CN1873005A - 蚯蚓微管结合蛋白Tau、其编码基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从蚯蚓总RNA中通过RT－PCR得到的基因E－tau和该基因表达的蛋白质E－Tau、含有上述基因序列的重组载体及其亚克隆和重组微生物，以及由该基因构建的真核表达载体、转染细胞系。该基因属于一种新的微管相关蛋白质Tau的基因，其表达产物属于一种新的蛋白质。本领域已部分了解神经tau与神经退行性疾病，特别是与早老性痴呆(Alzheimer’s disease，AD)的病理过程密切相关；该蛋白质具有促进微管装配和稳定微管网络的作用。本发明还涉及该基因在治疗神经退行性疾病中的应用。

Description

蚯蚓微管结合蛋白Tau、其编码基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，本发明涉及编码一种蚯蚓的微管结合蛋白的基因Etau。本发明还涉及该基因编码的蛋白质功能、含有上述基因序列的重组载体及其亚克隆和重组微生物，以及由这些亚克隆获得到的真核表达载体及转染的细胞系。此外，本发明还涉及该基因在神经元微管组装中的作用及其临床医学中对神经退行性疾病研究的应用。

背景技术

1975年，Weingarten等在研究神经元微管系统的分子结构过程中，发现了一种与微管蛋白质具有高亲和力的蛋白质，将其归类于微管结合蛋白(microtubule associated protein，MAP)，命名为神经tau。该蛋白质具有促进微管装配和稳定微管网络的作用，与信号转导、物质运输以及神经细胞发育相关。近十几年的研究显示，神经tau与神经退行性疾病，特别是与早老性痴呆(Alzheimer’s disease，AD)的病理过程密切相关。Tau的异常超磷酸化是神经纤维缠结(NFTs)的主要成分，而NFTs是AD等神经退行性疾病的一种重要的病理特征。1998年，Hutton等发现了17号染色体相关的帕金森氏病(Parkinson’s PD)样额颞叶痴呆(frontotemporaldementia with parkinsonsm linked to chromosome 17，FTDP-17)的病因是该染色体上的tau基因发生了突变。最近研究表明，该蛋白质也存在于神经细胞核内，能与DNA相互作用，具有稳定双螺旋结构的作用；还能与某些具有重要功能的蛋白质相互作用，表现出类似分子伴侣的功能。由于tau在AD等神经退行性疾病病理机制研究中的重要地位，使其成为微管结合蛋白家族中最受瞩目的成员之一。

自从tau首先从成体脑组织中被提取出来，人们就知道它以几种形式(异构体)存在，后来发现这是发育调控的结果(Matus，1988)。分子克隆研究现已发现成体哺乳动物的神经系统中至少存在六种tau蛋白质异构体，它们来源于同一个基因，经mRNA转录后的不同剪接而得到。

Tau基因位于17号染色体上，它在种系间高度保守。迄今为止，已经从小鼠、大鼠、牛以及人类的表达库中获得了tau的克隆(Lee等，1988；Goedert等，1988；Goedert等，1989a；Himmler，1989a；Himmler等，1989b；Mori等，1989；Kosik等，1989；Kanai等，1989；Goedert等，1989b)。目前以全长cDNA克隆形式被分离出来的六种人类tau的异构体分别由352-441个氨基酸组成，差别主要在于三个插入序列的存在与否(Goedert等，1988；Goedert等，1989a；Goedert等，1989b；Goedert和Jakes，1990)。

与tau蛋白质沉积相关的病症并不只限于阿尔茨海默病，在许多中枢神经系统疾病中也可以观察到，诸如皮克病(心包性假性肝硬变)和进行性核上麻痹(Joachim等，1987)。除此之外，还发现在大部分老龄的唐氏综合症患者脑中tau是配对螺旋样纤维的组成部分。这提示对于多种神经细胞的损伤，tau可能以一种相对非专一性的方式被影响。换句话说，tau的不同修饰，每一种针对特定的疾病，可能导致相似的神经纤维缠结的形成。

