CN1869215A - 一种制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法 - Google Patents
一种制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1869215A CN1869215A CN 200610016859 CN200610016859A CN1869215A CN 1869215 A CN1869215 A CN 1869215A CN 200610016859 CN200610016859 CN 200610016859 CN 200610016859 A CN200610016859 A CN 200610016859A CN 1869215 A CN1869215 A CN 1869215A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- virus
- particle
- albumen
- human papillomavirus
- yeast
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 title claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title abstract description 15
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 20
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 24
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 13
- 101150075239 L1 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 7
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 claims description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 5
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 4
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 claims description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 abstract description 12
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 24
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 15
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 6
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 5
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 4
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 229960002566 papillomavirus vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 2
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 206010004446 Benign prostatic hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 description 1
- 208000000907 Condylomata Acuminata Diseases 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101150013359 E7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010023825 Laryngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061523 Lip and/or oral cavity cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000032271 Malignant tumor of penis Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000002471 Penile Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010034299 Penile cancer Diseases 0.000 description 1
- 101710151715 Protein 7 Proteins 0.000 description 1
- 101710132701 Protein L1 Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 208000025009 anogenital human papillomavirus infection Diseases 0.000 description 1
- 201000004201 anogenital venereal wart Diseases 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 208000003362 bronchogenic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 201000005619 esophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 206010023841 laryngeal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000004962 larynx cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 208000012987 lip and oral cavity carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000000505 pernicious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 1
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 1
- 230000036555 skin type Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，属于生物技术领域。所述方法包括如下步骤：分别将编码所述人乳头瘤病毒晚期蛋白的基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体中，构建重组毕赤酵母细胞；利用重组毕赤酵母细胞进行发酵培养和甲醇诱导分泌表达L1蛋白，培养上清经纯化后，所得L1蛋白可自组装成病毒样颗粒。优点：1)分泌表达L1，所得L1蛋白可自组装成VLPs。2)表达产物自组装形成的病毒样颗粒具有与天然相似的结构，能自组装成病毒样颗粒，所形成的病毒样颗粒均一性较好。3)酵母细胞可实现大规模发酵，L1蛋白分泌到发酵上清中，纯化工艺相对简单、成本低，适合于规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及利用毕赤酵母细胞表达体系分泌表达并纯化人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)晚期蛋白L1，纯化后的L1蛋白可以自组装成病毒样颗粒(VLP)；利用酵母偏爱密码子对L1基因进行修饰，以利于L1蛋白在酵母细胞中的分泌表达。
背景技术
人乳头瘤病毒(HPV)是一类双链小分子DNA病毒，具有严格的种属特异性，主要感染人的皮肤和粘膜组织，引起相应部位上皮组织的增生性病变。根据感染部位可分为皮肤型和粘膜型两组，粘膜型HPV又根据引起病变的性质分为两类：引起粘膜上皮良性增生病变的低危型和与人类多种器官恶性肿瘤(如宫颈癌、阴茎癌、喉及头颈癌、支气管癌、食管癌、口腔癌等)密切相关的高危型。根据核酸序列同源性，HPV可分为100多型，不同型别的HPV引起不同的疾病。HPV 1、2、3、4、7、10、26-29在正常或免疫缺损个体中引起良性疣。HPV 5、8、9、12、14、15、17、19-25、36、46-50在免疫缺损个体中引起扁平状损伤。HPV 6、11、34、39、41-44、51-55引起生殖道或呼吸道粘膜发生非恶性湿疣。HPV 16、18和58与宫颈癌的发生高度相关，其中HPV16是最主要的致癌因素。HPV6和11是90％以上生殖器疣和喉乳头瘤的致病因子。
完整的人乳头瘤病毒(Papillomavirus，PV)颗粒直径约55nm，由病毒基因组DNA与衣壳两部分组成，无包膜，衣壳呈二十面体，由72个壳粒组成，病毒颗粒在CsCl中的浮力密度为1.34g/cm3。病毒基因组是双链环状DNA，约8kb。基因组含至少8个开放阅读框(ORF)，ORF间可部分或全部重叠，基因组根据功能分为三个功能区：早期区，编码6个非结构蛋白(E1、E2、E4、E5、E6、E7)，编码的蛋白与病毒的复制、转录和转化作用有关：晚期区，含L1、L2两个ORF，编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2两个结构蛋白，参与病毒粒子的组装；长控制区(LCR)，又称非编码区或上游调控区，不编码任何蛋白，但含有复制起点、启动子、增强子、沉默子等多种调控元件，影响病毒的复制和转录。
疫苗防治HPV相关疾病是近几年来的研究热点。由于目前无法通过组织培养获得大量的HPV病毒，并且考虑到HPVE6、E7基因的潜在致癌性，因此，不能通过减毒活疫苗或灭活疫苗等传统疫苗制备方式获得HPV疫苗。伴随分子生物学和基因工程技术的发展，目前HPV疫苗研究主要集中在HPV病毒样颗粒疫苗、重组病毒疫苗、亚单位疫苗等。
