CN1894585B - 一种检测样品中感兴趣的被分析物的测定装置及测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于检测样品中感兴趣的被分析物的测定试剂盒。该试剂盒包括：a)报道物；b)具有第一和第二结合区的被标记物，其中第一结合区能够与感兴趣的被分析物结合，第二结合区能够与报道物结合；c)能够与被标记物的第一结合区结合的固定化物；和d)能够与报道物结合的固定化捕获剂。布置为使得样品接触被标记物，然后接触固定化物，随后接触固定化捕获剂，在样品暴露于固定化捕获剂之前加入报道物。如果样品中没有被分析物，则被标记物与固定化物结合并因此不能与固定化捕获剂结合。如果样品中有被分析物，则被分析物与被标记物结合，使得被标记物不能与固定化物结合，但是可以借助于报道物与固定化捕获剂结合，从而通过借助于报道物与固定化捕获剂结合的被标记物的存在而测定被分析物的存在。

Description

一种检测样品中感兴趣的被分析物的测定装置及测定方法

技术领域

本发明涉及测定装置(assay device)，具体地而非排他地，涉及侧流测定装置，和它们在检测样品中是否存在被分析物的应用，所述被分析物具体地而非排他地为半抗原。

背景技术

用于检测样品中半抗原的存在和/或含量的侧流免疫测定装置是已知的，例如由EP291194公开。由于半抗原物质体积小，其中捕获剂(capture reagent)特异性结合在被分析物的两个不同表位上的夹心式捕获剂类型的结合反应是不可能的。代之以采用其中使样品中的被分析物与另一种物质(通常为相同的被分析物)竞争被标记的捕获剂的竞争反应。通常，侧流载体包括：含颗粒被标记试剂的试剂区；和位于试剂区下游的包括固定化物的检测区。在没有被分析物时，被标记试剂在检测区结合，产生可检测信号。在通常在试剂区的上游被加入的样品中被分析物的存在下，被标记试剂能够优先与被分析物结合，从而不能在检测区结合。因此，在检测区形成的信号随着被分析物浓度的增加而减少。对于半定量的是-非可视读数测定，以这种方式提供结果可能引起使用者的混淆或不确定性。为了避免这种不确定性，这种免疫测定的制造商已经在每个装置上印刷阳性和阴性结果看起来是什么样子的图片，以帮助使用者判读结果。通常，这种测定的使用者，例如用于检测某些药物滥用，将是实验室技术人员。然而，药物滥用的增加使得这种测定越来越多地被未经培训的个体使用。因此，判读结果的容易程度显得非常重要。

美国专利5451504和5874216公开了其中在检测区形成的信号随着被分析物浓度的增加而增加的半抗原检测用免疫测定法。

仍需要用于检测样品中被分析物的存在的替代/改善的方法，其中产生的信号随着被分析物浓度的增加而增加。

发明内容

根据第一方面，本发明提供了用于检测样品中感兴趣的被分析物的测定试剂盒，其包括：

a)报道物；

b)具有第一和第二结合区的被标记物，其中第一结合区能够与感兴趣的被分析物结合，第二结合区能够与报道物结合；

c)能够与被标记物的第一结合区结合的固定化物；和

d)能够与报道物结合的固定化捕获剂，

布置为使得样品接触被标记物，然后接触固定化物，随后接触固定化捕获剂，在样品暴露于固定化捕获剂之前加入报道物，

其中，如果样品中没有被分析物，则被标记物与固定化物结合并因此不能与固定化捕获剂结合；并且其中，如果样品中有被分析物，则被分析物与被标记物结合，使得被标记物不能与固定化物结合，但是可以借助于报道物与固定化捕获剂结合，从而通过借助于报道物与固定化捕获剂结合的被标记物的存在而测定被分析物的存在。固定化物可以在截留区中被提供，而固定化捕获剂可以在独立的检测区中被提供，样品从截留区移动到检测区。

