CN1871025A

CN1871025A - 基于印记位点调节物兄弟(boris)的预防性癌症疫苗

Info

Publication number: CN1871025A
Application number: CNA2004800314130A
Authority: CN
Inventors: M·G·阿加德简炎; A·古其科炎
Original assignee: Individual
Current assignee: Yang Qiming
Priority date: 2003-08-25
Filing date: 2004-08-25
Publication date: 2006-11-29
Anticipated expiration: 2024-08-25
Also published as: JP2007504154A; EP1667711B1; WO2005021029A2; AU2004268001B2; CA2537161C; US20100166790A1; IL173943A0; DE602004028381D1; US8114405B2; DK1667711T3; RU2385163C2; CN1871025B; EP1667711A2; RU2006109359A; AU2004268001A1; US20060286115A1; RU2010110441A; US7579452B2; RU2556128C2; WO2005021029A3

Abstract

描述了编码印记位点调节物兄弟(BORIS)分子的无功能突变形式的多核苷酸，无功能突变的BORIS蛋白质、多肽或肽和BORIS的经修饰的蛋白质形式。这些分子用作针对癌症的治疗性疫苗。

Description

基于印记位点调节物兄弟(BORIS)的预防性癌症疫苗

发明领域

本发明涉及用于产生肿瘤疫苗的组合物和方法。

背景

脊椎动物能够产生作为针对来自环境的病原体以及针对内部产生的异常细胞，如肿瘤细胞的防御的免疫应答。免疫应答是多种细胞和因子之间复杂相互作用的结果，但是通常包含两个主要方面。一个方面是细胞组分，其中特化细胞直接攻击触犯物(具有抗原)，而另一方面是体液组分，其中抗体分子特异结合抗原并且帮助它的清除。个体成分一致地相互作用可以十分有效地限制入侵病原体的最初攻击和从宿主清除它们。

涉及提供免疫应答的初级细胞是淋巴细胞，其通常包含两种主要类别。第一种称作B细胞或B淋巴细胞，通常在骨髓中产生，并且负责产生和分泌抗体等。B细胞抗体产物倾向于与外来抗原直接作用并且中和它们或活化免疫系统的其他组分来消除外来抗原。具体地，调理性抗体结合细胞外外来物，从而使得它们易受吞噬和随后的细胞内杀死。另一方面，T细胞或T淋巴细胞通常在胸腺中产生或成熟，负责介导细胞免疫应答。这些细胞不识别完整抗原，而是应答其短肽片段，该短肽片段结合到出现在靶细胞以及抗原呈递细胞的表面上的特化蛋白质。更具体地，似乎细胞内产生的蛋白质或者细胞从胞外环境摄入的蛋白质被正常代谢途径连续地降解成肽。所得短片段与细胞内主要组织相容性复合体(MHC)分子结合并且MHC-肽复合体转运到细胞表面上以被T细胞识别。从而，细胞免疫系统不断监视细胞产生或摄入的全范围的蛋白质并且将消除呈递外来抗原或肿瘤抗原的任何细胞，即，受病毒感染的细胞或癌细胞。

免疫球蛋白G(IgG)的结构是四聚体蛋白质复合体结构，其包含两条相同的重(H)链和两条相同的免疫球蛋白轻(L)链。这些链通过二硫键连接在一起形成Y形抗体复合体。然而，在溶液中，所述分子呈现更球状形状并且易于结合生物体液中存在的外来抗原。免疫球蛋白的氨基酸序列分析已经导致在链内具有多种功能活性的特定区域的限定。每条轻链和每条重链具有在前110个氨基末端残基内限定的可变区(分别为V_L和V_H)。V_L和V_H区的三维配对构成了免疫球蛋白分子的抗原识别部分或者“抗原结合部位”(“ACS”)。因为免疫球蛋白的四聚体性质，每个分子有两个相同的抗原结合部位。这些链的可变结构域在序列中高度异质并且提供了抗原结合部位对许多抗原结构高度特异的多样性。可变结构域的异质性在整个可变区中不是均匀分布，而是位于三个片段中，所述三个片段称作互补性决定区(“CDR”)，称作CDR1、CDR2和CDR3。关于这些结构的更多信息，见Watson等人，1987，Molecular Biology of the Gene，第四版，Benjamin/Cummings Publishing Co.，Inc.Menlo Park，Calif.，此处将其引用作为参考。

每条重链还包括限定特定同种型的恒定区并且将免疫球蛋白分配到免疫球蛋白类别和亚类之一。恒定区含有称作结构域的单位(即，C_H1、C_H2等等)，其在单一类别的抗体中不显著不同。恒定区不参与抗原结合，但是可以与称作“效应子功能”的许多生物活性相关，所述效应子功能为诸如结合细胞表面上的Fc受体以及结合补体蛋白质。抗原呈递细胞如树突细胞和巨噬细胞的特征通常通过Fc受体的存在来区别。因此，如果抗体结合病原体，那么它可以通过Fc部分连接巨噬细胞。这允许病原体被巨噬细胞摄入和破坏——一种称作调理作用的过程。此外，如将在下面更详细讨论的，多种病原性抗原可以被APC加工和展示以进一步刺激免疫应答。

不像重链，轻链具有一个恒定结构域(C_L)。轻链通过二硫键与重链配对，所述二硫键连接重链恒定区C_H1与C_L。此外，重链具有铰链区，其将恒定区C_H1和C_H2与分子的剩余部分分开。该铰链区主要造成四聚体的柔性。分子的两条重链通过铰链区和C_H2之间接头处的二硫键配对在一起。

为了提供这种广泛所有组成成分，免疫球蛋白基因已经进化成允许从有限数目的基因产生许多种不同的免疫球蛋白蛋白质，即固有多态性。由于固有多态性，哺乳动物能够产生针对似乎无数种抗原的抗体。关于免疫球蛋白遗传学和蛋白质结构的综述见Lewin，″Genes III″，John Wiley andSons，N.Y.(1987)和Benjamini和Leskowitz，1988，Immunology，AlanR.Liss，Inc.，New York，将其并入本文作为参考。

在过去几年里，抗体由于它们的多样性和特异性已经在诊断和治疗应用中变得非常重要。分子生物学技术越来越多地用于扩大用于科学应用的抗体的种类和可用性。例如，产生一种抗体的B细胞可以与肿瘤细胞融合永生化并扩大以提供具有单一特异性的抗体的体外来源，所述抗体称作“单克隆抗体”(mAb)。此类永生化B细胞系称作“杂交瘤”。

直到最近，多数mAb的来源是体外培养的鼠(小鼠)杂交瘤。即，通常用所选抗原或者免疫原注射小鼠。随后，处死动物并将从其脾脏除去的细胞与永生化骨髓瘤细胞融合。尽管它们已经广泛用于诊断方法，但是鼠mAb不能很好地适于包括人的多数哺乳动物中的治疗应用。这部分是由于鼠抗体被其他哺乳动物物种识别为外来的并且引起免疫应答，其本身可以导致疾病。

为了克服至少一些外来mAb产生的免疫应答和缺少适宜的人mAb的问题，已经用基因工程构建人源化嵌合免疫球蛋白分子，其含有鼠抗体的抗原结合互补性决定区，但是其中该分子的剩余部分由不被识别为外来物的人抗体序列组成。此类抗体已经用于治疗肿瘤，因为小鼠可变区识别肿瘤抗原并且分子的人源化部分能够介导免疫应答而不被身体快速清除。见，例如，Jones等人，Nature，321：522-525(1986)，将其并入本文作为参考。

此类抗体的其他用途在PCT公开号WO 94/14847中详细描述，将WO94/14847也并入本文作为参考。在这些情况中，将外来抗原的表位，如病毒或者细菌表位嫁接到免疫球蛋白的高变区以诱导应答。即，工程化抗体用作疫苗引起免疫应答和赋予长期免疫原性记忆，从而允许受试者击退随后的感染。

这些和更常规的疫苗是有效的，因为它们刺激免疫系统的两个叉。尽管与免疫应答的体液组分相关的复杂性，但是它将不会自身能够有效保护动物免于受试者每天受到的无数病原性攻击。相反地，只有高度进化的细胞应答的存在才允许高级生物幸存和繁殖。

如上面指出的，从骨髓中前体细胞产生的T淋巴细胞或者T细胞是针对入侵病毒和其他微生物的免疫应答中的主要成员。祖先干细胞迁移到胸腺，在胸腺中，作为所称作的胸腺细胞，它们变得特化。具体地，它们开始展示受体分子，所述受体分子后来使得成熟T细胞检测感染。为了有益，T细胞必须通过它们的受体附着到抗原(蛋白质标记物信令入侵物的存在)。同时，它们将对身体产生的物质不反应(blind)，因为自身反应性T细胞可以破坏正常组织。通常，仅仅产生有用受体的那些胸腺细胞将完全成熟并且进入血流以巡视身体。健康个体中将无效或者将攻击身体的自身组织的其他胸腺细胞在离开胸腺前通过程序性细胞死亡清除。

最后进入循环作为溶细胞T淋巴细胞或者T辅助细胞的成熟T细胞保持静止，除非它们遇到它们的受体可以识别的抗原。当遇到淋巴细胞对其具有亲和性的特异抗原时，它们增殖并进行效应子功能，其结果是外来抗原的清除。

已经将T细胞基于它们执行的不同任务分类成一些亚群。这些亚群包括辅助T细胞(T_h)，其是促进或增强T和B细胞应答所需的；细胞毒性(或者溶细胞)T淋巴细胞(CTL)，其通过细胞裂解直接杀死它们的靶细胞；和抑制性或调节性T细胞(Ts或者Tr)，其下调免疫应答。在每种情况中，T细胞识别抗原，但是仅仅当通过附着到抗原呈递细胞表面的特化蛋白质复合体呈递在细胞的表面上时，T细胞才会识别所述抗原。更具体地，T细胞使用称作T细胞抗原受体(TCR)的特异受体，TCR是跨膜蛋白质复合体，其能够与共同称作主要组织相容性复合体(MHC)的一组蛋白质结合识别抗原。数千相同TCR在每个细胞上表达。TCR在功能和结构上与表面抗体(非分泌的)有关，B细胞将所述表面抗体用作它们的抗原受体。此外，T细胞的不同亚群还表达许多细胞表面蛋白质，它们的一些称作“标记蛋白质”，因为它们是特定亚群特征性的。例如多数T_h细胞表达细胞表面CD4蛋白质，而多数CTL细胞表达细胞表面CD8蛋白质，Tr细胞表达CD25和CD4分子。这些表面蛋白质在免疫应答的启动和维持中是重要的，所述免疫应答取决于APC表面上具体蛋白质或蛋白质复合体之间的识别和相互作用。