HPV病毒样颗粒疫苗主要是以HPV衣壳为首选目的蛋白。HPV衣壳是由L1和L2蛋白共同构成，二者比例约5∶1。单独的L1蛋白可以自发组装成直径与HPV成熟病毒大小相近(约55nm)的病毒样颗粒，VLP和天然PV的形态相似，都是二十面体结构，只是VLP内部无病毒核酸。在动物实验中，只有L1蛋白装配成的VLP诱发的抗体具有中和病毒、预防感染的能力，而变性的L1蛋白免疫后不能预防感染。VLP保留了天然病毒粒子的抗原表位，是最有希望的HPV预防性候选疫苗，VLP结构的保留对预防病毒感染至关重要。因此，在HPV疫苗研制及HPV临床诊断中，获得保留有天然病毒构象及尽可能多的表位的重组病毒样颗粒是关键，而且需要高效率的表达及制备方法。
在原核细胞中表达时因缺乏必要的蛋白质翻译后修饰、加工、转运等机制不能在细胞内表达过程中自动折叠形成衣壳立体结构(即VLP)。有报道表明在大肠杆菌中表达L1尽管不能自动装配成VLP，但经过复杂的体外变性复性过程，仍可以形成VLP，但得率非常低，仅有0.02-0.04％。所以，尽管在基因工程产物制备上原核表达系统有成本低、工艺简单、产量高的优点，但实现重组HPV L1装配成VLP这一目的，不适合选择原核表达系统。
最早关于HPV衣壳蛋白装配成病毒样颗粒(VLP)的研究是用痘苗病毒表达系统表达HPV16的L1和L2蛋白(Zhou J et al.，Virology1991 Nov；185(1)：251.257)。Rose等用杆状病毒表达系统单独表达HPVLl蛋白时自动装配成VLP(Rose RC et al.，J Virol 1993，67(4)：1936.1944)，W09420 137(Rose RC et al.)专利公开了杆状病毒表达系统制备L1蛋白及VLP。Hofmann在酿酒酵母中表达了HPV-6a L1和L1+L2并观察到了自组装成的VLP(Hofmann KJ，et al.，Virology.1995，209(2)：506-518.)，W0953 1 532(Hofmann KJ，et al.)公开了由酵母表达系统制备重组VLP(L1，L1+L2)的方法。US5,888,516(kathrin U.Jansen，et al.)也在酿酒酵母中表达了HPV-16L1和L1+L2并观察到了自组装成的VLP，然而，这些酵母表达主要是在胞内进行，纯化工艺相对繁琐，并且所形成的病毒样颗粒均一性较差，US6,245,568B1专利中对病毒样颗粒的分解和再组装进行了研究，病毒样颗粒经过再组装后样品的均一性有较好的提高。
发明内容
本发明提供了一种高效制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，所述方法包括如下步骤：(a)分别将编码所述人乳头瘤病毒晚期蛋白(L1)的基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体中，构建重组毕赤酵母细胞；(b)利用重组毕赤酵母细胞进行发酵培养和甲醇诱导分泌表达L1蛋白，培养上清经纯化后，所得L1蛋白可自组装成病毒样颗粒。
本发明一个实施方式中，其中编码人乳头瘤病毒晚期蛋白(L1)的基因包括从感染人乳头瘤病毒的病理组织中提取的L1基因。
本发明一个实施方式中，其中编码人乳头瘤病毒晚期蛋白(L1)的基因还包括根据酵母偏爱密码子进行基因修饰的L1基因。
本发明一个实施方式中，其中所述人乳头瘤病毒为HPV6、HPV11、HPV16、HPV18或HPV58型别。
本发明一个实施方式中，其中(a)所用的宿主酵母菌为毕赤酵母GS115、KM71、SMD1168或SMD1168H菌株。
本发明一个实施方式中，其中(a)步骤所用表达载体为pPICZαB，也可用其他分泌表达载体如pPIC9K。
本发明一个实施方式中，其中(b)步骤纯化L1蛋白时至少应用一步层析过程。
本发明一个实施方式中，其中一步层析包括DEAE阴离子交换柱层析。
本发明利用毕赤酵母细胞表达体系高效率表达HPV16L1蛋白，经过柱层析纯化，获得重组病毒样颗粒，纯度大于95％；应用聚合酶链反应(PCR)合成法，根据毕赤酵母密码子的偏爱性，合成病毒衣壳蛋白L1基因，并克隆到毕赤酵母表达载体中，构建重组毕赤酵母菌株，诱导表达L1蛋白，并可形成病毒样颗粒，L1蛋白表达量较未修饰的有明显提高。所得病毒样颗粒在电镜下观察为55～60nm，与天然HPV病毒粒子相似。本发明提供的方法适用于制备HPV 6、11、16、18、58等其它型别HPV的重组病毒样颗粒。本发明方法中使用的酵母表达载体和毕赤酵母是本领域熟知的常规载体和细胞，例如表达载体pPICzαB、酵母GS115菌株等。
本发明的方法具有如下优点：1)分泌表达L1，所得L1蛋白可自组装成VLPs。2)表达产物自组装形成的病毒样颗粒具有与天然相似的结构，能自组装成病毒样颗粒，所形成的病毒样颗粒均一性较好。3)酵母细胞可实现大规模发酵，L1蛋白分泌到发酵上清中，纯化工艺相对简单、成本低，适合于规模生产。
附图说明
图1：pPICZaB-L1用XhoI与XbaI和pPICZaB-mL1用XhoI与NotI双酶切
泳道1：1Kb Marker
泳道2：pPICZaB-16L1 XhoI与XbaI酶切
泳道3：pPICZaB-6L1 XhoI与XbaI酶切
泳道4：pPICZaB-58L1 XhoI与XbaI酶切
