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CN1894201B - 二(l)-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体及其制造方法 - Google Patents

二(l)-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体及其制造方法 Download PDF

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CN1894201B CN2004800376974A CN200480037697A CN1894201B CN 1894201 B CN1894201 B CN 1894201B CN 2004800376974 A CN2004800376974 A CN 2004800376974A CN 200480037697 A CN200480037697 A CN 200480037697A CN 1894201 B CN1894201 B CN 1894201B
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Abstract

一种二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体，其具有大的片状晶形且更易于从母液中分离。该晶体通过在较低温度下进行结晶的新方法获得。

Description

二(L)-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体及其制造方法
发明背景
发明领域
本发明涉及L-赖氨酸硫酸盐晶体及该晶体的制造方法，更具体地说涉及结构中掺入结晶水的二L-赖氨酸酸盐晶体，以及大量制造这些晶体的方法，所述晶体易于从母液中分离。最后，本发明涉及包含通过上述新方法制造的L-赖氨酸的产品。
相关现有技术简述
L-赖氨酸是一种必需氨基酸，除其他用途之外，广泛地应用于制药和农用工业，作为营养调节剂和饲料添加剂。其主要以L-赖氨酸盐酸盐进行循环(www.ajinomoto.co.jp/ajinomoto/A-life/aminoscience/siryou/lijin.html)。当以二L-赖氨酸硫酸盐形式存在时，观察到其饲养效果相当于L-赖氨酸盐酸盐(Roth等，1994：Biological Efficiency of L-Lysine Base and L-Lysine SulphateCompared with L-Lysine in Piglets；Agribio.Res.47(2)：177-186(1994))。
已知二L-赖氨酸硫酸盐晶体包含无水二L-赖氨酸硫酸盐(Aketa等，Stereo chemical studies XL A biomimetic conversion of L-Lysineinto optically active Pharm.Bull.24(4)：623-31(1976))。因此，常添加醇至二L-赖氨酸硫酸盐水溶液中，使无水二L-赖氨酸硫酸盐晶体能产生。因为所添加的醇必须从产生的晶体中除去，所以必须要增加额外的纯化步骤，则进一步减少了晶体的产率。参见Aketa等。
已知无水二L-赖氨酸硫酸盐晶体在水中高度可溶，也导致了晶体的低产率。结果，母液中高浓度的晶体导致结晶速率的降低。最后获得的少量晶体是非常细小的，难以从母液中分离，进一步加剧了低产率的问题。
因此，在本领域显然需要获得纯且高度可分离的L-赖氨酸晶体的改良方法。由于在许多不同行业的产品中L-赖氨酸是这样一种重要的成分，所以在本领域确实需要结晶并纯化L-赖氨酸的高效方法。
本发明描述了用于L-赖氨酸结晶和纯化的高效新方法，提供了明显增加的产率，并能从母液中更容易且有效地分离产物晶体。本发明也描述了L-赖氨酸硫酸盐的新晶形。
发明概述
本发明描述了用于结晶二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物的技术，以及所产生的晶体，除其他优良特性外，该晶体具有优良的可分离性和高产率。
根据本发明的第一方面，描述了从溶液中制造二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体的方法，包括在约-10℃至约35℃的温度下混合赖氨酸溶液和硫酸，使晶体形成，并回收晶体。
根据本发明的又一方面，描述了制造二L-赖氨酸单硫酸盐的方法，包括在约-10℃至约35℃的温度下混合赖氨酸溶液和硫酸，使晶体形成，回收晶体，干燥晶体以除去结晶水，并收集二L-赖氨酸硫酸盐。
根据本发明的另一方面，描述了二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体，其特征在于在粉末X-射线衍射中在衍射角2θ为16.6°和17.0°处具有峰。
根据本发明的再一方面，描述了从溶液中制造二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体的方法，包括在超过约40℃的温度下混合赖氨酸溶液和硫酸，使晶体形成，然后降低温度至约-10℃至约35℃，使晶体形成，并回收晶体。
