饰的载体一起反应形成具有上式I所示的结构。

本发明公开的方法一个特征是式I的结合物中的腙键不需要还原成酰肼键。此外，合成法是特异性的，不引起任何显著的副反应，并且能实现高产率。

苯甲醛可以与半抗原，抗原或载体(例如蛋白)在足以形成具有式VII表示的结构的苯甲醛-修饰的化合物条件下反应：

半抗原-NH-C(O)-(R²)_y-C₆H₄-C(O)H

或

Pr-NH-C(O)-(R²)_yC₆H₄-C(O)H

其中R²是-(CH₂)_nC(O)-或-(CH₂)_nN(H)-C(O)-；y是0或1；C₆H₄是苯环；n是1到6；并且Pr是蛋白。根据某些实施例，苯甲醛修饰的蛋白可以具有由式VIII表示的结构：

Pr-Lys-NH-C(O)-(R²)_yC₆H₄-C(O)H

其中Lys是赖氨酸残基。

从式VII和VIII可以明显看出，用苯甲醛化合物的衍生化作用通常发生在半抗原，抗原或载体的至少一个自由氨基上。已经用琥珀酰亚胺基-烷基-苯甲醛(SBA)衍生化的苯甲醛-修饰的化合物在这里也指“SBA-Pr”，“SB A-抗原”以及“SB A-载体”。

通常，半抗原，抗原或载体的苯甲醛衍生化作用可以通过约5到约20mg/ml浓度，更尤其约8到约14mg/mL浓度的半抗原，抗原或载体与溶于约0.1mL二甲亚砜(DMSO)的苯甲醛化合物反应实现。该反应可以在约7到8的pH，存在合适量的磷酸盐，碳酸盐，甘油和/或盐(例如NaCl)的缓冲液中进行。DMSO的体积可以小于约10％的反应混合物。反应混合物中添加10％的甘油保护蛋白免于变性。该反应在约4到约25℃(通常约20℃)进行约1到约5小时，同时通过添加NaOH维持pH。

在半抗原，抗原或载体是蛋白的一个实施例中，可以使用的苯甲醛化合物的量可以由蛋白及其赖氨酸残基的量计算而来，并且例如，不应该超过赖氨酸残基量的总量。例如，牛血清蛋白(BSA)的分子量64kDa并且包含60个赖氨酸/BSA。10mg BSA相当于包含9.3微摩尔赖氨酸残基的0.156微摩尔。因此，能被使用的琥珀酰亚胺基-烷基-苯甲醛(SBA)(分子量，247)的量不应该超过9微摩尔(2.2mg)。pH 7.4时，SBA的量将衍生BSA的赖氨酸氨基，并且没有任何显著的副反应。

适用于本发明公开的方法的示例性的苯甲醛化合物可以由下式IX表示：

R³-C(O)-(R²)_y-C₆H₄-C(O)H

其中R²是-(CH₂)_n-C(O)-或-(CH₂)_n-N(H)-C(O)-；R³是氢，琥珀酰亚胺基-O-，琥珀酰亚胺基，琥珀酰亚胺基-N(H)-O-，烷基或氨基；y是0或1；C₆H₄是苯环；n是1到6。根据某些实施例，苯甲醛化合物可以是琥珀酰亚胺基甲酰基苯甲酸甲酯(SFB)，琥珀酰亚胺基-O-C(O)-(CH₂)_n-C(O)-C₆H₄-CHO或琥珀酰亚胺基-O-C(O)-(CH₂)_n-N(H)-C(O)-C₆H₄-CHO。

二酰肼可以与半抗原，抗原或载体(例如蛋白)在足以形成具有由下式X表示的结构的二酰肼修饰的化合物的条件下反应：

抗原-CO-NH-NH-C(O)-(C(R⁶)₂)_z-C(O)-NH-NH₂或

Pr-CO-NH-NH-C(O)-(C(R⁶)₂)_z-C(O)-NH-NH₂

其中R⁶和z与上式II和III中的含义相同。

用ADH衍生的二酰肼-修饰的化合物在这里也指“AH-抗原”，“AH-蛋白”或“AH-载体”。

用二酰肼衍生抗原，半抗原和载体的方法是本领域已知的(看到，例如Schneerson等，J.Exp.Med.152：361-76，1980；Kubler-Kielb等，J Bacteriol.186(20)：6981-901，2004年10月；Shrivastav，J.ImmunoassayImmunochem.25(3)：215-25，2002)。在某些实施例中，用二酰肼衍生化作用是单步法，意思是指二酰肼的一个肼基(-NHNH₂)部分与半抗原，抗原或载体的自由羧基直接形成酰胺键。换句话说，半抗原，抗原或载体不需要在与二酰肼反应之前用另一试剂进行初始衍生化作用或修饰。一种二酰肼衍生法包括将半抗原或抗原与二酰肼在肽偶联剂，优选水溶性碳二亚胺诸如1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺甲碘化物存在下反应。

适用于本发明公开的方法的示例性的二酰肼化合物可以由下式XI表示：

H₂NNH-R⁵-NHNH₂

其中R⁵是-C(O)-(C(R⁶)₂)_z-C(O)-(其中z是1到10；每一R⁶独立地是氢或烷基)。根据某些实施例，二酰肼可以是二羧酸二酰肼诸如己二酸二酰肼(ADH)，琥珀酸二酰肼，辛二酸二酰肼，癸二酸二酰肼，丙二酸二酰肼或戊二酸二酰肼。