泳道5：pPICZaB-m16L1 XhoI与NotI酶切
泳道6：pPICZaB-m58L1 XhoI与XbaI酶切
泳道7：pPICZaB-m6L1 XhoI与XbaI酶切
图2、为三种重组酵母细胞分泌上清中L1蛋白的表达，其中：
泳道1：HPV6L1重组酵母细胞发酵上清；
泳道2：HPV16L1重组酵母细胞发酵上清；
泳道3：HPV58L1重组酵母细胞发酵上清；
泳道4：标准蛋白分子量
图3、为纯化的L1蛋白的SDS-PAGE鉴定结果。其中
泳道1：标准蛋白分子量标记；
泳道2：纯化的HPV6L1蛋白；
泳道3：纯化的HPV16L1蛋白；
泳道4：纯化的HPV58L1蛋白；
图4、为纯化的HPV6L1蛋白的Western印迹鉴定结果。其中
泳道1：标准蛋白分子量标记；泳道2：纯化的HPV6L1蛋白。
图5、为纯化的HPV16L1蛋白的Western印迹鉴定结果。其中
泳道1：标准蛋白分子量标记；泳道2：纯化的HPV16L1蛋白。
图6、为纯化的HPV58L1蛋白的Western印迹鉴定结果。其中
泳道1：标准蛋白分子量标记；泳道2：纯化的58L1蛋白。
图7、为HPV6L1蛋白自组装病毒样颗粒的电镜结果。
图8、为HPV16L1蛋白自组装病毒样颗粒的电镜结果。
图9、为HPV58L1蛋白自组装病毒样颗粒的电镜结果。
具体实施方式
宫颈癌病理标本由四川省肿瘤医院妇瘤科提供；大肠杆菌TOP10菌株由吉林大学疫苗研究中心保存；pPICZαB和PGEM-T-easy分别购于美国Invitrogen公司和promega公司；DNA聚合酶、各种限制性内切酶和T4DNA连接酶购自Takara公司；DEAE-SepharoseTMFast Flow阴离子层析介质购自Pharmacia公司。1kb DNA marker购于美国NEB公司。RNaseA核酸酶、proteinaseK、酵母基因组提取试剂盒，购于美国Promega公司。兔源性抗HPV6 L1多克隆抗体和兔源性抗HPV58L1抗体由本实验室制备，鼠源性抗HPV16 L1camvir-1抗体，购于BIODESIGN公司。PCR引物由上海生工生物技术公司合成。Mini protean3 cell型蛋白质电泳仪，TRANS-BLOTSDSEMI-DRY TRAN SFER CELL型蛋白转膜仪(BIO-RAD公司)，凝胶成像系统GelDoc2000(BIO-RAD公司)；
实施例1 HPV6L1、HPV16L1 HPV58L1、编码序列的获得
1、以宫颈癌病理组织基因组为模板，用如下引物，按常规PCR方法扩增HPV6、16、58L1序列。
HPV6上游引物：5′CTCGAGAAAAGAATGTGGCGGCCTAGCG3
HPV6下游引物：5′TTACCTTTTAGTTTTGGC3′
HPV16上游引物：5’CTCgAgAAAAgAATgTCTCTTTggCTgCCT3’
HPV16下游引物：5′TTACAgCTTACgTTTTTTgC3′。
HPV58上游引物：5′CTCgAgAAAAgAATggTgCTgATTTTATgT3′
HPV58下游引物：5′TTATTTTTTAACCTTTTTg3′
利用引物引入XhoI酶切位点和提高分泌的序列AAAAgA。
2、应用聚合酶链反应(PCR)合成法，根据毕赤酵母密码子的偏爱性，合成HPV6L1、HPV16L1和HPV58L1基因，并引入XhoI酶切位点和提高分泌的序列AAAAgA，合成的L1基因记为m6L1、m16L1、m58L1。
实施例2 重组毕赤酵母的获得
1、重组酵母整合质粒(pPICZαB-6L1和pPICZαB-m6L1)的构建
利用实施例1中获得的PCR产物分别与T-easy连接，并转化TOP10，经碱裂解法提取T-HPV6L1和T-HPVm6L1质粒，用XhoI与Not I双酶切质粒，利用琼脂糖电泳回收试剂盒回收HPV-6L1和m6L1基因片段，与同样酶切的pPICZαB载体(Invitrogen公司)连接并转化TOP10菌株，用含zeocin抗性的LB平板筛选，得到阳性克隆，小量提取质粒，经酶切电泳鉴定，获得的重组酵母细胞整合质粒命名为pPICZαB-6LI和pPICZαB-m6L1。酶切电泳鉴定结果见图1，酶切结果均与预期相符。测序结果进一步证实正确。
2、重组酵母整合质粒(pPICZαB-16L1和pPICZαB-m16L1)的构建
利用实施例1中获得的PCR产物分别与T-easy连接，并转化TOP10，经碱裂解法提取T-HPV16L1和T-HPVm16L1质粒，分别用XhoI与XbaI和XhoI与Not I双酶切质粒，利用琼脂糖电泳回收试剂盒回收HPV-16L1和m16L1基因片段，与同样酶切的pPICZαB载体(Invitrogen公司)连接并转化TOP10菌株，用含zeocin抗性的LB平板筛选，得到阳性克隆，小量提取质粒，经酶切电泳鉴定，获得的重组酵母细胞整合质粒命名为pPICZαB-16L1和pPICZαB-m16L1。酶切电泳鉴定结果见图1，酶切结果均与预期相符。测序结果进一步证实正确。
3、重组酵母整合质粒(pPICZαB-58L1和pPICZαB-m58L1)的构建
利用实施例1中获得的PCR产物分别与T-easy连接，并转化TOP10，经碱裂解法提取T-HPV58L1和T-HPVm58L1质粒，用XhoI与Not I双酶切质粒，利用琼脂糖电泳回收试剂盒回收HPV-58L1和m58L1基因片段，与同样酶切的pPICZαB载体(Invitrogen公司)连接并转化TOP10菌株，用含zeocin抗性的LB平板筛选，得到阳性克隆，小量提取质粒，经酶切电泳鉴定，获得的重组酵母细胞整合质粒命名为pPICZαB-58Ll和pPICZαB-m58L1。酶切电泳鉴定结果见图1，酶切结果均与预期相符。测序结果进一步证实正确。