被标记物可以在位于截留区上游的试剂区中被提供。在向试剂区施加样品之后，被标记物可在样品中移动并且能够与样品中如果存在的感兴趣的被分析物结合，并且进一步能够移动到截留区和随后移动到检测区。报道物、被标记物、固定化物和固定化捕获剂可以在基底上和/或基底中被提供，其可为侧流载体。

报道物可以是可移动的，并且可存在于检测区上游的基底上。在一个实施方案中，报道物在试剂区或其上游被提供。在另一个实施方案中，报道物在截留区被提供。

被标记物的第一和第二结合区能够分别特异性结合感兴趣的被分析物和报道物，固定化物能够特异性结合被标记物的第一结合区，固定化捕获剂能够特异性结合报道物。

根据第二方面，本发明提供侧流载体免疫测定装置，其包括：

a)具有可移动性被标记物的试剂区，可移动性被标记物具有第一和第二结合区，其中第一结合区是感兴趣的被分析物特异性的，第二结合区是报道物特异性的；

b)位于试剂区或其下游的截留区，截留区包括待检测的固定化的感兴趣的被分析物；

c)位于截留区下游的检测区，检测区包括报道物特异性的固定化捕获剂；和d)位于检测区上游的可移动性报道物。

根据第三方面，本发明提供用于检测样品中感兴趣的被分析物的存在的方法，该方法包括：

使样品接触具有第一和第二结合区的被标记物，其中第一结合区能够与感兴趣的被分析物结合，第二结合区能够与报道物结合；

使样品接触能够与被标记物的第一结合区结合的固定化物；

随后使样品接触能够与报道物结合的固定化捕获剂；

其中在样品接触固定化捕获剂之前加入报道物，并且其中如果样品中没有被分析物，则被标记物与固定化物结合并因此不能借助于报道物与固定化捕获剂结合；并且其中如果样品中有被分析物，则被分析物与被标记物结合，使得被标记物不能与固定化物结合，但是可以借助于报道物与固定化捕获剂结合，从而通过借助于报道物与固定化捕获剂结合的被标记物的存在而测定被分析物的存在。

样品可以在暴露于检测区之前暴露于截留区下，所述检测区存在于具有固定化捕获剂的基底上，所述截留区存在于具有固定化物的基底上。

本发明第三方面的方法可包括使样品暴露于试剂区，所述试剂区存在于具有被标记物的基底上。当样品接触试剂区时，被标记物可在样品中移动，然后移动的被标记物能够与样品中感兴趣的被分析物(如果存在)结合。

本发明第三方面的方法可包括将被怀疑含有感兴趣的被分析物的样品加入到包括可移动性报道物、可移动性被标记物、固定化物、和固定化捕获剂的基底中的单一步骤。或者，报道物和/或被标记物在施加于基底之前可以被加入到样品中。

根据另外的方面，本发明提供用于半抗原的阳性检测的方法，其中将流体样品加入到侧流载体中，于是，如果存在被分析物，则形成与可移动性被标记物结合的第一结合复合物。可移动性被标记物在形成被分析物复合物之前或之后也经历与报道物的特异性结合反应，所述报道物随后渗透到检测区中，于是，该报道物被报道物特异性固定化捕获剂所捕获。可以测定存在于检测区中的被标记试剂或使其显像，以提供被分析物存在的指示。

当没有被分析物时，可移动性被标记物与报道物形成结合复合物。该复合物随后被截留区所捕获并因此不能渗透到检测区中。

根据另一个方面，本发明提供本发明的测定试剂盒或装置用于在检测样品中被分析物的应用。

本发明提供用于检测样品中被分析物的测定试剂盒或装置，其中产生的信号随着样品中被分析物浓度的增加而成比例地增加。样品可为流体，如液体，例如取自受试者的体液，或为来源于固体的液体。该鉴定试剂或其它试剂可用于从固体得到液体样品。