根据本发明的再一方面，描述了制造二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体的方法，包括通过蒸发浓缩二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物水溶液，使晶体形成，并回收所述晶体。
根据本发明的再一方面，描述了制造二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体的方法，包括在超过约40℃的温度下制备二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物水溶液，降低温度至约-10℃至约35℃，使晶体形成，并回收所述二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体。
根据本发明的再一方面，描述了制造二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体的方法，包括添加不良溶剂至二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物水溶液中，使晶体形成，并回收所述晶体。
根据本发明的再一方面，描述了制造二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物柱状晶体的方法，包括在超过约40℃的温度下制备二L-赖氨酸单硫酸盐片状晶体的浆，降低温度至约-10至约35℃，使晶体形成，并回收所述晶体。
根据本发明的再一方面，描述了制造二L-赖氨酸硫酸盐的方法，包括通过蒸发浓缩二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物水溶液，使晶体形成，回收所述晶体，干燥所述晶体以除去结晶水，并收集所述二L-赖氨酸硫酸盐。
根据本发明的再一方面，描述了二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体。
根据本发明的再一方面，描述了通过上述方法制造的二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体。
根据本发明的再一方面，描述了包含通过上述方法制备并干燥的L-赖氨酸的组合物。
尽管如此，通过阅读如下详述的依照与此提供的实施方案及附图，本发明的其他目的、特征和伴随的优点对于本领域技术人员而言是显而易见的。
附图简述
参考本发明优选的实施方案，仅作为举例，并参考附图，本发明申请现将得到更详细的描述，在附图中：
图1描述了二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物的晶体(显微照片)。
图2描述了无水二L-赖氨酸硫酸盐的晶体(显微照片)。
图3描述了在不同温度下从二L-赖氨酸硫酸盐水溶液中沉淀出来的晶体(显微照片)。
图4是显示温度和二L-赖氨酸硫酸盐溶解度之间关系的图。
图5显示了二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体的粉末X-射线衍射图。
图6显示了无水二L-赖氨酸硫酸盐晶体的粉末X-射线衍射图。
图7显示了二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体的热分析结果。
图8显示了无水二L-赖氨酸硫酸盐的热分析结果。
图9显示了实施例1中获得的晶体的粉末X-射线衍射图。
图10显示了实施例2中获得的晶体的粉末X-射线衍射图。
图11显示了实施例3中获得的晶体的粉末X-射线衍射图(通过浓缩结晶)。
图12显示了实施例3中获得的晶体的粉末X-射线衍射图(通过冷却结晶)。
图13显示了实施例3中获得的晶体的粉末X-射线衍射图(通过重排结晶)。
图14显示了实施例3中获得的晶体的粉末X-射线衍射图(通过添加甲醇结晶)。
图15显示了实施例3中获得的晶体的粉末X-射线衍射图(通过添加乙醇结晶)。
图16显示了实施例3中获得的晶体的粉末X-射线衍射图(通过添加2-异丙醇结晶)。
图17显示了实施例4中获得的晶体的粉末X-射线衍射图(晶体I)。
图18显示了实施例4中获得的晶体的粉末X-射线衍射图(晶体II)。
优选实施方案描述
本发明描述了L-赖氨酸的新结晶技术和纯化方法以及新晶体，用于当前使用L-赖氨酸的任何申请中，例如饲料添加剂或营养补充物。更具体地说，本发明描述了通过新的纯化方法形成新的二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体。本发明描述了除无水二L-赖氨酸硫酸盐晶体之外，当进行结晶导致新的二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物沉淀时，如何改变，具体来说是降低，结晶温度。
该新的二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体优于无水二L-赖氨酸硫酸盐晶体，是因为它们是较大的且更易于从母液中分离。此外，由于在水中的更低溶解度，产生更高的结晶产率，并因为二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体掺入水到该晶体中作为结晶水，可预计由于结晶过程中所使用溶剂的量减少，提高了结晶产率。