4、获得表达HPV6L1蛋白的重组毕赤酵母菌株
将获得的表达质粒pPICZαB-6L1和pPICZαB-m6L1用SacI酶切后，用琼脂糖电泳回收试剂盒回收线性化pPICZαB-6L1和pPICZαB-m6L1，定量后取0.2μg线性质粒在电转化仪上于1.5kv，25μF，200Ω条件下转化Pichia pastoris GS115感受态细胞，并将转化后的酵母菌涂于含zeocin抗性的MDH平板筛选，于30℃培养，至有转化子长出(大约3～7天)。zeocin抗性梯度筛选高拷贝转化子，zeocin浓度分别为100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml，得到的高拷贝转化子。
5、获得表达HPV16L1蛋白的重组毕赤酵母菌株
将获得的表达质粒pPICZαB-16L1和pPICZαB-m16L1用SacI酶切后，用琼脂糖电泳回收试剂盒回收线性化pPICZαB-16L1和pPICZαB-m16L1，定量后取0.2μg线性质粒在电转化仪上于1.5kv，25μF，200Ω条件下转化Pichia pastoris GS115感受态细胞，并将转化后的酵母菌涂于含zeocin抗性的MDH平板筛选，于30℃培养，至有转化子长出(大约3～7天)。zeocin抗性梯度筛选高拷贝转化子，zeocin浓度分别为100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml，得到的高拷贝转化子。
6、获得表达HPV58L1蛋白的重组毕赤酵母菌株
将获得的表达质粒pPICZαB-58L1和pPICZαB-m58L1用SacI酶切后，用琼脂糖电泳回收试剂盒回收线性化pPICZαB-58L1和pPICZαB-m58Ll，定量后取0.2μg线性质粒在电转化仪上于1.5kv，25μF，200Ω条件下转化Pichia pastoris GS115感受态细胞，并将转化后的酵母菌涂于含zeocin抗性的MDH平板筛选，于30℃培养，至有转化子长出(大约3～7天)。zeocin抗性梯度筛选高拷贝转化子，zeocin浓度分别为100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml，得到的高拷贝转化子。
实施例3 HPV6、16和58L1蛋白在重组酵母中的分泌表达
1、诱导表达 分为两个阶段，第一是生长阶段，此阶段以甘油为碳源，进行菌体积累，没有目的蛋白的表达。第二是诱导表达阶段，此阶段以甲醇为唯一碳源，菌体增长缓慢，目的蛋白在甲醇诱导下进行分泌表达。培养过程：从YPD平板挑取新鲜单菌落接入含30mLBMGY的摇瓶，摇床培养24h作为种子液，吸取1.3mL接入含40mLBMGY的250mL摇瓶进入生长阶段，摇床培养24h，室温离心(6000r/min 6min)，菌体用15mL BMMY悬浮，重新放入摇床培养进入诱导阶段。每24h补1％甲醇(培养条件均为30℃、300rpm)。诱导60小时左右，收获培养物，4000rpm、30分钟，收集上清。
2、目的蛋白的检测 进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶用考马斯亮兰R250染色，蛋白电泳凝胶经染色、扫描后，用图像处理软件分析特异条带对应蛋白质的分子量、相对含量及占细胞总蛋白百分比。将收获发酵液上清进行SDS-PAGE电泳(见图2)，结果显示：重组酵母所表达的L1分子量约为56kD左右。
实施例4 HPV6、16和58L1VLP的制备与鉴定
1.重组酵母的发酵
按实例3中的发酵方法进行发酵。
2.HPV6、16和58L1 VLP的制备
发酵上清(1000mL)加50％饱和硫酸铵沉淀蛋白。室温放置3天，4000rpm水平转头离心，30分钟。用PBS 85ml重溶沉淀。在经10000rpm、15分钟离心，收上清进行DEAE层析。上样量800ml，样品加20mM的PBS溶液稀释(1∶8)。预处理柱，用20mMPBS平衡7个柱体积，上样量达800ml，速度为40，灵敏度为0.1，电压200。用0.3mol/LNaCl 20mMPBS洗至基线，用0.4mol/LNaCl 20mMPBS解析蛋白，所收峰用截留分子量10K的超滤器超滤，用DPBS-Mg洗蛋白，终体积为10ml，SDS-PAGE电泳鉴定(见图3)和Westernblot鉴定(见图4、5、6)。上清加于450g/L蔗糖-0.85mol/LNaCl DPBS垫层的离心管上部，4℃、27500rpm(100000g，BACKMAN SW-28转头)离心240min；弃上清，沉淀加1ml 0.85mol/LNaCl DPBS，收获蛋白-70℃保存。
3、表达产物VLP的鉴定
发酵上清经纯化，得到VLP，经2％磷钨酸负染，电镜观察VLP形态(见图7、8、9)。VLP为圆形，直径约55～60nm。
Claims (8)
1.一种制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)分别将编码所述人乳头瘤病毒晚期蛋白(L1)的基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体中，构建重组毕赤酵母细胞；