Tau是阿尔茨海默病病理学研究中的关键分子之一，并且与其他几种神经退行性疾病有关(Grundke-Iqbal等，1986a；Grundke-Iqbal等，1986b；Iqbal等，1986)。统计数字显示，所有与tau有关的病理学占据了痴呆病的75％。在这些神经系统的疾病中，家族遗传性额颞页痴呆引起了广泛的关注。此种家族性痴呆的患者，其tau基因发生了某些错义突变(Poorkaj等，1998；Hutton等，1998；Spillantini等，1998)，表明tau蛋白质的单基因突变引发其积累和加工的异常可以直接导致痴呆产生。为了弄清阿尔茨海默病及其他与tau蛋白质有关的病理学过程的分子机制，了解tau蛋白质各方面的功能是十分必要的。

Tau最初是以一种重要的脑微管结合蛋白被发现的，它可以促进微管的组装并稳定后者的结构(Weingarten等，1975)。90年代，几个实验室分别报道了tau存在于多种细胞株系的细胞核中(Loomis等，1990；Davisand Johnson，1999)，Greenwood等人发现核tau与DNA有直接或间接的结合(Greenwood and Johnson，1995)，因此推测tau蛋白质除作为微管结合蛋白外，还具有其他的功能。弄清tau的功能无疑将会有助于阐明阿尔茨海默病及其他与tau蛋白质相关的病理学过程的分子机制。

到目前为止，尽管已经在许多动物种类中发现了Tau蛋白质并对其功能做了大量研究，但是从未见在蚯蚓中发现Tau蛋白质的报道。根据果蝇、大鼠、小鼠及人类的Tau结构的保守性，本发明人从蚯蚓身体部分及神经节部分的总RNA中，通过RT-PCR发现一个新的Tau基因，命名为Etau，并且对其限制性酶谱、序列及表达的蛋白质进行了分析，并得到了多克隆抗体。此外，本发明人还研究了该基因在真核细胞中的表达模式，发现该基因与微管的组装及与信号转导、物质运输以及神经细胞发育相关。

发明内容

本发明提供一种从蚯蚓总RNA中通过RT-PCR得到的基因E-tau和该基因表达的蛋白质E-Tau、含有上述基因序列的重组载体及其亚克隆和重组微生物，以及由该基因构建的真核表达载体、转染细胞系。该基因属于一种新的微管相关蛋白质Tau的基因，其表达产物属于一种新的蛋白质。本领域已部分了解神经Tau蛋白质具有促进微管装配和稳定微管网络的作用，与信号转导、物质运输以及神经细胞发育相关；神经tau与神经退行性疾病，特别是与早老性痴呆(Alzheimer’s disease，AD)的病理过程密切相关。本发明还涉及该基因表达的蛋白质E-Tau在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用，该神经退行性疾病特别是早老性痴呆。

本发明提供的基因Etau具有如SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列。另一方面，该基因中的一个或多个碱基的缺失、插入或替代产生具有与SEQ ID NO.1所示序列具有相同功能的变异体也应包括在本发明的内容之内。因此，本发明应当包括具有SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸的变异体，这些变异体的序列与SEQ ID NO.1所示序列的同源性至少为80％，优选的至少为90％。

所以本发明还提供了该基因的变异体的片段。

另一方面，本发明提供含有该基因及其变异体或其片段的重组载体。选择的载体通常能在使用的特定宿主细胞内发挥功能，也就是说，载体与宿主细胞兼容，从而能实现基因的扩增和(或)基因的表达。在本发明的一个实施方案中，上述载体是pET28a(NOVAGEN)，插入的是Etau或其片段，插入位点可以是Nco I和Xho I或EcoR I和BamH I等。

