CN1899367B - 筋骨草提取物、其制备方法、用途和复方制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种筋骨草提取物，还公开了这种提取物的制备方法、这种提取物用于制备治疗子宫肌瘤或乳腺增生的药物的用途和含有该提取物的复方制剂。本发明的提取物和复方制剂对于治疗子宫肌瘤或乳腺增生具有显著疗效，而且长期使用无明显毒副作用。本发明提取物的主要成份是8-乙酰基哈巴苷和哈巴苷。

Description

筋骨草提取物、其制备方法、用途和复方制剂

技术领域

本发明涉及筋骨草提取物，更详细地说，本发明涉及用于治疗子宫肌瘤或乳腺增生的筋骨草提取物。

背景技术

筋骨草制剂主要有：筋骨草片(部颁标准，WS3-B-1446-93)和胶囊(部颁标准，WS3-B-3704-98)，作用为清热解毒，祛痰，止咳。筋骨草在传统中医药中记载的药性苦甘，寒；《本草拾遗》记载味甘，平，无毒；《纲目拾遗》记载性寒，味苦；《本草再新》记载归经“入肺经”。具有清肺止咳，利胆退黄，凉肝息风，软坚散结之功效。主治气管炎，吐血，衄血，赤痢，淋病，咽喉肿痛，疔疮，痈肿，跌打损伤。

现有的筋骨草制剂(片和胶囊)，清热解毒，止咳，祛痰，平喘，用于急、慢性支气管炎，肺脓肿。在这些产品中，是以乙醇提取得到的提取物，并以全草粗碎混合后制成片剂和胶囊，没有任何的定性定量指标来控制其质量。现有的产品的质量均有不稳定，服用量大，溶解度差，生物利用度低，无特异性质量控制标准，在工艺技术和质量控制上均存在许多缺陷。

筋骨草片是中国药典77版一部收载的品种，系唇形科筋骨草Ajugadecumbens Thunb.的全株.根据Min Zhida et al，Chem Pharm Bull，1990，38(11)：3167Y TAKEDA，S TSUCHIDA and T FUJITA.Phytochemistry，1987，26(8)：2303的记载，筋骨草中的主要化学成分是环烯醚萜类、二萜类、黄酮类和苯乙醇苷类等。其中环烯醚萜类有8-乙酰基哈巴苷(8-O-acetylharpagide)、哈巴苷(Harpagide)、莱普苷(Reptoside)、筋骨草苷A、B、C、D(decumboside A、B、C、D)和筋骨草甾酮(decumbesterone)等。

综上所述，到目前为止，未见关于筋骨草提取物有效部位群的相关报道或文献公开，也未见筋骨草用于治疗子宫肌瘤和乳腺增生的报道或文献公开。

子宫肌瘤和乳腺增生是威胁妇女健康的常见病和多发病，也是国内外医学界正在研究的疑难病。现代研究证实，这两种疾病的发病机理均与精神长期处于紧张状态有关。在生活节奏日益加快的今天，其发病率呈上升趋势。迄今中西医均无有效治疗药物，手术切除子宫是最终的治疗方法，而子宫切除术又会给患者带来新的身、心痛苦，尤其是对于生育期妇女。因此，对该类疾病疗效确切且毒副作用小治疗药物的研制必将造福患者。

发明内容

基于上述背景技术部分的叙述，长期以来迫切需要开发出对于子宫肌瘤或乳腺增生疗效显著而且毒副作用小的药物。本发明人经过多年的研究和大量试验，发现采用筋骨草作原料，采用特定的提取方法所获得的提取物，能够有效地治疗子宫肌瘤或乳腺增生，而且产生的毒副作用很小。

本发明要解决的技术问题是提供一种用于治疗子宫肌瘤或乳腺增生的筋骨草提取物。本发明要解决的另一个技术问题是提供这种提取物的制备方法。本发明要解决的又一个技术问题是提供这种提取物用于制备治疗子宫肌瘤或乳腺增生的药物的用途。本发明要解决的又一个技术问题是提供含有这种提取物的复方制剂。

本发明的筋骨草提取物是通过以下方法之一制备的：

(1).以筋骨草粗粉作为原料，用水或浓度低于80％的乙醇，在30-90℃，优选在45-70℃进行加热提取，或者进行渗漉，提取液浓缩至比重为1.0-1.3，优选至1.12-1.16，过滤，经大孔吸附树脂处理，经水洗除去杂质后，用30％-95％的乙醇溶液洗脱树脂至有效成分完全洗出，回收溶剂，干燥，得到上述提取物；

或者(2).以筋骨草粗粉作为原料，用浓度为40％-95％乙醇提取，提取液浓缩至比重为1.0-1.3，优选至1.12-1.16，然后用水或5％-30％的乙醇溶液返溶，将溶出液过滤，回收溶剂，干燥，得到上述提取物。

本发明提取物的有效部位群是8-乙酰基哈巴苷(8-O-acetylharpagide)和哈巴苷(Harpagide)，它们在提取物中的含量为50-99％，哈巴苷与8-乙酰基哈巴苷的比例范围约为1∶2-4范围内。