测定试剂盒或装置可包括材料的单一连续条带，在该材料上适当地布置有分割区，使得样品的流向为从试剂区(如果存在)到截留区，直到检测区。或者，测定装置可包括：单独的室，这些单独的室指定为用于执行试剂区、截留区和检测区中每一个区的指定功能；和将每个室的产物转移到下一个室中的装置。所述各区是指相同或不同材料的单独区段(section)。这些区段可部分或完全地彼此重叠，使得样品能够从一个区段通到另一个区段。在具有良好释放特征的材料的一个或多个区段上可提供可移动性试剂(即，使试剂能够再悬浮在样品中并且能够沿着材料或通过材料渗透)，并且可以在一个或多个具有良好结合特征的区段上提供固定化试剂。所述区段可在使用之前经过处理，以增强或降低它们的结合和/或释放特征。具有良好释放特征的材料的例子为玻璃纤维，具有良好结合特征的材料的例子为硝化纤维。这种处理和材料在EP291194和EP383619中描述。

本发明某些实施方案的侧流载体可选自适当的多孔载体，如硝化纤维。或者，可使用允许样品移动通过截留区和检测区的任何适当的材料。另外，侧流载体可由强化固体背材支持，以增加装置的操作强度。载体也可包括超过一种的材料，这些材料布置为彼此流体接触。

或者，侧流载体可为具有一个或多个毛细管通道的微流体性(microfluidic)载体。

或者，本发明的测定试剂盒的基底可为包括固定化和任选可移动性试剂的一个或一系列的层或柱。在一个实施方案中，固定化物和固定化捕获剂布置为使得样品和被标记物接触固定化物，然后接触固定化捕获剂，其中在接触固定化捕获剂之前加入报道物。

本发明的测定试剂盒还可包括如美国专利6352862公开的流体沉浸件和/或样品接收件，以及位于检测区下游的对照区。因此，在本发明的测定试剂盒的另一个实施方案中，测定试剂盒包括位于固定化被分析物上游的对照标识物(其可为可移动的)；和位于固定化捕获剂下游的对照区，对照区包括能够与对照标识物结合的固定化捕获剂。对照标识物可与样品一起渗透通过截留区和检测区，并到达对照区，在那里，对照标识物被固定化捕获剂结合。在对照区的对照标识物的检测证实样品已经成功地渗透通过测定试剂盒，并从而为使用者提供测定已经完全成功的阳性信号。被标记物也可起到对照标识物的作用。可通过任何适当的方法在对照区产生信号。在一个实施方案中，对照区可包括用于可移动性对照标识物的固定化受体，其可存在于测定装置中对照区上游的任何位置，只要对照标识物的检测可与被分析物的检测区别开。随着样品沿着测定装置移动通过截留区和检测区，样品携带了可移动性对照标识物。或者，对照区可包括固定化无水物质，其在流体样品到达对照区时被诱导变色。在对照区提供阳性信号的另一种替代方法可被包括在本发明的测定装置中。

可另外将本发明的测定试剂盒或装置结合在外壳中，该外壳可为流体非可渗透性的，如EP291194公开的外壳。

在一个实施方案中，提供侧流免疫测定装置，该侧流免疫测定装置通常在装置的一端接触样品。样品流动通过多孔性流体载体材料，首先到达试剂区(如果存在)，然后到达截留区，进一步通过毛细管作用到达检测区。或者，可以通过其它力，如重力、离心力、搅拌等，推动样品通过本发明测定装置的各个连续区。

本发明的某些实施方案的试剂区包括可移动性被标记物，被标记物具有第一和第二结合区，其中第一结合区是感兴趣的被分析物特异性的，第二结合区是报道物特异性的。可移动性被标记物可通过本领域技术人员已知的许多方法淀积到试剂区的基底上，使得可移动性被标记物在加入样品之前保持固定在试剂区。在加入样品后，可移动性被标记物变得可动，被样品携带通过基底的其余部分。移动的被标记物在样品内自由移动，并且能够与报道物和被分析物(如果存在于样品中)相互作用并与二者结合。