用于实现本发明的优选载体是能够与细菌、酵母和哺乳动物宿主细胞相容的那些载体。其中尤其包括pCRII、pCR3和pcDNA3.1(Invitrogen，SanDiego，CA)、pB SII(Stratagene，La Jolla，CA)、pET 15(Novagen，Madison，WI)、pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)、pEGFP-N1(Clontech，PaloAlto，CA)、pETL(BlueBacII，Invitrogen)、pDSR-α(PCT Pub.No.WO90/14363)和pFastBacDual(Gibco-BRL，Grand Island，NY)。

另一方面，本发明还提供含有上述重组载体的重组微生物。当载体构建完成，即将本发明多核苷酸插入到载体的适当部位之后，就可以将所得载体导入适当的宿主细胞内，用于本发明多核苷酸的扩增和(或)表达。可以用本领域熟知的方法将载体转化到选定的宿主细胞内，这些方法包括，例如，转染法、感染法、氯化钙法、电穿孔法、显微注射法、脂转染法、DEAE-葡聚糖法，或已知的其他方法。选择的方法会根据所用宿主细胞的类型而有部分变化。这些方法以及其他适当的方法已为该领域的技术人员所熟知，并且在Sambrook等人的《分子克隆实验手册》(Cold Spring Harbor Laboratories，1989)和Davis等人的《分子生物学基本方法》(Elsevier，1986)中均有所描述。

本发明的多核苷酸的扩增和(或)表达可以在原核宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞(杆状病毒系统)和(或)真核宿主细胞中进行。表达宿主细胞的选择在某种程度上取决于是否要对目的蛋白质进行翻译后修饰(如糖基化和/或磷酸化)。如果需要，则优选的是酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞或哺乳动物宿主细胞。有关表达载体的综述，可参考Meth.Enz.，Vol.185(D.V.Goeddel，ed.，Academic Press 1990)。

另一方面，本发明还提供一种方法，用以获得本发明的表达蛋白质。该方法包括培养宿主细胞以合成该蛋白质，然后收集和裂解宿主细胞，再用本领域熟知的方法选择性地回收产物。

另一方面，本发明还提供该基因及其变异体或其片段的转染细胞系。在本发明的实施方案中，使用GFP融合的Etau来转染真核细胞，并得到稳定转染的细胞系。该细胞系例如包括HEK 293(ATCC CRL-1573)、HeLa(ATCC CCL-2)、NIH 3T3(ATCC CRL-1658)、BNL CL.2(ATCC TIB-73)、HepG2(ATCC HB-8065)、COS7(ATCC CRL-1651)、CHO(ATCCCRL-9618)、SH-SY5Y(ATCC CRL-2266)、IMR 32(ATCC CCL-127)、MRC5(ATCC CCL-171)、MCF7(ATCC HTB-22)、562(ATCC CCL-243)、SKOV-3(ATCC HTB-77)、HUV-EC(ATCC CRL-1730)(primary cell)和C6(ATCC CCL-107)等真核细胞系(购自ATCC)。

另外根据本领域常规技术方法，还得到Etau的多克隆抗体，这些标记GFP的Etau细胞系及多克隆抗体可以用于原位杂交以研究本发明的基因Etau的表达模式，但不局限于此。

由于神经tau与神经退行性疾病，特别是与早老性痴呆(Alzheimer’sdisease，AD)的病理过程密切相关。本发明还涉及蛋白质E-Tau在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用，该神经退行性疾病特别是早老性痴呆。