一段时间以来已知主要组织相容性复合体或者MHC实际上包含一系列糖基化蛋白质，其包含不同的四级结构。通常，所述结构为两种类型：I类MHC，其展示来自细胞内产生的蛋白质(如自身蛋白质或者病毒复制随后产生的蛋白质)的肽，和II类MHC，其通常展示来自从外面进入细胞的蛋白质(可溶性抗原，如细菌毒素)的肽。通过固有多态性确保多种抗原的识别，所述固有多态性提供了能够结合可能产生的任何病原性肽的MHC分子的多样库。基本上，所有有核细胞都产生和表达I类MHC，其可以显示天然发生的肽、肿瘤结合的肽或者病毒入侵者产生的肽。相反地，一些其他有核细胞和其中的特化淋巴样细胞(通常称作抗原呈递细胞)产生和表达II类MHC蛋白质。不管细胞类型，两种MHC类别都将肽携带到细胞表面并将它们呈递给静息T淋巴细胞。通常，T_h细胞识别II类MHC抗原复合体，而CTL倾向于识别I类MHC抗原复合体，尽管也发生抗原的交叉呈递。

当具有适当TCR的静息T细胞遇到在它的表面展示肽的APC时，TCR结合肽-MHC复合体。更具体地，数百TCR结合许多肽-MHC复合体。当接触足够TCR时，累积效应激活T细胞。负责MHC-抗原复合体的特异识别和应答的T细胞上的受体由一些整合血浆膜蛋白质的复合体组成。如同前面讨论的MHC复合体，通过固有多态性导致体细胞重排确保TCR的多样化库。将强调尽管TCR的库可以是多样的，但是每个T细胞仅表达一种特定TCR。然而，每个T细胞通常在每个细胞表面上显示对仅一种肽特异的该受体的数千拷贝。此外，一些其他类型的膜结合的蛋白质参与T细胞结合和活化。

T细胞的活化使得产生一系列化学信号(主要是细胞因子)，其导致细胞采取直接行动或者刺激免疫系统的其他细胞采取行动。对于I类MHC抗原激活，CTL增殖并破坏呈递相同抗原的受感染细胞。杀死受感染的细胞剥夺了病毒的生命支持并且使得它易受抗体接近，所述抗体最终清除该病毒。相比，II类MHC抗原复合体对T_h细胞的活化不破坏抗原呈递细胞(其是宿主防御系统的部分)，而是刺激T_h细胞增殖和产生影响多种细胞的信号(再次主要是细胞因子)。结果，信号转导导致B细胞刺激、巨噬细胞活化、CTL分化和炎症的启动，等等。该协同应答是相对特异的并且针对具有II类MHC系统呈递的所述肽的外来成分。

免疫系统可以接近的身体中那些结构中表位的不断监视提供了非常有效的方式用以识别和保持“自身”和破坏侵入身体或者病理性产生的表位和它们的载体。当正常运转时，免疫应答在清除微观病原体和认为在身体中不断产生的瘤(肿瘤)细胞中令人惊奇地有效并且在极大程度上它们在变得可检测之前就被免疫系统清除。身体的某些区域，如脑、眼和睾丸受到保护而免于免疫监视，这些部位称作免疫特权的。通常，自身识别的复杂机制非常有效并且允许强烈应答仅针对外来抗原。不幸的是，免疫系统偶然功能失常并且针对宿主的细胞，引起自身免疫应答。通常，当免疫细胞上的抗原受体识别健康细胞上的特异抗原时，自身免疫将发生并且导致具有那些特定物质的细胞死亡。在许多情况中，自身免疫反应是自限的，因为当引起自身免疫反应的抗原被清除时，自身免疫反应消失。然而，在一些情况中，自身反应性淋巴细胞比它们所应该的存活地更长并且继续诱导程序性细胞死亡或者消灭正常细胞。

当前数据表明针对所有癌症的免疫保护需要产生针对恶性细胞表达的独特肿瘤抗原的强烈细胞免疫应答。结果，成功的免疫保护首先需要肿瘤细胞中表达的独特抗原(肿瘤特异抗原)和其次，靶定该肿瘤抗原的强烈T细胞免疫应答的诱导。

一些肿瘤相关的抗原是当前已知的，并且已经用于产生疫苗的临床前和临床研究。例如，PSMA、PAP和PSA是前列腺肿瘤细胞中表达的抗原。Her2/neu和MUC1是乳腺癌细胞和其他癌(包括肺癌、卵巢癌、结肠癌和胰腺癌)表达的抗原。MAGEs和MART-1是黑素瘤肿瘤细胞相关的抗原，CEA是与胰腺癌或结肠直肠癌相关的抗原。还已经描述了其他组织和/或肿瘤特异抗原。然而，尽管所有这些抗原以正常或异常形式在肿瘤细胞中表达，但是它们也在多种正常细胞中表达，并且从而不能用于预防接种。换句话说，这些肿瘤相关的抗原仍然被免疫细胞识别为自身分子并且因此不发生免疫系统的真实活化。这造成了靶定这些肿瘤相关分子作为疫苗基础的至少两个障碍。第一个障碍是免疫系统对自身分子的无应答性(耐受性)，其限制了免疫系统产生有效细胞免疫应答的能力。第二个障碍是所产生的任意有效细胞免疫应答不应该针对表达所述靶抗原的正常细胞。这是建议上面讨论的所有肿瘤相关的抗原仅用作治疗性疫苗接种的靶标的原因。

最近已经描述了一种新的蛋白质，其能够克服与已知肿瘤相关抗原相关的问题。印记位点调节物兄弟(BORIS)首次被描述为在睾丸中发现的DNA结合蛋白。该蛋白质与CCTCC结合因子(CTCF)共有11个锌指(ZF)结构域，CCTCC结合因子是多价11-锌指核因子。CTCF是涉及基因调节的多个方面的保守的、普遍的且高度通用的因子并且形成甲基化敏感绝缘体，其调节X染色体失活和印记基因的表达。然而，BORIS在N和C末端与CTCF不同，并且在雄性生殖细胞发育期间与CTCF以相互排斥的方式表达。BORIS表达局限于睾丸并且仅在精母细胞的所选细胞亚群内，所述精母细胞在雄性生殖细胞发育期间参与甲基化标记的复原。该睾丸细胞亚群也是已知不表达CTCF的唯一正常细胞类型。因为所培养细胞中CTCF表达的抑制导致程序性细胞死亡，所以有理由假定BORIS受到活化而保持睾丸细胞中一些重要CTCF功能(Loukinov等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.99(10)：6806-6811；将其并入本文作为参考)。

最近，阐明尽管CTCF过表达也阻断细胞增殖，但是正常BORIS阴性细胞中BORIS的表达促进细胞生长，其可以导致转化(Klenova等人(2002)Cancer Biol.12：399-414；将其并入本文作为参考)。人BORIS定位于20q13区，公知其在许多相同类型肿瘤中观察到的频繁扩大和/或扩增，所述肿瘤还通常显示出在CTCF存在的16q22上共生同源基因座上杂合性的丧失(LOH)。这些区域与“热点”区相关，所述热点区与乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、结肠和食管癌以及肾胚细胞瘤有关。重要的是，BORIS表达的异常活化似乎在很大比例的多种癌中发现。使用RNA印迹或者RT-PCR，Klenova等人(2002)分析了代表多数主要形式的人类肿瘤的超过200种癌细胞系中BORIS mRNA水平并检测了所测试的一半以上细胞系中的转录物。对乳腺癌样品，对于原发癌的随后分析证实了用所述细胞系得到的结果。

发明概述

本发明涉及编码印记位点调节物兄弟(BORIS)肿瘤抗原的无功能突变多核苷酸和此类多核苷酸用于原发和转移癌症的预防性疫苗接种和免疫治疗的用途。多核苷酸可以是DNA或者RNA。在一个优选实施方案中，肿瘤抗原是缺少DNA结合能力的BORIS分子的无功能突变形式。在另一优选实施方案中，至少一个锌指(ZF)结构域由于突变或缺失是无功能的并且BORIS的功能被消除。在另一优选实施方案中，突变或缺失锌指结构域的任意组合并且除去BORIS蛋白质、多肽或肽的功能。在再一优选实施方案中，缺失所有ZF结合位点。在再一优选实施方案中，编码BORIS的突变形式的多核苷酸与分子佐剂融合。在再一优选实施方案中，编码BORIS的无功能突变形式的多核苷酸与至少一种编码分子佐剂的其他多核苷酸混合。可以使用增加细胞免疫应答的任意分子佐剂。尤其优选细胞因子、趋化因子和共同刺激分子。尤其优选的趋化因子、细胞因子和共刺激分子为β-防卫素2、Il12、IL18、MIPα3、IFNγ和CD80/86。

本发明还涉及包含编码BORIS的无功能突变形式的多核苷酸的载体。在优选实施方案中，所述载体指导细菌、哺乳动物、酵母细胞或者病毒系统中的表达。

本发明还涉及BORIS蛋白质、多肽或肽的无功能修饰(突变)形式。使用在序列中导入产生无功能蛋白质的缺失、替代或者加入的任意方法可以产生无功能突变体。在优选实施方案中，所述突变的BORIS蛋白质、多肽或者肽缺少DNA结合能力。在另一优选实施方案中，所述突变的BORIS蛋白质、多肽或者肽与常规佐剂混合。在再一优选实施方案中，所述无功能突变的BORIS蛋白质、多肽或者肽附着到可药用载体(主链)。在再一优选实施方案中，所述无功能突变的BORIS蛋白质、多肽或者肽连接到修饰BORIS的肽并且保持它的抗原性质。在再一优选实施方案中，所述无功能突变的BORIS蛋白质、多肽或者肽连接到蛋白质转导结构域(proteintransducing domain，PTD)。

本发明还涉及表达无功能突变BORIS分子的树突细胞。在优选实施方案中，树突细胞用编码突变BORIS分子的DNA转染。在再一优选实施方案中，用编码无功能突变BORIS分子的病毒载体感染树突细胞。在再一优选实施方案中，树突细胞装载无功能突变BORIS蛋白质、多肽、肽或者BORIS的任意无功能经修饰的蛋白质形式。

本发明包括针对BORIS蛋白质、多肽、肽的无功能突变形式或者BORIS的任意无功能经修饰的蛋白质形式产生的细胞免疫应答。本发明包括针对BORIS蛋白质、多肽、肽的无功能突变形式或者BORIS的任意经修饰的蛋白质形式产生的抗体。

本发明还包括包含编码BORIS的任意无功能突变形式的多核苷酸、无功能突变BORIS蛋白质、多肽或肽或者表达无功能突变BORIS分子的树突细胞的癌症预防性或者治疗性疫苗。