苯甲醛修饰的化合物可以与二酰肼-修饰的化合物通过将苯甲醛-修饰化合物和二酰肼-修饰化合物的反应混合物处于足以形成腙键的条件下结合。例如，苯甲醛修饰的化合物可以与二酰肼修饰的化合物混合并且通过添加NaOH或者HCl，将pH保持在约6.0到约7.0约60分钟。反应混合物可以转入小瓶并在室温下翻倒24-48小时以及通过包含0.2M NaCl，0.05M磷酸盐，0.1％甘油以及1mM EDTA的缓冲液中的合适的填料柱(Sephadex)。可以使用其它缓冲液但是应该包含甘油和EDTA。可以收集级分分析蛋白和糖/肽，两种组分的抗原性和分子大小。或者，透析/超滤可用于将试剂与结合物分离。

在某些实施例中，用于与SBA-蛋白结合的AH-抗原的量可以由AH含量计算而来。例如，具有5％AH的AH-抗原包含2.8微摩尔的AH/mg。为了与10mg的用SBA衍生化的BSA结合，应该使用包含5.6到8.4微摩尔的AH的约2到3mg的AH-抗原。AH-抗原溶于0.1mL的合适的溶剂(DMSO，水或磷酸盐缓冲液，pH7.0)中。

半抗原或抗原以便载体结合之后，可以通过多种本领域技术人员熟知的技术纯化半抗原-载体结合物或抗原-载体结合物。纯化步骤的一个目的是从结合物除去未结合的半抗原或抗原。包括在硫酸铵存在下超滤的用于纯化的一种方法描述在美国专利6,146,902中。或者，结合物可以与未反应的半抗原/抗原以及载体通过多种标准技术包括，例如，筛析色谱法，密度梯度离心，疏水作用层析或硫酸铵分级分离纯化。参见例如，Anderson等，J.immunol.137：1181-86，1986以及Jennings& Lugowski，J.Immunol.127：1011-18，1981。结合物的组成以及纯度可以由GLC-MS以及MALDI-TOF光谱法测定。

在这里公开的结合物可以包括在药物组合物中(包括治疗性以及预防性制剂)，通常与一或多种药学上可以接受的载体，以及任选地其它治疗性组分(例如抗生素或抗炎制剂)组合在一起。

这种药物组合物可以通过多种粘膜给药方式施用于受试者，包括口服，直肠，鼻内，肺内或透皮递送，或通过局部递送到其它表面。任选地，结合物可以通过非-粘膜的途径，包括通过肌内注射，皮下注射，静脉注射，心房内，关节内，腹膜内或非肠道途径施用。在其它实施方案中，结合物可以通过直接暴露于来源于受试者的细胞，组织或器官离体外施用。

为配制药物组合物，结合物可以与各种药用添加剂以及用于分散结合物的基体或载体组合。需要的添加剂包括但不限于，pH控制剂，诸如精氨酸，氢氧化钠，甘氨酸，氯化氢，柠檬酸等。此外，可以包括局部麻醉药(例如，苯甲醇，isotonizing试剂(例如，氯化钠，甘露醇，山梨糖醇)，吸附型抑制剂(例如，吐温80)，溶解度加强剂(例如，环糊精及其衍生物)，稳定剂(例如，血清白蛋白)，以及还原剂(例如，谷胱甘肽)。诸如氢氧化铝(例如，Amphogel，Wyeth Laboratories，Madison，NJ)，弗氏佐剂，MPL ^TM(3-O-脱酰基单磷脂A；Corixa，Hamilton IN)以及IL-12(Genetics Institute，Cambridge MA)的助剂，以及许多其他本领域众所周知的合适的助剂也可以包括在该组合物中。当组合物是液体时，通过0.9％(w/v)生理盐溶液的渗涨度作为整体测定的制剂的渗涨度通常被调节到在给药位点不诱导显著不可逆的组织损伤的值。通常，溶液的渗涨度被调节到约0.3到约3.0，诸如约0.5到约2.0或约0.8到约1.7的值。

结合物可以分散在基体或载体中，所述基体或载体可以包括能分散结合物的亲水性化合物以及任一需要的添加剂。基体可以选自大量合适的化合物，包括但不限于聚羧酸或其盐，羧基酐(例如，马来酸酐)与其他单体(例如，(甲基)丙烯酸甲酯，丙烯酸等等)的共聚物，亲水性乙烯基聚合物，诸如聚醋酸乙烯酯，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素衍生物，诸如羟甲基纤维素，羟丙基纤维素等等，以及天然聚合物诸如脱乙酰壳多糖，骨胶原，海藻酸钠，明胶，透明质酸及其无毒的金属盐。常常可生物降解的聚合物被选为基体或载体，例如聚乙酸，聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物，聚羟基丁酸，聚(羟丁酸-羟基乙酸)共聚物及其混合物。或者或加之，诸如甘油聚合物脂肪酸酯，脂肪酸糖酯等等的合成脂肪酸酯可以用作载体。亲水聚合物及其它载体可以单独或者组合使用。并且可以通过部分结晶作用，离子键合，交联等等赋予提高的结构完整性。载体可以多种形式提供，包括用于直接应用到粘膜表面的液体或粘稠溶液，凝胶，糊剂，粉末，微球体以及膜。