附图说明

图1：表示蚯蚓总RNA的琼脂糖凝胶图。

图2：表示本发明RT-PCR的琼脂糖凝胶图。M：DNA标记；1：EtauDNA，其中方框内为本发明基因。

图3：表示本发明多核苷酸的限制性酶切琼脂糖凝胶图。M：DNA标记；1：重组载体；2：空载体；3：双酶切重组载体；4：Etau DNA。

图4：表示本发明基因经真核表达载体构建Etau-GFP的酶切琼脂糖凝胶图。M：DNA标记；1：重组载体；2：空载体；3：双酶切重组载体；4：Etau DNA。

图5：通过SDS-PAGE检测纯化的本发明基因的表达产物。M：标准分子量；1：纯化的本发明蛋白质，其分子量约为46KDa。

图6：表示本发明基因经真核表达载体构建成Etau-GFP在细胞中的表达模式。

图7：表示本发明基因所得的多克隆抗体的western blot图。M：标准分子量；1：纯化的本发明蛋白质的免疫条带，其分子量约为46KDa。

图8：表示本发明基因表达的蛋白质E-Tau与微管相互作用的紫外光谱图。在37℃保温的微管蛋白质(10μM)溶液中加入E-Tau(2μM)，用日立分光光度计检测溶液在350nm吸光值的变化(微管组装后溶液的吸光值将变大)。曲线1：溶液中只有微管蛋白质；曲线2：溶液中同时含有微管蛋白质和E-Tau蛋白质。

图9：Etau的限制性酶切图谱的的确定和各种亚克隆的构建。

图10：Etau与人类tau(Htau)蛋白活性的对比(在37℃保温的微管蛋白质(10μM)溶液中加入E-Tau或Htau(2μM)，用日立分光光度计检测溶液在350nm吸光值的变化)。

图11：通过SDS-PAGE检测纯化的Etau亚克隆的表达产物。M：标准蛋白分子量，B：亚克隆B，E：亚克隆E。

图12：亚克隆B、E蛋白表达产物的生物活性测定(在37℃保温的微管蛋白质(10μM)溶液中加入B或E(2μM)，用日立分光光度计检测溶液在350nm吸光值的变化)。

具体实施方式

以下结合优选的实施例对本发明作详细的说明，但并不意味着对本发明的内容限制。

                  实施例1：蚯蚓总RNA的制备

步骤1：实验器具的处理与准备

1)塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等)

先将DEPC(焦碳酸二乙酯)水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次(EP管)；

2)玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰ DEPC过夜，再烤干)；

3)匀浆器：(包括剪刀、镊子)先洗净后，再高压(不需要泡DEPC)；

4)取组织用的剪刀用时在火上烤一下。

步骤2：蚯蚓样品制备

1)首先准备好用于包装样本的铝箔或冷冻保存管，并且用油性记号笔在铝箔或冻存管外表多处写明样本编号。

2)准确切除蚯蚓(赤子爱胜蚓，Esiena fetida)所需组织后，立即在冰上剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织类型。

3)在不含RNase的PBS中迅速漂洗样本，以去除血渍和污物。

4)用准备好的铝箔或冷冻保存管装载包裹组织，迅速投入液氮冷却。

步骤3：组织样本的碾磨及匀浆

1)将超低温保存的样品除去样品袋，在电子天平上称重后，转移至用液氮预冷的碾钵中，用杵子碾磨组织，其间不断加入液氮，直至碾磨成粉末状。

2)将碾磨成粉末状的样品，转移至已经加入适量TRIzol试剂的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中，在组织匀浆粉碎机上进行匀浆。匀浆液较透明且无颗粒即可。

3)小心吸取匀浆液转入新的离心管，在15～30℃放置5min。

4)将离心管于4℃，12000rpm，10min离心。

5)小心吸取上清液转入新的离心管。

步骤4：蚯蚓总RNA的抽提

1)向裂解液中加入氯仿，盖紧离心管盖，用力振荡离心管(溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象)；在15～30℃放置3min。

2)于4℃，12000rpm，离心15min。

3)从离心机中小心地取出离心管，吸取体积约为TRIzol试剂起始加入量一半的上清至另一无RNA酶的离心管。

步骤5：蚯蚓总RNA的洗涤及洗脱(应用Qiagen RNA提取试剂盒)(QIAGEN)

1)向在步骤4离心得到的上清液中加入一倍体积的70％乙醇，反复颠倒直至混匀。

2)小心的吸取700μL混合液(包括其中的沉淀物)转移到放置于2mL收集管中(试剂盒中提供)的RNease旋转柱(spin column)中，10,000rpm离心15秒，弃去过滤液和收集管。