本发明的二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体具有改良的尺寸和一般形态，使得它们更易于从母液中分离。图1描述了新的二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体，显示为大的片状晶体形式。如图1所示，这些晶体是较大的、片状的及柱样的。在结晶后分离步骤中，这些大的晶体更易于分离自母液。图2显示了作为对比的无水二L-赖氨酸硫酸盐晶体，其明显较小且形成簇(平板状晶体)，使得它们难以从母液中分离，导致了更低的产率。
本发明的二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体具有掺入到晶体内的水分，使其具有较佳的形态、尺寸且更易分离。优选地，该晶体具有3摩尔水掺入到晶格中，产生二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体。
用于新结晶方法的原料以赖氨酸溶液(含L-赖氨酸作为溶质的溶液)形式存在，优选为二L-赖氨酸硫酸盐水溶液。更优选地，该溶液用二L-赖氨酸硫酸盐过饱和，使得结晶过程开始发生。该作为原料的二L-赖氨酸硫酸盐溶液可通过为本领域技术人员所知的任何方法制备。该获得起始溶液的优选方法将引起发酵产生的培养液中二L-赖氨酸硫酸盐的累积。日本未审专利出版物(KOKAI)平5-30985和平5-244969教导了在发酵培养液中累积二L-赖氨酸硫酸盐的例证性方法。该结晶过程可通过蒸发直接起始自该发酵培养液并接着冷却。或者，另一种获得起始溶液的可行方法包括从商业来源获得二L-赖氨酸和硫酸，并在水溶液中混合它们。
作为原料的二L-赖氨酸硫酸盐溶液的浓度可通过本领域已知的方法调节用于结晶。一般地，溶液应当是过饱和的。用于测定包括诸如浓度、温度和溶解度的参数的起始溶液配方的方法为本领域所公知。作为指导，浓度仅需要大于二L-赖氨酸硫酸盐的溶解度。在一个实施方案中，如果结晶温度是20℃，在该温度下二L-赖氨酸硫酸盐的溶解度是102.9g/100g水。因此，在结晶原料中二L-赖氨酸硫酸盐的浓度应当调节到102.9g/100g水或更高。可通过本领域公知方法进行浓度的调节，例如，通过减压或蒸发。但是，可以使用任何已知用于调节浓度以达到过饱和的方法。
为获得较大的、更易于分离的本发明的二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体，可以使用本发明新的结晶方法。本发明的该方法包括在-10℃至35℃的温度下开始结晶，或者在更高的温度下开始结晶并随后降低温度至上述期望的范围内。这些温度是大约的且可正负改变5℃。发现降低原料的温度引起水溶液中二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物沉淀，产生了较大的晶形。图3描述了当在以5℃为间隔的5℃-60℃的不同温度下进行沉淀时晶体的形成。在该温度范围内可观察到，低于35℃时下形成的二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体是较大的、更多片状和柱状样的。超过40℃，二L-赖氨酸硫酸盐晶体形状是平板状的(小且成簇)。因此，本发明的方法包括在优选等于或低于约35℃，更优选低于约30℃，还更优选低于约25℃，甚至更优选低于约20℃的温度下的结晶步骤。最优选地，结晶温度为约10℃。为了能进行该方法，可添加二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶种到原料溶液中。
具体来说，结晶可通过任一如下步骤进行：
在约-10℃和约35℃的温度下混合赖氨酸溶液和硫酸，并使所述晶体形成，
在超过约40℃的温度下混合赖氨酸溶液和硫酸，并使晶体形成，以及
在超过约40℃的温度下制备二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物水溶液。
此外，在另一个实施方案中，在40℃或更高的温度下，接着降低温度到35℃或更低，晶体可以无水二L-赖氨酸硫酸盐晶体沉淀。这样，通过转变为二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体获得了本发明的二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体。该方法有利之处在于通过重排完成了杂质的去除。
另外，结晶可依如下实施方案来进行。
可通过蒸发浓缩二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物水溶液沉淀晶体。可通过将二L-赖氨酸硫酸盐溶解于水中或添加硫酸到除硫酸盐外的L-赖氨酸盐水溶液中制备二L-赖氨酸硫酸盐单硫酸盐三水合物水溶液。二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物的浓度并不具体限制，但优选饱和溶液。只要晶体沉淀，溶液的pH就不受限，但通常在5.0-7.0。可通过常规方法进行蒸发。压力可以是常压或减压(通常在2640-4000Pa)。温度可以是常温或可以实施加热(通常40.0-60℃)。优选在减压下进行蒸发。
可通过添加不良溶剂到二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物水溶液中沉淀晶体。二L-赖氨酸硫酸盐单硫酸盐三水合物水溶液可以是上述之一。只要其降低二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物的溶解度，不良溶剂就不受限，其可以是例如，甲醇、乙醇或2-异丙醇。不良溶剂的添加量要足以使得二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体形成，通常在5-30体积％。温度通常在-10-35℃。