结合物可以与基体或载体根据多种方法组合，并且可以通过扩散，分解载体，或关联形成水通道释放结合物。在一些情况下，结合物分散在由合适的聚合物，例如，异丁基2-氰基丙烯酸酯(参见，例如，Michael等，J.Pharmacy Pharmacol.43：1-5，1991)制备而来的微胶囊(微球体)或毫微囊剂(毫微球体)中以及分散在生物相容的分散介质中，所述分散介质产生延长时间内的持续递送以及生物活性。

本发明公开的组合物或者可以包含接近生理条件所需的药用介质物质，诸如pH调节剂以及缓冲剂，渗涨度调节剂，润湿剂等等，例如，乙酸钠，乳酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，单月桂酸山梨醇酐酯以及油酸三乙醇胺酯。对于固体组合物而言，可以使用的常规的无毒药用介质包括，例如，药物级甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，滑石，纤维素，葡萄糖，蔗糖，碳酸镁等等。

用于施用结合物的药物组合物还可以配制成溶液，微乳剂，或适于高浓度活性成份的其他有序结构。介质可以是溶剂或分散介质包含，例如水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇，液体聚乙二醇等等)，及其合适的混合物。例如可以通过利用诸如卵磷脂的包衣，通过保持可分散制剂所需的粒径，以及通过利用表面活性剂维持溶液适当的流动性。许多情况下，在组合物中需要包括等渗剂，例如，糖，多元醇，诸如甘露醇以及山梨糖醇或氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂产生结合物的延长吸收，所述试剂例如为单硬脂酸盐以及明胶。

在某些实施方案中，可以用缓释制剂施用结合物，例如包含缓释聚合物的组合物。这些组合物可以用防止迅速释放的介质，例如控释介质诸如聚合物，微密封的输送系统或生物吸附凝胶制备。公开的多种组合物的延长递送可以通过包含延迟吸收的组合物试剂，例如单硬脂酸铝水凝胶以及明胶产生。当想要控释制剂时，本发明公开的控释粘合剂包含对活性剂惰性的任意生物相容的控释物质并且其能够合并结合物和/或其他的生物活性剂。多种物质是本领域已知的。有用的控释粘合剂是在递送之后(例如，在粘膜表面，或体液存在下)在生理条件下缓慢代谢的物质。合适的粘合剂包含，但不限于用于缓释制剂的本领域众所周知的生物相容的聚合物以及共聚物。这种生物相容的化合物对周围组织无毒并且惰性，而且不触发显著的不良副作用，诸如鼻刺激，免疫应答，炎症等。它们被代谢成也与身体生物相容并且容易排出的代谢产物。

用于本发明公开的示范性的聚合物的材料包含但不限于来源于具有可水解的酯键的共聚以及均聚聚酯的聚合物基体。大量的这些材料是本领域已知的可生物降解并且产生不具有毒性或者低毒性的降解产物。示范性的聚合物包含聚乙醇酸以及聚乳酸，聚(DL-乳酸-共-羟基乙酸)，聚(D-乳酸-共-羟基乙酸)，以及聚(L-乳酸-共-羟基乙酸)。其它有用的可生物降解或可生物腐蚀的聚合物包含，但不限于，如聚(ε-己内酯)，聚(ε-aprolactone-共-乳酸)，聚(ε-aprolactone-共-羟基乙酸)，聚β-羟基丁酸)，聚(烷基-2-cyanoacrilate)，水凝胶的聚合物，诸如聚(甲基丙烯酸羟乙酯)，聚酰胺，聚(氨基酸)(例如，L-亮氨酸，谷氨酸，L-天冬氨酸等等)，聚(酯脲)，聚(2-羟乙基DL-aspartamide)，聚缩醛聚合物，polyorthoesters，聚碳酸酯，polymaleamides，多糖及其共聚物。用于制备这种制剂的多种方法是本领域已知的(参见，例如，Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，主编，MarcelDekker，Inc.，New York，1978)。其他的有用的制剂包含控释微胶囊(美国专利4,652,441和4,917,893)，用于制备微胶囊及其它制剂的乳酸-羟基乙酸共聚物(美国专利4,677,191和4,728,721)并用于水溶性肽的缓释组合物(美国专利4,675,189)。

本发明公开的药物组合物通常是无菌的并且在生产，储存以及使用条件下稳定存在。可以通过将需要量的结合物掺入具有根据需要一种或组合的在这里列举的组分的合适的溶剂中，然后过滤灭菌制备无菌溶液。通常，通过将结合物和/或其它生物活性剂掺入包含基本分散介质以及需要的在这里列举的其他组分的无菌介质中制备分散体。在无菌粉末的情况下，制备方法包含真空干燥以及冷冻干燥，其产生结合物的粉末加上任意其他想要的来自其预先无菌-滤过的溶液的组分。可以通过多种抗细菌以及抗真菌剂例如，对羟苯甲酸，氯代丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞等等实现微生物的预防作用。

根据本发明所公开的多种治疗方法，结合物可以与控制需要治疗或预防的病症控制相关的常规方法的方式递送给受试者。根据本发明公开的内容，结合物和/或其它生物活性剂的预防或治疗有效量被施用于一个时期需要这种治疗的受试者并且施用条件足以预防，抑制和/或改善选择的疾病(例如，炭疽病)或病症或其一或多种病征。

本发明公开的主题由下列非-限制性实施例进一步说明。

实施例

实施例1

材料和方法

菌株

通过43℃重复传代获自Ames菌株的B.pumilus，菌株Sh18(Goodman等，Biochem.7：706-10，)以及炭疽芽孢杆菌株A34，pX01^-，pX02⁺变体由Klein等(Science 138：1331-33，1962)描述。

聚-γ-谷氨酸

通过酸化到pH 1.5，用乙醇沉淀，以及通过0.2M NaCl中的2×100cm Sepharose CL-4B柱，从炭疽芽孢杆菌或B.pumilus的培养上清液(Myerowitz等，Infect.Immun.8：896-900，1973)提取聚-γ-谷氨酸γPGA。每一γPGA的组合物由¹H-NMR和¹³C-NMR证实并且由GLC-MS波谱学确定其光学异构组成。

分析

通过用6N HCl水解1小时后由GLC-MS在150℃进行氨基酸分析，衍生化到七氟丁酰R-(-)异丁基酯并用具有HP-50.32×30mm玻璃毛细管柱的Hewlett-Packard仪器(Model HP 6890)分析，在8℃/min的程序升温，电子电离(106eV)模式(MacKenzie，J.Assoc.Off.Anal.Chem.70：151-60，1987)从125℃到25O℃。在这些条件下，从L-光学异构体分离D-谷氨酸从而可以基于蛋白中D-谷氨酸相对于L-谷氨酸残基的比例计算各自比例(图1)。L-肽结合物中肽链的数目通过总L-谷氨酸相对于天冬氨酸的提高计算L-肽结合物。通过Lowry等(J.Biol.Chem.193：266-73，1951)的方法测定蛋白浓度，由Fields′分析(Biochem.J.124：581-90，1971)测定游离ε氨基，由2-吡啶基硫基(A₃₄₃)的释放测定硫化水平(Carlsson等，Biochem.J.173：723-37，1978)，以及经Schneerson等(J Exp.Med.152：361-76，1980)的报道测定酰肼(J Exp.Med.152：361-76，1980)。根据生产商说明书利用14％凝胶的SDS-PAGE。在PBS中的1.0％琼脂糖凝胶上进行双向免疫扩散。

MALDI-TOF

用线性模式，25kV加速电压以及300毫微秒离子提取延迟时间操作的PerSeptive BioSystems Voyager Elite DE-STR MALDI-TOF装置(PE Biosystems，Framingham，MA)获得质谱。经基质以及分析物的″夹心″制备用于分析的样品。首先，在样品阶段干燥1μl基质(sinnapinic酸的饱和溶液，在比例1∶1的CH₃CN和0.1％三氟乙酸中制备)。第二，应用1μl的样品以及其他的1μl基质。干燥“夹心”后，将样品置于质谱仪中。

抗原

用无热原水透析BSA(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)，无菌过滤并冷冻干燥。如Ramirez等(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.28：232-38，2002)和Johnsson等(J.Biotechnol.48：9-14，1996)所述制备来自炭疽芽孢杆菌的重组保护性抗原和来自P.aeruginosa的重组外毒素A并进行鉴定。经Merrifield的方法合成γPGA的示范性合成多肽(AnaSpec，San Jose，CA)，具有5，10，15或者20个残基的长度。经GLC-MS，LC-MS和MALDI-TOF验证它们的纯度和真实性。将γPGA多肽结合载体蛋白的C-或N-末端(-C显示C-末端是游离的；N-显示氨基-末端是游离的)。在氩下pH恒定滴定仪(pHstat)中实施AU反应。

I型：NBrAc-Gly₃-γDPGA_n-COOH(Br-Gly₃-γDPGA_n-C)

NBrAc-Gly₃-γLPGA_n-COOH(Br-Gly₃-γLPGA_n-C)

II型：NAc-L-Cys-Gly₃-γDPGA_n-COOH(Cys-Gly₃-γDPGA_n-C)

NAc-L-CyS-Gly₃-γLPGA_n-COOH(Cys-Gly₃-γLPGA_n-C)

III型：NAc-γDPGA_n-Gly₃-L-Cys-CONH₂(N-γDPGA_n-Gly₃-Cys)

NAc-YLPGAn-Gly₃-L-CyS-CONH₂(N-YLPGAn-Gly₃-Cys)

IV型：CHO-Gly₃-γDPGA_n-COOH

V型：NAc-γDPGA_n-Gly₃-CO-AH

NAc-γDPGA_n-CO-AH

VI型：NAc-γDPGA_n-Cys-CONH₂

BSA，rEPA和rPA与炭疽芽孢杆菌γDPGA和B.pumilusγDLPGA结合

用修饰的己二酸二酰肼(Schneerson等，J.Exp.Med.152：361-76，1980)衍生BSA，rEPA和rPA。pH保持在7.0并使用0.1M EDAC。产物，BSA-AH，rEPA-AH和rPA-AH包含2.0-4.8％的酰肼。

用0.01M EDAC将γPGA结合于rPA-AH或rEPA-AH，反应混合物通过0.2MNaCl中的1×90cm Sephacryl S-1000柱，并且经同一性系(identity line)收集与抗-PA和抗-γDPGA反应的级分。

经硫醚键将I型肽与rPA结合

第1步：用SPDP衍生BSA，rEPA和rPA

向rPA(30mg)的1.5ml缓冲液A′(PBS，3％甘油，0.005M EDTA，pH 7.6)，SPDP(10mg)的50μl二甲亚砜(DMSO)溶液中添加10μl等分样品并在pH7.6反应1小时。将产物，2-吡啶二硫-丙酰基-rPA(PDP-rPA)通过在缓冲液A(PBS，0.05％甘油，0.005M EDTA，pH7.6)中的1×48cmSephadex G-50柱，收集包含蛋白的级分并分析硫化水平，抗原性和分子量(Carlsson等，Biochem.J.173：723-37，1978)。

第2步：PDP-蛋白与I型肽结合

PDP-蛋白(24mg)的2ml缓冲液A溶液用50mM二硫苏糖醇在室温下处理30分钟并通过缓冲液A中的1×48cm Sephadex G-50柱。收集包含3-硫丙酰基-ε-Lys-NH₂-rPA(rPA-SH)的级分，浓缩到1.5ml并添加甘油至终浓度3％。10mg的Br-Gly₃-γ-DPGA_n-C的1ml Buffer A溶液调节到pH 7.6并添加rPA-SH，在室温下温育1小时(Inman等，Bioconj.Chem.2：458-63，1991)，转入小瓶，加盖并在室温下过夜翻转。添加0.5mg溴乙酰胺的50μl缓冲液A溶液封闭未反应的硫醇。30分钟后，反应混合物通过缓冲液B中的1×90cm Sephacryl S-200柱(0.01M磷酸盐，0.2M NaCl，0.05％甘油，pH7.2)。收集包含蛋白-γPGA的级分并分析肽和蛋白浓度，抗原性以及分子量。

产物：

每一摩尔的蛋白，BSA包含60，rPA包含58以及rEPA包含15摩尔的Lys。在这些条件下，用SPDP衍生BSA的60个ε-Lys-NH₂的28个，rPA的58个ε-Lys-NH₂的50-55个的以及rEPA的15个ε-Lys-NH₂的15个，并保持其抗原性。BSA-SH，rPA-SH和rEPA-SH与I型肽结合产生：

BSA-SH/Gly₃-cDPGA_n-C

BSA-SH/Gly₃-γLPGA_n-C

rEPA-SH/Gly₃-γDPGA_n-C

rPA-SH/Gly₃-γDPGA_n-C

与II，III和VI型肽结合

第1步：用SBAP衍生蛋白

将rPA或rEPA(30mg)的1.5ml Buffer A′溶液调节至pH 7.2。以10μl等分添加SBAP(11mg)的50μlDMSO溶液(Inman等，Bioconj.Chem.2：458-63，1991)。60分钟后，反应混合物通过缓冲液B中的1×90cm Sepharose CL-6B。收集包含溴乙酰氨基丙酰基-ε-Lys-NH-rPA(Br-rPA)的级分并分析蛋白的游离-NH₂，抗原性和分子量。

第2步：Br-蛋白与II，III和VI型肽的结合

用1N NaOH将5到15mg的II，III或VI型肽的缓冲液A溶液调节到pH 7.6。添加Br-蛋白(25mg)的1.5ml缓冲液A’溶液。1小时后，将反应混合物转入小瓶，加盖并在室温下过夜翻转，添加β-巯基乙醇(1μl)猝灭Br-蛋白中剩余的溴乙酰基。30分钟后，反应混合物通过缓冲液B中的1×90cm Sepharose CL-6B柱。收集包含蛋白-γPGA的级分并分析肽和蛋白浓度，抗原性以及分子量。

产物：

在这些条件下，分别用SBAP修饰rPA和rEPA的58个ε-Lys-NH₂残基的50-55个，以及15个ε-Lys-NH₂残基的15个。rPA_形式的58个ε-Lys-NH₂有30个游离，并且用SBAP衍生基本上将所有的30个ε-Lys-NH₂转化成溴乙酰化衍生物，Br-rPA_形式。

Br-rPA和Br-rEPA与II型肽结合产生4个结合物：

rPA/S-Cys-Gly₃-γDPGA_n-C

rPA/S-Cys-Gly₃-γLPGA_n-C

rEPA/S-Cys-Gly₃-γDPGA_n-C

rEPA/S-Cys-Gly₃-γLPGA_n-C

Br-rPA和Br-rEPA与III型肽结合产生4个结合物：

N-γDPGA_n-Gly₃-Cys-S/rPA

N-γLPGA_n-Gly₃-Cys-S/rPA

N-γDPGA_n-Gly₃-Cys-S/rEPA

N-γLPGA_n-Gly₃-Cys-S/rEPA

经免疫扩散随着与它们的蛋白和γPGA抗血清的同一性反应沉淀所有的8个结合物。经MALDI-TOF的典型分析显示于图2中。

Br-rEPA与VI型肽结合产生：

rEPA/Cys-γDPGA_n-N

Br-rPA_形式与N-γDPGA_n-Gly₃-Cys III型肽结合产生：

rPA_形式/Cys-Gly₃-γDPGA_n-N

IV型肽与BSA，rEPA和rPA经腙键的结合

将4-甲酰丙甲酰-γDPGA(CHO-γDPGA)结合于pH7.0磷酸盐缓冲液中的BSA-AH，rEPA-AH或rPA-AH，CHO-γDPGA与载体蛋白-AH的摩尔比为2∶1，在室温下进行24-48小时。反应混合物通过pH7.0的0.2M磷酸盐缓冲液中的1×90cm Sepharose CL-6B柱，收集与抗载体蛋白和抗-γDPGA抗体反应的级分。

BSA-AH，rEPA-AH或rPA-AH与IV型肽结合产生：

BSA-AH/CHO-Gly₃-γDPGA_n-C

rEPA-AH/CHO-Gly₃-γDPGA_n-C

rPA-AH/CHO-Gly₃-γDPGA_n-C

V型肽与BSA，rEPA，rPA，rPA_形式经腙键结合

第1步：用SFB对BSA，rEPA，rPA或rPA_形式衍生

向BSA(30mg)的1.2ml包含1％甘油的缓冲液A溶液中添加SFB(7.5mg)的100μl DMSO溶液并在pH 7.6反应1小时。产物，4-甲酰基苯甲酰基-BSA(CHO-BSA)通过缓冲液A中的1×48cm SephadexG-50柱。收集包含蛋白的级分并分析苯甲酰醛的存在，抗原性和蛋白浓度。分别利用4mg/ml rPA，rEPA和rPA_形式用SFB进行rPA，rEPA和rPA_形式的衍生。

第2步：CHO-BSA，CHO-rEPA，CHO-rPA或CHO-rPA_形式与V型肽结合

向CHO-BSA，CHO-rEPA，CHO rPA或CHO-rPA_形式(20mg)的1.25ml缓冲液A溶液中添加溶于pH 7.4的400μl的1M磷酸盐缓冲液的20mg V型肽。反应混合物的pH调节至7.0并在室温下温育48-72小时。混合物通过缓冲液A中的1×90cm Sepharose CL-6B柱并收集与抗载体蛋白和抗-γDPGA抗体反应的级分。

产物：

rPA_形式的58个ε-Lys-NH₂具有30个游离的(28个赖氨酸经甲醛处理修饰)，并用SFB衍生基本上将所有的30个ε-Lys-NH₂转化成4-甲酰基苯甲酰基-rPA_形式(CHO-rPA_形式)。CHO-BSA，CHO-rEPA，CHO-rPA或CHO-rPA_形式与V型肽结合产生：

BSA-CHO/AH-Gly₃-γDPGA_n-N

rEPA-CHO/AH-γDPGA_n-N

rPA-CHO/AH-γDPGA_n-N

rPA_形式-CHO/AH-Gly₃-γDPGA_n-N

BSA-CHO/AH与IV型肽经腙键结合

第1步：用SBAP衍生BSA

向BSA(56mg)的2.0ml Buffer A中添加pH 7.6的SLV(20mg)的200μl DMSO并在室温下反应1小时。将产物，BSA-LV-CHO通过缓冲液A中的l×48cm Sephadex G-50柱。收集包含蛋白的级分并分析蛋白浓度。

第2步：用ADH衍生BSA-LV-CHO

BSA-LV-CHO(35mg)的1.5ml pH 6.0的0.2M磷酸盐缓冲液与己二酸二酰肼(250mg)在pH 6.0，100μl甲硼烷-氢化物-吡啶复合物(800μmoles)存在下反应48小时。产物，BSA-LV-CHO/AH通过缓冲液A中的1×48cm Sephadex G-50柱。收集包含BSA的级分，分析蛋白浓度以及-AH衍生化水平。

第3步：

BSA-LV-CHO/AH与IV型肽结合

将BSA-LV-CHO/AH(20mg)的1.5ml，pH 6.0的0.2M磷酸盐缓冲液的溶液与10mg IV型肽，pH 6.0混合。60分钟后，添加100μl的甲硼烷-氢化物-吡啶复合物(800μmoles)，48小时后，产物通过缓冲液A中的1×48cm Sephadex G-50柱。收集与抗-BSA以及抗-γDPGA抗体反应的级分。

BSA-LV-CHO/AH与IV型肽结合产生：

BSA-SL-AH/CHO-Gly₃-γDPGA_n-C

免疫

以2-周间隔用2.5μgγPGA作为0.1mlPBS中的结合物s.c.3次免疫5到6-周龄雌性NIH GP小鼠，第二或第三次注射后7天对10只小鼠组抽血(Schneerson等，J.Exp.Med.152：361-76，1980)。对照接受PBS。

抗体

经ELISA(Taylor等，Infect.Immun.61：3678-87，1993)测定血清IgG抗体。Nunc Maxisorb平板涂有γDPGA，20μg/ml PBS或4μgrPA/ml PBS。在室温下平板用PBS中的0.5％BSA(或用用于分析BSA结合物的0.5％HSA)封闭2小时。使用MRX Dynatech读数器。相比标准血清计算抗体水平：对于γDPGA，经多次i.p.注射福尔马林-处理的炭疽芽孢杆菌菌株A34制备超免疫鼠血清并赋值100ELISA单位(EU)，对于PA包含4.7mg Ab/ml的mAb(Little等，Infect.Immun.56：1807-13，1988)。用Biostatistics and Information Management Branch，CDC(Plikaytis等，User′s Manual 12 CDC，1.00版本，1996)提供的ELISA数据处理程序计算结果。IgG水平表示为几何平均值(GM)。

调理吞噬作用

将炭疽芽孢杆菌菌株A34的孢子维持在每ml 1％苯酚中5×l0⁸个孢子的水平。扩大人细胞系，HL-60(CCL240，ATCC，Rockville，MD)并经二甲基甲酰胺区别成44％中幼粒细胞和晚幼粒细胞，以及53％条带和多形核白细胞(PMLs)。PMLs效应因子/靶细胞的比例为400∶1。离心PMLs并再悬浮在调理吞噬作用缓冲液中(Hanks′缓冲液，具有Ca²⁺，Mg²⁺和0.1％明胶(Life Technologies，Grand Island，NY))，每ml2×10⁷个细胞。在20％CO₂中每ml 5×10⁷个孢子培养孢子，并烯释到每毫升5×10⁴个孢子。用0.05ml的调理吞噬作用缓冲液烯释2-倍的血清，并将0.02ml(包含约10³细菌)添加到24-孔组织培养平板的每一孔中(Falcon，Franklin Lakes，NJ)。在37℃5％CO₂中温育平板15分钟。向每一孔添加0.01ml的等分剥夺初乳的小牛血清(补体)以及0.02ml的包含4×10⁵个细胞的HL-60悬浮液，并在37℃5％CO₂中伴随220rpm混合温育45分钟。将来自每一孔的0.01ml等分添加到50℃胰蛋白酶大豆琼脂，次日早晨确定CFU。

与对照孔中的生长相比较≥50％的杀伤率定义为调理吞噬作用(Romero-Steiner等，Clin.Diagn.Lab.Immunol 4：415-33，1997)。

统计

ELISA值表示为GM。不成对的t检验用于比较不同组小鼠的GMs。

实施例2

血清IgG抗-γDPGA抗体

此实施例证明了由IgG抗-γDPGA抗体引发的炭疽杆菌γDPGA以及B.pumilusγD/LPGA的结合物。

在3次注射后来自炭疽杆菌杆菌夹膜的天然γDPGA后引发痕量的抗体水平(表1)。所有的结合物，相反，在两次注射后引发IgG抗-γDPGA抗体(表1)。炭疽杆菌γDPGA和B.pumilusγD(60％)/L(40％)PGA的结合物在注射两次并第3次加强后引发中等水平的IgG抗-γDPGA抗体(表1)。然而，在两种结合物的合成过程中形成了沉淀，导致低产量。当制备合成的γPGA结合物时，此问题没有被克服。

用16∶1密度的rPA/Cys-Gly₃-γDPGA10-C以及11∶1和14∶1的rPA-SH/Gly₃-γDPGA₁₀-C的肽十聚体获得最高水平的抗-γDPGA抗体(表1)。rPA是比rEPA或BSA更有效的载体(表1)。rPA-SH/Gly₃-γDPGA₁₀-C外，每一载体蛋白具有11个链，所有的结合物在第3次注射后引发增加的抗-γDPGA抗体(表1)。由L肽在C-或N-末端结合制备的结合物诱导低水平的IgG抗-γDPGA抗体(表1)。

表1.由γPGA与BSA，rEPA以及rPA的结合物在小鼠中引发的组合物以及血清几何平均值IgG抗-γDPGA和抗-载体蛋白抗体

^*γDPGA来自炭疽芽胞杆菌(菌株A34)，2.5μg，作为用于注射的结合物；经过ELISA获得的抗体表示为EU。

经过ELISA获得的抗体表示为μg Ab/ml。

不适用的。

^§没有进行。

或N是指结合于蛋白的γPGA上的自由氨基酸。

具有作为载体的rPA和rEPA的两种γDPGA结合物的剂量反应表明rPA是比rEPA更有活性的载体(表2)。两种肽具有20个谷氨酸残基，且每一载体蛋白具有相似数目的链。最低剂量的rPA-SH/Gly₃-γDPGA-C(2.5μg)引发IgG抗-γDPGA抗体的最高水平(9，133EU，表2)。20μg剂量时水平下降约一半(表2)。相比之下rEPA-SH/Gly₃-γDPGA-C在所有的剂量引发相似的水平(表2)。

表2.由结合于rPA或rEPA的20-聚体γDPGA制备的结合物的剂量/免疫原性关系

结合物	MolγDPGA/mol蛋白	蛋白/γDPGA(wt/wt)	剂量/小鼠(μgγDPGA)	抗-γDPGA3^rd注射
					rPA-SH/Gly₃-γDPGA₂₀-C	8	1∶0.25	2.551020	9152707034874901
rEPA-SH/Gly₃-γDPGA₂₀-C	6	1∶0.23	2.551020	1956239326392834

用0.1ml的结合物s.c.以两周的时间间隔注射5-6周龄的NIH通用小鼠(n＝10)，在第三次注射后的第7天取血。通过ELISA测定IgG抗-γDPGA且结果显示为几何平均数(9,152 vs.3,487，P＝0.003；9,152vs.4,901，P＝0.04；9,152vs.1,956，P＜0.0001；7,070vs.2,393，P＜0.0001)。

通过使用γDPGA-rPA结合物(rPA/Cys-Gly₃-γDPGA₁₀-N，每一载体蛋白具有22个链)以每一小鼠2.5μg-0.31μg范围内的剂量(20μg每小鼠用于比较)进一步测定γDPGA结合物剂量与免疫原性之间的关系。对γDPGA的最佳反应为1.25μg每小鼠(表3)。对rPA的反应随免疫剂量增加而增加(表3)。

表3.由结合于rPA的10-聚体γDPGA制备的结合物的剂量/免疫原性关系

利用两种γDPGA-rPA研究佐剂对免疫原性的影响。注射与氢氧化铝的结合物显著提高了对rPA的免疫反应(表4)。抗-γDPGA水平没有统计学上的差异(表4)。

表4.制剂效果

^*氢氧化铝(Alhydrogel)

^**甲醛处理(Porro等.，J.Infect.Dis.142：716-24，1980；Nencioni等，Infect.Immun.59：625-30，1991)。

实施例3

血清IgG抗-载体蛋白抗体

此实施例证明了除抗-γDPGA之外，炭疽芽胞杆菌γDPGA的结合物引发IgG抗-载体蛋白抗体。

除少数例外，每一载体蛋白的γDPGA链的长度与数目与IgG抗-载体蛋白抗体的水平相关(表1)。由含有20个残基的γDPGA多肽制备的结合物引发低水平的载体蛋白抗体(表1)。由每链5或10个谷氨酸残基制备的结合物，以及每载体蛋白具有≤15链的结合物引发最高水平的IgG载体蛋白抗体(表1)。

实施例4

小鼠抗血清的调理吞噬活性

此实施例证明了IgG抗-γDPGA抗体具有调理吞噬活性。

来自正常小鼠以及来自这些用rEPA或rPA免疫的小鼠的血清不具有调理吞噬作用活性。然而，在用BSA-SH/Gly₃-γDPGA₁₀-C或BSA-SH/Gly₃-γDPGA₁₀-C免疫的小鼠中，IgG抗-γDPGA抗体的水平和调理吞噬作用(r＝0.7，P＝0.03，表5)之间具有相关性。将来自炭疽芽胞杆菌的γDPGA添加到免疫血清中显示出约60％的调理吞噬作用滴度剂量相关的降低。

表5.由BSA-SH/Gly₃-γDPGA₁₀-C引发的调理吞噬作用和IgG抗-γDPGA抗体(ELISA)。

ELISA和调理吞噬作用滴度倒数之间的相关系数为0.7，P＝0.03。

尽管本发明公开的内容已通过特定的实施例来描述，但很显然，本领域的普通技术人员可对其进行变化对其进行应用，且可以理解本发明可采用与在这里具体描述的不同的方式来实施。因此，本发明的公开内容包括了所有由下述权利要求书限定的内容的精神与范围中的所有修改。

Claims

1.制备含有共价连接载体的半抗原或抗原的免疫原性结合物的方法，该方法包括：

将第一试剂与二酰肼反应产生肼修饰的第一试剂，其中第一试剂是半抗原，抗原或载体；

将第二试剂与苯甲醛化合物反应产生苯甲醛修饰的第二试剂，其中第二试剂是半抗原，抗原或载体，条件是第一试剂或第二试剂是载体；以及

将肼修饰的第一试剂与苯甲醛修饰的第二试剂反应产生含有经腙键共价连接载体的半抗原或抗原的免疫原性结合物。

2.权利要求1的方法，其中免疫原性结合物的腙键并不进行还原反应形成酰肼键。

3.权利要求1或2的方法，其中的二酰肼具有由下式表示的结构H₂NNH-R⁵-NHNH₂

其中R⁵为-C(O)-(C(R⁶)₂)_z-C(O)-；z为1至10；并且每一R⁶独立地为氢或烷基。

4.权利要求3的方法，其中的二酰肼是己二酸二酰肼。

5.权利要求1的方法，其中的苯甲醛化合物具有由下式表示的结构：

R³-C(O)-(R²)_y-C₆H₄-C(O)H

其中R²为-(CH₂)_n-C(O)-或-(CH₂)_n-N(H)-C(O)-；R³为氢，琥珀酰亚胺基-O-，琥珀酰亚胺基，琥珀酰亚胺基-N(H)-O-，烷基，或氨基；y为0或1；C₆H₄为苯环；以及n为1至6。

6.权利要求5的方法，其中的苯甲醛化合物是琥珀酰亚胺基甲酰基苯甲酸甲酯，琥珀酰亚胺基-O-C(O)-(CH₂)_n-C(O)-C₆H₄-CHO或琥珀酰亚胺基-O-C(O)-(CH₂)_n-N(H)-C(O)-C₆H₄-CHO。

7.权利要求1的方法，其中将第一试剂与二酰肼反应是单步法，其中第一试剂与二酰肼的肼基部分形成酰胺键。

8.权利要求1的方法，其还包括在药物组合物中包含结合物。

9.权利要求1的方法，其中第一试剂或第二试剂包括γPGA。

10.权利要求1的方法，其中第一试剂或第二试剂包括芽胞杆菌荚膜γPGA或合成的γPGA。

11.含有由下式表示的结构的免疫原性结合物：

X-L-Z

其中X是载体；

Z是半抗原或抗原；并且

L是共价键合X和Z的连接基团，其中L具有下列结构：

-C(O)-(R²)_y-C₆H₄-CH＝N-NH-C(O)-(C(R⁶)₂)_z-C(O)-NH-NH-

其中R²为-(CH₂)_n-C(O)-或-(CH₂)_n-N(H)-C(O)-；y为0或1；C₆H₄为苯环；n为1至6；z为1至10；并且每个R⁶独立地为氢或烷基。

12.权利要求11的结合物，其中载体含有细菌毒素，细菌类毒素，病毒蛋白质或哺乳动物血清白蛋白。

13.权利要求11或12的结合物，其中半抗原或抗原含有肽，蛋白，多糖，糖脂，糖蛋白。

14.权利要求13的结合物，其中半抗原或抗原来源于病毒或细菌。

15.权利要求11的结合物，其中Z包括γPGA。

16.权利要求11的结合物，其中Z包括芽胞杆菌荚膜γPGA或合成的γPGA。

17.权利要求11的结合物，其中的结合物包括半抗原/载体结合物。

18.权利要求11的结合物，其中的结合物包括抗原/载体结合物。

19.药物组合物，含有权利要求11至18任一项的结合物。

20.权利要求19的药物组合物，还包括一种或者多种药用载体和另一种治疗成分。

21.权利要求20的药物组合物，其中另一种治疗成分为抗生素或者抗炎制剂。