3)转移RNease旋转柱到一个新的2mL收集管中。吸取700μL BufferRW1到RNease旋转柱中，10,000rpm离心15sec进行洗涤，弃去过滤液和收集管。

4)转移RNease旋转柱到一个新的2mL收集管中。吸取500μL BufferRPE到RNease旋转柱，10,000rpm离心15sec进行洗涤，弃去过滤液和收集管。

5)小心的打开RNease旋转柱，加入500μL Buffer RPE，盖上盖子，14,000rpm离心3min。

6)转移RNease旋转柱到一个新的2mL收集管中，14,000rpm离心1min。

7)转移RNease旋转柱到1.5mL离心管中，在RNease membrane表面加入30μL RNase-free水，室温放置1min后，10,000rpm离心1min。

8)再加入30μL RNase-free水，10,000rpm离心1min。

步骤6：蚯蚓RNA检测

所得总RNA在1％琼脂糖凝胶中检测，如图1所示。

注意事项

所有的实验步骤(包括离心)必须在室温下(15～25℃)进行。

                实施例2 通过RT-PCR得到Etau

化学合成如下寡核苷酸序列(上海生工)：

引物1：5’ATGGAGCCCCGCCAGGAGTTCGAA 3’

引物2：5’CAAACCCTGCTTGGCCAGGGAGGC 3’

取实施例1中的蚯蚓总RNA，采用RT-PCR one step kit(Qiagen Inc.)，按照说明书所述方法来操作。利用引物1和引物2，使用Taq DNA聚合酶进行PCR反应，95℃保温5分钟，50℃保温30分钟之后，进入如下循环：94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，循环35次，72℃延伸10分钟，冷却至4℃，得到Etau的核苷酸序列。将所得的DNA克隆于克隆载体pBluescript II KS-质粒(NOVAGEN)EcoR I位点，其序列如SEQ ID NO.1所示。

根据载体pBluescript II KS的特性，采用T3 primer和T7 primer为引物，分别用T3聚合酶和T7聚合酶对Etau的正反两个方向进行测序(上海生工)，该基因的核酸序列总长1053bp。其基因核甘酸序列(即全部的可读框)结果见SEQ ID NO.1，由该核甘酸序列所推导的蛋白质为351个氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例3：Etau的限制性酶切图谱的的确定和各种亚克隆的构建

步骤1：对本发明的Etau克隆进行单酶切、双酶切及多酶切，并通过琼脂糖凝胶电泳计算各酶切片段大小，并分析其多克隆位点，绘制出限制性酶切图谱，见图3。

步骤2：用Pst I对Etau进行酶切，并通过琼脂糖凝胶电泳回收该酶切片段，然后以pET28a载体，用同样的酶(Pst I)将其酶切，最后通过连接反应构建得到亚克隆A和B；用Pfu I/Ace II对Etau进行双酶切，构建得到亚克隆C；另外分别用BlpI/Pfu I、Pfu I/Pst I、Pst I/Hind III、Pfu I/BsrFI、BsrF I/Xho I及Ace II/Xho I对Etau双酶切，构建得到亚克隆D、E、F、G、H和I；共获得Etau不同片段大小的亚克隆9种，但不局限于此，见图9。

实施例4：绿色荧光蛋白质与Etau融合蛋白质(pEGFP-N1-Etau)的构建

我们应用pEGFP-N1真核表达载体(CLONTECH)将GFP的氨基端连接到Etau的羧基端。Etau全长DNA是从蚯蚓总RNA中应用RT-PCR反应扩增获得。上游引物为：

5’CTCGAGATGGAGCCCCGCCAGGAGTTCGAA 3’，在起始密码ATG前加入了Xho I位点；下游引物为：5’-GGATCCAACAAACCCTGCTTGGCCAGGGAGGC 3’，在GFP的起始密码ATG前引入了BamH I位点。为构建Etau-GFP融合基因，Etau DNA先通过Xho I和BamH I双酶切克隆入pEGFP-N1载体中，构建成pEGFP-N1-Etau并经测序验证，如图4所示。

           实施例5：Etau全长基因的表达与纯化

步骤1：表达质粒的构建。用Nco I和Xho I酶切Etau，同时将所用的表达载体pET 28a也用这两种酶进行双酶切，然后用T4DNA连接酶将上述片段连接起来，命名为pET 28a-Etau。酶切图谱和DNA测序结果表明表达质粒的构建准确无误。

步骤2：重组蛋白质的的表达和纯化。用CaCl₂法将pET 28a-Etau转化BL21(DE3)(Stratagene)菌株感受态细胞，用LB培养基37℃液体培养。当OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG(终浓度0.4mM)开始诱导本发明基因的表达，继续培养3小时，离心收集菌体。用添加蛋白质酶抑制剂的磷酸缓冲液(pH 7.3，aprotinin 1μg/ml，PMSF 100μg/ml)悬浮菌体，每1升培养液用50ml缓冲液悬浮，于冰浴中超声裂解菌体。随后，加入TritonX-100(终浓度1％)，轻轻搅拌均匀30分钟。离心取上清(4℃，10000rpm)，用Ni⁺⁺-螯合Sepharose 4B柱亲和吸附，用50mM咪唑洗脱除去杂蛋白质。然后收集200mM咪唑洗脱组分，透析，真空冷冻干燥，最后用SDS-PAGE实验来验证该样品，结果显示其分子量与预期一致(约为46KDa)，并且其纯度在90％以上，见图5。

           实施例5：转染真核细胞的表达模式

选择HEK 293，HeLa，COS-7，CHO，5HSY-5Y等真核细胞系进行转染。

步骤1：准备转染细胞(应用Inventrogen的转染试剂lipofectamine2000)

转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板在500μL/2mL含血清，不含抗生素的正常生长的培养基(LB培养基)中(每孔0.5-2×10⁵/3×10⁵个细胞)。使其在转染日能达到90-95％的融合。

步骤2：准备DNA/脂质体复合物

1)对于每孔细胞，使用50μL/250μL无血清培养基(如OPTI-MEMI、DMEM培养基)稀释0.8μg DNA/4.0μg DNA，轻轻混匀。

2)使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，每孔细胞用50μL/250μL无血清培养基稀释2μL/10μL Lipofectamine 2000转染试剂。轻轻混匀，室温孵育5分钟。

3)混合稀释的DNA和稀释的Lipofectamine 2000，此时总体积是100μL/500μL。轻轻混匀，室温放置20分钟以使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成。溶液可能会比较浑浊，但这不影响转染效率。

步骤3：转染细胞

1)将24孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入0.5ml/2ml无血清配养基。

2)逐滴加入100μL/500μL脂质体/DNA混合物到每孔中(从培养孔一边到另一边)，边加边前后来回摇动培养板，轻轻混匀。

3)在37℃，5％CO₂中孵育24-48小时。无需去掉复合物或更换培养基。或者在4-5小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。

4)在细胞中加入复合物24-72小时后，荧光镜下观察转染效率，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测各项指标。

步骤4：筛选稳定转染细胞系

1)转染24h后施加筛选压力，改用含G418(C₂₀H₄₀N₄O₁₀·2H₂SO₄，无中文名称，是一种抗生素)的培养基培养。在G418筛选浓度下持续培养14天后，挑出单克隆，扩大培养，期间每3天换液一次。

2)转染后细胞在非选择性培养液中培养18～24h，使转染的外源基因得到表达后，胰酶消化，按1∶15～1∶20稀释传代，接种入各种选择性培养液中继续培养，在2～3周内每2～4天更换培养液一次，使抗性克隆得以生长(如图6)。

3)挑选克隆进行扩大培养，然后进行DNA或RNA的杂交分析，新合成的蛋白质的检测以及相关各项指标的检测。

           实施例5：应用纯化的Etau产物以制备抗体

经纯化的重组表达的Etau产物进一步纯化后，直接溶于水中，这样得到的单一蛋白质可用本领域所熟知的方法免疫动物以制备多克隆抗体。得到多克隆抗体后，检测其效价及免疫特性。如图7。

         实施例6：纯化的Etau产物适用于分子神经生物学

已知该基因的产物Etau是一种神经Tau蛋白质具有启动微管装配和稳定微管网络的作用(如图8)，与信号转导、物质运输以及神经细胞发育相关，神经tau与神经退行性疾病，特别是与早老性痴呆(Alzheimer’sdisease，AD)的病理过程密切相关。因此应用该蛋白质产物可研究其与DNA和蛋白质的相互作用，以进一步明确Tau神经退行性疾病中的调控作用。因此，本发明的蛋白质E-Tau还可以用于制备治疗神经退行性疾病的药物，该神经退行性疾病特别是早老性痴呆。

实施例7：Etau产物的抗体适用于免疫细胞化学及免疫组织化学

按照《分子克隆实验手册》(Cold Spring Harbor Laboratories，1989)中所述方法，应用Etau的抗体可对蚯蚓组织和细胞进行原位杂交，从而进行Etau基因的表达模式以及Tau蛋白质执行功能的时间和部位，以及表达强度。

       实施例8：Etau亚克隆产物蛋白生物活性的鉴定

按照Etau全长基因的表达方法，将实施例3中的亚克隆片段B、E经对应的双酶切后用T4连接酶连接到相应酶切的表达载体pET 28a中，然后将质粒转入BL21感受态细胞，表达纯化得到相应的蛋白(见图11)，发现亚克隆蛋白B、E、都具有一定的活性，即促进微管蛋白的组装(见图12)。

          实施例9：蚯蚓Etau和人Htau的活性比较

Etau与人类tau(Htau)蛋白活性的对比(在37℃保温的微管蛋白质(10μM)溶液中加入E-Tau或Htau(2μM)(微管蛋白自猪脑内提取，提取方法参考文献(Robley C.1982)，Htau蛋白是按照文献先将连接到表达载体上的人tau基因转入大肠杆菌表达、纯化后得到的，表达和纯化方法参考文献(Goedert和Jakes，1990)，用日立分光光度计检测溶液在350nm吸光值的变化)。实验结果见图10。由此可见，蚯蚓Etau具有比已知的人Htau更高的促进微管蛋白组装的活性。

                          参考文献

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5.Goedert，M.and Jakes，R.(1990)Expression of separate isoforms of humantau protein：correlation with the tau pattern in brain and effects on tubulinpolymerization.EMBO J.9，4225-4230

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11.Hutton，M.，Lendon，C.L.，Rizzu，P.，Baker，M.，Froelich，S.，Houlden，H.，Pickering-Brown，S.，Chakraverty，S.，Isaacs，A.，Grover，A.，Hackett，J.，Adamson，J.，Lincoln，S.，Dickson，D.，Davies，P.，Petersen，R.C.，Stevens，M.，de Graaff，E.，Wauters，E.，van Baren，J.，Hillebrand，M.，Joosse，M.，Kwon，J.M.，Nowotny，P.，Heutink，P.，et al.(1998)Association of missense and 5′-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17.Nature 393，702-705

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                           序列表

<110>中国科学院生物物理研究所

<120>蚯蚓微管结合蛋白Tau、其编码基因及其应用

<130>IB052846

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1053

<212>DNA

<213>蚯蚓(Esiena fetida)

<400>1

atggagcccc gccaggagtt cgaagtgatg gaagatcacg ctgggacgta cgggttgggg     60

gacaggaaag atcagggggg ctacaccatg caccaagacc aagagggtga cacggacgct    120

ggcctgaaag ctgaagaagc aggcattgta gacaccccca gcctggaaga cgaagctgct    180

ggtcacgtga cccaagctcg catggtcagt aaaagcaaag acgggactgg aagcgatgac    240

aaaaaagcca agggggctga tggtaaaacg aagatcgcca caccgcgggg agcagcccct    300

ccaggccaga agggccaggc caacgccacc aggattccag caaaaacccc gcccgctcca    360

aagacaccac ccagctctgg tgaacctcca aaatcagggg atcgcagcgg ctacagcagc    420

cccggctccc caggcactcc cggcagccgc tcccgcaccc cgtcccttcc aaccccaccc    480

acccgggagc ccaagaaggt ggcagtggtc cgtactccac ccaagtcgcc gtcttccgcc    540

aagagccgcc tgcagacagc ccccgtgccc atgccagacc tgaagaatgt caagtccaag    600

atcggctcca ctgagaacct gaagcaccag ccgggaggcg ggaaggtgca aatagtctac    660

aaaccagttg acctgagcaa ggtgacctcc aagtgtggct cattaggcaa catccatcat    720

aaaccaggag gtggccaggt ggaagtaaaa tctgagaagc ttgacttcaa ggacagagtc     780

cagtcgaaga ttgggtccct ggacaatatc acccacgtcc ctggcggagg aaataaaaag     840

attgaaaccc acaagctgac cttccgcgag aacgccaaag ccaagacaga ccacggggcg     900

gagatcgtgt acaagtcgcc agtggtgtct ggggacacgt ctccacggca tctcagcaat     960

gtctcctcca ccggcagcat cgacatggta gactcgcccc agctcgccac gctagctgac    1020

gaggtgtctg cctccctggc caagcagggt ttg                                 1053

<210>2

<211>351

<212>PRT

<213>蚯蚓(Esiena fetida)

<400>2

Met Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr

1               5                   10                  15

Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His Gln

            20                  25                  30

Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala Gly

        35                  40                  45

Ile Val Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr

    50                  55                  60

Gln Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp

65                  70                  75                  80

Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg

                85                  90                  95

Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile

            100                 105                 110

Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu

        115                 120                 125

Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro

    130                 135                 140

Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro

145                 150                 155                 160

Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser

                165                 170                 175

Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro

            180                 185                 190

Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys

        195                 200                 205

His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp

    210                 215                 220

Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His

225                 230                 235                 240

Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe

                245                 250                 255

Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His

            260                 265                 270

Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe

        275                 280                 285

Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr

    290                 295                 300

Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn

305                 310                 315                 320

Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala

                325                 330                 335

Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu

            340                 345                 350

Claims (15)

1.一种多核苷酸，该多核苷酸的序列与SEQ ID NO.1所示序列的同源性至少为80％。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中，该多核苷酸的序列与SEQID NO.1所示序列的同源性至少为90％。

3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其具有SEQ ID NO.1所示序列。

4.一种蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示序列的同源性至少为80％。

5.根据权利要求4所述的蛋白质，其中，该蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示序列的同源性至少为90％。

6.根据权利要求4所述的蛋白质，其具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

7.一种重组载体，该重组载体的特征在于含有权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸。

8.一种含有权利要求7所述的重组载体的宿主细胞。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其选自原核细胞或真核细胞。

10.权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸转染的真核细胞，该细胞系包括：HEK 293，HeLa，NIH 3T3，BNL CL2，HepG2，COS-7，CHO，5HSY-5Y，IMR 32，MRC5，MCF7，562，SKOV-3，IGROV-1，HUV-EC和C6等真核细胞系。

11.一种GFP融合蛋白，其特征在于含有权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸所表达的蛋白质。

12.根据权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸在调控细胞微管组装中的应用。

13.根据权利要求4-6中任何一项的蛋白质在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

14.根据权利要求13的应用，其中所述神经退行性疾病为早老性痴呆。

15.根据权利要求4-6及11中任一项所述的蛋白质在免疫组织化学或抗体制备中的应用。

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