在结晶步骤后，通过常用的分离方法将二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体从母液中分离，包括但不限于，抽吸过滤、离心过滤、离心分离以及压滤。分离后，晶体可通过任一本领域公知的常用方法进行干燥并收集用于工业用途。
转变(Transition)结晶
通过在超过约40℃的温度下制备二L-赖氨酸单硫酸盐片状晶体的浆，降低温度至约-10到35℃，使晶体形成，并回收所述晶体，可以将二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物平板状晶体转变为柱状晶体。
该状晶体的浆可通过以超出在水中溶解量的量添加二L-赖氨酸硫酸盐到水中，搅拌并在超过约40℃的温度下老化过夜而得到制备。只要浆状态能保持，淤浆的pH就不受限，通常在5.0-7.0。
二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物的水溶性
在35℃及更低的温度下二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物沉淀，在40℃及更高的温度下无水二L-赖氨酸硫酸盐沉淀。一般地，随着温度的降低水溶度持续下降。但是，如图4所示，二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物的溶解度曲线令人惊奇地与无水二L-赖氨酸硫酸盐的溶解度曲线不连续。也就是说，在二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物沉淀的温度范围内，溶解度低于根据无水二L-赖氨酸硫酸盐溶解度曲线预计的溶解度。因此，发现较沉淀为无水二L-赖氨酸硫酸盐的晶体，沉淀为二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物的晶体具有更好的结晶产率。这是因为对于二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体而言，水自身被捕获到晶格中使得当结晶进行时，在上清液中可用的游离水减少，因此，减少上清液水对赖氨酸硫酸盐溶解的帮助。有助于得到高产率，即更多的晶体沉淀物。
二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物特性
进行粉末X-射线衍射、热分析以及L-赖氨酸含量分析以进一步阐明本发明的二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体特性。图5显示了二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体的粉末X-射线衍射，图6显示了无水二L-赖氨酸硫酸盐晶体的粉末X-射线衍射。
如图5和6所示，当衍射角2θ＝16.6°和17.0°时，二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体具有衍射峰。在无水二L-赖氨酸硫酸盐晶体中并不具有这些衍射峰。此外，虽然无水二L-赖氨酸硫酸盐在衍射角2θ＝13.8°处具有衍射峰，但二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体并不具有该衍射峰。因为二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体和无水二L-赖氨酸硫酸盐
晶体具有不同的粉末X-射线衍射图，因此确定它们具有不同的晶形。
进行热分析以进一步阐明二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体的性质。图7显示了二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体热分析结果，图8显示了无水二L-赖氨酸硫酸盐晶体热分析结果。比较图7和8，这两个晶体在215℃和300℃附近都具有热吸收峰。认为这是因为二L-赖氨酸硫酸盐熔化或伴随着分解的热吸收。
在45-60℃下，仅在二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物中观察到热吸收峰。推测是由于二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体失去其水分而出现该热吸收峰。因为在极端低温下二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物如此失去其水分，所以在干燥步骤过程中二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体易于失去其结晶水，对于无水二L-赖氨酸硫酸盐的工业生产是非常有利的。一般来说，晶体可以在不低于40℃下干燥过夜，以除去结晶水。如果温度低于40℃，则晶体可保持为水合物。干燥温度的上限并不受限，除非晶体分解，通常根据成本来确定。