本发明的复方制剂含有上述提取物以及活血化(破)瘀、活血调经、清热燥湿、清热解毒、清热凉血、理气止痛、补血和平抑肝阳类中药的至少一种。其中活血化(破)瘀类中药选自川芎、乳香、没药、姜黄、郁金中的至少一种；活血调经类中药选自益母草、桃仁、红花、丹参中的至少一种；清热燥湿类中药选自夏枯草、苦参、黄芩、龙胆草中的至少一种；清热解毒类中药选自败酱草、贯众、鱼腥草、野菊花、地锦草、半边莲、拳参、白花蛇舌草、青黛、山慈菇、漏芦、大叶桉中的至少一种；清热凉血类中药选自生地、玄参、紫草、牡丹皮、赤芍中的至少一种；理气止痛类中药选自香附、佛手、玫瑰花、檀香、乌药、荔枝核中的至少一种；补血药类中药选自白芍、熟地、何首乌中的至少一种；平抑肝阳类中药选自牡蛎。

本发明的复方制剂可以采用制药领域制备复方制剂的常规工艺进行制备，例如，将本发明的提取物与医药领域常用的各种药用辅料(纤维素类、淀粉类、糊精类、硬脂酸镁、乳糖、微粉硅胶等)混合，制剂成型；或者将本发明的提取物、上述活血化(破)瘀、活血调经、清热燥湿、清热解毒、清热凉血、理气止痛、补血和平抑肝阳类中药的至少一种的药物粉末或其提取物以及上述各种药用辅料混合，制剂成型；或者也可以将筋骨草与上述活血化(破)瘀、理气止痛和清热解毒类中药的至少一种混合后提取，然后将提取物与上述各种药用辅料混合，制剂成型。

本发明的提取物及其复方制剂可以制成医药领域的各种常规剂型，例如，片剂、丸剂、胶囊剂、凝胶剂、粉雾剂、气雾剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、无菌注射剂等各种常见剂型，也可以为上述各种剂型的速释或长效或定位给药或释药的制剂，其中长效制剂所用的技术是利用pH依赖控释包裹技术，或结肠酶降解控释包裹技术制成微米粒或纳米粒而得到。

以上所述的本发明的提取物或者复方制剂，可以通过各种常用的途径给药，包括口服、粘膜、经皮、皮下、静脉内和肌内注射给药，根据给予对象的体重及症状，给予剂量以通常在10-500毫克(提取物)/天的范围内。

本发明的提取物及其复方制剂，经本发明人的大量药效学和毒理学试验证明，对于治疗子宫肌瘤或乳腺增生具有显著疗效，而且长期使用无明显毒副作用。为了便于更加清楚地了解本发明，在本说明书的以下部分，本发明人通过具体的实施方式对本发明作出进一步的描述，但是，并非穷举的这种具体实施方式，并不对本发明的保护范围构成限制。

具体实施方式

实施例1-4

按照如下任一提取方法制备实施例1-4的提取物，所采用的具体工艺参数参见表1：

(1)以筋骨草粗粉作为原料，用水或乙醇进行加热提取，或者进行渗漉，提取液浓缩，过滤，经大孔吸附树脂处理，经水洗除去杂质后，用乙醇溶液洗脱树脂至有效成分完全洗出，回收溶剂，干燥，得到上述提取物；

或者(2)以筋骨草粗粉作为原料，用乙醇提取，浓缩提取液，然后用水或乙醇溶液返溶，将溶出液过滤，回收溶剂，干燥，得到上述提取物。

                表1筋骨草提取物工艺参数

本发明提取物中有效部位的理化参数及其实验依据

根据实验分析，本发明提取物的有效部位群是8-乙酰基哈巴苷(8-O-acetylharpagide)和哈巴苷(Harpagide)，它们在提取物中的含量为50-99％，哈巴苷与8-乙酰基哈巴苷的比例范围约为1∶2-4范围内。

哈巴苷具有如下通式I的结构，是1981年由Fontaine J等首次从Harpagophytum procumbens植物发现并报道于[Biological analysis ofHarpagophytum procumbens D.C.II.Pharmacological analysis of the effects ofharpagoside，harpagide and harpagogenine on the isolated guinea-pig ileum，J PharmBelg.，1981 Sep-Oct；36(5)：321-4]；8-乙酰基哈巴苷具有以下通式II的结构，是Breschi MC等首次从Ajuga reptans植物中发现并报道于[Vasoconstrictor activityof 8-O-acetylharpagide from Ajuga reptans.，J.Nat.Prod.1992；Aug；55(8)：1145-8]。

通式I：                                通式II：

哈巴苷的结构分析：

最大吸收波长为197nm，说明分子结构没有一个双键；IR给出下述信号3381→-OH，1655→C＝C，1237，1075→-C-O-C-，947→cis-CH＝CH-；¹H-NMR(DMSO-d6)显示：一个角甲基信号δ1.23(3H，s)，五个糖质子信号δ3.21-3.89，一个糖端基氢信号δ4.56(1H，d，J＝7.8Hz)，两个烯氢信号δ4.94(1H，d，J＝6.3Hz)和6.30(1H，d，J＝6.3Hz)；¹³C-NMR(DMSO-d6)共显示16个碳信号，除去葡萄糖上的六个碳信号δ99.4(d)，74.5(d)，78.1(d)，71.7(d)，77.5(d)，62.8(t)外，还剩10个碳信号，提示为单萜类化合物；¹³C-NMR显示两个烯碳信号δ142.6(d)和108.5(d)，一个缩醛碳δ93.2(d)，该化合物为环烯醚萜甙。与化合物1相比，化合物2除少了一个乙酰氧基外，其他信息基本一致；FAB-MS也验证了这一点：化合物2的分子量为364，与化合物1的分子量406相比，正好相差42(-COCH₃)；因此推测化合物2为harpagide。依据DEPT、HMQC和HMBC谱将¹H-NMR和¹³C-NMR数据进行了归属。