可移动性报道物可存在于试剂区内。可通过本领域技术人员已知的方法将已知浓度的报道物施加到本发明的基底上。在某些实施方案中，报道物因此在施加样品之前存在于基底中或基底上，并且通过向基底中加入样品而变得可动。报道物可选自不会是已经存在于感兴趣的样品中的物质。在一个实施方案中，选择报道物使得其不会妨碍感兴趣的被分析物的结合行为。类似地，感兴趣的被分析物可不妨碍检测区的结合行为。在本发明的一个实施方案中，报道物为卵清蛋白-FITC结合物。

被标记物的第一和第二结合区可分别为感兴趣的被分析物特异性的和报道物特异性的，而对其它被分析物有极少的特异性或者没有特异性(如在背景上方不能检测到)。结合区可包括能够与预期靶分子特异性结合而不能以可检测水平与任何其它分子结合的任何分子。当报道物为具有单一表位位点的物质如半抗原时，报道物可与载体如BSA或卵清蛋白结合，这些载体自身不妨碍测定。可使用本领域技术人员已知的标准结合方法使报道物与适当的载体分子结合。

当报道物为更大的、能够在不同的表位位点发生结合反应时，这种表位位点可相同或不同，可直接使用报道物而不必要使其与载体结合。

被标记物的每个结合区可为能够与感兴趣的物质特异性结合以形成特异性结合对的特异性结合区。特异性结合对的例子包括抗体和抗原，其中抗原可为肽序列、互补核苷酸或肽序列、高分子的酸和碱、染料和蛋白质粘合剂、肽和特异性蛋白结合剂、酶和辅助因子、效应器和受体分子，其中术语受体是指能够识别分子的特定或极性取向(即，表位或决定性位点)的任何化合物或组合物。

抗体包括但不限于多克隆的、单克隆的、双特异性的、人源化的和嵌合的抗体、单链抗体、Fab片段和F(ab′)2片段、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(anti-Id)抗体、和上述任一种的表位结合片段。抗体的部分包括Fv和Fv′部分。可以对Fv部分进行修饰，以产生被称为单链Fv(scFv)分子的合成构造。这包括共价结合于V_h和V_l区的肽连接体，其有助于分子的稳定性。抗体可为天然存在的抗体，如通过Koehler和Milstein方法得到的单克隆抗体和通过例如将抗原注射到动物中得到的多克隆抗体。抗体也可为部分或完全人源化的。可使用的其它合成构造包括互补决定区(CDR)肽。这些肽是包括抗原结合决定簇的合成肽。也可使用肽模拟。这些分子通常是模拟CDR环的结构并且包括抗原相互作用侧链的构象受限的有机环。

能够与感兴趣的被分析物和报道物结合的被标记物可为例如用第一特异结合试剂和第二特异结合试剂共同敏化的直接颗粒标记物，所述第一特异结合试剂是被分析物或被分析物质似物特异性的，所述第二特异结合试剂是报道物特异性的。共同敏化的物质的例子在EP833157中公开。或者，可移动性被标记物可为被标记的双特异性捕获物，其具有被分析物特异性和报道物特异性的两个结合区。双特异性捕获剂的例子在EP962771中给出。

标记可为任何适当的实体，并且可为直接的颗粒标记，如金属溶胶如金溶胶，或例如已经装载有适当染料(包括荧光染料)的有机颗粒如聚氨酯或胶乳。标记可为能够被检测和定量的任何适当的标记。适当的标记的另外的例子包括粒子如炭黑；能够反应以产生彩色反应产物的酶如辣根过氧化酶和碱性磷酸酶；能够产生可检测光如生物发光、化学发光、磷光、和荧光的分子；或本领域技术人员已知的任何其它标记。