本发明还涉及治疗癌症的方法，其包括对需要其的患者施用有效量的编码BORIS的任意无功能突变形式的多核苷酸、无功能突变BORIS蛋白质、多肽或肽或者表达或含有无功能突变BORIS分子的树突细胞(预防性疫苗)。可以通过肌内、皮下、皮内、静脉内、经鼻、直肠、阴道或者腹膜途径进行施用。癌症可以是原发或转移性癌症。患者可以患有多种不同形式的癌症。在优选实施方案中，癌症是乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、结肠癌或者食道癌。

附图简述

图1a、b、和c给出了用pBORIS(DNA免疫)pIL12/IL18(分子佐剂)接种小鼠(n＝10)的结果。这导致保护小鼠免于用天然表达小鼠BORIS的10⁴个4T1肿瘤细胞的攻击。图1a对于pBORIS/pIL12/IL18、pIL12/IL18和仅载体，在Y轴上显示了存活率，在X轴上显示了肿瘤攻击后的天数。图1b显示了对于pBORIS/pIL12/IL18、pIL12/IL18和仅载体，肿瘤体积和肿瘤攻击后天数之间的关系。图1c显示了用pBORIS/pIL12/IL18、pIL12/IL18和仅载体免疫的组之间在第21天时肿瘤体积的显著不同(^*P＜0.001)。

图2a和b显示了对于用pBORIS(DNA免疫)然后用Ad5-BORIS(病毒样颗粒)并用10⁴个4T1细胞刺激的小鼠，存活百分数和肿瘤刺激后天数之间的关系(a)和肿瘤体积和刺激后天数之间的关系。数据表明至少33天刺激后针对肿瘤刺激的完全保护。

图3a，b，c给出了用pBORIS加pIFNγ或者pIL12/IL18然后用10⁵个4T1肿瘤细胞对小鼠的基因枪免疫的结果。图3a显示了肿瘤生长更长时间至2cm³的体积，图3b显示了较低的肿瘤生长速率。图3c显示了在第14天组pBORIS/pIFNγ相对于载体(p＜0.05)，pBORIS/pIL12/IL18相对于pIL12/IL18(P＜0.05)和pBORIS/pIL12/IL18相对于载体(P＜0.01)之间肿瘤体积的显著差异。

图4a，b，和c显示了用pBORIS(DNA免疫)然后注射Ad5-BORIS(病毒样颗粒)免疫小鼠的结果。图4a显示了经接种小鼠的显著延长的存活，而图4b表明这些小鼠具有较低的肿瘤生长速率和用10⁵个4T1肿瘤细胞刺激小鼠后肿瘤生长到2cm³的体积的时间延长。图4c显示了在第15天组Ad5-BORIS相对于Ad5之间肿瘤体积的显著差异(P＜0.001)。

图5显示了通过GCG程序包，对于缺口罚分用0罚分产生的人和小鼠BORIS多肽的最佳适合比对，保守的锌指区高亮显示并且指出为ZF-11。

发明详述

尽管本发明可以以多种不同形式体现，但是在此处公开例证本发明原理的特定阐明性实施方案。应该强调的是本发明不限于所阐明的特定实施方案。

本发明包括使用仅在免疫特权的睾丸细胞中表达并且在许多经转化的肿瘤细胞中出现的抗原来防止耐受效应，其可以诱导其他肿瘤抗原。本发明还包括在编码所述抗原的DNA中引入特定改变以消除副作用和自身免疫反应。在该上下文中应用下面的定义。

术语“肿瘤”、“癌症”、“癌”、“瘤形成”和它们的近义词在本申请的上下文中可互换使用，用来一般指异常增生疾病和相关受影响的细胞或细胞团块。优选地，异常增生细胞在本文中指表达免疫特权的抗原。

细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是效应T细胞，通常是CD8+，其可以介导具有与MHC分子结合的抗原肽的靶细胞裂解。其他细胞毒性细胞包括γ/δ和CD4+NK 1.1+细胞。

免疫特权和免疫特权抗原指身体内的某些部位和抗原与免疫系统分离并且从而涉及通常不针对其产生免疫应答的抗原。异位(它们的正常免疫特权部位之外)表达的免疫特权抗原可以导致自身免疫或者肿瘤免疫。免疫特权抗原由某些肿瘤表达，导致对肿瘤和表达目同免疫特权抗原的非肿瘤位点的免疫应答。

抗原呈递细胞(APC)是可以加工和呈递与I类或II类MHC分子结合的抗原肽和递送T细胞活化必需的共刺激信号的细胞，包括树突细胞、巨噬细胞和B细胞。

“锌指结构域”指小的独立折叠的结构域，其需要一个或多个锌离子的配位以稳定它的结构。指结构(finger)结合三个碱基对亚位点并且特定接触由相对于α螺旋起始的1、2、3和6位中的氨基酸介导。

“BORIS的无功能突变形式”指缺少功能的BORIS蛋白质、多肽或者肽。“缺少功能”意在指不能执行野生型BORIS分子的关键活性的任一种，如DNA结合、父本DNA-甲基化模式的重建，等等。

“无功能突变体”指DNA或者氨基酸水平上的改变，其破坏所得蛋白质的野生型活性。此类改变可以是作为催化位点和/或者参与结合DNA或蛋白质的分子区中的氨基酸替代、缺失或者加入。能够破坏活性的改变的实例为参与催化或结合相互作用的关键氨基酸的缺失或替代，改变参与催化和/或结合相互作用的位点所需的三维结构的氨基酸加入，或者导致移码从而破坏所需三维结构的核苷酸加入或缺失。可以使用常规分子技术，如PCR，使用寡核苷酸等等产生突变(例如，见Sambrook，Maniatis和Fritsch)。还可以从细胞群体分离自然发生的突变(见，例如，Sambrook，Maniatis和Fritsch)。

“肽”指含有通过肽键连接的至少两个氨基酸的分子。“多肽”指含有通过肽键连接的至少10个氨基酸的分子，“蛋白质”指含有至少20个氨基酸的分子。

“编码BORIS的无功能突变形式的多核苷酸”指与人(SEQ ID NO：1)或小鼠(SEQ ID NO：3)BORIS多核苷酸具有至少50％、60％或70％序列同一性，更可能与人(SEQ ID NO：1)或小鼠(SEQ ID NO：3)BORIS多核苷酸具有75％、80％、90％、95％或96％、97％、98％或99％序列同一性的多核苷酸。

“无功能突变BORIS肽、多肽或蛋白质”指BORIS分子，其不能执行野生型BORIS分子的关键活性任一种，如DNA结合、父本DNA-甲基化模式的重建，等等。“无功能突变BORIS肽、多肽或蛋白质”与人(SEQ IDNO：1)或小鼠(SEQ ID NO：2)BORIS肽、多肽或蛋白质具有至少50％、60％或70％序列同一性，更可能与人(SEQ ID NO：2)或小鼠(SEQ ID NO：4)BORIS肽、多肽或蛋白质具有75％、80％、90％、95％或96％、97％、98％或99％序列同一性。

无功能突变的BORIS分子被识别为仅在经转化的肿瘤细胞中表达的非自身抗原并且用作抗原来克服现有技术的限制。BORIS的突变形式用作理想的非毒性疫苗，因为它应该不具有它的DNA结合活性和/或自然功能导致的不希望的副作用。换句话说，用于接种的突变BORIS没有功能活性并且仅作为免疫原(抗原)存在。不像其他肿瘤特异抗原，BORIS不在妇女中的正常组织中表达。此外，尽管BORIS在男人中正常睾丸的青春期发育期间表达，但是引入和/或表达无功能突变的BORIS应该无害，因为睾丸是免疫特权组织(免疫细胞不可及)。换句话说，免疫后产生的抗-BORIS免疫应答对于正常细胞没有危险并且BORIS疫苗不诱导自身免疫。此外，保证了产生有效免疫应答，因为不像其他肿瘤特异抗原，BORIS被识别为外来抗原。BORIS特异T细胞没有在胸腺中缺失并且将突变BORIS识别为非自身抗原并且产生免疫应答。

在一个实施方案中，通过RT-PCR对从小鼠或者人睾丸分离的mRNA产生编码小鼠BORIS的cDNA(mBORIS)。将该分子的DNA结合结构域缺失并用已知在产生单链Fv结构域抗体中工作良好的小间隔区代替。通过自动化核苷酸序列分析证实正确的序列。所得分子缺少11ZF结构域并且由通过18个氨基酸的间隔区连接C-末端区(氨基酸573-636)的mBORIS(氨基酸1-258)的N-末端区组成。

将突变cDNA克隆到pORF载体中处于hEF1-HTLV启动子控制下，然而，可以使用其他表达载体。这里，所突变的cDNA有效连接能够导致在宿主细胞中表达的启动子和/或调节分子。可以使用病毒载体，包括α-病毒DNA或者RNA载体、腺病毒和逆转录病毒(见Vasilevko，V.等人(2003)Clin.Exp.Metastas.20：489-98.；Leitner，W.W.等人(2003)Nat Med 9：33-39；Ribas，A等人(2002)Curr.Gene Ther 2：57-78)。

除了上面的，本发明还包括使用编码无功能突变的BORIS分子的病毒样颗粒，如来自腺病毒、人乙型肝炎、人丙型肝炎、痘苗病毒、多瘤病毒(polyoviurs)等等的病毒样颗粒。来自不同病毒的重组病毒蛋白质具有自组装成病毒样颗粒(VLP)的有用性质。这些颗粒不含有病毒核酸并且因此是非复制的、非感染的并且保持构象正确的抗原表位。已经在许多实验系统，如哺乳动物细胞、杆状病毒感染的昆虫细胞、酵母、大肠杆菌、无细胞系统和转基因植物中显示了VLP产生。重要的是，用VLP接种不仅产生体液免疫应答而且产生细胞免疫应答。VLP感染专职APC并且随后诱导保护性细胞免疫应答，包括CD4⁺Th1(帮助CD8⁺T细胞的CD4⁺T细胞类型)和CD8⁺CTL应答。从而，VLP已经清楚地揭示了激活细胞免疫应答(T细胞应答)的罕见能力。VLP用作预防性疫苗的潜力当前正在许多不同临床试验中评估。来自这些试验的结果是令人鼓舞的，在每个试验中都报导了极佳的耐受性和高免疫原性。产生由截短的BORIS抗原组成的VLP疫苗将促进诱导针对表达该肿瘤结合抗原的癌细胞的强烈细胞免疫应答。乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)和VSV是适宜的VLP的实例。

为了产生更稳固的细胞免疫应答，将截短的或者突变的mBORIS与分子佐剂如B7共刺激分子、β-防卫素2/3、MIPα3、IFNγ、细胞因子、趋化因子等融合后克隆到载体中。其他适宜的分子佐剂在下表中列出。

XCL1(Lymphotactinα，SCM-1α，ATAC)	IL-1α，IL-1β
XCL1(Lymphotactinα，SCM-1α，ATAC)	IL-1α，IL-1β	XCL2(Lymphotactinβ，SCM-1β，ATAC)	IL-2
CCL1(I-309，TCA3)	IL-3	XCL2(Lymphotactinβ，SCM-1β，ATAC)	IL-2
CCL1(I-309，TCA3)	IL-3	CCL2(MCP-1，MCAF，JE)	IL-4

CCL3(MIP-1，αMIP-1αS，LD78α)	IL-5
CCL3(MIP-1，αMIP-1αS，LD78α)	IL-5	LD78β(MIP-1αP)	IL-6
LD78γ	IL-7	LD78β(MIP-1αP)	IL-6
LD78γ	IL-7	CCL4(MIP-1β)	IL-9
CCL5(RANTES)	IL-10	CCL4(MIP-1β)	IL-9
CCL5(RANTES)	IL-10	CCL7(MCP-3)	IL-11
CCL8(MCP-2)	IL-12	CCL7(MCP-3)	IL-11
CCL8(MCP-2)	IL-12	CCL9(MIP-1γ)	IL13
CCL10(CCF18)	IL14	CCL9(MIP-1γ)	IL13
CCL10(CCF18)	IL14	CCL11(Eotaxin)	IL-15
CCL12(MCP-5)	IL-16	CCL11(Eotaxin)	IL-15
CCL12(MCP-5)	IL-16	CCL13(MCP-4，CKβ10)	IL-17
CCL15(HCC-2，Lkn-1，MIP-5，CC-2，NCC-3，MIP-1δ)	IL-18	CCL13(MCP-4，CKβ10)	IL-17
CCL15(HCC-2，Lkn-1，MIP-5，CC-2，NCC-3，MIP-1δ)	IL-18	CCL16(NCC-4，LEC，HCC-4，LMC，Mtn-1，LCC-1，CKβ12)	IL-21
CCL17(TARC)	IL-23	CCL16(NCC-4，LEC，HCC-4，LMC，Mtn-1，LCC-1，CKβ12)	IL-21
CCL17(TARC)	IL-23	CCL18(DC-CK1，PARC，MIP-4，AMAC-1，CKβ7)	TNFα
CCL19(exodus-3，ELC，MIP-3β，CKβ11)	TNFβ	CCL18(DC-CK1，PARC，MIP-4，AMAC-1，CKβ7)	TNFα
CCL19(exodus-3，ELC，MIP-3β，CKβ11)	TNFβ	CCL20(exodus-1，MIP-3α，LARC，ST38)	IFNα
CCL21(exodus-2，SLC，6-Ckine，TCA4，CKβ9)	IFNβ	CCL20(exodus-1，MIP-3α，LARC，ST38)	IFNα
CCL21(exodus-2，SLC，6-Ckine，TCA4，CKβ9)	IFNβ	CCL22(MDC，ABCD-1，DC/B-CK)	IFNγ
CCL23(MIP-3，MPIF-1，CKβ8-1)	M-CSF	CCL22(MDC，ABCD-1，DC/B-CK)	IFNγ
CCL23(MIP-3，MPIF-1，CKβ8-1)	M-CSF	CCL24(MPIF-2，CKβ6，eotaxin-2)	G-CSF
CCL25(TECK，Ckβ15)	GM-CSF	CCL24(MPIF-2，CKβ6，eotaxin-2)	G-CSF
CCL25(TECK，Ckβ15)	GM-CSF	CCL26(Eotaxin-3，MIP-4α)	MIF
CCL27(ALP，Skinkine，ILC，ESkine，CTAK)	CD46(MCP)	CCL26(Eotaxin-3，MIP-4α)	MIF
CCL27(ALP，Skinkine，ILC，ESkine，CTAK)	CD46(MCP)	CXCL8(IL-8)	CD27(T14，S152)
CXCL9(mig)	CD54(ICAM-1)	CXCL8(IL-8)	CD27(T14，S152)
CXCL9(mig)	CD54(ICAM-1)	CXCL1O(γIP-10，crg-2)	CD80(B7-1，BB1)
CXCL11(H174，β-R1，I-TAC，IP-9)	CD86(B7-2，B70)	CXCL1O(γIP-10，crg-2)	CD80(B7-1，BB1)
CXCL11(H174，β-R1，I-TAC，IP-9)	CD86(B7-2，B70)	CXCL12(SDF-1α，SDF-1β，PBSF)	CD134(FLT3，STK-1)
CXCL13(BLC，BCA-1)	CDw137(4-1BB)	CXCL12(SDF-1α，SDF-1β，PBSF)	CD134(FLT3，STK-1)
CXCL13(BLC，BCA-1)	CDw137(4-1BB)	CXCL14(BRAK，bolekine)	CDw150(SLAM，IPO3)
CX3CL1(Fractalkine，神经趋化因子)	CD153(CD30L)	CXCL14(BRAK，bolekine)	CDw150(SLAM，IPO3)
CX3CL1(Fractalkine，神经趋化因子)	CD153(CD30L)	防卫素(DFα，DFβ)	CD161(NKR-P1A)

备选地，可以使用常规佐剂如Tween80、5％乙醇和布比卡因用于DNA免疫。常规佐剂的其他实例包括矿物盐类(如氢氧化铝和磷酸铝凝胶)、基于油乳剂和表面活性剂的制剂，如MF59、QS21、AS08[SBAS2](水包油乳剂+MPL+QS21)、Montanide ISA-51和ISA-720，微粒佐剂，如病毒体、AS04([SBAS4]A1盐与MPL)、ISCOMS、聚丙交酯共-乙交酯(PLG)、微生物衍生物(天然和合成的)，包括单磷酰脂质A(MPL)、Detox(MPL+M.Phlei细胞壁骨架)、AGP[RC-529]、DC_Chol、OM-174(脂质A衍生物)、CpG基序、经修饰的LT和CT(遗传修饰的细菌毒素)、内源免疫调节剂，如GM-CSF、IL-12、Immudaptin，以及上表中列出的所有其他趋化因子、细胞因子和共刺激分子和惰性载体，如金颗粒。

佐剂可以与编码印记位点调节物兄弟(BORIS)蛋白质、多肽或者肽的无功能突变形式的多核苷酸、无功能突变BORIS蛋白质、多肽或者肽和表达无功能突变BORIS肽、多肽或蛋白质的树突细胞混合。

额外的肽分子可以包括在无功能突变BORIS构建体中以增强/促进MHC类途径的专职抗原呈递细胞(APC)对无功能突变BORIS的呈递。一个实例是用肽转导结构域(PTD)产生的构建体。通常，免疫应答依赖于天然抗原加工和呈递。肿瘤相关抗原可以在细菌、酵母或者哺乳动物细胞中表达，然而在那些系统中表达的蛋白质抗原将不会最大地刺激T细胞应答(CTL应答或者Th1-有偏(biased)应答)，因为可溶性外源蛋白质主要通过II类MHC途径加工。实际上，许多抗肿瘤疫苗依赖于CD8+CTL的诱导，但是这通常需要在APC的胞质溶胶内合成蛋白质。不幸的是，通常，真核细胞的质膜是多数蛋白质可通透的。然而，最近已经表明与蛋白质转导结构域(PTD)融合的外来蛋白质可以穿透质膜，允许所述蛋白质在细胞内积累。这增强了APC的I类MHC分子将外来肽向抗原特异的CD8+T细胞的呈递。

接种/免疫

本发明的疫苗制剂包含免疫原性量的编码无功能突变BORIS蛋白质、多肽或肽的多核苷酸、无功能突变BORIS蛋白质、多肽或肽或者表达无功能突变BORIS蛋白质、多肽或肽的树突细胞与可药用载体的组合。可以使用模拟表位(mimeotopes)，其是具有不相关序列但是具有相应于无功能突变BORIS蛋白质、多肽或肽的三维结构并且以相同方式发挥免疫功能的多肽。模拟表位是与BORIS结构不相关但是具有相同三维抗原性表位并且可以被抗-BORIS T细胞识别的任意生物分子。

“免疫原性量”是编码无功能突变BORIS蛋白质、多肽或肽的多核苷酸、无功能突变BORIS蛋白质、多肽或肽或者表达无功能突变BORIS蛋白质、多肽或肽的树突细胞的量，所述量足以在疫苗所施用的受试者中引起免疫应答。所施用的量是诱导所希望的免疫应答和所希望的保护程度的量。示例性可药用载体包括，但不限于，无菌的无致热原水和无菌的无致热原生理盐水溶液。

本发明的疫苗制剂适于经诊断患有至少一种类型癌症的患者，所述癌症包括但不限于，乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、结肠癌和食管癌。本发明的疫苗制剂还适于已知具有对癌症的遗传易感性的患者。此外，本发明的疫苗制剂适于普通的一般群体，包括没有癌症或者没有对癌症的遗传易感性的群体，其希望引起保护以免于发生表达野生型BORIS蛋白质、多肽或肽的至少一种类型的癌症。

可以通过任一种适宜的方式施用疫苗制剂，所述方式包括肠胃外注射(如腹膜内、皮下或者肌内注射)、皮内、静脉内、经鼻、直肠、阴道、或者施用于呼吸道表面。通过鼻内施用(例如，通过使用滴管、拭子或者吸入器鼻内沉积药物制剂)可以实施病毒向呼吸道表面的局部应用。通过吸入施用，如通过产生含有复制子的药物制剂的可呼吸的颗粒(包括固态颗粒和液态颗粒)，如气溶胶混悬剂，然后导致受试者吸入可呼吸的颗粒也可以将病毒局部应用于呼吸道表面。用于施用药物制剂的可呼吸颗粒的方法和装置是公知的，并且可以使用任意常规技术。“免疫原性量”是足够在疫苗施用的受试者中引起免疫应答的复制子颗粒的量。

当RNA或者DNA用作疫苗时，可以使用诸如金颗粒(基因枪)递送、通过脂质体递送、直接注射等本领域技术人员已知的其他方法直接施用RNA或者DNA。任意一种或多种构建体或者复制RNA可以任意组合使用以在受试者中有效引起免疫原性应答。通常，所施用的核酸疫苗可以为将诱导所希望的免疫应答和所希望的保护程度的量。将施用的疫苗的精确量可以取决于实践者的判断并且可以对于每个受试者和抗原是独特的。

疫苗可以以单次剂量方案，或者优选地以多次剂量方案施用，在多次剂量方案中主要接种过程可以为1-10次单独剂量，然后以保持和/或加强免疫应答所需的随后时间间隔施用其他剂量，例如，对于第二次剂量为1-4个月，如果需要，数月后施用随后剂量。适宜的免疫方案的实例包括：(i)0、1个月和6个月；(ii)0、7天和1个月，(iii)0和1个月，(iv)0和6个月，或者其他方案，所述方案足够引起预计赋予保护免疫性、或者减轻疾病症状，或者减轻疾病严重性的所希望的免疫应答。

人(hBORIS)可以从人睾丸分离并且以相同方式操作。同样的，BORIS可以从任意哺乳动物或者脊椎动物的睾丸分离并且相似地使用。

实施例

1.产生编码处于hEF1-HTLV启动子控制下的mBORIS分子的ZF缺失形式的质粒

使用来自小鼠睾丸的多聚-A RNA和下面的引物进行RT-PCR反应：

MB1F 5’-CGTCACCATGGCTGCCGCTGAGGTCCCTG

MB1R 5’-AAGCTTCTGAAAGCTCTGAGGCTTTCCCTTGG

MB2F 5’-GGATCCGAGACGTTAGCCCCCAACAAGGACAGG

MB2R 5’-GAATTCTCACTTATCCATCATGTTAAAGATCATCTCGCAGG

SpF 5’-AGCTTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGG

SpR 5’-GATCCCGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCA

PCR条件为94℃30秒，60℃30秒，72℃2分钟。进行30个循环。

将PCR产物亚克隆到PCRII-TOPO克隆载体(Invitrogen)中。用BamHI酶限制酶切PCRII-TOPO中的C-末端cDNA，并合并含有插入片段的阳性克隆并将其随后用HindIII酶限制酶切。将间隔区引物(SpF和SpR)退火以产生突出的粘性末端并连接到BamHI-HindIII限制酶切的载体。将N-末端编码的片段用HindIII限制酶切并合并现在与载体分离的插入片段并将其连接到含有C-末端和间隔区的HindIII消化的构建体中。然后将具有正确定向的克隆进行选择、测序(见，例如，下面的ZF缺失的BORIS分子的序列)并亚克隆到pORF质粒中处于hEF1-HTLV启动子(Invivogen)控制下。

使用标准分子技术(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor；并入本文作为参考)，用所得构建体转染CHO细胞。

使用标准分子技术(Sambrook等人，1989)，通过从所转染的CHO细胞分离的mRNA的RNA印迹分析锌指缺失的mBORIS构建体的表达。

2.用编码BORIS分子的ZF缺失形式的DNA免疫小鼠

使用EndoFree Plasmid maxi试剂盒(Qiagen)分离编码ZF缺失的mBORIS构建体的质粒。通过紫外分光光度法(260nm/280nm吸收比＞1.7)和凝胶电泳证实质粒DNA的纯度。

用DNA包被金颗粒(1μg/0.5mg金)并使用Helios基因枪(Gene Gun)免疫5-7周龄Balb/c小鼠。以相同方法每两周三次强化小鼠。最后强化后10天，从小鼠取血并用1.0×10⁴或者1.0×10⁵个4T1癌细胞攻击小鼠。每天或者每2-3天使用卡钳测量肿瘤大小。

3.保护研究

用质粒疫苗免疫小鼠：

预防性抗癌疫苗方法的一个实例是使用编码小鼠BORIS分子的缺失形式的DNA，所述小鼠BORIS分子的缺失形式缺少锌指结构域并且因此没有DNA结合性质。

如我们在前面描述的(Ghochikyan等人(2003)Eur J Immunol 33：3232-41)，将所纯化的质粒用于包被金颗粒(2μg质粒/0.5mg金颗粒)。使用Helios基因枪(Bio-Rad，Hercules，CA)如Ross等人(2000，Nat.Immunol1：127-131)描述的在剃毛的腹部皮肤上进行用质粒免疫BALB/c小鼠。简言之，将小鼠用每0.5mg～1μm金颗粒(DeGussa-Huls Corp.，Ridefield Park，NJ)含有2μg DNA的剂量以400psi的氦气压设置轰击小鼠3次。将小鼠免疫并通过相同方法每两周加强并在最后加强后10天如所描述的(Vasilevko等人，2003)用两种不同剂量的4T1乳腺癌细胞(10⁵或10⁴)攻击。将不同组的小鼠用与编码某些分子佐剂的DNA混合的编码经修饰的BORIS分子的质粒免疫(详情见表1)。已知此类分子佐剂增加对不同抗原的细胞免疫应答。

表1.使用与pORF-mGMCSF(编码小鼠GMCSF)、pORF-mIFNγ(编码小鼠IFNγ)或pORF-mIL12+pIRES-mIL18(编码小鼠IL12和IL18的两种质粒)混合的BORIS保护性疫苗(pORF-mBORIS)每两周免疫小鼠一次，共5次。最后加强后，将小鼠用表达经修饰的BORIS分子的10⁵或10⁴个4T1小鼠乳腺癌细胞攻击。

组	免疫原	分子佐剂	用4T1细胞攻击
组	免疫原	分子佐剂	用4T1细胞攻击	12345678	pBORISpBORISpBORIS载体-pBORIS载体-	pGM-CSFpIFNγpIL12/IL18-pIL12/IL18pIL12/IL18-pIL12/IL18	10⁵10⁵10⁵10⁵10⁵10⁴10⁴10⁴

产生编码小鼠BORIS分子(Ad5-BORIS)的ZF缺失形式的腺病毒载体和免疫小鼠

使用来自Stratagene的AdEasy XL腺病毒载体系统(AdenoviralVector System)制备Ad5-BORIS重组腺病毒。通过将ZF-缺失的mBORIS片段亚克隆到质粒pShuttle-CMV制备穿梭载体。使用pORF-mBORIS质粒作为模板和下面的引物通过PCR合成BORIS片段：

SalI-MB-F 5’-ACGCGTCGACATGGCTGCCGCTGAGGTCCCTGTCCCTTCTGGG

NotI-MB-R 5’-CGGCCGTCACTTATCCATCATGTTAAAGATCATCTCGCAGG

将PCR产物亚克隆到PCR4-TOPO克隆载体(Invitrogen)中。用SalI和NotI限制性内切酶限制性酶切BORIS片段。所得产物在琼脂糖凝胶上纯化并使用SaII-NotI克隆位点亚克隆到pShuttle-CMV载体中。

通过免疫印迹(见下图)分析CHO细胞中ZF-缺失的mBORIS的体外表达。

通过免疫印迹检测CHO中pShuttle-BORIS的表达。

用PmeI线性化携带缺失的BORIS的穿梭载体并将其在琼脂糖凝胶上纯化。用Pme-消化的pShuttle-mBORIS质粒转化电泳感受态细胞BJ-5183-Ad-1以产生重组Ad质粒。用所选重组Ad-BORIS DNA转染AD-293细胞并制备原代病毒原种。所得原代病毒原种(10⁷pfu/ml)在AD-293细胞中扩增，然后在CsCl梯度上纯化。所纯化的病毒针对PBS-5％蔗糖透析并用于免疫小鼠。

将用pBORIS每两周一次免疫Balb/c小鼠四次并用Ad5-BORIS(10⁹PFU)肌内注射(i.m.)加强一次。用载体注射的对照动物使用Ad5加强。最后一次加强后10天，用两种不同剂量的4T1乳腺癌细胞(10⁵和10⁴个)如所描述的(Vasilevko等人，2003)攻击小鼠。

肿瘤细胞系

使用F.Miller博士(Karmanos Cancer Institute，Detroit，MI)提供的乳腺肿瘤细胞系。4T1.2细胞是来自410.4细胞(最初从BALB/c fC3H小鼠中单个自发产生的乳腺肿瘤分离的乳腺肿瘤细胞系)没有用诱变剂处理的硫代鸟嘌呤抗性变体。细胞培养(37℃，10％CO₂)在Dulbecco改良的Eagle基本培养基(DMEM)中，所述培养基含有低水平葡萄糖并且补加5％胎牛血清，10％新生小牛血清，2mM谷氨酰胺，100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素，0.1mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠(D10)(Life Technologies，Inc.)。

测定肿瘤体积

通过二维测量每天测定并使用公式L×(W²)/2计算肿瘤体积，其中L代表肿瘤长度，W代表肿瘤宽度。对于涉及用10⁴个细胞攻击的实验，当小鼠看起来濒死或者肿瘤达到约1.5cm³时结束实验，对于涉及用10⁵个4T1细胞攻击的实验，当小鼠看起来濒死或者肿瘤达到约2cm³时结束实验。

出现的时间(潜伏期)指定为存在具有超过0.1cm³体积的肿瘤之前经过的时间。为了确定肿瘤生长速率，在肿瘤生长的接近线性期分析散布图。

统计学分析

使用方差分析(ANOVA)和Tukey多重比较在后检验(Tukey multiplecomparisons post-test)检查出现肿瘤结节(潜伏期)和肿瘤生长(肿瘤体积)的平均时间以及存活时间的结果。用GraphPad Prism 3.0软件计算平均值和标准差(SD)。

4.免疫学

使用两种不同的免疫方案分析针对BORIS的B和T细胞免疫应答。

1.制备小鼠BORIS蛋白质和免疫小鼠

通过使用NcoI-XhoI克隆位点将小鼠BORIS的ZF缺失的片段亚克隆到细菌表达载体pET24d(+)中与C-末端6His标记处于框内。在克隆的PCR步骤期间引入两个位点并除去终止密码子。此外，构建编码与蛋白质转导结构域(PTD)融合的缺失BORIS分子的质粒。通过PCR将HIV-Tat蛋白质转导结构域(Tat_47-57YGRKKRRQRRR)与所缺失的BORIS的N-末端融合然后克隆到pET24d(+)载体NcoI-XhoI克隆位点中。用所得pET-mBORIS或者pET-TATmBORIS质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)株系在28℃生长在含有卡那霉素的LB中直到达到A₆₀₀0.8。通过加入终浓度为1mM的IPTG诱导蛋白质合成。3-5小时后通过离心收获细胞并将其用于通过亲和层析在镍-NTA(氮川乙酸)柱(Qiagen)上的蛋白质纯化。

图.从大肠杆菌BL21(DE3)纯化ZF缺失的BORIS。通过10％SDS-PAGE分析蛋白质。用与PTD融合的BORIS产生相同数据(未显示)。

此外，将与PTD融合的BORIS的ZF缺失的片段亚克隆到酵母表达载体pGAPZalpha框内，信号序列克隆到EcoRI-XbaI克隆位点中。在克隆的PCR步骤期间引入两个位点并除去ATG起始密码子。通过用经AvrII限制酶线性化的pGAPZ-BORIS电穿孔转化巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)X33菌株并在含有100μg/ml Zeocin的YPD培养基上选择阳性克隆。对于表达分析，在YPD/Zeocin培养液中生长所选阳性克隆并通过免疫印迹在不同时间点分析上清液中的表达。

2.用树突细胞(DC)免疫小鼠

如下从小鼠骨髓前体得到原代骨髓DC。将从股骨和胫骨收获的红细胞耗竭的鼠骨髓细胞接种在补加重组鼠GM-CSF(100U/ml)的完全RPMI-10培养基中。在第三天，温和除去未贴壁的粒细胞并加入新鲜培养基。在第7天收获未贴壁的DC并使用CD11c微珠(Microbeads)通过阳性选择试剂盒(Miltenyi)纯化。

在培养的第7天收获并通过阳性选择纯化的DC，通过以10⁷个细胞/ml以1000-2000的感染复数在RPMI 1640中孵育用Ad5-BORIS感染。1小时后，加入完全培养基以将DC稀释到1×10⁶到2×10⁶个细胞/ml的终浓度。24小时后收获细胞，充分洗涤以便清除任何腺病毒颗粒的遗留，并用于免疫。此外，将在培养的第7天收获并通过阳性选择纯化的DC与10μg/ml ZF-缺失的mBORIS蛋白质在37℃，5％CO₂中孵育24小时，用PBS洗涤两次。使用抗小鼠BORIS抗体和用FITC标记的适宜的二级抗体，通过流式细胞术以等分试样分析DC的蛋白质摄入。对Balb/c小鼠每三周用1×10⁶个DC腹膜内免疫三次并在最后加强后10天分析在脾细胞培养的培养物中的T细胞应答。

5.结果

免疫结果在图1-4中给出。

使用哺乳动物表达载体pORF(Invivogen)和AdEasy XL腺病毒载体系统(Adenoviral Vector System)(Stratagene)构建编码缺少DNA结合功能的癌症特异小鼠BORIS抗原(缺失的11-锌指)的突变形式的DNA。这些疫苗已经用作小鼠乳腺癌模型中的预防性抗癌疫苗。在该模型中，我们使用BALB/c小鼠(H-2d单元型)和4T1天然乳腺肿瘤细胞系，其是没有诱变剂处理的来自410.4细胞的硫代鸟嘌呤抗性变体。重要的是，如我们通过RT-PCR阐明的，这些小鼠乳腺癌细胞表达完整小鼠BORIS分子。因此，这是用于检查BORIS分子用作保护性癌症疫苗的能力的理想模型。

进行了两种不同类型的实验。第一种类型实验包括用与作为分子佐剂的编码不同小鼠细胞因子的DNA(pGM-CSF；pIL12/IL18；pIFNγ)混合的pBORIS(编码缺失的小鼠BORIS分子的质粒)接种的一组小鼠。用载体(pORF)或pIL12/IL18作为对照注射小鼠。将小鼠用基因枪技术免疫和加强，然后用10⁴或10⁵个4T1细胞攻击。

第二种类型的实验包括用pBORIS接种并用经修饰而表达ZF缺失的小鼠BORIS分子(Ad5-BORIS)的复制缺陷腺病毒载体(Ad5)加强。用载体注射并用Ad5加强的一组小鼠作为对照。用10⁴或10⁵个4T1细胞攻击动物并分析肿瘤外观和生长。我们注意到以前已经发现将少至10⁴个4T1.2细胞注射到BALB/c小鼠的乳腺导致在100％受攻击的动物中乳腺肿瘤的局部生长。

用pBORIS加上pIL12/IL18或者pBORIS然后通过Ad5-BORIS免疫导致保护小鼠免于用10⁴个未经修饰的4T1肿瘤细胞的攻击。尽管来自用与pIL12/IL18混合的pBORIS免疫的组的50％小鼠产生小肿瘤(0.2-0.4cm³)，但是它们都存活到第39天。所有实验小鼠在约10天前死亡。

用Ad5-BORIS接种的小鼠的结果更极端。在第24天，当对照组中小鼠死于肿瘤生长时，用Ad5-BORIS疫苗免疫的小鼠不仅100％都是活的，而且根本不产生肿瘤。实际上，它们在攻击后至少在第33天前都不产生肿瘤。这些结果表明ZF缺失的BORIS疫苗有效保护动物免于用10⁴个乳腺肿瘤细胞的攻击。

使用更严格条件并用10⁵个4T1肿瘤细胞攻击小鼠进行第二组实验。用质粒pBORIS加上pIFNγ或者pIL12/IL18接种显著延长肿瘤生长到2cm³体积的时间并增加BALB/c小鼠的存活。接种还降低了用10⁵个4T1肿瘤细胞攻击的小鼠中的肿瘤生长速率。在用10⁵个未修饰的4T1细胞攻击前，用pBORIS接种并用Ad5-BORIS加强的小鼠中检测到更深远的效果。这里，在第23天，当对照组中所有小鼠都死于肿瘤生长时，用Ad5-BORIS免疫的80％小鼠都是活的并且存活动物具有显著更小尺寸的肿瘤。

用从大肠杆菌系统纯化的缺失的小鼠BORIS蛋白质免疫单独组的BALB/c小鼠。这里，用与Quil A Th1型常规佐剂(Sigma)混合的蛋白质(50μg/小鼠)皮下注射5只小鼠。4次免疫后，所有动物都诱导了抗-BORIS抗体的重要效价。另一组5只小鼠同时用分离的感染Ad5-BORIS的树突细胞腹膜内免疫。3次注射后，小鼠产生了针对mBORIS的T细胞应答，其在用mBORIS蛋白质活化的脾细胞培养物中体外检测到。因此，用BORIS免疫在小鼠中诱导B和T细胞免疫应答并且这些免疫应答保护动物免于攻击。

6.附着到PTD的截短的BORIS作为亚基疫苗

PTD附着到无功能截短的或者突变BORIS蛋白质并在酵母表达系统中产生融合产物。将编码PTD和无功能突变BORIS的基因亚克隆到酵母表达载体如pGAPZα中。使用标准分子技术纯化所表达和分泌的蛋白质。将小鼠用以两种不同常规佐剂配制的抗原免疫并分析免疫应答以及对肿瘤抗原的保护。

7.编码无功能突变BORIS的病毒样颗粒作为亚基疫苗

产生基于乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)的VLP-BORIS亚基疫苗。该抗原在酵母细胞中表达后自装配成VLP。可以将外来序列插入到HBcAg的一些区中而不破坏装配过程。因此，产生嵌合HBcAg-BORIS颗粒，其用于小鼠免疫。

8.BALB/c和p53KO小鼠中的分析

分析没受攻击的BALB/c小鼠中和年轻p53敲除小鼠中的免疫应答，所述年轻p53敲除小鼠在那个年龄不产生肿瘤。测定用不同BORIS疫苗免疫的小鼠中体液和细胞免疫应答。在3个月实验期分析来自经免疫小鼠的血清以检测抗-BORIS抗体产生。测定BALB/c小鼠攻击之前和之后CD4+和CD8+T细胞增殖和T调节细胞的激活。同时，分析可以直接杀死乳腺肿瘤细胞的NK细胞的激活。阐明用乳腺肿瘤4T1细胞攻击之前和之后BORIS-特异细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的功能活性。天然表达野生型BORIS分子的P815肿瘤细胞用作靶细胞，其与4T1细胞一起用于检测NK和CTL活性。

额外参考文献

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从而描述了本发明，本领域技术人员显而易见的是可以作出用于实践本发明的材料和方法的多种修改。认为此类修改在下面权利要求定义的本

发明范围内。

此处引用的来自专利和期刊文献的每个参考文献都通过此类引用完整地特别并入本文。

序列描述：ZF缺失的BORIS分子的核苷酸序列

atg gct gcc gct gag gtc cct gtc cct tct ggg tac ttc acc cag atc aaa gag cag aag ttg aag cct

gga gac cta gag gag gag aaa gag gag gac ggg gta caa aga gtg gaa gcc cag gag gga gtt gtc aag

gag gtg gag gcc gag aac agt tgc ctg ctt ctg gag gcc agg gcc ccg gtg gag agc gac agg cgg atc

ctg acc ctg caa acg gtg cac ctg gag tcc cag gat gtg cac cta cag ggg ctg gga tgg ctg agc gtg cca

cac tct gag gag ctt tca ggg acg gta cca gag gcg gaa ggc ata ctg cag ttg cca tcc gtg ctg tgg ctc

gac cca gag ccc cag ctc agc ctt cag cat tgc gtg acg gtc agc atc ccg gaa gag ctg tac cca cca gag

gag ctg cag cgg ata cat ttt cac ctg ctg aga gag aat gtg cta atg gcc gag gag aac cca gag tta aca

cca gac ttg gac gaa agc aca gcc ctg aaa aag ccc gaa gaa gat gaa aag gac cag ctc ccg ccc cag

gga gag aca gac aag aga gaa gag agg ttg ctc ctt ctg gaa atg aaa cca aaa gag gga aaa gac gac

gaa att gtc ctg acc att tcc cat cta agc ctc gaa gaa cag caa gat cca cca gcg gcc aat cag aca agt

gtg ccg gga gcc aaa gcc gca aaa cca aaa cgg cgg agg cag acc aag gga aag cct cag agc ttt cag

aag ctt ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg gga tcc gag acg tta gcc ccc

aac aag gac agg aga cca gtg aca agg aca cag gcc tcg gag gga gaa gca gga cac aag gaa ggg gag

cct cag tgc cct ggg gag cag gct ctg ggc cac caa gga gaa gca gcg ggg agc cag agc cca gac cac

ggc ctt acc tgc gag atg atc ttt aac atg atg gat aag tga

序列描述：小鼠BORIS的野生型核苷酸序列

CCATTTTGTGCACCTTGATCAAAGCCCATGTCTACTAGGCCCCAGCACCTCTGCACCCCA

TAAAGATTGCACGCTCTTTTTCCATCAGGGGTCGTCACCATGGCTGCCGCTGAGGTCCCT

GTCCCTTCTGGGTACTTCACCCAGATCAAAGAGCAGAAGTTGAAGCCTGGAGACCTAGAG

GAGGAGAAAGAGGAGGACGGGGTACAAAGAGTGGAAGCCCAGGAGGGAGTTGTCAAGGAG

GTGGAGGCCGAGAACAGTTGCCTGCTTCTGGAGGCCAGGGCCCCGGTGGAGAGCGACAGG

CGGATCCTGACCCTGCAAACGGTGCACCTGGAGTCCCAGGATGTGCACCTACAGGGGCTG

GGATGGCTGAGCGTGCCACACTCTGAGGAGCTTTCAGGGACGGTACCAGAGGCGGAAGGC

ATACTGCAGTTGCCATCCGTGCTGTGGCTCGACCCAGAGCCCCAGCTCAGCCTTCAGCAT

TGCGTGACGGTCAGCATCCCGGAAGAGCTGTACCCACCAGAGGAGCTGCAGCGGATACAT

TTTCACCTGCTGAGAGAGAATGTGCTAATGGCCGAGGAGAACCCAGAGTTAACACCAGAC

TTGGACGAAAGCACAGCCCTGAAAAAGCCCGAAGAAGATGAAAAGGACCAGCTCCCGCCC

CAGGGAGAGACAGACAAGAGAGAAGAGAGGTTGCTCCTTCTGGAAATGAAACCAAAAGAG

GGAAAAGACGACGAAATTGTCCTGACCATTTCCCATCTAAGCCTCGAAGAACAGCAAGAT

CCACCAGCGGCCAATCAGACAAGTGTGCCGGGAGCCAAAGCCGCAAAACCAAAACGGCGG

AGGCAGACCAAGGGAAAGCCTCAGAGCTTTCAGTGTGACACCTGCCCGTTCACTTCCTCC

AAGCTCTCAACTTTCAATCGTCACATCAAAATTCACAGCAATGAGAGGCCACACCTGTGT

CACCTGTGCCTGAAGGCCTTCCGGACTGTCACTCTTCTTAGGAACCATGTGAACACCCAC

ACAGGAACCAGGCCCCACAAGTGCAGGGACTGCGACATGGCGTTTGTCACCAGCGGAGAA

CTCGTCCGGCACAGGCGTTACAAACACACTTATGAGAAGCCCTTCAAGTGCTCCCTGTGC

AAGTACGCCAGCGTCGAGGCAAGCAAGATGAAGCGTCACATCCGCTCACACACGGGTGAG

CGTCCCTTCCAGTGTTGCCAGTGTGCTTATGCCAGCAGGGACTCCTACAAGCTGAAGCGC

CACATGAGGACACACTCAGGTGAGAAGCCGTATGAATGTCCCACCTGTCACGTCCGGTTC

ACCCAGAGCGGGACCATGAAAATCCATATAGCACAGAAGCACGGAGAGAATGTGCCCAAA

TACGAGTGTCCCCACTGTGCCACCATCATCGCGAGGAAGAGCGACCTGCGTGTCCATCTG

CGTAACCTGCACAGCCAGAGCCCGGAGGAGATGAAGTGCCGATACTGTCCCGCTGGCTTC

CATGAGCGCTATGCCCTCATTCAGCACCAGAGGACCCACAAGAACGAGAAGAAGTTCAAG

TGCAAGCAGTGCGATTACGCGTGCAAGCAGGAGCGATGCTTGAAGGCGCACATGCGCATG

CACACAGGAGAGAAGCCCTTCTCCTGCCTGGCCTGCAACAAGCACTTCCGACAGAAGCAG

CTACTGACCGTGCACCTGAGGAAGTACCATGACCCGAACTTCGTCCCCAATCTGCACCTG

TGCCTCAAGTGTGATAAACGTTTCTCCCGCTGGAGTAACCTGCAGAGACACAGAAAGAAG

TGTGACCCGGAGCATGAGACGTTAGCCCCCAACAAGGACAGGAGACCAGTGACAAGGACA

CAGGCCTCGGAGGGAGAAGCAGGACACAAGGAAGGGGAGCCTCAGTGCCCTGGGGAGCAG

GCTCTGGGCCACCAAGGAGAAGCAGCGGGGAGCCAGAGCCCAGACCACGGCCTTACCTGC

GAGATGATCTTTAACATGATGGATAAGTGATGGATAAGTGAGCAGTCGTGCCTCTCCGTG

CAGTGGCCTCTGGGGGAAGAAACCAGTTAGAAATAAGTTCCCAGACACAGCACAGTGTTC

TCAGAGTTTGAGATAGTGTGTAGAAATGTTTGAGAGAAGGGGAAAAAAACCCTGCAGCTA

TTTCCAAAGACTTGAGTCAGAGCTCGAAGTGAAGGTGCACATATCTGGGCCCTAGCAGGT

GCCCAGAATGAGTCAGGGACAGATTCTAGGTGATACTTATGTCCACGGGGGCTCAGACCA

GTTAACGCCTTGGTGGTCAGAGCAGAAAATTTTTTGAGTTGTTGTACCCACCCTCAA

序列描述：人BORIS的野生型核苷酸序列

1 ggcaccagac gcggtgcacg aggcagagcc acaagccaaa gacggagtgg gccgagcatt

61 ccggccacgc cttccgcggc caagtcatta tggcagccac tgagatctct gtcctttctg

121 agcaattcac caagatcaaa gaactcgagt tgatgccgga aaaaggcctg aaggaggagg

181 aaaaagacgg agtgtgcaga gagaaagacc atcggagccc tagtgagttg gaggccgagc

241 gtacctctgg ggccttccag gacagcgtcc tggaggaaga agtggagctg gtgctggccc

301 cctcggagga gagcgagaag tacatcctga ccctgcagac ggtgcacttc acttctgaag

361 ctgtggagtt gcaggatatg agcttgctga gcatacagca gcaagaaggg gtgcaggtgg

421 tggtgcaaca gcctggccct gggttgctgt ggcttgagga agggccccgg cagagcctgc

481 agcagtgtgt ggccattagt atccagcaag agctgtactc cccgcaagag atggaggtgt

541 tgcagttcca cgctctagag gagaatgtga tggtggccag tgaagacagt aagttagcgg

601 tgagcctggc tgaaactgct ggactgatca agctcgagga agagcaggag aagaaccagt

661 tattggctga aagaacaaag gagcagctct tttttgtgga aacaatgtca ggagatgaaa

721 gaagtgacga aattgttctc acagtttcaa attcaaatgt ggaagaacaa gaggatcaac

781 ctacagctgg tcaagcagat gctgaaaagg ccaaatctac aaaaaatcaa agaaagacaa

841 agggagcaaa aggaaccttc cactgtgatg tctgcatgtt cacctcttct agaatgtcaa

901 gttttaatcg tcatatgaaa actcacacca gtgagaagcc tcacctgtgt cacctctgcc

961 tgaaaacctt ccgtacggtc actctgctgc ggaaccatgt taacacccac acaggaacca

1021 ggccctacaa gtgtaacgac tgcaacatgg catttgtcac cagtggagaa ctcgtccgac

1081 acaggcgcta taaacatact catgagaaac cctttaaatg ttccatgtgc aagtatgcca

1141 gtgtggaggc aagtaaattg aagcgccatg tccgatccca cactggggag cgcccctttc

1201 agtgttgcca gtgcagctat gccagcagag atacctacaa gctgaaacgc cacatgagaa

1261 cgcactcagg tgagaagcct tacgaatgcc acatctgcca cacccgcttc acccagagcg

1321 ggaccatgaa aatacatatt ctgcagaaac acggcgaaaa tgtccccaaa taccagtgtc

1381 cccattgtgc caccatcatt gcacggaaaa gcgacctacg tgtgcatatg cgcaacttgc

1441 atgcttacag cgctgcagag ctgaaatgcc gctactgttc tgctgtcttc catgaacgct

1501 atgccctcat tcagcaccag aaaactcata agaatgagaa gaggttcaag tgcaaacact

1561 gcagttatgc ctgcaagcag gaacgtcata tgaccgctca cattcgtacc cacactggag

1621 agaaaccatt cacctgcctt tcttgcaata aatgtttccg acagaagcaa cttctaaacg

1681 ctcacttcag gaaataccac gatgcaaatt tcatcccgac tgtttacaaa tgctccaagt

1741 gtggcaaagg cttttcccgc tggattaacc tgcacagaca ttcggagaag tgtggatcag

1801 gggaagcaaa gtcggctgct tcaggaaagg gaagaagaac aagaaagagg aagcagacca

1861 tcctgaagga agccacaaag ggtcagaagg aagctgcgaa gggatggaag gaagccgcga

1921 acggagacga agctgctgct gaggaggctt ccaccacgaa gggagaacag ttcccaggag

1981 agatgtttcc tgtcgcctgc agagaaacca cagccagagt caaagaggaa gtggatgaag

2041 gcgtgacctg tgaaatgctc ctcaacacga tggataagtg agagggattc gggttgcgtg

2101 ttcactgccc ccaattccta aagcaagtta gaagttttta gcatttaagg tgtgaaatgc

2161 tcctcaacac gatggataag tgagagagag tcaggttgca tgttcactgc ccctaattcc

2221 taaagcaagt tagaaatttt tagcattttc tttgaaacaa ttaagttcat gacaatggat

2281 gacacaagtt tgaggtagtg tctagaattg ttctcctgtt tgtagctgga tatttcaaag

2341 aaacattgca ggtattttat aaaagtttta aaccttgaat gagagggtaa cacctcaaac

2401 ctatggattc attcacttga tattggcaag gtggcccaca atgagtgagt agtgattttt

2461 ggatatttca aaatagtcta gaccagctag tgcttccaca gtcaaagctg gacattttta

2521 tgttgcatta tatacaccca tgatatttct aataatatat ggttttaaac attaaagaca

2581 aatgttttta tacaaatgaa ttttctacaa aatttaaagc taccataatg cttttaatta

2641 gttctaaatt caaccaaaaa atgttttact cttataaaaa ggaaaactga gtaggaaatg

2701 aaatactaga ttagactaga aaataaggaa taaatcgatt ttactttggt ataggagcaa

2761 ggttcacctt tagatttttg tattctcttt taattatgct ccttggcagg tatgaaattg

2821 ccctggttac attccattat tgcttattag tatttcactc cataaccctt ttttctgcta

2881 aaactactct ttttatattt gtaaaataat tggcagagtg agaagaaaca taaaatcaga

2941 taaggcaaat gtgtacctgt aaggaatttg tactttttca taatgcccag tgattagtga

3001 gtatttccct tttgccagtt gacaagattt ttccaccctc gagcagcgtg agagatgcct

3061 ctttaacact tgaaattcat ttctatctgg atacagaggc agatttttct tcattgctta

3121 gttgagcagt ttgttttgct gccaacctgt ctccacccct gtatttcaag atcattgata

3181 agccctaaat tcaaattctt aagatatgga ccttttattg aaaatatcac aagttcagaa

3241 tccctataca atgtgaatat gtggaaataa tttcccagca ggaagagcat tatattctct

3301 ttgtaccagc aaattaattt aactcaactc acatgagatt taaattctgt gggctgtagt

3361 atgccatcat tgtgactgaa tttgtgcaat ggtttcttaa tttttttact gttatttaaa

3421 gatgttttac ataattcaat aaaatgaaat gacttaaaat tgcaaaaaaa aaaaaaaaaa

3481 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa

序列描述：人BORIS的氨基酸序列

MAATEISVLSEQFTKIKELELMPEKGLKEEEKDGVCREKDHRSP

SELEAERTSGAFQDSVLEEEVELVLAPSEESEKYTLTLQTVHFTSEAVELQDMSLLSI

QQQEGVQVVVQQPGPGLLWLEEGPRQSLQQCVAISIQQELYSPQEMEVLQFHALEENV

MVASEDSKLAVSLAETAGLIKLEEEQEKNQLLAERTKEQLFFVETMSGDERSDEIVLT

VSNSNVEEQEDQPTAGQADAEKAKSTKNQRKTKGAKGTFHCDVCMFTSSRMSSFNRHM

KTHTSEKPHLCHLCLKTFRTVTLLRNHVNTHTGTRPYKCNDCNMAFVTSGELVRHRRY

KHTHEKPFKCSMCKYASVEASKLKRHVRSHTGERPFQCCQCSYASRDTYKLKRHMRTH

SGEKPYECHICHTRFTQSGTMKIHILQKHGENVPKYQCPHCATILARKSDLRVHMRNL

HAYSAAELKCRYCSAVFHERYALIQHQKTHKNEKRFKCKHCSYACKQERHMTAHIRTH

TGEKPFTCLSCNKCFRQKQLLNAHFRKYHDANFIPTVYKCSKCGKGFSRWINLHRHSE

KCGSGEAKSAASGKGRRTRKRKQTILKEATKGQKEAAKGWKEAANGDEAAAEEASTTTK

GEQFPGEMFPVACRETTARVKEEVDEGVTCEMLLNTMDK

序列描述：小鼠BORIS的氨基酸序列

MAAAEVPVPSGYFTQIKEQKLKPGDLEEEKEEDGVQRVEAQEGVVKEVEAENSCLLLEAR 60

APVESDRRILTLQTVHLESQDVHLQGLGWLSVPHSEELSGTVPEAEGILQLPSVLWLDPE 120

PQLSLQHCVTVSIPEELYPPEELQRIHFHLLRENVLMAEENPELTPDLDESTALKKPEED 180

EKDQLPPQGETDKREERLLLLEMKPKEGKDDEIVLTISHLSLEEQQDPPAANQTSVPGAK 240

AAKPKRRRQTKGKPQSFQCDTCPFTSSKLSTENRHIKIHSNERPHLCHLCLKAFRTVTLL 300

RNHVNTHTGTRPHKCRDCDMAFVTSGELVRHRRYKHTYEKPFKCSLCKYASVEASKMKRH 360

IRSHTGERPFQCCQCAYASRDSYKLKRHMRTHSGEKPYECPTCHVRFTQSGTMKIHIAQK 420

HGENVPKYECPHCATILARKSDLRVHLRNLHSQSPEEMKCRYCPAGFHERYALIQHQRTH 480

KNEKKFKCKQCDYACKQERCLKAHMRNHTGEKPFSCLACNKHFRQKQLLTVHLRKYHDPN 540

FVPNLHLCLKCDKRFSRWSNLQRHRKKCDP FHFTLAPNKDRRPVTRTQASEGEAGHKEGE 600

PQCPGEQALGHQGEAAGSQSPDHGLTCEMIFNMMDK

序列描述：ZF缺失的小鼠BORIS的氨基酸序列

MAAAEVPVPSGYFTQIKEQKLKPGDLEEEKEEDGVQRVEAQEGVVKEVEAENSCLLLEARAPVESDRR

ILTLQTVHLESQDVHLQGLGWLSVPHSEELSGTVPEAEGILQLPSVLWLDPEPQLSLQHCVTVSIPEELY

PPEELQRIHFHLLRENVLMAEENPELTPDLDESTALKKPEEDEKDQLPPQGETDKREERLLLLEMKPKE

GKDDEIVLTISHLSLEEQQDPPAANQTSVPGAKAAKPKRRRQTKGKPQSFQKLGGGGSGGGGSGGGGS

GSETLAPNKDRRPVTRTQASEGEAGHKEGEPQCPGEQALGHQGEAAGSQSPDHGLTCEMIFMMDK

Claims

1.免疫原性组合物，其包含选自由编码印记位点调节物兄弟(BORIS)蛋白质、多肽或肽的无功能突变形式的多核苷酸，无功能突变的BORIS蛋白质、多肽或肽，表达无功能突变的BORIS肽、多肽和蛋白质的树突细胞和模拟无功能突变的BORIS分子的任意分子构成的组的成员。

2.根据权利要求1的组合物，其中所述无功能突变的BORIS蛋白质、多肽或肽缺少DNA结合性质。

3.根据权利要求1的组合物，其中所述无功能突变的BORIS蛋白质、多肽或肽缺少锌指结构域。

4.根据权利要求1-3任一项的组合物，其中所述蛋白质、多肽或肽连接到可药用载体。

5.根据权利要求1-3任一项的组合物，其中所述BORIS蛋白质、多肽或肽连接到蛋白质转导结构域。

6.根据权利要求1-3任一项的组合物，其中所述突变BORIS蛋白质、多肽或肽连接到修饰BORIS的肽并且保持或增强所述BORIS蛋白质、多肽或肽抗原性。

7.根据权利要求1的组合物，其中用编码突变BORIS蛋白质、多肽或肽的DNA转染表达所述无功能突变的BORIS蛋白质、多肽或肽的所述树突细胞。

8.根据权利要求1的组合物，其中用编码无功能突变BORIS蛋白质、多肽或肽的病毒载体感染表达所述无功能突变的BORIS蛋白质、多肽或肽的所述树突细胞。

9.根据权利要求1、7或8任一项的组合物，其中表达所述突变的BORIS蛋白质、多肽或肽的所述树突细胞装载BORIS蛋白质、多肽或肽或者BORIS的任意经修饰的蛋白质、多肽或肽形式。

10.根据权利要求1-9任一项的组合物，其还包含佐剂。

11.根据权利要求1-10任一项的组合物，其中所述佐剂与编码无功能突变BORIS蛋白质、多肽或肽的所述DNA，或者突变BORIS蛋白质、多肽或肽混合或融合。

12.根据权利要求1-11任一项的组合物，其中所述佐剂选自细胞因子、趋化因子和共刺激分子。

13.载体，其包含根据权利要求1-12任一项的免疫原性组合物。

14.权利要求13的载体，其中所述载体允许在细菌、哺乳动物、酵母或者病毒系统中表达。

15.宿主细胞，其用根据权利要求1-12任一项的组合物转化。

16.根据权利要求15的宿主细胞，其中所述细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞或者酵母细胞。

17.抗体，其包含识别来自无功能突变BORIS蛋白质、多肽或肽的表位的结合位点。

18.针对癌症的疫苗，其包含选自由编码BORIS蛋白质、多肽或肽的无功能突变形式的多核苷酸，无功能突变的BORIS蛋白质、多肽或肽，表达无功能突变的BORIS肽、多肽和蛋白质的树突细胞和模拟无功能突变的BORIS分子的任意分子构成的组的分子。

19.根据权利要求18的疫苗，其中所述无功能突变BORIS缺少至少一个锌指结构域。

20.根据权利要求18和19任一项的疫苗，其中所述无功能突变的BORIS缺少DNA结合能力或者任意其他天然BORIS功能。

21.根据权利要求18-20任一项的疫苗，其还包含佐剂。

22.根据权利要求18-20任一项的疫苗，其还包含可药用载体。

23.免疫哺乳动物受试者的方法，其包括对需要其的患者施用有效量的由编码BORIS蛋白质、多肽或肽的无功能突变形式的多核苷酸，无功能突变的BORIS蛋白质、多肽或肽，表达无功能突变的BORIS分子的树突细胞和模拟无功能突变的BORIS分子的任意分子构成的组的成员。

24.权利要求23的方法，其中编码无功能突变BORIS蛋白质、多肽或肽的所述多核苷酸，无功能突变的BORIS蛋白质、多肽或肽，表达无功能突变的BORIS分子的树突细胞或模拟无功能突变的BORIS分子的任意分子与分子佐剂混合或融合。

25.权利要求23和24任一项的方法，其中所述分子佐剂是增加细胞免疫应答和/或抗体应答的分子。

26.权利要求1-25任一项的方法，其中所述分子佐剂选自任意细胞因子、趋化因子、共刺激分子。

27.权利要求1-26任一项的方法，其中编码无功能突变BORIS蛋白质、多肽或肽的所述多核苷酸，无功能突变的BORIS蛋白质、多肽或肽，表达无功能突变的BORIS分子的树突细胞或模拟无功能突变的BORIS分子的任意分子与任意常规佐剂或分子佐剂混合。

28.权利要求1-27任一项的方法，其中所述突变BORIS蛋白质、多肽或肽连接到可药用载体。

29.权利要求1-28任一项的方法，其中所述突变BORIS蛋白质、多肽或肽连接到修饰BORIS并且保持和/或增强它的抗原性性质的肽。

30.权利要求1-29任一项的方法，其中所述突变BORIS蛋白质、多肽或肽还包含蛋白质转导结构域(PTD)。

31.权利要求1-30任一项的方法，其中用编码突变BORIS分子的DNA转染表达BORIS的所述树突细胞。

32.权利要求1-30任一项的方法，其中用编码无功能突变BORIS分子的病毒载体感染表达BORIS的所述树突细胞。

33.权利要求1-30任一项的方法，其中表达BORIS的所述树突细胞装载BORIS蛋白质、多肽或肽，或者BORIS的任意经修饰的蛋白质形式。

34.权利要求1-34任一项的方法，其中通过肌内、皮下、皮内、静脉内、经鼻、直肠、阴道或腹膜途径进行所述施用。

35.根据权利要求1-35任一项的方法，其中所述患者患有一种以上类型的癌症。

36.权利要求1-36任一项的方法，其中所述患者患有癌症。

37.根据权利要求1-36任一项的方法，其中所述患者没有癌症。

38.根据权利要求1-36任一项的方法，其中所述患者没有癌症，但是具有对癌症的遗传易感性。

39.根据权利要求1-36任一项的方法，其中所述正常患者没有可检测的癌症，但是希望保护他自己免于可能产生恶性肿瘤。

40.根据权利要求1-39任一项的方法，其中所述免疫起因于引起包含T细胞的细胞免疫应答，所述T细胞识别来自无功能突变的BORIS肽、多肽、蛋白质的表位或者模拟表位。

41.树突细胞，其表达无功能突变的BORIS肽、多肽、蛋白质或者模拟表位。

42.树突细胞，其装载无功能突变的BORIS肽、多肽、蛋白质或者模拟表位。

43.表达无功能突变的BORIS蛋白质、多肽或肽的树突细胞，其用编码无功能突变的BORIS蛋白质、多肽或肽的病毒载体感染。

44.免疫原性组合物的用途，用于制备针对癌症的疫苗，其中所述免疫原性组合物包含选自由编码无功能突变BORIS蛋白质、多肽或肽的多核苷酸，无功能突变的BORIS蛋白质、多肽或肽，表达无功能突变的BORIS分子的树突细胞或模拟无功能突变的BORIS分子的任意分子构成的组的成员。