实施例1方法所获得的二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体的L-赖氨酸含量优选在65％左右。可通过本领域已知的任何方法测定L-赖氨酸，包括HPLC。更优选地，通过在约46℃下除去结晶水将晶体转变为无水状态，L-赖氨酸含量可增加至高于75％。日本未审专利出版物(KOKAI)平5-192089提供了通过直接干燥发酵培养液所获得的通常含有二L-赖氨酸硫酸盐的物质的例子，因此，不使用纯化步骤。通过该方法获得的晶体一般含有低于50％的L-赖氨酸。因此，比较起来，本发明的晶体在这方面占优，它们含有更高的L-赖氨酸含量。
根据下列实施例，本发明将更具体地解释如下，其仅意在说明而非限制附加权利要求所定义的发明范围。
实施例
在此披露的数据获得自在如下条件下的分析：
a.L-赖氨酸含量：日立(Hitachi)氨基酸分析仪L-8800(蛋白质水解产物分析法)
b.粉末X-射线衍射：飞利浦(Phillips)X’Pert PW3040/00型(X-射线：CuKα，波长：1.5418
Figure S04837697420060623D000081
)
c.热分析：Shimadsu Seisakujo差示扫描量热计DSC-60
d.元素分析：通过元素分析仪vario EL3分析碳、氢和氮(元素的)；通过有机元素分析仪CHN-O-Rapid分析氧(元素的)；通过Ionchlomato分析仪分析硫(硫作为硫酸被分析，其通过与氧燃烧所产生)；所有的分析都在Tore研究中心进行。
实施例1
将获得自商业来源(Daiichi Fine Chemicals，Ltd.，lot A2882)的584g量的50％L-赖氨酸溶液置于500ml玻璃烧杯中，并保持在10℃的水浴中。然后添加102g量的98％硫酸(试剂级，Junsei Kagaku lot1L8102)，将L-赖氨酸转变为二L-赖氨酸硫酸盐。结果，沉淀出大的柱状晶体，如图1所示。
搅拌所获得的浆并在5℃下放置过夜，之后通过抽吸过滤使用滤纸分离母液和晶体。
表1显示了元素分析的结果。图9显示了粉末X-射线衍射图。
表1
  实施例1 二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体的理论值2(C<sub>6</sub>H<sub>16</sub>N<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)·SO<sub>4</sub>·3H<sub>2</sub>O
  碳   32.38％ 32.3％
  氢   8.16％ 8.5
  氮   12.42％ 12.6
  氧   38.25％ 39.5
  硫   7.34％ 7.2
图7显示了热分析结果。该分析条件如下：
表2
＊)QH表示热量
文件名：2002-10-17 09-51.tad
单位名称：DSC60
收集日期：02/10/17
收集时间：09:51:54
样品名称：2-赖氨酸硫酸盐3水合物[A1慢速(slow)]
样品量：2.750[mg]
注释：参比空白
[温度程序]
起始温度：30.0
加热速率[℃/分钟] 保持温度[℃] 保持时间[分钟] 气体
2.00 450.0 0 氮气
如表1所示，实施例1中所获得晶体的元素分析结果接近于二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物的理论元素组成。因此，实施例1所获得的晶体被确认为二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物。
如图9所示，实施例1所获得晶体具有在衍射角2θ＝16.6°和17.0°处的衍射峰，且不具有在13.8°处的衍射峰。因此，它们被确认为二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物。
实施例2
为了比较目的，除结晶温度为45℃外，通过与实施例1相同的方法进行二L-赖氨酸硫酸盐结晶。立即获得通过从母液分离获得的晶体的粉末X-射线图。该分离的晶体在105℃下也被干燥并进行元素分析。
图10显示了粉末X-射线图。表3显示了元素分析的结果。
表3
实施例2 无水二L-赖氨酸硫酸盐晶体的理论值2(C<sub>6</sub>H<sub>16</sub>N<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)·SO<sub>4</sub>
碳 36.76％ 36.7％
氢 7.75％ 8.2％
氮 14.12％ 14.3％
氧 31.91％ 32.7％
硫 8.32％ 8.2％
图8显示了热分析结果。该分析条件如下：
表4
＊)QH表示热量
文件名：2002-10-16 11-33.tad
单位名称：DSC60
收集日期：02/10/16
收集时间：11:33:50
样品名称：2-赖氨酸硫酸盐[A1]
样品量：  4.990[mg]
注释：    参比空白
[温度程序]
起始温度:30.0
  加热速率[℃/分钟]   保持温度[℃]   保持时间[分钟]   气体
  10.00   450.0   0   氮气
如表3所示，实施例3所获得晶体的分析值接近于无水二L-赖氨酸硫酸盐晶体的理论值。因此，实施例2所获得的晶体被确认为无水二L-赖氨酸硫酸盐。
如图10所示，无水二L-赖氨酸硫酸盐晶体在衍射角2θ＝13.8°处具有独特的衍射峰。此外，没有现察到二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物特有的2θ＝16.6°和17.0°
峰。因此，实施例2所获得晶体被确认为无水二L-赖氨酸硫酸盐。
实施例3
1.浓缩结晶
具有34.5wt％的L-赖氨酸浓度和调节到7的pH的320g量的无水二L-赖氨酸硫酸盐溶液用作原料，并通过使用旋转式蒸发器(压力：30mmHg，水浴温度：40℃)浓缩至约1.5倍。结果，观察到柱状晶体的沉淀。
2.冷却结晶
搅拌pH调节到7的二L-赖氨酸硫酸盐浆，并在60℃下老化过夜。然后，通过抽吸过滤使用滤纸分离饱和的二L-赖氨酸硫酸盐溶液和晶体。将饱和的二L-赖氨酸硫酸盐溶液用作原料并从60℃冷却到10℃。结果，观察到柱状晶体的沉淀。
3.溶剂添加结晶
具有34.5wt％的L-赖氨酸浓度和调节到7的pH的320g量的无水二L-赖氨酸硫酸盐溶液用作原料，分别将甲醇、乙醇和2-丙醇以20％(v/v)的量添加到该溶液中。结果，观察到柱状晶体的沉淀。
4.转变结晶
搅拌pH调节到7的二L-赖氨酸硫酸盐浆，并在60℃下放置过夜以获得仅含有小的平板状晶体的淤浆(无水二L-赖氨酸硫酸盐晶体)。然后，将浆从60℃冷却到10℃。结果，所有的平板状晶体都转变为柱状晶体。
就上述1-4中所获得每一产物而言，通过抽吸过滤使用滤纸分离母液和晶体。在室温下干燥所获得的晶体，测定L-赖氨酸含量，进行粉末X-射线衍射、热分析和元素分析。
在该实施例中所披露的数据是通过在如下条件下分析所获得的：
L-赖氨酸含量：日立(Hitachi)氨基酸分析仪L-8800(蛋白质水解产物分析法)
粉末X-射线衍射：飞利浦(Phillips)X’Pert PW3040/00型(X-射线：CuKα，波长：1.5418
Figure S04837697420060623D000121
)
热分析：SEIKO INSTRUMENTS差示扫描量热计TG/TDA220 SII
元素分析：所有的分析都在Tore研究中心进行(报告号：P-101976-01)
在该实施例中通过不同结晶方法所获得的所有晶体都是粗的柱状晶体且具有不同于元水二L-赖氨酸硫酸盐的晶形。
各种结晶方法所获得晶体的L-赖氨酸含量示于表5中。
表5
[单位：wt％]
结晶方法   浓缩   冷却   转变   溶剂添加  (甲醇)   溶剂添加  (乙醇)   溶剂添加  (2-异丙醇)
L-赖氨酸含量   66   68   66   66   65   66
(二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物的理论L-赖氨酸含量：66wt％，无水二L-赖氨酸硫酸盐的理论L-赖氨酸含量：75wt％)
如表5所示，该实施例中所获得晶体的L-赖氨酸含量约为66wt％，符合二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物的理论L-赖氨酸含量，即65wt％。图11-16显示了各种结晶方法所获
得晶体的粉末X-射线图。如图11-16所示，在该实施例中通过各种结晶方法所获得的晶体在衍射角2θ＝16.6°和17.0°处具有独特的衍射峰。因此，它们都被确认为二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体。
在对该实施例所获得晶体进行的热分析中，在50-60℃下观察到独特的热吸收峰。推测是由于二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体失去其水分而产生的热吸收峰。
表6显示了通过各种结晶方法所获得晶体的元素分析结果。
表6
  二L-赖氨酸单  硫酸盐三水合物  晶体的理论值  2(C<sub>6</sub>H<sub>16</sub>N<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)·  SO<sub>4</sub>·3H<sub>2</sub>O   浓缩  结晶   冷却  结晶   转变  结晶   溶剂添加  甲醇   溶剂添加  乙醇   溶剂添加  2-异丙醇
  碳   32.3％   31.97％   31.75％   31.86％   32.48％   32.63％   31.87％
  氢   8.5％   8.24％   8.22％   8.25％   8.14％   8.13％   8.19％
  氮   12.6％   12.45％   12.34％   12.39％   12.60％   12.69％   12.38％
  氧   39.5％   39.17％   39.80％   39.14％   37.57％   37.30％   38.80％
  硫   7.2％   7.26％   7.11％   7.10％   7.41％   7.37％   7.15％
如表6所示，该实施例中所获得晶体的元素分析结果接近于二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物的理论元素组成。因此，该实施例中所获得的所有晶体都被确认为二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物。
实施例4
将黄色短杆菌(Vrevibacterium flavum)AJ 11275(NRRL B-11474)接种在培养基(pH7.2)中，该培养基含有葡萄糖100g/L、硫酸铵8.0g/L、酵母抽提物(Basco)1.05g/L、KH2PO4 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、FeSO4·7H2O 10mg/L、MnSO4·4H2O 10mg/L、维生素B1盐酸盐0.2mg/L、生物素0.05mg/L以及表面活性剂GD-113(Nippon Jushi)0.05mg/L，并在31.5℃下搅拌培养70小时以获得L-赖氨酸发酵培养液。所获得培养液的L-赖氨酸含量为3.46wt％。
通过使用冷冻高速离心机(KUBOTA 7930型)在25℃下4500rpm离心培养液20分钟，并将上清液用作除去细胞的溶液。该除去细胞的溶液用作原料并通过使用旋转式蒸发器(压力：30mmHg，水浴温度：60℃)浓缩至约4倍，然后改变条件(压力：20mmHg，水浴温度：40℃)以全部浓缩至约10倍。结果，观察到柱状晶体的沉淀。
搅拌所获得的浆并在10℃下老化约40小时，之后通过使用过滤布摆动(swing)分离母液和晶体。
在室温下干燥所获得的晶体，并用饱和的L-赖氨酸溶液洗涤5次，然后用乙醇洗涤。所获得的晶体是粗的柱状晶体且具有不同于无水二L-赖氨酸硫酸盐的晶形。所获得晶体的L-赖氨酸含量为63wt％(理论含量：65wt％)。在下文中，该晶体称为晶体I。
图17显示了晶体I(二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物)的粉末X-射线图。
如图17所示，该实施例中所获得的晶体I(在室温下干燥的，25℃)在衍射角2θ＝16.6°和17.0°处具有衍射峰，是二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物特有的。因此，它们被确认为二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物。
表7现实了通过该结晶方法所获得晶体的元素分析结果。
表7
  C(％)   H(％)   N(％)   O(％)  S(％)
  二L-赖氨酸单硫酸盐三水  合物晶体的理论值   32.3   8.5   12.6   39.5  7.2
  实施例4中所获得的晶体I   32.0   8.3   12.4   39.9  6.8
如表7所示，该实施例中所获得晶体I的元素分析结果接近于二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物的理论元素组成。因此，该晶体I被确认为二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物。
然后，在105℃下干燥所获得的二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体36小时以获得无水二L-赖氨酸硫酸盐。所获得的无水二L-赖氨酸硫酸盐的L-赖氨酸含量为74wt％(理论含量：74wt％)。在下文中，该晶体称为晶体II。
图18显示了通过在105℃下干燥获得的晶体II(无水二L-赖氨酸硫酸盐)的粉末X-射线图。
如图18所示，在该实施例中通过在105℃下干燥获得的晶体II在衍射角2θ＝13.8°处具有衍射峰，是无水二L-赖氨酸硫酸盐特有的。因此，该晶体被确认为无水二L-赖氨酸硫酸盐。
表8显示了元素分析的结果。
表8
  C(％)   H(％)   N(％)   O(％)  S(％)
二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体的理论值   36.7   8.2   14.3   32.7  8.2
实施例4中所获得的晶体II   36.9   7.8   14.3   32.6  8.2
如表8所示，该实施例中所获得晶体II的分析值接近于无水二L-赖氨酸硫酸盐晶体的理论值。因此，该晶体被确认为由二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物所获得的无水二L-赖氨酸硫酸盐。
L-赖氨酸含量测定、粉末X-射线分析以及元素分析依实施例3相同的方法进行。
考虑到上述结果，认为无水二L-赖氨酸硫酸盐可由实际的发酵液通过二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物所获得。
虽然就其优选的实施方案而言，本发明业已得到详述，但可进行各种改变，并使用等同方案，而不背离本发明的范围，这对于本领域技术人员应当是显而易见的。每一前述的文献其全文在此引入作为参考。
工业实用性
一种二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体，其具有大的片状晶形且更易于从母液中分离。

Claims (24)

1.一种制造二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体的方法，包括：
a)在5℃至约35℃的温度下混合赖氨酸溶液和硫酸，使所述晶体形成，并
b)回收所述晶体，
其中所述水合的二L-赖氨酸硫酸盐晶体特征在于在粉末X-射线衍射中在衍射角2θ为16.6°和17.0°处具有峰，并且在衍射角2θ为13.8°处没有峰。
2.权利要求1的方法，其中所述温度为5℃至约20℃。
3.权利要求2的方法，其中所述温度为约10℃。
4.权利要求1的方法，其中所述晶体通过过滤或离心分离回收。
5.权利要求4的方法，其中所述过滤选自：抽吸过滤、离心过滤和压滤。
6.一种制造二L-赖氨酸硫酸盐的方法，包括：
a)通过一种方法制造二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体，所述方法包括在5℃至约35℃的温度下混合赖氨酸溶液和硫酸，使所述晶体形成，并回收所述晶体，其中所述水合的二L-赖氨酸硫酸盐晶体特征在于在粉末X-射线衍射中在衍射角2θ为16.6°和17.0°处具有峰，并且在衍射角2θ为13.8°处没有峰，
b)干燥所述晶体以除去结晶水，和
c)收集所述二L-赖氨酸硫酸盐。
7.权利要求6的方法，其中所述温度为5℃至约20℃。
8.权利要求7的方法，其中所述温度为约10℃。
9.权利要求6的方法，其中所述晶体通过过滤或离心分离回收。
10.权利要求9的方法，其中所述过滤选自：抽吸过滤、离心过滤和压滤。
11.一种制造二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体的方法，包括：
a)在超过约40℃至最高达60℃的温度下混合赖氨酸溶液和硫酸，并使晶体形成，
b)降低溶液和晶体的温度到5℃至约35℃，并进一步使晶体形成，和
c)回收所述二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体，
其中所述水合的二L-赖氨酸硫酸盐晶体特征在于在粉末X-射线衍射中在衍射角2θ为16.6°和17.0°处具有峰，并且在衍射角2θ为13.8°处没有峰。
12.权利要求11的方法，其中步骤(b)中所述温度为5℃至约20℃。
13.权利要求12的方法，其中步骤(b)中所述温度为约10℃。
14.权利要求11的方法，其中所述晶体通过过滤或离心分离回收。
15.权利要求14的方法，其中所述过滤选自：抽吸过滤、离心过滤和压滤。
16.一种二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体，特征在于在粉末X-射线衍射中在衍射角2θ为16.6°和17.0°处具有峰，并且在衍射角2θ为13.8°处没有峰。
17.一种制造二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体的方法，包括：
a)通过蒸发浓缩二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物水溶液，并使晶体形成，和
b)回收所述晶体，
其中所述水合的二L-赖氨酸硫酸盐晶体特征在于在粉末X-射线衍射中在衍射角2θ为16.6°和17.0°处具有峰，并且在衍射角2θ为13.8°处没有峰。
18.权利要求17的方法，其中所述蒸发是在减压下进行的。
19.一种制造二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体的方法，包括
a)在超过约40℃至最高达60℃的温度下制备二L-赖氨酸硫酸盐水溶液，
b)降低温度到5℃至约35℃，并使晶体形成，和
c)回收所述二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体，
其中所述水合的二L-赖氨酸硫酸盐晶体特征在于在粉末X-射线衍射中在衍射角2θ为16.6°和17.0°处具有峰，并且在衍射角2θ为13.8°处没有峰。
20.权利要求19的方法，其中所述溶液是饱和溶液。
21.一种制造二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体的方法，包括
a)添加不良溶剂到二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物水溶液中，并使晶体形成，和
b)回收所述晶体，
其中所述水合的二L-赖氨酸硫酸盐晶体特征在于在粉末X-射线衍射中在衍射角2θ为16.6°和17.0°处具有峰，并且在衍射角2θ为13.8°处没有峰。
22.权利要求21的方法，其中所述不良溶剂是甲醇、乙醇或2-异丙醇。
23.一种制造二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物柱状晶体的方法，包括：
a)在超过约40℃至最高达60℃的温度下制备二L-赖氨酸单硫酸盐平板状晶体的浆，
b)降低温度到5℃至约35℃，并使晶体形成，和
c)回收所述晶体，
其中所述水合的二L-赖氨酸硫酸盐柱状晶体特征在于在粉末X-射线衍射中在衍射角2θ为16.6°和17.0°处具有峰，并且在衍射角2θ为13.8°处没有峰。
24.一种制造二L-赖氨酸硫酸盐的方法，包括：
a)通过权利要求17或18的方法制造二L-赖氨酸单硫酸盐三水合物晶体，
b)干燥所述晶体以除去结晶水，和
c)收集所述二L-赖氨酸硫酸盐。
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AKETA K-I ET AL.STEREOCHEMICAL STUDIES. XL. A BIOMIMETICCONVERSION OF L-LYSINE INTO OPTICALLY ACTIVE2-SUBSTITUTED PIPERIDINES. SYNTHESES OF D-ANDL-PIPECOLIC ACID, AND (S) (+)-CONIINE FROM L-LYSINE.CHEMICAL AND PHARMACEUTICAL BULLETIN,PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN.24 4.1976,24(4),621-631. *

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