(b)利用重组毕赤酵母细胞进行发酵培养和甲醇诱导分泌表达L1蛋白，培养上清经纯化后，所得L1蛋白可自组装成病毒样颗粒。
2.根据权利要求1所述的制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，其中编码人乳头瘤病毒晚期蛋白(L1)的基因包括从感染人乳头瘤病毒的病理组织中提取的L1基因。
3.根据权利要求1所述的制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，其中编码人乳头瘤病毒晚期蛋白(L1)的基因还包括根据酵母偏爱密码子进行基因修饰的L1基因。
4.根据权利要求1所述的制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，其中所述人乳头瘤病毒为HPV6、HPV11、HPV16、HPV18或HPV58型别。
5.根据权利要求1所述的制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，其中(a)所用的宿主酵母菌为毕赤酵母GS115、KM71、SMD1168或SMD1168H菌株。
6.根据权利要求1所述的制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，其中(a)步骤所用表达载体为pPICZαB，也可用其他分泌表达载体如pPIC9K。
7.根据权利要求1所述的制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒方法，其中(b)步骤纯化L1蛋白时至少应用一步层析过程。
8.根据权利要求7所述的制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒方法，其中一步层析包括DEAE阴离子交换柱层析。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2006100168597A CN1869215B (zh) | 2006-05-19 | 2006-05-19 | 一种制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2006100168597A CN1869215B (zh) | 2006-05-19 | 2006-05-19 | 一种制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1869215A true CN1869215A (zh) | 2006-11-29 |
| CN1869215B CN1869215B (zh) | 2012-07-04 |
Family
ID=37442994
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2006100168597A Active CN1869215B (zh) | 2006-05-19 | 2006-05-19 | 一种制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1869215B (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101200696B (zh) * | 2007-11-14 | 2011-07-20 | 山东大学 | 人乳头瘤病毒的酵母增殖模型及建立方法与应用 |
| CN101440371B (zh) * | 2007-11-23 | 2012-09-05 | 上海泽润生物科技有限公司 | 一种16型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白l1基因 |
| CN101487009B (zh) * | 2008-01-15 | 2012-11-21 | 上海泽润生物科技有限公司 | 用毕赤酵母表达系统制备抗人乳头瘤病毒16型感染的疫苗的方法 |
| CN103667319A (zh) * | 2012-09-10 | 2014-03-26 | 同济大学 | 抗人乳头瘤病毒的三价疫苗及其制法和用途 |
| CN104761623A (zh) * | 2013-12-17 | 2015-07-08 | 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 | 一种以α-螺旋5为靶标的抑制HPV L1五聚体形成的抑制剂 |
| CN106282278A (zh) * | 2015-06-29 | 2017-01-04 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种人乳头瘤病毒l1蛋白的发酵方法 |
| CN108201623A (zh) * | 2016-12-19 | 2018-06-26 | 无锡鑫连鑫生物医药科技有限公司 | 人乳头瘤病毒重组四价疫苗、其制备方法及其应用 |