在包括试剂区的那些实施方案中，本发明的截留区可相对于样品流向位于试剂区的下游。截留区包括可以固定方式连接于测定装置基底上的固定化物，并且这种固定化物与任何被标记物结合，所述的被标记物的第一结合区尚未与样品中感兴趣的被分析物结合。这样，截留区阻止没有与样品中感兴趣的被分析物结合的任何被标记物前进到达检测区，从而预防出现假阳性结果(当实际上在流体样品中没有感兴趣的被分析物时，在检测区产生信号)。与样品中感兴趣的被分析物结合的任何被标记物(并且该被标记物还与报道物结合)将通过截留区并进入检测区。因此，在被分析物和用于截留区结合位点的被标记物之间没有竞争反应，样品中存在的任何被分析物会直接导致被标记物进入检测区。

固定化物可为感兴趣的被分析物或其类似物。感兴趣的被分析物的类似物包括得自动物的相关物质的类似分子(当这种动物存在时)、或合成为在结构上模仿被分析物、或者特别是模拟被分析物的具体结合区的分子。

固定化物可通过本领域技术人员已知的任何方法连接于截留区中的基底上。固定化物可直接连接于截留区上，或者可连接于自身被固定在截留区中的支撑分子上。或者，固定化物可被固定到被保持为与流体载体材料为流体接触的支撑材料如固体塑料片上。或者，固定化物可连接到当样品通过装置时接触样品的测定材料的表面上。例如，当免疫测定装置为微流体性装置时，固定化物可连接于携带样品通过装置的毛细管通道的内表面上。

实际上，截留区的捕获效率低于100％，因此，即使当流体样品中没有被分析物时，并非所有的报道物-标记试剂结合复合物必然被截留区所捕获，因此它们会渗透到检测区中。然而，为了避免出现假阳性结果，测定装置中报道物的存在量可以选择为使得向装置中加入没有被分析物的样品时不会在检测区中观察到标记试剂。报道物的加入量可根据侧流载体的类型及其被如何处理而定。最佳的加入量最容易地通过常规实验进行确定。检测区可相对于样品流动方向位于截留区的下游，并且可包括能够与报道物结合的固定化捕获剂。固定化捕获剂可与报道物结合，从而只有当报道物与被标记物结合时才固定被标记物。因此，只有当样品中存在的被分析物与被标记物(被标记物还结合了报道物)结合时、并且报道物又在检测区中被结合时，才会在检测区产生阳性信号。当样品中没有被分析物时，报道物仍然前进到达检测区，在检测区中，报道物与固定化捕获剂结合，但是由于检测区中没有被标记物，不会产生信号。

在本发明的一个实施方案中，测定装置包括截留区和检测区。在将样品加入到装置之前，可将样品与包括被标记物和任选的报道物的适当缓冲溶液混合，所述被标记物具有第一和第二结合区，其中第一结合区能够与感兴趣的被分析物结合，第二结合区能够与报道物结合。溶液可进行适当地缓冲，以防止对可能在被分析物、被标记物、和报道物之间发生的结合相互作用造成任何妨碍。可将样品与缓冲溶液混合适当的时间，以允许样品中如果存在的被分析物、被标记物和报道物之间发生任何的结合反应。在混合之后，可将样品在截留区上游的位置处加入到测定装置中。然后样品以如上所述任何方式首先通过截留区，然后通过检测区。因此，被分析物、被标记物和报道物之间最初的结合相互作用可在将样品加入到测定装置之前发生。

感兴趣的被分析物可选自能够与被标记物的第一结合区发生结合行为的任何物质。本发明的测定装置适合于检测包括小分子如半抗原的被分析物。半抗原可定义为只有当与载体结合时才能够引发免疫应答的小的抗原决定簇。半抗原可结合于抗体，但是其自身不能单独引发抗体反应，例如通过将半抗原注射到动物身体中。半抗原的非限制性例子包括苯丙胺系毒品如MDA(3，4-亚甲二氧基安非他明)、MDMA(也称为″Ecstasy″，3，4-亚甲二氧基-N-甲基安非他明)、MDEA(3，4-亚甲二氧基-N-乙基安非他明)、BDB(3，4-亚甲二氧基苯基-2-丁胺)、MBDB(3，4-亚甲二氧基苯基-N-甲基丁胺)、和MDPA(3，4-亚甲二氧基-N-丙基安非他明)；鸦片制剂如吗啡和可待因、以及它们的合成类似物，包括海洛因、氢吗啡酮、氢可酮、羟考酮和羟吗啡酮；麦角酸酰二乙胺(LSD)及其代谢物；四氢大麻酚和可卡因；毒性药品如地西泮、尼古丁、对乙酰氨基酚、咖啡因、利培酮、苯巴比妥；激素类如黄体酮、雌二醇及其代谢物、睾酮；杀虫剂；染料如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红等。

