CN1809753B - 通过二维凝胶电泳分析包含生理可接受消化酶混合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分析样品同一性、蛋白质和/或肽模式以及稳定性的新方法，样品含有具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的生理可接受酶混合物，但特别是消化酶如胰酶制剂的混合物，特别是在包含所述酶混合物的药用产品的制造方面，例如脱溶胰酶制剂或者胰酶制剂微小微球体 <strong>。</strong>

Description

通过二维凝胶电泳分析包含生理可接受消化酶混合物的方法

技术领域

本发明涉及分析样品的同一性、蛋白质和/或肽模式以及稳定性的新方法，所述样品包含具有脂肪分解、蛋白水解和淀粉分解活性的生理可接受酶混合物，但特别是消化酶如胰酶制剂的混合物，特别涉及包含所述酶混合物如脱溶胰酶制剂(precipitated pancreatin)或胰酶制剂的微小微球体(mini-microsphere)的药用产品的制造方面。

背景技术

胰酶制剂是已知的具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的酶混合物，其是可以获得的，例如商品名Creon，其可以为颗粒、片剂或包含包有肠溶衣的微球体的胶囊，并且胰酶制剂在医学上可以用作酶替代品，例如在胰腺机能不全、胃手术后的消化机能不全、肝和胆疾病、囊性纤维化和慢性胰腺炎情况下。胰酶制剂通常是作为天然酶混合物通过从猪胰腺提取获得的，例如按照描述于德国专利申请DE25 12 746和DE 42 03 315中的方法，并且然后以本领域已知的方式将胰酶制剂制成预期的盖仑制剂形式。胰酶通常以固形制剂形式口服施用。

发明内容

本发明的目的是提供适于包含消化酶如胰酶制剂的药物制剂的新分析方法，特别是还涉及包含所述酶混合物如胰酶制剂或胰酶制剂的微小微球体的药用产品的制造方面。具体而言所述目的是提供用于验证药物制造的适合并可靠的分析方法，该方法分析并确定所述消化酶样品的同一性、蛋白质和/或肽模式以及稳定性。另一个目的是提供在最适于分析胰酶制剂(特别是脱溶胰酶制剂或胰酶制剂的微小微球体)条件下的所述分析方法。

根据本发明，具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的生理可接受的酶混合物，例如微生物来源的适当酶混合物和/或特别是动物来源的消化酶混合物，例如优选地为胰酶制剂或胰酶制剂样消化酶混合物，是按照基本上描述于本专利说明书的分析方法进行分析的。

对于本发明，能够分析任意动物或微生物来源的具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的生理可接受酶混合物。通过本发明方法分析的具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的酶混合物可以是纯微生物来源的和纯动物来源的，或者也可以是动物和微生物来源的酶混合物。

因此，在本发明的一个变体中，所使用的酶混合物是纯微生物来源的。特别是由细菌，即由杆菌属(Bacillus)或假单胞菌属(Pseudomonas)菌株，产生的酶，或者由如霉菌的真菌培养物，例如根霉菌属(Rhizopus)或曲霉属(Aspergillus)菌株，产生的酶特别适合作为微生物酶。在本领域的叙述中已经描述了此类生理可接受细菌和/或霉菌真菌酶的实例，例如与其合成和用于治疗消化不良的用途相关。脂肪酶可以来自例如杆菌属或假单胞菌属菌株，淀粉酶和脂肪酶可以来自霉菌真菌，例如根霉菌属菌株，并且蛋白酶也可以来自例如曲霉属。

然而，本发明一个优选的变体将涉及具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的消化酶混合物的用途，其特性近似于胰酶制剂。对于本发明，优选地使用包含胰酶制剂的消化酶混合物并且特别是胰酶制剂自身，并且如果期望，可以将脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶类的一种或多种微生物酶，即由微生物合成的酶，加入到胰酶制剂中或者包含胰酶制剂的消化酶混合物中。根据本发明最优选的方法适合用于分析脱溶胰酶制剂或胰酶制剂的微小微球体样品。

在本发明的一个变体中，根据本发明将分析的药物制剂优选地包括胰酶制剂或包含胰酶制剂的消化酶混合物。根据本发明所分析的这些药物制剂可以包括胰酶制剂或包含胰酶制剂的消化酶混合物，并且除了胰酶制剂还可能包含来自一组从微生物获得的脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶的一种或多种生理可接受酶。用于该添加剂中的微生物酶特别包括上面已经提及的细菌合成酶，例如由杆菌属或假单胞菌属菌株合成的细菌合成酶，或者由如霉菌真菌的真菌培养物，如根霉菌属或曲霉属菌株合成的细菌合成酶。除了胰酶制剂或包含胰酶制剂的酶混合物，所包含的脂肪酶可以来自例如杆菌属或假单胞菌属菌株，所加入的淀粉酶和脂肪酶来自霉菌真菌，例如根霉菌属菌株，并且所加入的蛋白酶还可以来自曲霉属。

目前已经发现具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的生理可接受酶混合物，如胰酶制剂或者可以从微生物和/或动物来源获得的并且参照本发明所描述的非动物来源酶混合物，能够按照本发明的方法进行非常有效地分析。本发明提供了用于分析和确定所述包含具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的生理可接受酶混合物的消化酶组合物或样品的同一性、蛋白质和/或肽模式以及稳定性的强有力且可靠(可重复)的方法。对于本领域技术人员很明显他可以某种程度上改变所给定的参数而不减少根据本发明的方法的全部功能性；例如可以期望调整在下面叙述中、实施例中、表和图中表明执行该方法的参数的+/-10％，特别是调整+/-5％。

因此，本发明适于通过二维凝胶电泳(2D GE)表征和/或说明包含具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的生理可接受消化酶混合物的蛋白质样品的分析方法，其中蛋白质样品用于制造用于治疗疾病和/或失调的药物制剂，所述方法包括：

(a)通过将酶混合物样品溶于用于凝胶电泳的溶剂组合物的样品制备，其中溶剂组合物包含适于溶解蛋白质物质的特定溶剂、用于蛋白质定量的内部标准和蛋白酶抑制剂；

(b)用于界定第一维凝胶电泳并应用梯度分离蛋白质级分的等电聚焦步骤；

(c)包括再缓冲的随后预处理步骤；

(d)转移至第二维凝胶电泳并通过SDS-PAGE分离；

(e)将步骤(d)所得到的凝胶固定并染色；和

(f)通过荧光扫描进行光密度测量法评价。

所述2D GE方法特别适于分析并确定包含具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的生理可接受消化酶混合物的所述消化酶组合物或样品的同一性、蛋白质和/或肽模式以及稳定性，蛋白质或肽级分的分子量为大于大约8kDa(千道尔顿)。在一个变体中本发明特别适于分析并确定胰酶制剂的同一性、蛋白质和/或肽模式以及稳定性，并且特别是所述胰酶制剂为脱溶胰酶制剂或者胰酶制剂的微小微球体。应用于执行本发明方法变体的参数下面详细描述于说明书中涉及“使用MALDI-TOF MS鉴定斑点”、“脱溶胰酶制剂的应激试验研究”、“通过2D凝胶电泳确定脱溶胰酶制剂样品的同一性和蛋白质模式的分析方法”的部分及相关表格中，并且通过本发明上下文中所给出的图进一步图解说明。

对于消化酶样品，例如胰酶制剂并且特别是脱溶胰酶制剂或者胰酶制剂的微小微球体，其中蛋白质或肽级分的分子量低于大约8kDa(千道尔顿)，根据本发明的变体通过另外关于分析用RP-HPLC方法的申请可以补充该方法。

如上面所定义本发明一方面涉及微生物合成的脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶酶混合物的分析。如上面所定义本发明另一方面涉及消化酶的胰酶制剂和/或胰酶制剂样混合物的分析。如上面所定义本发明另一方面还涉及胰酶制剂样品的分析，其中胰酶制剂样品是胰酶制剂或者胰酶制剂的微小微球体。

如上面所定义本发明另一方面涉及分析方法，其中(a)溶解样品步骤中所使用的溶剂是含7M脲、2M硫脲、4％(w/v)CHAPS、1％(w/v)DTT和0.5％Pharmalyte的pH 3-10的裂解缓冲液。

如上面所定义本发明另一方面还涉及分析方法，其中用于定量步骤(a)中所使用的蛋白质的内部标准是磷酸化酶B，优选地为兔磷酸化酶B，或者碳酸酐酶，优选地为牛碳酸酐酶。

如上面所定义本发明另外一方面涉及分析方法，其中蛋白酶抑制剂是Mini Complete和/或Pefabloc SC。

如上面所定义本发明另一方面进一步涉及分析方法，其中(a)溶解样品步骤中所使用的溶剂是Lp3，其由以下组成：

(i)溶于2ml裂解缓冲液的1.5mg Mini Complete，和

(ii)溶于2ml裂解缓冲液的1mg Pefabloc SC，

其中(i)和(ii)的比例为1∶1 v/v，

其中裂解缓冲液含有7M脲、2M硫脲、4％(w/v)CHAPS、1％(w/v)DTT和0.5％Pharmalyte

，pH 3-10。

如上面所定义本发明还涉及分析性2D GE方法，其中所述方法用于表征和定量分子量大于大约8kD的蛋白质和/或肽级分。

如上面所定义本发明另一方面涉及分析方法，该方法包括确定胰酶制剂的同一性和/或蛋白质和/或肽模式，胰酶制剂优选地为脱溶胰酶制剂样品或者胰酶制剂的微小微球体样品。

如上面所定义本发明另一方面涉及分析方法，该方法包括另外使用MALDI-TOF-MS鉴定蛋白质和/或肽斑点。

如上面所定义本发明一方面涉及分析方法，该方法作为应激性或稳定性试验进行以确定胰酶制剂和杂质和/或降解物的同一性和/或蛋白质和/或肽模式，胰酶制剂优选地为脱溶胰酶制剂样品或者胰酶制剂的微小微球体样品，并且任选地还包括定量所述蛋白质、肽、杂质和/或降解物。

如上面所定义本发明另一方面涉及分析方法，其中所述方法进一步包括通过RP-HPLC表征或定量分子量低于大约8kD的低分子量蛋白质和/或肽级分。

如上面所定义本发明另一方面还涉及适于通过2维凝胶电泳表征和/或说明具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的生理可接受酶混合物样品的溶剂组合物，其中生理可接受酶混合物用于制造治疗疾病和/或失调的药物制剂，溶剂组合物包括：

(a)适于凝胶电泳的溶剂并溶解蛋白质物质，其中溶剂是含7M脲、2M硫脲、4％(w/v)CHAPS、1％(w/v)DTT和0.5％Pharmalyte

的裂解缓冲液，pH 3-10；

(b)用于蛋白质定量的内部标准；和

(c)和蛋白质抑制剂。

该溶剂的变体中，使用的是溶剂组合物，其中溶解样品的溶剂是Lp3，其由以下组成：

(i)溶于2ml裂解缓冲液的1.5mg Mini Complete，和

(ii)溶于2ml裂解缓冲液的1mg Pefabloc SC，

其中(i)和(ii)的比例为1∶1 v/v，

其中缓冲液含有7M脲、2M硫脲、4％(w/v)CHAPS、1％(w/v)DTT和0.5％Pharmalyte

，pH 3-10。

下面所使用的一些缩略语和/或术语的列表：

mms             微小微球体(胰酶制剂的微小微球体)

HCl             盐酸

API             活性药物成分

NDA             新药上市申请

FDA             食品与药品管理局

MALDI-TOF MS    矩阵辅助激光解吸和电离质谱分析

UTLIEF          超薄层等电聚焦

ESI-MS          电喷射电离质谱分析

根据本发明的分析方法，特别是验证药物和调控目的之后，优选地试图用于表征和说明脱溶胰酶制剂背景并且还可以应用于胰酶制剂包有肠溶衣的微小微球体(胰酶制剂的微小微球体)。

例如，提交给NDA的关于活性成分脱溶胰酶制剂和剂型胰酶制剂包有肠溶衣mms的产品说明书涵盖酶的鉴定、纯度、测定法、胃液抗性和释放条目。鉴定工艺水平基于酶学测定法，酶学测定法用于确定API和剂型两种形式的酶的活性。“纯度”还包括确定残余溶剂(API，mms)、脂肪(API)、水(API，mms)和微生物学性质。考虑到目前FDA基于Q6B指南“生物技术/生物制品的说明书、测试方法和验收标准”的需求和期望，更加详细的表征对于药品和剂型是必需的，并且特别关注对不同类型酶、杂质和这些酶的降解物进行鉴定和定量。表征的结果和方法将选择用于详细说明背景。

因此本发明意图表征并详细说明2D凝胶电泳(2D GE)的使用，因为发现了尽管脱溶胰酶制剂是不同类型组分的复杂混合物，二维电泳仍然有希望提供最好的选择性以分离肽和蛋白质，即不同类型的酶、杂质和蛋白质的降解物。而且，染色凝胶成像允许对组分进行定量并比较胰酶制剂样品、脱溶胰酶制剂或胰酶制剂的微小微球体样品中的蛋白质和/或肽模式。本发明表明胰蛋白酶消化后通过斑点选择和MALDI-TOF MS能够完成最显著的斑点的鉴定。