| CN111154777A (zh) * | 2014-02-18 | 2020-05-15 | 上海泽润生物科技有限公司 | 重组人乳头瘤病毒蛋白表达 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AP2004003021A0 (en) * | 2001-08-31 | 2004-06-30 | Univ Cape Town | Vectors, constructs and transgenic plants for HPV-11 and HPV-16 L1 capsid protein. |
| CN1498963A (zh) * | 2002-11-08 | 2004-05-26 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的生产方法 |
| CA2560487C (en) * | 2004-03-24 | 2013-01-29 | Merck & Co., Inc. | Optimized expression of hpv 52 l1 in yeast |
| AU2005280896B2 (en) * | 2004-09-10 | 2010-08-05 | Asahi Glass Company, Limited | Vaccine for oral administration |
-
2006
- 2006-05-19 CN CN2006100168597A patent/CN1869215B/zh active Active
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101200696B (zh) * | 2007-11-14 | 2011-07-20 | 山东大学 | 人乳头瘤病毒的酵母增殖模型及建立方法与应用 |
| CN101440371B (zh) * | 2007-11-23 | 2012-09-05 | 上海泽润生物科技有限公司 | 一种16型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白l1基因 |
| CN101487009B (zh) * | 2008-01-15 | 2012-11-21 | 上海泽润生物科技有限公司 | 用毕赤酵母表达系统制备抗人乳头瘤病毒16型感染的疫苗的方法 |
| CN103667319A (zh) * | 2012-09-10 | 2014-03-26 | 同济大学 | 抗人乳头瘤病毒的三价疫苗及其制法和用途 |
| CN104761623A (zh) * | 2013-12-17 | 2015-07-08 | 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 | 一种以α-螺旋5为靶标的抑制HPV L1五聚体形成的抑制剂 |
| CN104761623B (zh) * | 2013-12-17 | 2019-11-29 | 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 | 一种以α-螺旋5为靶标的抑制HPV L1五聚体形成的抑制剂 |
| CN111154777A (zh) * | 2014-02-18 | 2020-05-15 | 上海泽润生物科技有限公司 | 重组人乳头瘤病毒蛋白表达 |
| CN111154777B (zh) * | 2014-02-18 | 2023-08-15 | 上海泽润生物科技有限公司 | 重组人乳头瘤病毒蛋白表达 |
| CN106282278A (zh) * | 2015-06-29 | 2017-01-04 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种人乳头瘤病毒l1蛋白的发酵方法 |
| CN106282278B (zh) * | 2015-06-29 | 2021-06-08 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种人乳头瘤病毒l1蛋白的发酵方法 |
| CN108201623A (zh) * | 2016-12-19 | 2018-06-26 | 无锡鑫连鑫生物医药科技有限公司 | 人乳头瘤病毒重组四价疫苗、其制备方法及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1869215B (zh) | 2012-07-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103255163B (zh) | 一种ev71病毒样颗粒及其制备方法与应用 | |
| EP2154147B1 (en) | A truncated l1 protein of human papillomavirus 16 | |
| US9943586B2 (en) | Truncated L1 protein of human papillomavirus type 11 | |
| US9745351B2 (en) | Truncated L1 protein of human papillomavirus type 6 | |
| CN102154325A (zh) | 针对人乳头瘤状病毒的疫苗及其制法和用途 | |
| CN112500458A (zh) | 鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株亚单位疫苗、其制备方法及应用 | |