在本发明中，术语“体液”包括可以得自哺乳动物体的所有液体，包括例如血液、血浆、尿液、淋巴液、胃液、胆汁、血清、唾液、汗液、组织液、和脑脊液。根据感兴趣的被分析物而定，可考虑其它流体和液体样品，如得自工业、环境或农业来源的那些。另外，体液可进行加工(例如血清)或者未进行加工。如有需要，可将样品预处理以得到和/或释放感兴趣的被分析物，处理方法可涉及处理固体样品以得到包含感兴趣的被分析物的液体样品。从受试者得到体液样品的方法为本领域技术人员所公知的。

本发明每个方面优选的特点加以必要的变更适用于每个其它方面。本文中提到的现有技术文件以法律允许的最大程度被并入本文。

具体实施方式

参考以下实施例可以更完全地理解本发明的特点和优点，但是应该理解，以下实施例只是本发明的具体实施方案，不应将本发明看作是受限于如下所述具体实施方案的具体特点。参考以下附图，其中：

图1说明设计用于检测利培酮的本发明的一个测定，其包括在检验阴性样品和阳性样品时的测定结果图解。

图2显示本发明的测定装置，其包括通过层压而与硝化纤维膜的条带连接的Whatman玻璃纤维材料区段。

图3说明与标准利培酮测定相比，检测患者样品中利培酮的存在的测定结果。

图4表示在使用标准利培酮测定检测后的本发明的不同测定装置。

实施例描述了抗精神病药利培酮的阳性读数半抗原测定。在这个实施例中，报道物为结合于卵清蛋白载体的FITC(荧光素-5-异硫氰酸酯，异构体1)。进行多次实验以保证抗-FITC抗体不与利培酮结合，并且保证抗利培酮抗体不显著与FITC结合。图1提供示例性的半抗原测定的示意图，包括检测阳性和阴性样品时的结果。

抗-FITC抗体

由Fitzgerald Inc.Concord MA，USA提供(克隆M25285、M25286、M49209)。在初步筛选之后，选择克隆M25286用于这些实验。

卵清蛋白-FITC结合物的制备

将10mg的FITC(Molecular Probes，USA)与1ml的二甲基亚砜(DMSO)(Aldrich Chemicals)混合。在50mM碳酸盐缓冲液(pH 9.3)中制备5mg/ml的卵清蛋白(Sigma Chemical Co.)。制备卵清蛋白与FITC的一系列反应比(从1∶10到最大1∶40)。将反应物包在箔中在室温下静置过夜并在第二天早晨通过凝胶过滤(用磷酸盐缓冲盐水PBSA平衡的PD10柱)纯化。所有的结合物在PBSA中以1∶100进行稀释并通过UV/可见光扫描表征。产生以下的卵清蛋白与FITC的结合比：1∶2.5、1∶3.9、1∶3.8和1∶2.6。选择结合比为1∶3.9的结合物OBB02用于这些实验。

卵清蛋白-利培酮结合物的制备

在无水二甲基甲酰胺(DMF)(ROMIL)中制备利培酮、N-羟基琥珀酰亚胺(Sigma)、和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺·HCl(Sigma)的原液。在0.1M磷酸钠缓冲液(pH 7)中制备卵清蛋白(Sigma)的溶液。

在玻璃小瓶(bijou)中制备利培酮、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺·HCl(以1∶1∶1的比)的活化混合物并在室温下摇动～2小时。将上述活化混合物滴加到卵清蛋白的溶液中并在室温下在磁力搅拌器上搅拌过夜。选择上述试剂的量以生产25∶1(利培酮对卵清蛋白)的反应比。选择这个比例以增加结合效能，降低沉淀的可能性。

在第二天早晨，使用PD10柱(Amersham Biosciences)将结合物通过空间排阻层析法纯化。在施用于柱之后，将结合物洗脱在磷酸盐缓冲盐水(加上叠氮化钠)pH 7(Sigma)中。结合物通过HPLC表征，得到6.8∶1的结合比(利培酮对卵清蛋白)。

侧流载体的制备

根据EP291194中公开的方法，使用连接于计量泵和注射器的加样笔(pen)将试剂定量加入到Mylar做背材的硝化纤维膜(8μm Schleicher& Schuell，代码C10888-1)上。为膜制备卵清蛋白-利培酮结合物的3个区域(利培酮009，2.39mg.ml)。第一区域距离测定条带的基线为8.5mm，随后的区域在第一区域下游相隔1.5mm。将抗-FITC-克隆M25286-(2.5mg/ml)沉淀为单个区，距离条带基线16mm(观察区)。在沉积之后，将膜在55℃干燥5分钟并在1％(w/v)聚乙烯醇(PVA)(Airvol9K 18034004)加上3％(w/v)蔗糖(BDH Analar K30139086236)中封闭。使封闭溶液色谱通过膜，直到膜被饱和。在饱和之后，将膜在75℃干燥5分钟。

在抗-利培酮和抗-FITC中包覆的胶乳粒子的制备

将Duke Scientific蓝色胶乳(CB 1615)(直径400nm)在包含抗-利培酮(100ug/ml，克隆6352∶1)以及抗-FITC(25ug/ml，克隆M25286)的0.5％(w/v)固体混合物中包覆。在室温下培养60分钟之后，将胶乳粒子在室温下在20mg/ml BSA(牛血清清蛋白，Intergen Type H7N21207)中封闭30分钟。在制备之后，将粒子洗涤并交换到干燥缓冲液(包含6.5％BSA和20％蔗糖(w/v)的100mM硼酸盐，pH 8.5)中。

试剂在Whatman玻璃纤维材料上的沉积

将如上在抗-利培酮和抗-FITC中包覆的胶乳粒子淀积在Whatman玻璃纤维载体上(在干燥缓冲液中)成为一条线。使用Hamilton注射器和连接于X-Y绘图仪的泵将胶乳淀积在载体(0.23uls/mm)上成为线条。另外，制备卵清蛋白-FITC结合物OBBO2在干燥缓冲液中的1∶20稀释物并且通过Hamilton泵和注射器淀积在相同的玻璃纤维材料上(0.23uls/mm)成为分隔的线条。通过层压将Whatman玻璃纤维材料与包含卵清蛋白-利培酮结合物以及抗-FITC检测区的硝化纤维膜连接，以生产图2中所示的测定装置。

装置的检验

通过在利培酮阴性尿液池中进行稀释，从1.18mg/ml利培酮原液制备利培酮标准品。将构建好的测定装置置于塑料外壳中，使得Whatman玻璃纤维的～3mm能够被保持在利培酮标准品的池中。将装置在如上制备的利培酮标准品的300μl等分样品中保持垂直，在室温下保持五分钟。

在五分钟之后，将装置在室温下干燥。使用Persona^TM监测器(由Unipath Ltd销售)进行光学定量检测区的信号强度。

测定了多名患者的样品，结果如图3中所示。

图4表示用尿液利培酮标准品进行检验之后的不同测定装置条带。这些测定条带清楚地显示在卵清蛋白-利培酮结合物区域上的信号如何在尿液中的利培酮水平升高时衰竭。相反地，检测区的信号强度随着利培酮浓度的增加而增加，产生阳性响应。

Claims (11)

1.用于检测样品中感兴趣的被分析物的测定试剂盒，其包括：

a)报道物；

b)具有第一和第二结合区的被标记物，其中第一结合区能够与感兴趣的被分析物结合，第二结合区能够与报道物结合；

c)能够与被标记物的第一结合区结合的固定化物；和

d)能够与报道物结合的固定化捕获剂，

布置为使得样品接触被标记物，然后接触固定化物，随后接触固定化捕获剂，在样品暴露于固定化捕获剂之前加入报道物，

其中，如果样品中没有被分析物，则被标记物与固定化物结合并因此不能与固定化捕获剂结合；并且其中，如果样品中有被分析物，则被分析物与被标记物结合，使得被标记物不能与固定化物结合，但是可以借助于报道物与固定化捕获剂结合，从而通过借助于报道物与固定化捕获剂结合的被标记物的存在而测定被分析物的存在。

2.权利要求1的测定试剂盒，其中固定化物在截留区中被提供，固定化捕获剂在独立的检测区中被提供，样品从截留区移动到检测区。

3.权利要求2的测定试剂盒，其中被标记物在位于截留区上游的试剂区中被提供，并且其中在使用时，当样品接触试剂区时，被标记物在样品中移动并且能与样品中如果存在的感兴趣的被分析物结合，并且能够进一步移动到截留区和随后移动到检测区。

4.权利要求2的测定试剂盒，其中报道物在截留区或截留区的上游被提供。

5.用于检测样品中感兴趣的被分析物的侧流载体免疫测定装置，其包括：

a)可移动性报道物；

b)具有可移动性被标记物的试剂区，可移动性被标记物具有第一和第二结合区，其中第一结合区是感兴趣的被分析物特异性的，第二结合区是报道物特异性的；

c)位于试剂区或试剂区下游的截留区，截留区包括固定化的感兴趣的被分析物；和

d)位于截留区下游的检测区，检测区包括报道物特异性的固定化捕获剂；

其中可移动性报道物位于检测区的上游；

其中，如果样品中没有被分析物，则被标记物与固定化的被分析物结合并因此不能与固定化捕获剂结合；并且其中，如果样品中有被分析物，则被分析物与被标记物结合，使得被标记物不能与固定化的被分析物结合，但是可以借助于报道物与固定化捕获剂结合，从而通过借助于报道物与固定化捕获剂结合的被标记物的存在而测定被分析物的存在。

6.权利要求2-5中任一项的测定试剂盒或装置，其另外包括：

-位于检测区上游的可移动性对照标识物；和

-位于检测区下游的对照区，对照区包括能够与对照标识物结合的固定化捕获剂。

7.权利要求2-5中任一项的测定试剂盒或装置，其中被分析物是半抗原。

8.用于检测样品中感兴趣的被分析物的存在的方法，该方法包括：

使样品接触具有第一和第二结合区的被标记物，其中第一结合区能够与感兴趣的被分析物结合，第二结合区能够与报道物结合；

使样品接触能够与被标记物的第一结合区结合的固定化物；

随后使样品接触能够与报道物结合的固定化捕获剂；

其中在样品接触固定化捕获剂之前加入报道物，并且其中如果样品中没有被分析物，则被标记物与固定化物结合并因此不能借助于报道物与固定化捕获剂结合；并且其中如果样品中有被分析物，则被分析物与被标记物结合，使得被标记物不能与固定化物结合，但是可以借助于报道物与固定化捕获剂结合，从而通过借助于报道物与固定化捕获剂结合的被标记物的存在而测定被分析物的存在。

9.权利要求8的方法，其中样品在暴露于检测区之前暴露于截留区下，所述检测区存在于具有固定化捕获剂的基底上，所述截留区存在于具有固定化的感兴趣的被分析物的基底上。

10.权利要求9的方法，其中样品暴露于试剂区，所述试剂区存在于具有被标记物的基底上，然后被标记物在样品中移动。

11.权利要求1到7中任一项的测定试剂盒或装置用于检测样品中被分析物的应用。

Images