一般而言，在样品脱盐之后，根据本发明通过2D GE方法的分离将在胰酶制剂样品或mms样品的水缓冲溶液的第一维电泳(步骤(b)等电聚焦)的凝胶上进行，使用pH梯度为3-10以覆盖宽范围的可能组分或化合物。聚焦在固定化电解质干燥条带(immobiline Dry Strip)带上进行。作为例证的起始梯度下面列表显示：

步骤(2D GE等电聚焦)	电压[V]一直到大约	时间[h]一直到大约
			1	150	4，优选地为1
2	300	4，优选地为1
			3	600	3，优选地为1
4	1200	1
			5	2400	1
6	3500	8，优选地为7.25

一般而言，根据本发明2D GE方法的第二维电泳(步骤(d)SDS-PAGE)中的分离将在使用如SDS-GLYCIN-TRIS缓冲液在手工制备凝胶(例如在以下条件：T＝13％，C＝3％)上进行，电泳使用下面表中列出的梯度：

步骤

电流[mA]大约如

电压[V]大约如

1	80	最大45
			2	150	最大200
3	10	安全电压

一般而言，使用例如乙醇/乙酸混合物固定之后用荧光燃料进行染色并随后在例如乙醇/乙酸中进行脱色。用水洗涤后，进行光密度扫描。然后，使用例如胶体考马斯亮蓝进行染色以通过MALDI-TOF MS进行鉴定。为了该目的，将从凝胶中挑取斑点并进行胰蛋白酶消化。使用例如乙腈/0.1％TFA从凝胶中洗脱肽并在C18 ZipTip柱上进行纯化。使用2，5-二羟苯甲酸共结晶后，用吸量管将提取物吸到目的板上。

作为举例说明在分析方法中本发明的适用性和有用性的实例，选择了三批三种脱溶胰酶制剂(腺体来自不同国家并用不同加工方法加工)，包括胰酶制剂SPL 85。对于每种脱溶胰酶制剂的每一批，将每批中的一个样品应用于凝胶进行三次分析以检验脱溶步骤、样品制备和分离的重复性。将斑点定量并鉴定特征斑点。

作为举例说明本发明在稳定性测试中的适用性和有用性的实例，将先前用于举例说明适用性和有用性的相同批次的样品置于应激条件下(温度、湿度、光)以确定任何活性损失并且然后还分析或观察差别并且，如果适用，可鉴定潜在的降解物。

如上面所指出，对于消化酶样品例如胰酶制剂并且特别是脱溶胰酶制剂或酶制剂的微小微球体，含有分子量低于大约8kDa(千道尔顿)的蛋白质或肽级分，根据本发明的一个变体可通过另外应用分析性RP-HPLC方法对本方法进行补充。应用于本发明RP-HPLC方法变体中的参数在下面详细描述于说明书涉及“具有MALDI-TOF-MS的RP-HPLC用于胰酶制剂分析的可行性”的部分中。

使用“MALDI-TOF MS”、“脱溶胰酶制剂应激试验研究”、“通过2D凝胶电泳确定脱溶胰酶制剂同一性和蛋白质模式的分析方法”鉴定斑点以及相关表格进一步在上下文中通过给出的图进行图解说明。

HPLC在很大程度上是自动化的、可重复性好的、广泛用于常规分析的高度选择性方法，该方法同样用于蛋白质分析。化合物定量是容易的并且能够通过LC-ESI-MS进行峰的鉴定。能够检测并鉴定低分子量肽和其他低分子量化合物以便使该方法补充例如2D凝胶电泳或SDS-PAGE。因此该方法可以特别地用于酶类、杂质和降解物的指纹分析、鉴定和定量。

通常HPLC方法涉及例如由以下组成的灵敏HPLC装置：自动采样器G 1313A；Quat.pump G 1311A；紫外分光光度检测器G 1314A；真空除气器G 1322A；HP柱加热炉G1316A；1100控制模块G 1323A；LAN-界面35900E和Chem-Server或等同的系统。典型的HPLC柱可以是例如MODULO O-CART QS UPTISPHERE 5 WRP、Interchim(UP5WRP$15QS)，具有RP 18固定相，5.0μm，长度为150mm且内径为3.0mm的不锈钢管材料；或者可比的相应HPLC柱。RP 18、5.0μm相是有益的，例如有可能使用100％水操作，并且对于蛋白质和肽是适当的。适当柱的其它实例是例如从Varian B.V.，Middelburg，TheNetherlands可获得的Polaris 5μm C18-A 150×4.6mm(商品订购号：A2000150×046)；或者例如MicroSolv技术公司，Long Branch，NJ07740，USA的Cogent Bidentate，C((Octyl)，4μm，300 A，150×4.6mm。

HPLC方法可以在以下例证条件下进行操作：

操作模式    梯度HPLC

流动相      流动相A    水/TFA 0.05％(v/v)

            流动相B    乙腈/TFA 0.05％(v/v)

梯度

时间[min]	％A	％B
				0	100	0	线性梯度至

75	10	90	线性梯度至
				75.1	100	0	无梯度
80	100	0	平衡

流率      1.0ml/分钟

分析期    75分钟

温度      20±5.0℃

注入柱    10μl

对于例如UV-检测器可以使用波长214nm。

使用MALDI-TOF MS鉴定斑点

根据本发明的一方面，分析方法包括从2D凝胶鉴定蛋白质斑点，例如脱溶胰酶制剂样品。使用MALDI-TOF MS进行的斑点鉴定更加详细描述于下面段落中。下面更加详细描述了2D凝胶电泳和MALDI-TOF MS的方法步骤。通过从进行2D凝胶方法获得的湿凝胶建立肽质量指纹图谱，并且通过附加的对未能清楚鉴定的斑点应用MALDI-MS/MS对蛋白质进行表征。

肽质量指纹图谱：

对于肽质量指纹图谱(PMF)，使用直径0.2cm的可操作吸量管手工从湿凝胶上切取各个斑点。然后将每个斑点转移至单独的管中(0.5ml)。使用特殊洗涤步骤：1.100μl 10mM碳酸氢铵，振荡5分钟，2.10mM碳酸氢铵、50％乙腈，振荡5分钟对考马斯亮蓝染色的斑点进行脱色。该过程必须重复至少3次或者直至全部斑点完全无色。最后一次洗涤步骤后将5μl乙腈加到每个管中。当斑点为白色时，依赖于管内凝胶的量可以加入2-6μl消化缓冲液。消化缓冲液为含有0.01μg/μl改性牛胰蛋白酶(Roche Diagnostics，Basel，Switzerland)的10mM碳酸氢铵。在37℃消化过夜。

消化后，取出上清液，在管中留下凝胶基质。如果没有留下上清液，将加入5-μl提取介质(1％TFA、50％乙腈)。在超声浴中超声作用10分钟后，将两个管转移至真空离心蒸发浓缩器中以去除乙腈。然后浓缩所述肽并通过使用C18 Zip-Tip(Millipore，USA)按照制造商说明书将样品脱盐。现在可以将提取的混合物转移至MALDI-MS靶(Applied Biosystems)上。将0.1μl量的样品与0.1μl DHBS基质(2，5二羟苯甲酸∶2羟基-5甲氧基-苯甲酸9∶1)混合。然后通过MALDI质谱仪测量靶(Voyager STR，Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)。反射器模式中使用质量范围600-4200道尔顿(Da)。由于基质效应低分子量范围(＜600 Da)难以检测。

示踪PMF波谱并且内部校准至2个质量已知自体胰蛋白酶的肽(805.42 Da；2163.05 Da)。通常校准的波谱具有小于50ppm的精确度。使用软件ProFound(Genomic Solutions，USA)对PMF进行数据库搜索。当采样点1和采样点2之间的缺口为至少e-04且能够解释最强质谱或者如果序列覆盖度相对较高(＞30％)时达到显著采样数。

鉴定结果列于下面表A并且图1显示使用示踪脱溶胰酶制剂的已鉴定斑点而获得的2D-凝胶。

而且，图2描述根据本发明方法的高度重复性。在不同的4天制备单一脱溶胰酶制剂样品的三个凝胶。

MALDI-MS/MS：

选择不能够通过PMF清楚鉴定的蛋白质斑点用于ProteomicsAnalyzer 4700(Applied Biosystems，Framingham，CA，USA)的MALDI-MS/MS分析。为了该目的，选择具有某些峰强度的肽并进行片段化以获得序列信息。使用Mascot软件(Matrixscience，London，UK)，将所获得的波谱片断用于搜索NCBI数据库(http://www.ncbi.nih.gov/)，National Center for BiotechnologyInformation，National Library of Medicine，Building 38A，Bethesda，MD 20894，USA。超过一定Mascot值的波谱是有意义的。在可疑的实例中进行手工控制。

表A显示通过MALDI-MS/MS获得的结果。

脱溶胰酶制剂的应激试验研究

根据本发明另一方面，2D凝胶电泳方法用于分析监测降解过程和/或监测脱溶胰酶制剂样品的稳定性。该稳定性试验更加详细描述于下面涉及脱溶胰酶制剂的应激(稳定性)试验的测试报告中。

根据本发明的另一方面，在应激试验中，对于(a)当应用于脱溶胰酶制剂时的稳定性试验，(b)定位应激试验中所形成的潜在降解产物，和(c)鉴定显示降解作用的斑点，观察了2D凝胶电泳(2D GE)方法的适应性。研究揭示出已经鉴定的一些斑点的显著变化，这对于包括于本研究中的两种类型脱溶胰酶制剂是可比较的。因此该方法被当作稳定性指示。

为了评价2D GE方法用于表征脱溶胰酶制剂的适应性，将脱溶胰酶制剂样品置于应激试验条件下贮存并且根据本法明方法进行观察。通过2D GE检测等份这些样品以确定进行应激试验所需要的持续时间并且寻找能够与胰酶制剂降解产物相关的斑点。

根据如下面详细描述的分析性方法“通过2D凝胶电泳鉴定同一性和蛋白质模式”进行应激试验。

对于应激试验使用了以下样品：

样品	贮存条件	时间点/天
			胰酶制剂N	40°/75％	0.16.32
胰酶制剂SPL 85	40°/75％	0.15.28

将大量20g脱溶胰酶制剂加入培养皿并用第二块培养皿覆盖。将样品置于40℃/75％相对湿度贮存。在开始时和1、2、4、8、16和32天后分别收获100mg样品。通过2D GE检测0、16和32天后取出的样品。将全部样品深度冰冻贮存，即-15℃以下，避光并保持一定湿度，直到这些样品用于研究。

通过2D凝胶电泳确定脱溶胰酶制剂样品同一性和蛋白质模式的分析方法

根据本法明方法一方面，2D凝胶电泳方法被用作通过2D凝胶电泳确定脱溶胰酶制剂样品同一性和蛋白质模式的分析性方法。文中更加详细地描述了该方法，使用以下缩略语：

CHAPS 3-(3-chol氨基丙基)二甲基铵基-1-丙烷-磺酸盐

DTT   二硫苏糖醇

TRIS  三(羟甲基)氨基甲烷

APS   过硫酸铵

TEMED N，N，N′，N′-四甲基乙二胺

SDS   十二烷基硫酸钠

所应用的2D GE方法说明书：

二维凝胶电泳(2D GE)分离技术(O′Farrell PH，J.Bi0l.Chem.250：4007-4021(1975))利用蛋白质复合体混合物各种组分的电泳迁移率，在第一维电泳中根据电荷(pI)通过等电聚焦(IEF)进行分离并且在第二维电泳中根据大小(Mr)通过SDS-PAGE进行分离。

一般而言，电泳是按照欧洲药典(Ph.Eur.2.2.31)进行的，并且在上下文中术语“水”无特别限制意思是指双蒸水或去离子水或等同性质的水。

在该方法中应用以下材料和试剂：

-  乙腈，例如Merck，产品编号1033530220

-丙烯酰胺，例如Serva，产品编号10688.02

-琼脂糖，例如VWR International，产品编号1.16802.0025

-过硫酸铵，例如Serva，产品编号13 375.01

-溴酚蓝，例如VWR International，产品编号1.08122.0005

-2-丁醇，例如VWR International，产品编号8.22263.1000

-CHAPS，例如Roth，产品编号1479.2

-DTT，1，4-二硫苏糖醇，例如Roth，产品编号6908.2

-电极纸，例如Amersham Biosciences，产品编号80-1106-19

-电极纸条，例如Amersham Biosciences，产品编号18-1004-40

-乙醇，例如VWR International，产品编号TC212-9025

-乙酸，例如Roth，产品编号3738.2

-固定化电解质干燥条，pH 3-10NL，例如AmershamBiosciences，产品编号17-1235-01

-甘油，例如Serva，产品编号23176

-甘氨酸，例如Roth，产品编号3908.3

-脲，例如Roche Diagnostics，产品编号1 685 902

-碘乙酰胺，例如Sigma，产品编号I-6125

-PharmalyteTM 3-10，Amersham Biosciences，产品编号17-0456-01

-蛋白质测试混合物4，例如Serva，产品编号39208.01

-蛋白质测试混合物5，Serva，产品编号39209.01

-Roti-Blue-浓缩剂，产品编号A152.1

-样品杯，例如Amersham Biosciences，产品编号18-1004-35

-SDS，十二烷基硫酸钠，例如Serva，产品编号20 763.02

-硅油，例如Serva，产品编号35132

-TEMED，例如Bio-Rad，产品编号161-0800

-硫脲，例如Fluka，产品编号88810

-TRIS，用于电极缓冲液，例如Roth，产品编号4855.2

-TRIS，用于其它溶液，例如Bio-Rad，产品编号161-0719在该方法中应用以下溶液：

(1)裂解缓冲液：

7M脲、2M硫脲、4％(w/v)CHAPS、1％(w/v)DTT、0.5％PharmalyteTM pH 3-10

(2)溶剂Lp3：

溶解于2ml裂解缓冲液1的1.5mg Mini Complete：溶解于2ml裂解缓冲液的1mg Pefabloc(1∶1 v/v)

(3)再水合溶液：

6M脲、2M硫脲、4％CHAPS、0.2％DTT、0.2％PharmalyteTM pH3-10、少许溴酚蓝

(4)凝胶溶液(T＝13％，C＝3％)：

75g甘油、425mL水、375mL分离胶缓冲液(5)、630mL丙烯酰胺溶液

(5)分离胶缓冲液：

将181.66g TRIS、4g SDS溶解于900ml水并且用盐酸R调整至pH8.8，用水调整至体积1000ml

(6)APS-溶液：

10％(w/v)过硫酸铵溶于水

(7)甘油溶液：

50％(v/v)甘油溶于水，加入少许溴酚蓝

(8)丁醇，用水饱和：

2-丁醇，贮于上面水中

(9)电极缓冲液：

19.9g SDS、299.6g甘氨酸、58.0g TRIS溶于20l水

(10)DTT-溶液：

1％DTT溶于平衡缓冲液

(11)碘乙酰胺溶液：

4％碘乙酰胺溶解于平衡缓冲液

(12)平衡缓冲液：

在水中溶解30％甘油、6M脲、4％SDS和33.40mL分离胶缓冲液(5)并将体积调至1000ml

(13)琼脂糖溶液：

将300mg琼脂糖和少许溴酚蓝溶解于60ml缓冲液(9)中并煮沸直到溶液变得澄清

(14)蛋白质标准溶液：

将10mg每种蛋白质测试混合物4和5溶解于1mL裂解缓冲液(1)。

通过加入小量溴酚蓝使溶液染色。蛋白质分子量为：6.5kDa、12.5kDa、21kDa、29kDa、45kDa、67kDa、97.4kDa。

(15)乙醇/乙酸混合物：7％乙酸、10％乙醇

(16)Sypro Ruby溶液，Biorad

(17)考马斯溶液：

一边搅拌一边将180mL水和60mL甲醇加入到60mL Roti-Blue

-浓缩剂中

Pefabloc SC说明书：

AEBSF 4-(2-氨乙基)-苯磺酰氟盐酸化物；它具有以下特性：在TLC中是均质的；公式：C8H10NO2SF x HCl；分子量：Mr＝239.5；丝氨酸蛋白酶的特异、有效且不可逆的抑制剂。Pefabloc SC的抑制活性可以与PMSF或DFP相比，然而，它是非毒性的。建议起始浓度是0.1-1.0mg/ml(0.4-4mM)。

Mini Complete说明书：

Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablet；它具有以下产品描述：特异性抑制剂；具有宽抑制特异性的几种蛋白酶抑制剂混合物。抑制丝氨酸、半胱氨酸和金属蛋白酶，以及钙蛋白酶。用于来自组织或细胞，包括动物、植物、细菌、酵母和真菌，的提取物。包含可逆的和不可逆的蛋白酶。溶解性/稳定性：在水性缓冲液中可溶、或者直接加到提取介质中。备选地，可在1.5ml水中制备7x贮存液或者100mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0。贮存液在4℃可稳定1-2周或者在-20℃稳定至少12周。通过透析能够去除Complete中的全部抑制剂。推荐使用截止值＞10kDa的膜。Complete能够在室温用于含硫醇溶液。建议起始浓度为：在10ml水性缓冲液或水中溶解一片片剂。如果存在非常高的蛋白水解活性，7ml缓冲液使用一片片剂。

使用以下装置或者使用技术人员已知的适当等同装置进行该方法：

-超声器：Bandelin electronics，Sonoplus，HD 2070

-再溶胀盘(Reswelling Tray)：固定化电解质干燥条再溶胀盘用于7-18cm IPG条；产品编号80-6371-84，Amersham Biosciences

-电泳仪：Multiphor II，产品编号18-1018-06，固定化电解质干燥条试剂盒，产品编号18-1004-30，Amersham Biosciences

-制胶器：DALT Multiple Gel Caster，产品编号80-6330-61，Amersham Biosciences

-灌制盒：Dalt Gel Cassette，产品编号80-6067-27，AmershamBiosciences

-分离片：Separator Sheets，产品编号80-6436-63，AmershamBiosciences

-Hoefer Dalt-分离室：IsoDalt凝胶电泳系统ID 440-230V，产品编号80-6068-98，Amersham Biosciences

-恒温装置：MultiTemp III恒温循环器，产品编号18-1102-78，Amersham Biosciences

-电泳电源：EPS 3501 XL电源，产品编号18-1130-05，Amersham Biosciences

-荧光扫描仪FLA3000(Raytest)

-ProteomWeaver 2.2(Definiens AG，80339  München，Germany)

附图说明

结果显示于表A-I和图1-7，它们描述了在脱溶胰酶制剂样品应激稳定性试验中所获得的2D凝胶。所述表和图的内容概括如下：

表A-I内容：

表A来自2D-GE具有NCBI数据库登记号的斑点(也见图1)

表B胰酶制剂批次1(t＝0和16天)的斑点强度，具平均值和标准差和相对t0的斑点调节。

表C胰酶制剂批次1(t＝0和16天)的斑点强度，具平均值和标准差和相对t0的斑点调节。

表D胰酶制剂批次1(t＝32天)的斑点强度，具平均值和标准差和相对t0的斑点调节。

表E胰酶制剂批次1(t＝32天)的斑点强度，具平均值和标准差和相对t0的斑点调节。

表F胰酶制剂批次2(t＝0和15天)的斑点强度，具平均值和标准差和相对t0的斑点调节。

表G胰酶制剂批次2(t＝0和15天)的斑点强度，具平均值和标准差和相对t0的斑点调节。

表H胰酶制剂批次2(t＝32天)的斑点强度，具平均值和标准差和相对t0的斑点调节。

表E胰酶制剂批次2(t＝32天)的斑点强度，具平均值和标准差和相对t0的斑点调节。

图1-7内容：

图1使用具已鉴定标记斑点的脱溶胰酶制剂所获得的2D-凝胶(也参见表J和K中的数据)

图2使用单一脱溶胰酶制剂样品2D-凝胶方法的重复性；在不同的4天进行3次凝胶电泳(IPG 3-10NL、荧光染色、外标准碳酸酐酶、应用量320ng)

图3应激试验后所获得的相对胰酶制剂批次1的2D-凝胶(SyproRuby)

图4应激试验后所获得的相对胰酶制剂批次2的2D-凝胶(SyproRuby)

图5对于胰酶制剂批次1所计算的平均凝胶数(n＝3)

图6对于胰酶制剂批次2所计算的平均凝胶数(n＝3)

图7添加两个内部标记蛋白质磷酸化酶B和碳酸酐酶的脱溶胰酶制剂的2D凝胶，如本说明书涉及分析性方法“同一性和蛋白质模式”部分中所描述获得。

具体实施方式

(A)样品制备

将所要检测的10mg脱溶胰酶制剂样品溶解于500μl Lp3。室温振荡5分钟后，离心悬浮液。将澄清的上清液用于测定蛋白质含量(Bradford)。两种不同的蛋白质用作内部标准，即磷酸化酶b(来自兔)和牛碳酸酐酶。在进行第一维凝胶分离之前将这些标准蛋白质加到样品中。为了改变澄清上清液的量(5-15μl)，加入2μl内部标准溶液1和6.7μl内部标准溶液2。

内部标准溶液1(磷酸化酶b)的制备：

制备磷酸化酶b溶液-通过在20℃振荡30分钟低压冻干于裂解缓冲液3中(Sigma，目录号：P-6635)，浓度为1μg/μl。

内部标准溶液2(碳酸酐酶)的制备：

制备碳酸酐酶溶液-通过在20℃振荡30分钟低压冻干于裂解缓冲液3中(Sigma，目录号：P-6403)，浓度为0.03μg/μl。

(B)固定化电解质干燥条再水合作用

待切割的IPG条(固定化电解质干燥条(T＝4％、C＝2.7％、pH3-10NL)以干燥和冰冻状态递送。使用之前，将条在再溶胀盘内再水合过夜。对于18cm条，使用350μL再水合溶液(3)。

(C)等电聚焦法(第一维电泳)

(C.1)经再水合的固定化电解质干燥条的制备：

将电聚焦槽的冷却块恒温至20℃。将再水合条浸泡入水中并放置于凝胶上面的水饱和滤纸片(贴附电极用纸)上。用水弄湿第二层滤纸片上，吸干以去除多余的水并将其放置于IPG凝胶条表面。轻轻将它们吸干几秒钟以去除多余的再水合溶液。

(C.2)按照以下步骤1-13进行本方法：

1.将冷却板放入Multiphor II电泳装置内。将5ml硅油移吸到冷却板上，随后将固定化电解质干燥条盘放在冷却板上面。避免盘和冷却板之间的大气泡。

2.将盘上的电极铅连接到Multiphor II装置。

3.向盘中倒入大约5ml硅油。

4.在油上面将固定化电解质条校准器放入盘内。

5.将经再水合的IPG凝胶条(凝胶侧面向上且酸性末端朝向阳极)转移入盘内校准器的相邻凹槽内。调整条从而使阳极凝胶边缘排齐。

6.切割两个IEF电极条或者从2mm厚滤纸(例如MN 440，Macherey&Nagel，Germany)制备的纸条，使得长度对应放于盘中的全部IPG凝胶条的宽度。用水浸泡电极条，通过用滤纸吸干去除多余水分并将弄湿的IEF电极条放置于阴极和阳极附近对齐的条顶端。

7.放置电极并轻轻向下将它们压到IEF电极条顶端。

8.将样品杯放到样品杯连接杆上。杯在样品杯连接杆上的位置足够高以避免接触到凝胶表面。将样品杯连接杆放置于一定位置，使得在样品杯和阳极(或者阴极，在阴极点样的情况下)之间存在几毫米的距离。

9.将样品杯移动至一定位置，使得每个IPG凝胶条上面一个样品杯，并且最后向下压样品杯以保证与每个条良好接触。

10.一旦样品杯放于适当位置，将大约50ml硅油倒入盘中从而完全覆盖IPG凝胶条。如果油漏入样品杯，吸出油，重新调整样品杯并检查是否再次漏油。用几滴硅油填满每个样品杯。

11.通过底层放置将样品吸至杯内，并且再次注意是否漏油。

12.关闭Multiphor II电泳槽的盖并按照下面表中给出的参数(运行条件)开始运行。对于对于改进的样品输入，电压限于低电压(150-300V)电泳最开始的几个小时。然后继续保持稳定状态。

pH 3-10NL运行条件：

步骤	电压[V]	时间[h]
			1	150	1
2	300	1
			3	600	1
4	1200	1
			5	2400	1
6	3500	7.25

[0221]13.当IEF运行完成后，从盘中取出电极、样品杯连接条和IEF电极条。使用干净的镊子并从盘中取出IPG凝胶条。那些不立即用于第二维电泳运行和/或继续进一步参照的IPG凝胶条在-78℃贮存于两层塑料薄膜之间可长达几个月。

(D)灌制凝胶用于第二维电泳(SDS PAGE)

灌制凝胶之前一天，制备1.5L凝胶溶液并除气和过滤。将溶液在紧紧密封烧瓶内4℃贮存过夜。使用浇筑漏斗封闭灌制室的贮液槽。加入125ml甘油溶液。灌制之前，立刻在凝胶溶液中一边搅拌一边加入75μL TEMED和8ml APS-溶液，并且将凝胶溶液倒入灌制室。全部转移凝胶溶液之后，取出浇筑漏斗并加入贮液槽内的甘油溶液。现在将凝胶溶液仅放置于灌制室的灌制盒内。立即用丁醇覆盖凝胶，用水饱和，并且将凝胶聚合三小时。

(E)第二维电泳(SDS-PAGE)

按照以下步骤1-11进行SDS-PAGE操作：

1.用电极缓冲液(9)加满电泳槽并冷却(13℃)。用少许水覆盖灌制室中的凝胶直到使用之前。

2.对于每块凝胶，使用5μl蛋白质标准溶液浸湿滤纸小条。

3.以垂直方向固定SDS凝胶以易于使用第一维IPG条。

4.如下平衡IPG凝胶条：

从冰箱中取出聚集的IPG凝胶条并将它们放入各个测试管中。加入10ml平衡缓冲液。用Parafilm膜密封测试管，将它们在摇动器上摇动10分钟，并且然后倒掉平衡缓冲液。如上向测试管中加入10ml碘乙酰胺溶液并继续在摇动器上平衡10分钟。

5.第二次平衡之后，用电极缓冲液漂洗IPG凝胶条几秒钟。

6.从凝胶中去除多余水分，将IPG凝胶条和含蛋白质标准溶液的滤纸在旁边放置于SDS凝胶顶端并用热的凝胶溶液(75℃)覆盖。使用匙突小心将IPG条压到SDS凝胶表面以实现完全接触。允许琼脂糖凝固至少5分钟。对剩余的IPG条重复该步骤。

7.将凝胶盒插入电泳仪中并开始电泳。

8.如下表中说明运行SDS-PAGE凝胶过夜。步骤1持续50Vh。

第二维电泳运行条件(SDS-PAGE)

步骤	电流[mA]	电压[V]	[Vh]
				1	80	最大45	50
2	150	最大200	可变，见步骤9
				3	10	最后步骤维持安全电压

9.当溴酚蓝示踪染料已经到达凝胶较低边缘时，终止运行。

10.用匙突小心打开盒，并还使用匙突从聚丙烯酰胺凝胶中去除琼脂糖层。

11.从盒固定器上取出凝胶并然后将其浸入水中以从玻璃板中去除凝胶。然后继续固定、蛋白质染色或印迹。

(F)凝胶固定和染色

分别固定每块凝胶。用350mL乙醇/乙酸混合物固定30分钟。使用SyproRuby-溶液(350ml)避光染色3小时。使用350mL乙醇/乙酸混合物进行背景脱色30分钟，避光。扫描之前，用水洗涤凝胶两次。如果需要，扫描后用胶体考马斯亮蓝溶液染胶过夜。第二天在水中振荡染色的凝胶。当背景几乎脱色时，利用可视扫描仪进行扫描。

分析性2D凝胶电泳方法评价

使用脱溶胰酶制剂获得的典型2D凝胶显示于图1，带有已鉴定的示踪斑点。

利用荧光扫描仪FLA3000(Raytest)检测所有获得的2D-凝胶评价图像。将凝胶扫描为16-bit文件，像素大小为100μ。激发光波长为473nm。

使用ProteomWeaver 2.2(Definiens)进行tiff-文件的评价。通过将图像排列于适当分组进行实验。然后根据软件的算法对全部凝胶进行斑点检测。所使用的检测设置为缺省设置并且对于凝胶中几乎全部可见斑点是足够的。斑点检测后，将全部各个凝胶重新手工检测以确信使错误检测降低到最小。当斑点检测的同时，通过软件进行斑点自动定量，并且在整个实验过程中标准化数量以易于凝胶中不同斑点的斑点鉴定的比较。该标准化过程不依赖于实验中凝胶的数量并且对于那些在不同时间点整合入实验的凝胶都能够进行。然后开始匹配过程，将相同斑点鉴定分配到整个凝胶的相同斑点。

此外，使用添加两种内部标记蛋白质磷酸化酶B和碳酸酐酶的脱溶胰酶制剂所获得的典型2D凝胶显示于图7。标准化、定量和所进行的匹配过程使得能够将一个参照斑点的强度与已知蛋白质量的两个内部标记蛋白质的强度进行比较。在一个实例中，根据本发明将磷酸化酶B和碳酸酐酶掺入至全部具有特征性且总是恒量的蛋白质的样品(分别为2μg和0.2μg)。已显示了两种蛋白质在2D-凝胶中表现为不变模式并且不与胰脏样品现存斑点重叠。碳酸酐酶仅产生一个单一斑点，磷酸化酶B显示至少5个亚型，但是两种蛋白质都能够进行斑点检测并因此非常容易进行定量。将目的斑点的强度直接与两种标记蛋白质的强度相比较导致只要斑点强度在标记蛋白质强度范围内就可以进行绝对定量。为了获得统计学上有意义的结果，全部凝胶重复运行，至少重复运行三次，并且各组凝胶彼此之间进行比较。所得到的斑点平均强度是斑点彼此之间进行比较的基础。

使用MALDI-TOF-MS的RP-HPLC用于胰酶制剂分析的可行性

可行性研究的目的是为了显示使用MALDI-TOF-MS的RP-HPLC对于分析胰酶制剂，特别是脱溶胰酶制剂或者胰酶制剂微小微球，的有用性。在以下测试中，平台(BioVisioN AG，Hannover)应用于如下面详细描述表征脱溶胰酶制剂，包括与HPLC方法特异性相关的详细评价和验证。

作为样品，两批胰酶制剂(批1和批2)用于HPLC测试。样品必须贮存于5+/-3℃，避免光照和潮湿，例如在密封瓶中，直到这些样品用于表征鉴定。打开之前，将瓶子调整至室温，例如通过将它们贮存于室温条件直到完全平衡。

下面描述的HPLC方法用于检验样品。按照技术人员已知的标准程序将随后通过MALDI-TOF-MS表征的样品分为部分，例如按照平台程序。根据欧洲药典(Ph.Eur.，2.2.29)进行液相层系。

通过在RP-18反相柱上进行梯度HPLC，检测波长为214nm，确定脱溶胰酶制剂特征组分(化合物)的蛋白质和/或肽模式。按照面积％方法进行定量。通常，欧洲药典试剂由字母R表示，称重并测量的数量使用欧洲药典(1.，一般注意事项)中所标明的精确度程度进行同量。此外，无质地限制的术语“水”指去离子水，电阻系数为NLT 0.18MΩm且TOC为NMT 0.5mg/ml。

以下试剂用于测试实验：

·用于层析R的乙腈，例如Baker，编号：9017

·三氟乙酸R

·氯化钠R

·溶剂：在1l水中溶解20.00g氯化钠R(2％NaCl溶液)以下仪器或等同系统用于测试实验：

Agilent HPLC装置由以下组成：

·自动采样器G 1313A

·ALSTherm G1330A

·Quat.泵G 1311A

·UV-检测器G 1314A

·真空除气器G 1322A

·HP柱恒温箱G1316A

·1100控制模块G 1323A

·LAN-界面35900E

·ChemServer

Heraeus Biofuge 17RS或等同系统。

柱：

·类型：MODULO O-CART QS UPTISPHERE 5WRP，Interchim

(UP5WRP$15QS)

·固定相：RP-18，5.0μm

·管道材料：不锈钢

·长度：150mm

·内径：3.0mm

在以下条件下进行HPLC测试：

操作模式    梯度HPLC

流动相      流动相A水/TFA 0.05％(v/v)

流动相B     乙腈/TFA 0.05％(v/v)

梯度

时间[min]	％A	％B
				0	100	0	线性梯度至
90	46	54	线性梯度至
				90.1	100	0	无梯度
105	100	0	平衡

流率              1.0ml/分钟

分析期            95分钟

温度              27±2.0℃

注射体积          10μl

自动采样器温度    4℃±1℃

通过UV-检测器在214nm波长下检测。

测定制剂：

在30ml烧杯中称量将用于检测的大约80.0mg脱溶胰酶制剂。对于胰酶制剂包有肠溶衣的微小微球体的检测，之前微小微球体必须研磨并且称重140mg粉末。在＜4℃，15分钟内一边搅拌一边将样品溶解于10ml冰冷的溶剂。离心溶液(对于Heraeus Biofuge 17RS，应用8ml、10min、15000U/min、4℃)。作为样品溶液注射入澄清上清液。在开始该顺序之前必须立即新鲜制备样品制剂。

性能：

通过使用上述RP-HPLC方法已经检测了不同批次脱溶胰酶制剂及其制品。已经将选择性最适化以在适当运行时间内获得最大数量的峰。使用胰酶制剂批次1获得的典型层析图描述于图8-11和表J和K。

表J和K的内容：

表J  胰酶制剂斑点鉴定的数据(参见图11)：鉴定20+

表K  胰酶制剂斑点鉴定的数据(参见图11)：鉴定20+X

图8-11的内容：

图8脱溶胰酶制剂的典型层析图，批次1，

图9脱溶胰酶制剂的典型层析图(0-14分钟)，批次1

图10脱溶胰酶制剂的典型层析图(60-90分钟)，批次1

图11脱溶胰酶制剂的注解RP-HPLC层析图(分钟35)，批次1

关于峰特异性和鉴定的评价，已经试图将LC连接至ESI-MS但信号会重叠。因此，通过应用技术，检测了脱溶胰酶制剂样品。将层析图自动分割为96份，每份对应大约55.1秒的运行时间。然后，自动用吸量管将各份与目标板上的芥子酸基质移吸到一起。自动化定位后使用多重解吸作用和电离作用将每个单一斑点进行MALDI-TOF-MS。

所考虑的目的质量范围覆盖1-大约60,000。根据使用单一m/z信号定量的

技术的标准程序可以可视化该范围。将m/z基础与相应组分和最初层析图一起建立文件。

Claims (16)

1.通过二维凝胶电泳分析包含具有脂肪水解、蛋白质水解和淀粉水解活性的生理可接受消化酶混合物的蛋白质样品的方法，所述方法包括步骤：

(a)通过将样品溶解于用于凝胶电泳的溶剂组合物中来制备蛋白质样品，其中所述的溶剂组合物包含适于溶解蛋白质材料的溶剂、用于定量蛋白质的内部标准和蛋白酶抑制试剂；

(b)采用等电聚焦电泳界定第一维凝胶电泳，并且应用梯度分离蛋白质级分；

(c)接着将蛋白质级分重新溶于缓冲液；

(d)将来自步骤(c)的蛋白质级分转移至凝胶电泳的第二维上并且通过SDS-PAGE分离级分中的成分；

(e)将步骤(d)的SDS-PAGE凝胶固定和染色；和

(f)通过荧光扫描进行光密度测量法评价凝胶。

2.根据权利要求1的方法，其中酶混合物是微生物合成的脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶的混合物。

3.根据权利要求1的方法，其中酶混合物是消化酶的胰酶和/或胰酶样混合物。

4.根据权利要求3的方法，其中样品是脱溶的胰酶或胰酶微小微球。

5.根据权利要求1的方法，其中在步骤(a)中使用的溶解样品的溶剂是7M尿素、2M硫脲、4％w/vCHAPS、1％w/vDTT和0.5％

的pH3-10的裂解缓冲液。

6.根据权利要求1的方法，其中在步骤(a)中使用的用于蛋白质定量的内部标准是磷酸化酶B或者碳酸酐酶。

7.根据权利要求1的方法，其中蛋白酶抑制试剂是MiniComplete和/或Pefabloc SC。

8.根据权利要求7的方法，其中在步骤(a)中使用的溶解样品的溶剂是Lp3，其如下组成：

(i)溶解于2ml的7M尿素、2M硫脲、4％w/vCHAPS、1％w/vDTT和0.5％

的pH3-10的裂解缓冲液中的1.5mg MiniComplete和

(ii)溶解于2ml所述裂解缓冲液中的1mg的Pefabloc SC；

其中(i)和(ii)以1∶1v/v的比率组成。

9.根据权利要求1的方法，其中样品是具有分子量大于8kD的蛋白质和/或肽级分。

10.根据权利要求1的方法，其中鉴定了胰酶的同一性和/或蛋白质和/或肽模式。

11.根据权利要求10的方法，还包括使用MALDI-TOF-MS鉴定蛋白质和/或肽的斑点。

12.根据权利要求1-10任意一项所述的方法，其中所述方法作为确定胰酶的同一性和/或蛋白质和/或肽模式以及杂质和/或降解物存在的应激或稳定性测试来进行。

13.根据权利要求9的方法，该方法还包括通过RP-HPLC表征和定量具有分子量小于8kD的蛋白质和/或肽级分。

14.溶剂组合物，其适于通过二维凝胶电泳表征和/或说明具有脂肪水解、蛋白质水解和淀粉分解活性的生理可接受消化酶混合物样品，所述酶混合物用于制造治疗疾病的药物制剂，该溶剂组合物包括：

(a)适于凝胶电泳和溶解蛋白质材料的溶剂，其为7M尿素、2M硫脲、4％w/vCHAPS、1％w/vDTT和0.5％的pH3-10的裂解缓冲液；

(b)用于定量蛋白质的内部标准；和

(c)蛋白酶抑制试剂。

15.根据权利要求14的溶剂组合物，其中溶解样品的溶剂是Lp3，其由如下组成：

(a)由溶解于2ml的7M尿素、2M硫脲、4％w/vCHAPS、1％w/vDTT和0.5％

的pH3-10的裂解缓冲液中的1.5mgMini Complete；和

(b)溶解于2ml所述裂解缓冲液中的1mg的Pefabloc SC；

其中(a)和(b)以1∶1v/v的比率组成。

16.根据权利要求12的方法，其中所述方法还包括所述蛋白质、肽、杂质和/或降解物的定量。

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