哈巴苷的结构鉴定：

UVλ：197nm；IR v_max ^KBr：3381，2930，1655，1379，1237，1075，947cm^-1；FAB-MS(m/z)：387[M+Na]⁺，347[M-OH]，274，207，167(100％)，145，115；¹H-NMR(300Hz，DMSO)δ：1.23(3H，s，H-10)，1.78(1H，dd，J＝3.9，14.1Hz，7α-H)，1.90(1H，dd，J＝4.5，13.5Hz，7β-H)，2.53(1H，brs，H-9)，3.21(1H，d，J＝7.8Hz，H-2’)，3.26(1H，m，H-4’)，3.29(1H，m，H-3’)，3.40(1H，m，H-5’)，3.63(1H，d，J＝5.4Hz，H-6)，3.68(1H，m，H1-6’)，3.89(1H，dd，J＝1.8，10.2Hz，H₂-6’)，4.56(1H，d，J＝7.8Hz，H-1’)，4.94(1H，d，J＝6.3Hz，H-4)，5.73(1H，d，J＝1.2Hz，H-1)，6.30(1H，d，J＝6.3Hz，H-3)；¹³C-NMR数据见表。

8-乙酰基哈巴苷的结构分析：

最大吸收波长为197nm，说明分子结构中没有共轭双键；IR显示有下列官能团：3440→-OH，1711→C＝O，1652→C＝C，1238，1075→-C-O-C-，960→cis-CH＝CH-；¹H-NMR(DMSO-d₆)显示：一个角甲基信号δ1.35(3H，s)，一个乙酰氧基信号δ1.92(3H，s)，六个糖质子信号δ2.98-3.68，一个糖端基氢信号δ4.38(1H，d，J＝7.8Hz)，两个顺式烯氢信号δ4.87(1H，d，J＝6.3Hz)和6.35(1H，d，J＝6.3Hz)；¹³C-NMR(DMSO)共显示16个碳信号，除去一个乙酰氧基信号22.0(q)，170.1(s)和葡萄糖上的六个碳信号δ97.3(d)，73.0(d)，77.1(d)，70.2(d)，75.7(d)，61.6(t)外，还剩9个碳信号，提示为单萜类化合物；¹³C-NMR显示两个烯碳信号δ141.2，107.4和缩醛碳信号92.4(d)，说明为环烯醚萜类化合物。将¹³C-NMR数据与8-acetylharpagide的文献值^[4]比较，二者基本吻合，因此，确定该化合物为8-acetylharpagide。依据DEPT、HMQC和HMBC谱将¹H-NMR和¹³C-NMR数据进行了归属。

8-乙酰基哈巴苷的结构鉴定：

UVλ：197nm；IR v_max ^KBr：3440，2912，1711，1652，1375，1238，1075，960；FAB-MS(m/z)：429[M+Na]⁺，407[M+H]⁺，369，329(100％)，311，277，241，209；¹H-NMR(DMSO-d6)δ：1.35(3H，s，10-CH₃)，1.92(3H，s，-COCH₃)，1.77(1H，dd，J＝4.5，14.7Hz，7α-H)，2.05(1H，dd，J＝3.9，12.9Hz，7β-H)，2.64(1H，brs，H-9)，2.98(1H，d，J＝6Hz，H-2’)，3.06(1H，m，H-5’)，3.10(1H，m，H-4’)，3.14(1H，m，H-3’)，3.46(1H，d，J＝1.2Hz，H₁-6’)，3.56(1H，brs，H-6)，3.68(1H，dd，J＝6.6Hz，H₂-6’)，4.38(1H，d，J＝7.8Hz，H-1’)，4.87(1H，d，J＝6.3Hz，H-4)，5.86(1H，d，J＝1.2Hz，H-1)，6.35(1H，d，J＝6.3Hz，H-3)。

提取物的含量测定

方法：按照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定。色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(10∶90)为流动相；检测波长为197nm；柱温30℃。

对照品溶液的制备：精密称取哈巴苷和乙酰哈巴苷对照品适量，甲醇溶解，分别配制成0.088mg/ml和0.124mg/ml的对照品溶液。

供试品溶液的制备：取按照上述方法制备的提取物0.1g精密称定，置锥形瓶中，精密加20％乙醇100ml，密塞，称重，超声处理10min，放冷，称重，用20％乙醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液5μl与供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

结果：10批样品的测定均在50-70％。其回收率的测定结果如下。

                表2乙酰哈巴苷回收率测    定结果

                        表3哈巴苷的回收率测定结果

参见本说明书附图，图中表示的是本发明筋骨草提取物含量测定的高效液相图。

实施例5-12

含筋骨草的中药复方提取物的制备

按照实施例5-12中的任一配伍组合，与筋骨草提取物配伍的中药复方提取物可以采用制药领域制备复方制剂的常规工艺进行制备后混合应用，或者也可以将筋骨草与实施例5-12中的至少一种药物混合后提取，然后将提取物与上述各种药用辅料混合，制剂成型。所采用的具体配伍药物参见表2：

                表4与筋骨草提取物配伍应用的药物

实施例13

筋骨草提取物中有效部位对大鼠乳腺增生模型的药效学试验数据

大鼠乳腺增生模型以模型组大鼠的乳腺组织出现下述病理变化为模型成功的标志：乳腺小叶数增多，小叶内腺泡增多，小叶呈弥散性增大，甚至相互融合，小叶形态不规则，变形，或失去小叶结构，轮廓不清，但仍保持小叶增生的特点。个别动物的小叶导管上皮明显增生，部分管泡的基低膜明显增厚，管泡内有透明纤维样分泌物或浆液渗出，个别小叶内结缔组织轻度增生，小叶周围有大量的淋巴细胞浸润。

疗效判定标准以上述病理组织变化的半定量分级标准，应用药理统计软件进行统计，与模型组比较有显著性差异为准。

1.试验材料

1.1药物：筋骨草提取物：每克含乙酰哈巴苷700mg。乳癖消：辽宁省恒仁药业有限责任公司，批号：02042；苯甲酸雌二醇注射液：1mg/ml，上海第九制药厂生产，批号：001102。黄体酮注射液：10mg/ml，上海第九制药厂生产，批号020115。血清促滤泡成熟素(hFSH)、雌二醇(E2)、血清促黄体生成激素(LH)放射免疫分析试剂盒：均购自北京福瑞生物工程公司，批号：0109。

1.2动物：SD种大鼠，雌性，200-250克，购自维通利华实验动物有限公司，合格证号：SCXK(京)2002-0003。

1.3仪器：FG-630微机多道γ测定仪，北京262厂制造；SAKUPA自动脱水机，日本产；Leitz旋转式切片机，德国产；SAKURA RSH-100自动染色机，日本产；Nikon光学显微镜，日本产；DLYMPUS BH-2生物自动显微照相系统，日本产。

2.方法

取SD种大鼠，按照体重随机分为6组，每组10只，除空白对照组外，其余动物肌肉注射苯甲酸雌二醇0.5mg/Kg，每日1次，连续25天，既而改用肌肉注射黄体酮4mg/Kg，每日1次，连续5天。造型同时以筋骨草提取物按照40、20、10mg/Kg灌胃给药30天，阳性对照药乳癖消2.4g/Kg连续灌胃给药30天(相当临床剂量的30倍)。第31天，将动物以3％戊巴比妥麻醉，腹主动脉取血，离心，取血清测定雌二醇(E2)、促滤泡成熟素(hFSH)、促黄体生成激素(LH)；肉眼检查乳腺情况；用8mm打孔器取第2、3对乳房称重，10％福尔马林固定，石蜡切片，HE染色，光镜检查；取卵巢和子宫称重。用t检验比较组间差异。

3.结果

3.1对大鼠乳腺增生模型的影响

3.1.1对乳房大体形态的影响

肉眼观察显示，模型组大鼠的第2、3对乳房均明显红肿，乳头增大、增高，阳性药乳癖消组及给药大、中、小剂量组大鼠的乳房红肿明显减轻，乳头增高、增大不明显。

3.1.2对乳房重量的影响

结果显示，模型组大鼠的第2、3对乳房重量均明显增加，与对照组比较差异显著；与模型组比较，阳性药乳癖消组及给药各剂量组大鼠的乳房重量明显降低(见表1)。

3.1.3对乳房组织形态的影响

光镜下观察，正常对照组大鼠的乳腺未见明显增生，结构正常。模型组大鼠的乳腺小叶数增多，小叶内腺泡增多，小叶呈弥散性增大，甚至相互融合，小叶形态不规则，变形，或失去小叶结构，轮廓不清，但仍保持小叶增生的特点。个别动物的小叶导管上皮明显增生，部分管泡的基低膜明显增厚，管泡内有透明纤维样分泌物或浆液渗出，个别小叶内结缔组织轻度增生，小叶周围有大量的淋巴细胞浸润。给药各组和阳性药对照组的乳腺组织病变较模型组均有不同程度的好转，腺泡增多、增大，腺管上皮增厚，腺管内渗出，腺泡周围的炎性浸润程度均较模型组明显减轻，给药大、中、小剂量组对乳腺组织的作用随其剂量的增大呈量效关系。

3.1.4对子宫系数的影响

结果显示，模型组大鼠的子宫重量增加，子宫系数增加，与对照组比较差异显著；与模型组比较，阳性药及给药大剂量组大鼠的子宫重量减轻，子宫系数降低，差异显著，给药中、小剂量组大鼠的子宫系数有降低趋势，但无显著性差异(见表5)。

3.2对激素水平的影响

结果显示，模型组大鼠的雌二醇(E2)和血清促黄体生成激素(LH)明显升高，与空白对照组比较差异显著；与模型组比较，阳性药及给药各组可降低E2水平，与模型组比较差异显著(P＜0.05)；对促滤泡成熟素(hFSH)和促黄体生成激素(LH)有影响趋势，但无显著性差异(P＞0.05)(见表4)。

4.小结

筋骨草提取物以40、20、10mg(提取物)/Kg剂量灌胃给药，以乳癖消冲剂2.4g/Kg(相当临床剂量的30倍)为阳性对照药，可对抗雌、孕激素所致大鼠实验性乳腺增生模型，降低其乳腺增生的程度和乳房重量，降低雌二醇水平，降低子宫系数，与模型组比较差异显著。

        表1.对大鼠乳房重量的影响(X±S；n＝10)

注：与空白对照组比较：^#P＜0.05；^##P＜0.01；与模型组比较：^*P＜0.05；^**P＜0.01(下同)。

            表2.对大鼠乳房组织形态的影响(X±S；n＝10)

注：10×10倍镜下连续3个视野；

腺泡数为每视野中腺泡数最多者的均数。

            表3.对大鼠乳腺增生程度的影响(X±S；n＝10)

注：乳腺增生的分级标准：

+++重度：炎症细胞浸润及上皮增生较弥散，个别有结缔组织。

++中度：炎症细胞浸润及上皮增生较局限，累及多个小叶。

+轻度：炎症细胞浸润及上皮增生呈片状散在。

-正常：无明显增生及炎症细胞浸润。

                        表4.对激素水平的影响(X±S；n＝8)

                    表5.对大鼠子宫系数的影响(X±S；n＝10)

                        实施例14

筋骨草提取物中有效部位对动物子宫肌瘤模型的药效学试验数据

动物子宫肌瘤模型以模型组动物的子宫重量增加、雌激素水平升高、子宫平滑肌厚度增加及子宫组织出现下述病理变化为模型成功的标志：分角子宫根部平滑肌层呈明显不均匀增厚，平滑肌细胞排列紊乱，显示平滑肌条索状为主，排列方向呈旋涡，细胞核呈长杆状，有个别平滑肌细胞呈圆形或多边形，部分动物的子宫肌间质有明显出血、子宫肌层有红色变性，并有轻度炎细胞的浸润，以淋巴细胞为主，有少量中性粒细胞。

疗效判定标准以上述指标的变化和病理组织的半定量分级标准，应用药理统计软件进行统计，与模型组比较有显著性差异为准。

1.材料

1.1动物  豚鼠：雌性，体重300-350g；大鼠：SD种，雌性，体重200-250克，SPF级，购自维通利华实验动物有限公司，合格证号：SCXK(京)2002-0003。兔：雌性，新西兰种，2-2.5Kg，均购自北京通利养殖厂(京动许字2000第010号总第55号)。小鼠：昆明种，雌雄各半，体重18-20g，购自中国医学科学院动物研究所繁殖厂(合格证号：SCXK 11-00-0006)。

1.2药物与试剂  筋骨草提取物：每克含乙酰哈巴苷700mg。桂枝茯苓丸：成都金鼎药业有限公司生产，批号：0020627。苯甲酸雌二醇注射液：1mg/ml，上海第九制药厂生产，批号：991102。黄体酮注射液：10mg/ml，上海第九制药厂生产，批号980201。血清促滤泡成熟素(hFSH)、雌二醇(E2)、血清促黄体生成激素(LH)放射免疫分析试剂盒：均购自北京福瑞生物工程公司，批号：0009。

1.3仪器  BIOPACSY STEM八道生理记录仪：美国制造。FG-630微机多道γ测定仪：北京262厂制造。

2.方法和结果

2.1对豚鼠实验性子宫平滑肌瘤的影响

选用成年未孕豚鼠60只，随机分为正常对照组、模型对照组组、阳性药对照组、筋骨草提取物大、中、小剂量组，每组10只。模型组及给药各组肌肉注射苯甲酸雌二醇，0.2mg/只，3次/周，连续注射3个月后，加黄体酮1.5mg/只肌注，2次/周，连续1个月。在造型同时，筋骨草各剂量组每日口服给药，模型组和正常对照组每日给等剂量水。4个月后，所有动物给药0.5h后，3％戊巴比妥腹腔注射麻醉(0.1ml/100g)，称重，腹主动脉取血，离心，取血清测雌二醇(E2)、血清促滤泡成熟素(hFSH)、血清促黄体生成激素(LH)；剖腹观察子宫大体形态，沿子宫膀胱连体处剪取子宫，称重，计算子宫系数，(子宫重/体重)；量取子宫颈以上及分角子宫根部横径；于20％中性福尔马林中固定，子宫分角以上相同部位横切取材0.5cm，每侧取材3块，石蜡包埋，HE染色，光镜观察子宫组织形态，每张切片选取5个部位，在10×10镜下，以显微测微尺测量平滑肌厚度，取平均值，用t检验比较组间差异。

2.1.1对子宫重量的影响模型组动物的子宫重量增加，与对照组比较差异显著。给药各组与模型组比较重量减轻，差异显著(P＜0.05)。见表1。

2.1.2对子宫横径的影响模型组动物子宫分角下和分角根部横径较对照组增粗，差异显著，给药各组横径均小于模型组，差异显著(P＜0.05)。见表1。

2.1.3对子宫平滑肌厚度的影响以目镜测微尺小格数目为厚度单位，模型组动物子宫平滑肌厚度较正常对照组明显增厚(P＜0.001)，给药各组较模型组明显变薄，与模型组比较差异显著(P＜0.001)。见表2.

                表1.对子宫肌瘤豚鼠子宫重及子宫横径的影响(X±S；n＝10)

注：与模型组比较*P＜0.05；**P＜0.01(下同)

        表2.对子宫肌瘤豚鼠子宫平滑肌厚度的影响(X±S；n＝10)

2.1.4对激素水平的影响  模型组动物血清E2和LH水平明显升高，给药各组均可不同程度地降低E2水平，与模型组比较差异显著(P＜0.05)；对hFSH和LH有影响趋势，但无显著差异(P＞0.05)。详见表2。

            表2.对子宫肌瘤豚鼠激素水平的影响(X±S；n＝10)

2.1.5子宫组织的形态学变化  镜下观察，正常对照组动物子宫黏膜腺体属于分泌期，平滑肌肌层未见明显增厚，间质未见出血及炎症细胞的浸润。模型组分角子宫根部平滑肌层呈明显不均匀增厚，平滑肌细胞排列紊乱，显示平滑肌条索状为主，排列方向呈旋涡，细胞核呈长杆状，有个别平滑肌细胞呈圆形或多边形，部分动物的子宫肌间质有明显出血、子宫肌层有红色变性，并有轻度炎细胞的浸润，以淋巴细胞为主，有少量中性粒细胞。给药各组动物的子宫平滑肌层均不同程度地薄于模型组，排列规整，大、中剂量组动物子宫未见炎性浸润，子宫肌间质未见有明显出血，小剂量组个别动物见有轻度的炎性浸润。

2.2对大鼠实验性子宫平滑肌瘤的影响

选用成年未孕大鼠60只，随机分为正常对照组、模型组、阳性对照组、筋骨草提取物大、中、小剂量组，每组10只。模型组及给药各组肌肉注射苯甲酸雌二醇0.5mg/Kg，3次/周，连续注射3个月后，加黄体酮5mg/Kg肌注，2次/周，连续1个月。在造型同时，筋骨草各剂量组每日口服给药，模型组和正常对照组每日给等剂量水。4个月后，所有动物给药0.5h后，3％戊巴比妥腹腔注射麻醉(0.1ml/100g)，称重，腹主动脉取血，离心，取血清测雌二醇(E2)；剖腹观察子宫大体形态，沿子宫膀胱连体处剪取子宫，称重，计算子宫系数(子宫重/体重)；量取子宫颈以上及分角子宫根部横径；于20％中性福尔马林中固定，子宫分角以上相同部位横切取材0.5cm，每侧取材3块，石蜡包埋，HE染色，光镜观察子宫组织形态，每张切片选取5个部位，在10×10镜下，以显微测微尺测量平滑肌厚度，取平均值，用t检验比较组间差异。

2.2.1对体重、子宫及卵巢重量的影响  模型组动物体重下降，子宫重量增加，卵巢重量减少，与对照组比较差异显著。给药各组动物的体重及卵巢重量均有不同程度地增加，子宫重量均有不同程度地下降，与模型组比较差异显著。详见表3。

            表3、对子宫肌瘤大鼠体重及子宫、卵巢系数的影响(n＝10，X±S)

2.2.2对免疫器官的影响  模型组动物的胸腺萎缩，重量下降，脾脏重量增加，与正常对照组比较差异显著。给药各组动物的胸腺和体重均有不同程度地增加，脾脏重量均有不同程度地下降，与模型组比较差异显著。见表4。

            表4、对子宫肌瘤大鼠免疫器官的影响(n＝10，X±S)

2.2.3对子宫根部厚度的影响  模型组动物子宫分角根部竖直径、横直径和分角根部下直径均较对照组增粗，与正常对照组比较差异显著，给药各组动物的子宫根部直径均小于模型组，与模型组比较差异显著(P＜0.05)。见表5。

            表5、对子宫肌瘤大鼠子宫根部厚度的影响(n＝10，X±S)

2.2.4对激素水平的影响  模型组动物的雌二醇(E2)明显升高，给药各组均可不同程度地降低E2水平，与模型组比较差异显著(P＜0.05)。见表6。

            表6、对子宫肌瘤大鼠雌激素水平的影响(X±S；n＝10)

2.2.5子宫组织的形态学变化  镜下观察，正常对照组动物子宫肌层由平滑肌组成，肌束间以结缔组织分层，肌层分层不明显，未见增厚，未见出血及炎症细胞的浸润。模型组子宫平滑肌明显增厚，细胞核呈长梭状，密集排列，核多为长杆状，两端钝圆，染色质纤细，胞浆呈粉红色，平滑肌束间为少量的纤维血管组织及轻度的炎性细胞浸润，以中性分叶核为主。给药各组动物的子宫平滑肌增厚及炎症细胞浸染的程度均较模型组有不同程度地减轻。见表7、8。

    表7、对子宫肌瘤大鼠子宫平滑肌厚度的影响(X±S；n＝10)

注：(为16×16倍光镜下测量)

                表8、对子宫组织病变程度的影响(n＝10)

注：秩和检验：与模型组比较^*P＜0.05；^**P＜0.01

分级标准：

“-”：子宫肌层未见增厚，未见有炎症浸润，结构正常。

“+”：子宫肌层增厚不明显，炎症浸润轻。

“++”：子宫肌层轻度增厚，炎症细胞浸润较明显，以中性分叶核为主。

“+++”：子宫肌层明显增厚，炎症细胞浸润较重。

“++++”：子宫肌层明显增厚，肌细胞排列紊乱，弥漫性炎细胞浸润。

2.3对兔在体子宫的影响

兔经耳缘静脉注射戊巴比妥钠30mg/Kgb.w麻醉，仰位固定，下腹部剪毛，于下腹部作一正中切口，长度约4-5cm。打开腹腔，从子宫颈与阴道交界处向一侧子宫放入一气囊，气囊与一硅胶管连接，排尽气囊内的空气，并让气囊中充满水，硅胶管与压力换能器相连，用多道生理记录仪监测子宫活动情况。术后待子宫活动恒定时(约手术后30min)，记录一段正常收缩曲线，然后经十二指肠给药，记录药后30、60和90min子宫活动曲线，用BIOPAC System Acknowledgement3.5计算软件计算子宫收缩幅度、收缩频率及收缩曲线下面积。

统计方法：分别将每只动物给药后30、60及90min记录的子宫收缩幅度、4min收缩次数及每分钟收缩曲线下面积分别减去该动物给药前的相应值，得出给药前后的差值，即子宫收缩幅度变化值、收缩频率变化值及曲线下面积变化值。全部数据均以均数±标准差表示，用t-检验比较各给药组与模型对照组间的差异。

结果：筋骨草大剂量可增加给药后30min-90min；小剂量可增加给药后30min-60min兔在体子宫的收缩幅度，两剂量对收缩次数及曲线下面积没有影响。见表9。

        表9.筋骨草提取物对兔在体子宫平滑肌的影响(X±S；n＝10)

3、结论

筋骨草提取物对雌、孕激素所致大鼠和豚鼠的实验性子宫肌瘤模型具有明显的抑制作用，可降低模型导致的子宫重量增加，使子宫分角下、分角根部横径和子宫平滑肌厚度变小；降低雌激素(雌二醇)水平；抑制动物子宫的充血肿胀和子宫组织的病理性改变；增加兔在体子宫的收缩幅度；抑制大鼠棉球肉芽肿和小鼠耳肿胀；抑制缩宫素、化学刺激和热刺激致小鼠的疼痛反应，与模型组比较差异显著。

实施例15

筋骨草提取物的安全性试验

1、急性毒性试验

在最大给药容量和最大给药浓度条件下，小鼠灌胃给予筋骨草25g提取物/kg(相当于750g生药/kg)后大多动物表现出活动减少现象，随后渐恢复正常。动物无死亡。给药后约24小时后，行为、活动基本恢复正常。在以后14天的观察期内体重增长正常，未见明显异常症状。

在最大给药容量和最大给药浓度条件下，大鼠灌胃给予筋骨草10g提取物/kg(相当于300g生药/kg)后，大多动物表现出自发活动减少，常伏卧不动现象，随后渐恢复正常。动物无死亡。给药后约24小时后，行为、活动基本恢复正常。在以后的观察期内体重增长正常，未见明显异常症状。

2、长期毒性试验

摘要：筋骨草提取物大、中、小剂量1200mg/kg、220mg/kg、40mg/kg，连续对大鼠灌胃给药25周。结果显示，各给药组大鼠的一般状态、血液学、血液生化学指标和主要脏器组织未见明显异常。

试验目的

观察筋骨草提取物对SD种雌性大鼠连续灌服25周，动物机体可能产生的毒副作用及其严重程度，以确定本品的安全剂量范围，为人临床安全用药提供依据。

试验材料

受试药物：筋骨草提取物：每克提取物含生药3.6克，由中国中医研究院中药研究所制剂室提供。使用前加蒸馏水配成相应的浓度。

试剂盒：总胆固醇试剂盒：中生北控生物科技股份有限公司生产，其余9项血液生化学指标测定试剂盒均由北京北化康泰临床试剂有限公司生产。尿液检验试纸(8N全项目)由中国苏州第一制药厂生产。

动物：SD种大鼠，雌性，体重95+5克，购自北京维通利华实验动物有限公司，合格证号：SCXK(京)2002-0003。

仪器：MEK6318K型全自动血球记录仪，日立公司生产；HUMALYZER2000生化测定仪，德国生产。

动物饲料：大鼠饲料，北京朝阳区九江口饲料厂生产[京动许字(2000)第007号，总052号]。主要成分：粗灰分8.0％、食盐0.54％、粗蛋白26.7％、粗脂肪6.8％、粗纤维3.7％、钙1.4％、总磷0.92％。

动物饲养条件：三级动物饲养设施，室温：22-24℃，相对湿度45-60％。

试验方法

动物的分组及给药剂量

动物每笼5只，饲以全价营养饲料，自由饮水，实验前先适应性喂养一周后随机分为4组，每组40只。大剂量组1200mg(提取物)/kg、中剂量组220mg(提取物)/kg、小剂量组40mg(提取物)/kg，给药体积均为1ml/100g，正常对照组灌服同体积0.5％CMC-Na。连续灌胃给药25周，每周给药6天。每周一称量体重及进食量，据体重调整给药剂量。

检测项目及方法

每日观察动物的一般状态，即精神状态，行为活动，毛色和尿便等情况。于给药12周、25周，分别取各组动物10只、20只，眼眶取血测定血红蛋白(HB)、红细胞总数(RBC)、白细胞总数(WBC)及分类、血小板(PLT)等血液学指标，测定凝血时间；股动脉取血离心取血清，自动生化分析仪测定天门冬氨基转移酶(GOP)、丙氨酸氨基转移酶(GPT)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、肌肝(Crea)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALb)、血糖(Glu)、总胆红素(T-Bili)、总胆固醇(T-CHO)等生化指标；解剖取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、脑(大脑、小脑)、甲状腺、胸腺、胰腺、垂体、视神经、胃、十二指肠、结肠、空肠、回肠、子宫、卵巢、膀胱、胸骨、乳腺称重，计算脏器系数；做脏器的病理组织学检查。将试验结果进行统计学处理，做组间T检验，比较组间差异。各组剩余10只动物，于停药后周5后做上述检查，观测指标同上。

试验结果

对动物一般状态及体重的影响

动物一般状态：给药12周、25周和停药5周后，各组大鼠活动正常，精神状态良好，毛色有光泽，二便正常，尿常规检查未见明显异常(见表5)，未见其它明显异常，各组动物均未出现死亡。

动物体重及进食量：给药12周、25周和停药5周后，各组大鼠的体重及进食量正常，与空白对照组比较未见显著差异(见表1、2)。

对大鼠血液学指标的影响

血液学的测定结果表明，大鼠给药12周、25周和停药5周后，大、中、药5周后，与空白对照组相比各给药组大鼠的一般状态、血液学、血液生化学指标和主要脏器组织未见与药物相关的显著性影响。小三剂量组所测指标与对照组比较无统计学的显著性差异(见表3-1、3-2、6)。

对血液生化指标的影响

血液生化指标的测定结果表明，大鼠给药25周后，三剂量组所测指标均在正常范围内波动，与对照组比较无统计学的显著性差异(见表4-1、4-2)。

对大鼠主要脏器系数的影响

给药12周、25周和停药5周后，解剖大鼠，用肉眼大体观察各组大鼠的脏器未见明显粘连、变性等异常，给药三剂量组各脏器系数与对照组比较无统计学的显著性差异(见表7-1、7-2)。

对主要脏器组织学的影响

病理检查结果显示，本品给药12周、25周和停药5周后，各给药组大鼠的主要脏器组织未见明显与受试物相关的病理性损伤，详见病理检查报告及照片。

结论

筋骨草提取物1200mg/kg、310mg/kg、80mg/kg，连续对大鼠灌胃给药12周、25周和停药后5周对大鼠的一般状态、血液学、血液生化学指标和主要脏器的组织学检察未见与药物相关的病理性改变。

表1、给药25周对雌性大鼠体重的影响(            X±SD；n＝40；g)

表2、给药25周对雌性大鼠进食量的影响(            X±SD；n＝40；g/100g)

表3-1、给药25周对雌鼠血液常规指标的影响(X±SD；n＝20)

表3-2、给药25周对雌鼠血液常规指标的影响(            X±SD；n＝20)

表4-1、给药25周对雌鼠血清生化指标的影响(            X±SD；n＝20)

表4-2、给药25周对雌鼠血清生化指标的影响(            X±SD；n＝20)

注：与对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

                    表5、给药25周对大鼠尿常规的影响(n＝20)

注：*呈弱阳性；#            X±SD

                表6对凝血时间的影响(            X±SD；n＝20；sec)

            表7-1、给药25周对雌性大鼠脏器系数(            X±SD；n＝20；g/100g)

            表7-2、给药25周对雌性大鼠脏器系数(            X±SD；n＝20；g/100g)

Claims (7)

1.用于治疗子宫肌瘤或乳腺增生的筋骨草提取物，其特征在于该提取物是通过以下方法制备的：

以筋骨草粗粉作为原料，用水或浓度低于80％的乙醇，在30-90℃进行加热提取，或者进行渗漉，提取液浓缩至比重为1.0-1.3，过滤，经大孔吸附树脂处理，经水洗除去杂质后，用30％-95％的乙醇溶液洗脱树脂至有效成分完全洗出，回收溶剂，干燥，得到上述提取物

2.权利要求1的提取物，其中加热提取的温度为45-70℃，提取液浓缩至比重为1.12-1.16。

3.权利要求1的提取物，它含有50-99％的8-乙酰基哈巴苷和哈巴苷。

4.权利要求1的提取物，它所含的哈巴苷与8-乙酰基哈巴苷的比例为1∶2-4。

5.权利要求1-4之一的提取物的制备方法，其特征在于该方法是：

以筋骨草粗粉作为原料，用水或浓度低于80％的乙醇，在30-90℃进行加热提取，或者进行渗漉，提取液浓缩至比重为1.0-1.3，过滤，经大孔吸附树脂处理，经水洗除去杂质后，用30％-95％的乙醇溶液洗脱树脂至有效成分完全洗出，回收溶剂，干燥，得到上述提取物。

6.权利要求5的方法，其中加热提取的温度为45-70℃，提取液浓缩至比重为1.12-1.16。

7.权利要求1-4之一的筋骨草提取物的用途，其特征在于用于制备治疗子宫肌瘤或乳腺增生的药物。