| CN1869215B (zh) | 一种制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法 | |
| US9364529B2 (en) | Truncated L1 protein of human papillomavirus type 18 | |
| CN114058524A (zh) | 一种法氏囊亚病毒颗粒疫苗及其制备方法 | |
| RU2494106C2 (ru) | Гены, кодирующие главный капсидный белок l1 вируса папилломы человека, и их применение | |
| CN1498963A (zh) | 人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的生产方法 | |
| CN102586287A (zh) | 一种hpv16l1多核苷酸序列及其表达载体、宿主细胞和应用 | |
| CN110669142B (zh) | 融合rgd的猪圆环病毒2型病毒样颗粒、突变型感染性克隆及其制备方法和应用 | |
| RU2445357C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей pichia angusta - продуцент капсидного белка l1 вируса папилломы человека типа 16 | |
| CN111773383A (zh) | 一种o型口蹄疫亚单位疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN104164373B (zh) | 用汉逊酵母表达系统产生hpv68l1蛋白的方法 | |
| CN101063142A (zh) | 人乳头瘤病毒16型dna疫苗和基因佐剂及其应用 | |
| CN104164447A (zh) | 用汉逊酵母表达系统产生hpv45 l1蛋白的方法 | |
| CN104164374A (zh) | 用汉逊酵母表达系统产生hpv31 l1蛋白的方法 | |
| RU2546242C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha - ПРОДУЦЕНТ ГЛАВНОГО КАПСИДНОГО БЕЛКА L1 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 18 | |
| CN114540393A (zh) | 一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒及其构建方法和应用 | |
| RU2676160C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей Hansenula polymorpha - продуцент главного капсидного белка L1 вируса папилломы человека типа 11 | |
| RU2546240C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha - ПРОДУЦЕНТ ГЛАВНОГО КАПСИДНОГО БЕЛКА L1 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 56 | |
| RU2546241C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha - ПРОДУЦЕНТ ГЛАВНОГО КАПСИДНОГО БЕЛКА L1 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 16 | |
| RU2681174C1 (ru) | Способ получения рекомбинантной вакцины для профилактики папилломавирусной инфекции человека, рекомбинантная вакцина |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 130012 Torch Road 1260, Jilin, Changchun Applicant after: Changchun BCHT Biotechnology Co., Ltd. Address before: 130012 Torch Road 1260, Jilin, Changchun Applicant before: Changchun Baike Biotechnology Co., Ltd. |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: CHANGCHUN BAIKE BIOTECH CO., LTD. TO: CHANGCHUN BCHT BIOTECHNOLOGY CO. |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |