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CN1865281B - 卵巢癌抗独特型抗体6b11 t细胞表位肽及其应用 - Google Patents

卵巢癌抗独特型抗体6b11 t细胞表位肽及其应用 Download PDF

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CN1865281B CN2006100832997A CN200610083299A CN1865281B CN 1865281 B CN1865281 B CN 1865281B CN 2006100832997 A CN2006100832997 A CN 2006100832997A CN 200610083299 A CN200610083299 A CN 200610083299A CN 1865281 B CN1865281 B CN 1865281B
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Abstract

本发明涉及卵巢癌抗独特型抗体6B11的两条T细胞表位肽，其序列分别为IALITTKIAWYFDV和SQSTHFPYT。还涉及了这两条肽在制备卵巢癌疫苗以及检测卵巢癌疫苗治疗反应和疗效的试剂盒中的应用，所述肽可以与热休克蛋白共同构建卵巢癌疫苗。所述肽在治疗卵巢癌中具有良好的应用前景。

Description

卵巢癌抗独特型抗体6B11 T细胞表位肽及其应用
技术领域
本发明涉及二条卵巢癌抗独特型抗体6B11的T细胞表位肽及其在增强抗卵巢癌细胞免疫反应中的应用。
背景技术
卵巢癌是严重威胁妇女健康的疾病，在妇科恶性肿瘤中发病率为第二位、死亡率却高居首位，是妇科恶性肿瘤的主要死因。其发病隐匿、进展迅速，70％～80％的卵巢癌患者发现时已为晚期，5年生存率仅为30％左右，传统手术、化疗效果尚不满意；即使暂时控制病情，70％以上的卵巢癌最终仍会进展或复发，进一步治疗更加困难。因此，目前迫切需要更有效的治疗方法来提高卵巢癌患者的生存率，改善生活质量。
肿瘤的生物治疗是继传统手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗模式，肿瘤疫苗作为肿瘤生物治疗的一种，因其能动援机体免疫系统发挥积极的抗肿瘤作用，可以具有特异性、靶向性等特点，成为传统治疗手段的有益补充，已经用于多种恶性肿瘤的临床治疗。
随着生物技术的不断进步和对于机体免疫反应认识的进一步深入，肿瘤疫苗也经历了极大的发展，主要包括细胞疫苗、抗原疫苗、抗独特型疫苗、肽疫苗或表位疫苗。肿瘤的细胞疫苗来源于自体或异体肿瘤细胞或其粗提取物，由于其含有个体的全部肿瘤抗原，能诱导出一定的抗肿瘤免疫反应，但是，其存在免疫原性弱、有致瘤性等缺点；抗原疫苗为提取自肿瘤细胞的特异性或相关性抗原，与细胞疫苗相比成份进一步明晰，降低了致瘤性和自身免疫反应；抗独特型疫苗是模拟肿瘤抗原关键表位的内影像，与原始的肿瘤抗原不同，应用以后能打破肿瘤机体固有的免疫耐受状态，激发机体自身的特异性免疫反应，与抗原疫苗相比制备更为简单，副作用轻微；肽疫苗为能发挥关键抗肿瘤作用的肽。现已明确，任何肿瘤抗原都必须先由抗原递呈细胞降解为短肽，再由其中关键性的表位肽与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合，激发免疫细胞发挥抗肿瘤作用。可见，肿瘤疫苗的发展历程体现了一个由浅入深、由粗到细的科学探索过程，而表位肽代表着未来肿瘤疫苗发展的新方向。
表位是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称抗原决定簇，它是T、B细胞受体及抗体特异性结合的基本单位。在免疫应答中，T细胞和B细胞所识别的抗原表位不同，分别称为T细胞表位和B细胞表位。MHC分子是高度多态性的细胞表面分子，由它们将表位肽递呈给免疫细胞，诱导相应的免疫细胞群增殖，发挥特异性抗肿瘤作用。经典理论认为，与MHC I类分子结合的主要是内源性抗原肽，一般为8-12个氨基酸，此MHC—肽复合物转运至细胞表面被CD8T细胞的受体识别；与MHC II类分子结合的主要是外源性抗原肽，长度变化较大，一般为9-25个氨基酸，此MHC—肽复合物转运至细胞表面被CD4T细胞的受体识别。CD4T细胞，又称为Th细胞，据分泌细胞因子的不同可以划分为两群，即Th1和Th2。Th1主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β，Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-13。CD8T细胞，也即经典的CTL细胞。根据机体对病原体或肿瘤的免疫应答特点，可以选择特异性Th和(或)CTL表位以定向诱导宿主的Th和(或)CTL应答，甚至通过选择Th1表位或Th2表位，诱导机体向Th1或Th2型免疫应答定向发展，从而实现免疫应答的有效诱导和精确调控。最近的研究结果表明，这两个通路并非完全独立，外源性抗原经机体处理后获得的肽也可以进入MHC I类分子通路，被CD8T细胞的受体识别。这对于应用外源性抗原发挥抗肿瘤作用的实践来说，是一种强有力的理论支持，因为CD4T细胞多数只能发挥非特性地抗肿瘤作用，对肿瘤的杀伤作用是间接的，而特异性CD8T细胞才能更有效、更直接地对肿瘤细胞发挥杀伤作用，如果外来抗原能够进入MHC I类分子通路，就有可能诱导出特异性的CD8T细胞，从而发挥有效的抗肿瘤作用；同时也表明Th和CTL细胞诱导通路间存在密不可分的联系，正如从功能上而言，在Th表位存在的情况下，CTL表位诱导免疫反应才成为可能或更为有效。现已明确，树突状细胞(DCs)、热休克蛋白分子对于实现这种交叉递呈效应起重要作用。因此，鉴定有效的抗肿瘤表位肽，可望提供更为精确和有效的调控抗肿瘤免疫反应的手段。
目前，鉴定表位肽的方法主要有：酶解法；洗脱法；合成重叠肽法；用噬菌体显示肽库技术筛选模拟表位；用计算机软件预测候选表位肽，再用实验方法验证。虽然表位肽鉴定的方法学上不断进步，这些方法操作起来还是很费时，而且由于肿瘤的调变性和肿瘤机体的免疫耐受特性，筛选得到的肽往往不是十分有效。
国外已经制备了结肠癌、黑色素瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、前列腺癌等恶性肿瘤的表位肽，部分进入了临床研究阶段，取得了初步的疗效。国内外关于卵巢癌表位肽的制备和应用均鲜见报道。
本发明为用卵巢上皮癌可溶性抗原OC166-9免疫BALB/c小鼠制备抗卵巢癌单克隆抗体COC166-9，再用COC166-9免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术制备出一株可以模拟卵巢癌抗原OC166-9的Ab2β型抗独特型抗体6B11(具体参见本申请人在先的专利申请CN1356341，该申请已授权)。由此抗独特型抗体鉴定获得了两条模拟卵巢癌抗原的T细胞表位肽，这些肽与原始肿瘤抗原不同，有助于打破肿瘤机体的免疫耐受状况，从而可以用于调节抗卵巢癌细胞免疫反应和进行临床疗效的监测。
发明内容
本发明的目的为进一步鉴定卵巢癌抗独特型抗体6B11诱导特异性抗卵巢癌细胞免疫反应的有效成份，获得两条T细胞表位肽，分别为抗独特型抗体的重链和轻链CDR3区肽，序列为：IALITTKIAWYFDV和SQSTHFPYT。
该两条T细胞表位肽可以诱导产生比其来源的抗独特型抗体更强的抗卵巢癌细胞免疫反应，因此，可用于构建卵巢癌疫苗，用于卵巢癌的辅助治疗，还可以监测卵巢癌疫苗的治疗反应和临床疗效。
本发明还提供了制备上述抗独特型抗体T细胞表位肽的方法。
本发明的优点如下：
1、本发明的抗独特型抗体T细胞表位肽为其来源的抗独特型抗体诱导细胞免疫反应的有效成份，既保留了该抗体诱导特异性抗卵巢癌细胞免疫反应的特性，又避免了抗体中抑制性表位在免疫反应诱导中的负面效应；
2、本发明的抗独特型抗体T细胞表位肽包括Th和CTL表位，可以同时诱导CD4和CD8T细胞反应，初次和再次免疫应答都很健全，所诱导的抗卵巢癌免疫反应有效；
3、本发明的抗独特型抗体T细胞表位肽中，Th和CTL表位肽为针对同一肿瘤抗原的相关T细胞表位，与牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白和破伤风类毒素等来源的Th表位肽与CTL表位肽的无关组合相比，抗卵巢癌效果更为特异和有效。
4、本发明的抗独特型抗体T细胞表位肽来源于抗独特型抗体6B11，为一种模拟肽，与真实的肿瘤抗原不同，可以打破肿瘤机体固有的免疫耐受状态而发挥抗肿瘤作用。
一方面，本发明的两条抗独特型抗体T细胞表位肽，能特异性杀伤OC166-9阳性的卵巢癌细胞，可以作为卵巢癌疫苗用于卵巢癌的治疗，并且可以联合其他针对卵巢癌的T细胞表位肽，作为卵巢癌疫苗用于多种类型卵巢癌的治疗；另一方面，本发明的两条抗独特型抗体T细胞表位肽，可以与热休克蛋白分子构建融合蛋白，发挥热休克蛋白的分子伴侣作用、免疫佐剂作用和抗原交叉递呈作用，作为卵巢癌疫苗用于卵巢癌的治疗；这两条抗独特型抗体T细胞表位肽，还可以分别与热休克蛋白分子的结合序列共同合成，再于合适的离子条件下与热休克蛋白分子进行可逆性的结合，以体内抗原肽分子刺激免疫细胞的方式，作为卵巢癌疫苗用于卵巢癌的治疗，制备得到的疫苗经树突状细胞负载后，刺激自体淋巴细胞，同时设单纯T细胞表位肽刺激组、非树突状细胞负载组(如经射线照射的自体外周血单个核细胞)等，以研究热休克蛋白分子和DCs在抗原交叉递呈作用中的分工和协作情况，通过与不同的热休克蛋白分子(人或鼠HSP70和gp96)联合应用制备抗卵巢癌疫苗，观察同种属和异种属、HSP70和gp96作用效果的差异，从而为选择热休克蛋白分子作为疫苗佐剂提供理论依据、为研究热休克蛋白分子的功能差异提供参考；另一方面，本发明的两条抗独特型抗体T细胞表位肽，作为ELISPOT实验的刺激分子，可以用于检测抗独特型抗体或抗独特型抗体T细胞表位肽应用后，产生特异性细胞的数量，从而监测其治疗反应，并对其治疗的有效性进行评价；最后，本发明的两条抗独特型抗体T细胞表位肽，可以利用Th表位肽和CTL表位肽分别做成Tetramer I和II检测试剂盒。用于精确定量抗独特型抗体6B11或抗独特型抗体T细胞表位肽应用后，产生特异性CLT细胞的数量，从而监测其诱导免疫反应的有效性。
附图说明：
图1成熟树突状细胞表面分子的表达情况；
图2BrdU细胞增殖分析；
图3摸索MHC II类分子抗体的最适应用浓度；
图4应用MHC II类分子阻断抗体后进行BrdU细胞增殖分析；
图5CD4T细胞分选后进行BrdU细胞增殖分析；
图6流式细胞术测定CD4T细胞细胞内细胞因子；
图7Confocal显微镜检测T2细胞表面MHC-I分子的表达情况；
图851Cr释放实验检测肽特异性CTLs的细胞毒效应；
图9摸索MHC I类分子抗体的最适应用浓度；
图10MHC-I类分子抗体阻断后进行VH CDR3(重链互补决定区3)和VL CDR3(轻链互补决定区3)肽特异性CTLs的51Cr释放实验；
图1151Cr释放实验检测VH CDR3和VL CDR3肽特异性CTLs对K562细胞的杀伤作用；
图1251Cr释放实验检测VH CDR3和VL CDR3肽特异性CTLs杀伤卵巢癌细胞的有效性；
图13抗独特型抗体6B11以及VH CDR3和VL CDR3肽诱导的CTLs细胞因子表达谱的情况；
图14抗独特型抗体6B11-CTLs以及VH CDR3和VL CDR3区肽特异性CTLs中抗原特异性IFN-γ产生细胞的情况。
具体实施方式：
实施例1 卵巢癌抗独特型抗体6B11的制备
具体的制备过程参见本申请人的在先申请CN1356341，其技术路线包括以下两个主要步骤：
1.以卵巢上皮癌可溶性抗原OC166-9免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术制备抗卵巢癌单克隆抗体COC166-9。
2.以COC166-9免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术制备模拟卵巢癌抗原OC166-9的抗独特型抗体。
实施例2 上述抗独特型抗体6B11的T细胞表位肽的鉴定及诱导免疫反应特性的检测
技术路线如下：
一、外周血单核细胞来源DCs的制备以及抗独特型抗体6B11和肽的负载
(一)外周血单核细胞的分离
抽取HLA-A2健康人外周血，经EDTA抗凝后，用Ficoll淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞。在6孔培养板中，每孔内1×107个单个核细胞，定容于1ml含5％人AB血清的AIM-V培养液中，于37℃、5％CO2条件下孵育2小时。吸取并吹洗去未贴壁的细胞作为淋巴细胞于液氮中冻存备用，贴壁的细胞即为单核细胞。
(二)DCs(树突状细胞)的诱导培养及成熟表型分析
将上述6孔培养板中分离获得的单核细胞每孔加入2ml含5％人AB血清的AIM-V培养液，同时加入终浓度均为1000U/ml的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rh GM-CSF)和重组人白细胞介素-4(rhIL-4)进行诱导培养。第4天，补加1ml含5％人AB血清的AIM-V培养液，同时补加同样浓度的rh GM-CSF和rhIL-4。第6天，再次补加1ml含5％人AB血清的AIM-V培养液，同时加入终浓度均为1000U/ml的重组人肿瘤坏死因子-α(rh TNF-α)、重组人α-干扰素(rh IFN-α)、重组人白细胞介素-6(rh IL-6)和终浓度为1μg/ml的前列素E2(PGE2)，共同孵育24小时，诱导DCs成熟。
收获DCs，经过洗涤后，调浓度为每10ml离心管中1×106个细胞，分别加入FITC和PE标记的荧光抗体每管5μl，4℃避光标记30分钟，洗涤两次。利用流式细胞分析术对上述经过成熟诱导的DCs表面CD80，CD86，CD83，CD1a和HLA-DR分子的表达情况进行分析(如图1)。
(三)DCs负载抗独特型抗体6B11以及抗独特型抗体6B11CDRs(互补决定区)区肽
(1)DCs负载抗独特型抗体6B11
于DCs培养第4天，在补加培养液、rh GM-CSF和rh IL-4同时，加入终浓度为40μg/ml的抗独特型抗体6B11进行负载，作为刺激细胞备用。
(2)DCs负载抗独特型抗体6B11CDRs肽
收获经诱导成熟后的DCs，洗涤后调整浓度为1×106个/ml，分别加入终浓度为30μg/ml的各条肽或30μg/ml的各条肽和5μg/ml的匙孔血蓝蛋白(KLH)进行负载，作为刺激细胞备用。
二、抗独特型抗体6B11以及抗独特型抗体6B11CDRs肽特异性CTLs的诱导
(一)抗独特型抗体6B11特异性CTLs的诱导
用负载抗独特型抗体6B11的DCs(anti-Id DCs)刺激上述冻存的自体淋巴细胞，获得抗独特型抗体6B11特异性CTLs(6B11-CTLs)，每7天作为1个周期，于周期第3日补加10U/ml的重组人白细胞介素-2(rh IL-2)，最终获得经过1个周期或3个周期刺激的抗独特型抗体6B11-CTLs。
(二)抗独特型抗体6B11CDRs肽特异性CTLs的诱导
用负载肽和KLH的DCs刺激上述冻存的自体淋巴细胞，获得肽特异性CTLs(肽-CTLs)，每7天作为1个周期，于周期第3日补加10U/ml的rh IL-2，最终获得经过3个周期刺激的肽-CTLs。
收获经过1个周期刺激的6B11-CTLs，作为反应细胞用于细胞增殖分析实验、ELISA细胞因子测定实验和IFN-γELISPOT实验；收获经过3个周期刺激的6B11-CTLs和肽-CTLs，作为效应细胞用于51Cr释放实验。
三、抗独特型抗体6B11Th表位肽的鉴定以及其诱导免疫反应型别的分析
(一)BrdU ELISA细胞增殖分析方法鉴定抗独特型抗体6B11的Th表位肽
人工合成抗独特型抗体6B11的全部CDRs区肽(6条)，并利用细胞增殖分析方法进行Th表位肽的筛选。以经过1个周期刺激的抗独特型抗体6B11-CTLs为反应细胞、以分别负载抗独特型抗体和肽的DCs为刺激细胞，按10：1比例于37℃、5％CO2条件下共同孵育120小时，进行BrdU ELISA细胞增殖分析。每孔为100μl AIM-V培养液，含1×105个抗独特型抗体6B11-CTLs。在刺激的最后2小时，每孔加入10μl BrdU标记液，去除板孔中液体，于60℃条件下干燥细胞1小时。每孔再加入200μl FixDenat液，于37℃条件下作用30分钟，用于固定淋巴细胞中的DNA。最后每孔加入100μl BrdU单克隆抗体作用90分钟，经底物法显色后，用自动酶标仪读取450nm处的吸光度值，检测细胞的增殖情况。以未负载DCs组和植物血凝素(PHA)组分别作为实验的阴性和阳性对照。结果，反应细胞6B11-CTLs在受到阳性对照PHA刺激时，发生了明显的增殖反应，表明实验所用的反应细胞具有健全的增殖能力，在遇到T细胞受体特异性的肽后能进行正常的增殖；6B11-DCs因具有完整抗独特型抗体的全部肽片段，可以刺激反应细胞发生增殖反应；在6条CDRs肽中，只有重链(VH)CDR3肽和轻链(VL)CDR3肽可以分别刺激反应细胞发生增殖反应，而且前者的作用更强一些；其他各条肽不能刺激反应细胞发生增殖反应；表明VH CDR3和VL CDR3肽为抗独特型抗体发挥效应机制的关键部分(如图2)。
为了进一步分析上述细胞增殖反应的组成情况，应用抗人MHC-II类分子抗体对刺激细胞进行阻断，以判断Th表位肽的作用情况。首先，摸索最适的MHC-II类分子抗体的使用浓度，最终选择1：20的稀释度(如图3)。MHC-II类分子阻断后的细胞增殖分析结果显示，PHA和6B11-DCs引发的增殖反应在很大程度上被MHC-II类分子抗体阻断；VH CDR3肽引发的增殖反应可以大部分被MHC-II类分子抗体阻断，而VL CDR3肽引发的增殖反应不能被MHC-II类分子抗体阻断；其他各条肽不能引发增殖反应，而且与MHC-II类分子抗体应用与否无关(如图4)。以上结果表明，与PHA一样，VH CDR3肽主要引发CD4T细胞发生增殖反应，而VL CDR3肽引发的增殖反应与CD4T细胞无关。对反应细胞进行CD4T细胞磁珠分选后的细胞增殖分析显示，除了PHA和6B11-DCs外，只有VH CDR3肽可以引发CD4T细胞发生增殖反应，VL CDR3肽不能引发CD4T细胞发生增殖反应，与前述结果一致(如图5)。表明，VH CDR3肽(IALITTKIAWYFDV)确实可以诱导6B11-CTLs中CD4T细胞的增殖反应，为抗独特型抗体6B11的一个Th表位肽。
(二)流式细胞内细胞因子测定方法检测Th表位肽诱导免疫反应的型别
将抗独特型抗体6B11-CTLs分别与负载VH CDR3肽的DCs以及未负载DCs共同孵育，用流式细胞术检测抗独特型抗体6B11-CTLs来源的CD4T中细胞内细胞因子的产生情况。结果发现，VH CDR3肽可以刺激CD4T细胞分泌高水平的IFN-γ，仅产生低水平的IL-4(如图6)。以上结果表明，VH CDR3肽(IALITTKIAWYFDV)作为抗独特型抗体的Th表位肽，主要诱导Th1型免疫反应。
四、抗独特型抗体6B11CTL表位肽的鉴定
(一)利用SYFPEITHI法则预测抗独特型抗体6B11CDRs区HLA-A2结合肽
将抗独特型抗体6B11CDRs区肽的序列分别输入预测网站，分析序列中可能的HLA-A2结合肽，并给出预测分值。网址为SYFPEITHI(http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/)。筛选分值≥7的结合肽，共有13条：VH CDR2区4条、VH CDR3区4条、VL CDR1区4条和VL CDR3区1条。由于应用该法则只能预测出9mer或10mer的HLA-A2结合肽，为了尽可能地不遗漏序列，我们人工合成了上述13条分值≥7的9mer肽以及VH CDR1和VL CDR2区的2条8mer肽，用于进一步实验(如表1)。
(二)T2细胞结合力分析实验筛选抗独特型抗体6B11CDRs区HLA-A2结合肽
将经SYFPEITHI法则筛选出来的肽以及VH CDR1和VL CDR2区肽分别进行T2结合力分析。T2细胞分别与不同浓度(0.3μg/ml、3μg/ml和30μg/ml)的各条肽共同孵育24小时，再与抗人MHC-I类分子抗体共同孵育后，利用共聚焦显微镜分析T2细胞表面HLA-I类分子的表达情况。结果，VH CDR2区肽(NNKYYNTAL)为高度结合力肽，VL CDR3区肽(SQSTHFPYT)为中度结合力肽，VH CDR3区肽(LITTKIAW与IALITTKIA)和VL CDR1区肽(VHSNGNTYL)为低度结合力肽(如表1，图7)。NNKYYNTAL、LITTKIAW、IALITTKIA和VHSNGNTYL为新筛选肽，与抗独特型抗体CDRs区肽一起合成，用于CTL表位肽的筛选。
表1 抗独特型抗体6B11CDRs区HLA-A2结合肽的筛选
(三)51Cr释放实验鉴定抗独特型抗体6B11的CTL表位肽
以经过3个周期刺激的6B11-CTLs和肽-CTLs为效应细胞，以负载相应肽的T2细胞、HOC1A细胞和HLE细胞为靶细胞，进行标准的4小时51Cr释放实验。将1×106个靶细胞放在0.5ml含5％小牛血清的RPMI1640培养液中，加入100μCi Na2 51CrO4，于37℃标记过夜，最后用冷的含5％小牛血清的RPMI1640培养液洗涤细胞3次以终止标记反应。将5×103靶细胞放在100μl培养液中与等体积的效应细胞混合于96孔板板孔中，效靶比设为40：1、20：1、10：1和5：1。自发释放孔内为靶细胞和培养液，最大释放孔内则为靶细胞和含1％Triton X-100的相应培养液。用平板离心机轻甩孔板2分钟，于37℃、5％CO2条件下共同孵育4小时。再次轻甩孔板，每孔吸取100μl的上清转移入计数管中，并做好相应的标记，用γ计数仪测定cpm值。所有实验均设2复孔，自然释放孔与最大释放孔cpm值之比<20％。
杀伤率(％)＝[(实验孔平均cpm值-自然释放孔平均cpm值)/(最大释放孔平均cpm值-自然释放孔平均cpm值)]×100
结果，VH CDR3肽-CTLs能杀伤负载该肽的T2细胞和HOC1A细胞，表明VH CDR3肽确实为抗独特型抗体中具有杀伤效应的表位肽，而且该表位肽也是卵巢癌抗原OC166-9的优势表位肽，能参与免疫反应的诱导(如图8C)；VL CDR3肽-CTLs也能杀伤负载该肽的T2细胞和HOC1A,也是抗独特型抗体中具有杀伤效应的优势表位肽(如图F)。随效靶比降低，6B11-CTLs、VH CDR3肽-CTLs和VL CDR3肽-CTLs对靶细胞的杀伤率亦随之降低。其余各肽—CTLs均不能杀伤相应肽刺激的T2细胞和HOC１A细胞，为抗独特型抗体6B11中与T细胞杀伤效应无关的肽(如图8A、B，D、E，G-J)。
为了进一步分析上述杀伤作用的效应情况，应用抗人MHC-I类分子抗体对靶细胞进行阻断，以判断CTL表位肽的作用情况。首先，摸索最适的MHC-I类分子抗体的使用浓度，最终选择1：20的稀释度(如图9)。MHC-I类分子阻断后的51Cr释放实验结果显示，VH CDR3肽-CTLs仍然可以杀伤经MHC-I类分子阻断的该肽刺激的T2细胞和HOC1A细胞，其杀伤作用不受MHC-I类分子抗体干扰，也即与CD8T细胞的作用无关；VL CDR3肽-CTLs对经MHC-I类分子阻断的该肽刺激的T2细胞和HOC1A细胞的杀伤作用明显受到抑制，其杀伤作用受MHC-I类分子抗体的干扰，主要是CD8T细胞介导的(如图10)。表明，虽然VH CDR3肽与VL CDR3肽均能引发杀伤作用，但是其效应机制不同，前者与CD8T细胞无关，而后者为CD8T细胞介导，也即说明VL CDR3肽(SQSTHFPYT)为抗独特型抗体6B11的一个CTL表位肽。
五、抗独特型抗体6B11T细胞表位肽生物活性的检测
(一)51Cr释放实验检测抗独特型抗体6B11T细胞表位肽杀伤作用的特异性和有效性
分别以Th表位肽、CTL表位肽和抗独特型抗体6B11诱导特异性CTLs细胞作为效应细胞；以K562细胞和HOCA细胞为靶细胞进行51Cr释放实验，用以检测Th表位肽、CTL表位肽杀伤作用的特异性，并与抗独特型抗体6B11进行比较。未负载DCs刺激的T细胞和naiveT细胞作为阴性对照。结果，VH CDR3肽-CTLs能杀伤K562细胞，存在非特异性效应机制；VL CDR3肽-CTLs不能杀伤K562细胞，不存在非特异性效应机制(如图11)。由于VH CDR3肽和VL CDR3肽均为抗独特型抗体6B11的效应部分，二者分别参与了其诱导的非特异性和特异性的效应机制。
为了考察T细胞表位肽杀伤作用的有效性和杀伤效率，我们进行了如下实验。分别利用终浓度为30μg/ml的VH CDR3肽、30μg/ml的VL CDR3肽、15μg/ml的VH CDR3肽与15μg/ml的VL CDR3肽和40μg/ml的抗独特型抗体6B11刺激T细胞，获得相应的特异性CTLs作为效应细胞，以HOC1A为靶细胞，进行51Cr释放实验，以对比各组抗原物质刺激免疫反应的有效性。结果，VH CDR3肽-CTLs和VL CDR3肽-CTLs均能杀伤靶细胞HOC1A，而且联合应用VH CDR3肽和VL CDR3肽刺激得到的特异性CTLs杀伤作用更强，表明二者之间存在协同效应；与6B11-CTLs相比，其杀伤作用也更强(如图12)。进一步证明了，VH CDR3肽和VL CDR3肽为抗独特型抗体6B11中负责诱导T细胞反应的有效成分，具有比抗独特型抗体6B11更为精确的效应作用。
(二)ELISA法检测T细胞表位肽诱导细胞因子谱的情况
分别以6B11-CTLs、VH CDR3-CTLs和VL CDR3-CTLs与靶细胞HOC1A按40：1的比例混合，于37℃、5％CO2条件下共同孵育48小时，收获上清，利用双抗夹心ELISA方法测定IL-2、IFN-γ和IL-4的含量。结果，6B11-CTLs能分泌高水平的IL-2和IFN-γ，IL-4分泌水平低，表明抗独特型抗体6B11诱导的免疫反应存在Th1或Tc1极化现象；VH CDR3肽-CTLs也能分泌高水平的IL-2和IFN-γ，IL-4分泌水平低，表明其诱导Th1型免疫反应；VH CDR3肽和VL CDR3肽特异性CTLs亦能分泌高水平的IL-2和IFN-γ，IL-4分泌水平低，与抗独特型抗体6B11所诱导的免疫反应趋势相同，从另一个角度说明了，VH CDR3肽和VL CDR3肽参与了抗独特型抗体6B11来源的T细胞免疫反应的诱导(如图13)。
(三)Elispot法检测分泌IFN-γ的特异性细胞频数
Elispot方法能从单个细胞水平精确检测抗原特异性细胞因子的产生情况，并能计数抗原特异性细胞的数量，为监测免疫反应的最为有效的方法之一。以6B11-CTLs、VH CDR3和VL CDR3肽特异性CTLs为反应细胞，HOC1A和HLE细胞为刺激细胞，共同孵育24h后，检测抗原特异性IFN-γ分泌细胞的数量。结果，6B11-CTLs、VH CDR3和VL CDR3肽特异性CTLs均能对HOC1A细胞发生应答，IFN-γ分泌细胞的频数分别为196/1×106T细胞和184/1×106T细胞，二者与未负载DCs刺激的T细胞组和naiveT细胞组相比差异有统计学意义。各组T细胞对HLE细胞应答情况相当，IFN-γ分泌细胞的频数相仿(如图14)。以上结果表明，抗独特型抗体6B11与VH CDR3和VL CDR3肽均能诱导抗原特异性T细胞反应，而且IFN-γ是该抗原特异性T细胞的效应分子。
六、抗独特型抗体6B11T细胞表位肽在构建卵巢癌疫苗中的应用
目前，由于对卵巢癌抗原的信息了解较少，尚缺乏用于构建卵巢癌疫苗的特异性T细胞表位肽，上述T细胞表位肽对于构建卵巢癌疫苗具有重要的意义。以下以热休克蛋白为例，举例说明T细胞表位肽在构建卵巢癌疫苗中的应用。
(一)T细胞表位肽—热休克蛋白卵巢癌疫苗的构建
(1)理论基础
T细胞表位肽单独应用易降解，热休克蛋白被认为是目前最理想的肽疫苗构建的载体，其优点如下：种属间同源性高，可以避免引发同种异体反应；与肽结合或形成融合蛋白后，可以防止肽的降解；可以引导肽进入相应的免疫刺激通路中，使肽的作用更为精确；可以激活抗原递呈细胞，促进细胞因子的分泌，从而增强免疫反应；可以促进抗原的交叉递呈。
(2)构建方案
1)构建T细胞表位肽与热休克蛋白的融合蛋白作为卵巢癌疫苗
①T细胞表位肽与热休克蛋白融合蛋白的构建、表达和鉴定
利用基因克隆、DNA重组和PCR技术构建包含组蛋白标签的T细胞表位肽与热休克蛋白融合基因的质粒(CTL肽-热休克蛋白质粒、Th肽—热休克蛋白质粒、CTL肽—linker—Th肽-热休克蛋白质粒、CTL肽—linker—通用Th肽-热休克蛋白质粒、无关CTL肽-热休克蛋白质粒、通用Th肽—热休克蛋白质粒)；以大肠杆菌BL21(DE3)作为表达菌，经IPTG诱导后以包涵体的形式表达T细胞表位肽—热休克蛋白的融合蛋白；为了恢复热休克蛋白的构像和溶解性，采用镍结合柱借助组蛋白标签纯化和复性T细胞表位肽与热休克蛋白的融合蛋白；利用ELISA和Western blot方法检测融合蛋白中热休克蛋白的生物活性；以32P标记的ATP为底物，通过监测自ATP释放32P的射线量，检测热休克蛋白的ATP酶活性情况；利用SDS-PAGE凝胶电泳和序列测定来检测融合蛋白的分子量以及分析序列的正确性。
②卵巢癌患者体外实验检测T细胞表位肽与热休克蛋白融合蛋白疫苗的抗卵巢癌作用
DCs的培养以及成熟诱导；以DCs负载T细胞表位肽与热休克蛋白的融合蛋白，DCs负载无关T细胞表位肽与热休克蛋白的融合蛋白组和未负载DC组均作为阴性对照；上述各组DCs刺激卵巢癌患者自体T细胞，利用流式细胞术分析效应细胞的组成和激活情况，利用ELISA方法测定效应细胞培养上清中细胞因子(IL-2、IL-4、INF-γ和TNFα等)的表达情况，判断效应细胞的极性(Th1、Tc1极化或是Th2、Tc2极化)，利用ELISPOT方法检测抗原特异性效应细胞的数量，利用51Cr释放实验检测效应细胞的抗卵巢癌作用。
③动物实验检测T细胞表位肽与热休克蛋白融合蛋白疫苗的抗卵巢癌作用
建立SCID鼠卵巢癌模型，皮下注射T细胞表位肽与热休克蛋白的融合蛋白疫苗，观察SCID鼠的一般状况、肿瘤生长情况和腹水产生情况；观察SCID鼠的平均生存期；取SCID鼠肿瘤组织，切片后免疫组化染色检测肿瘤浸润淋巴细胞的类型、数量以及随时间推移的变化情况。
2)构建T细胞表位肽与热休克蛋白可逆性结合的卵巢癌疫苗
热休克蛋白的表达和鉴定；T细胞表位肽与热休克蛋白结合序列的合成；Bio-Rad法测定热休克蛋白的浓度，肽与热休克蛋白按摩尔比10：1混合于结合缓冲液中，37℃条件下作用1小时，Microcon50经分子排阻法去除游离肽；利用质谱分析、凝胶电泳和ATP酶活性分析的方法来鉴定T细胞表位肽与热休克蛋白可逆性结合的情况；卵巢癌患者体外实验和动物实验检测所构建疫苗的抗卵巢癌作用(具体参见构建方法一相关实验)。
(二)T细胞表位肽参与构建多表位肽卵巢癌疫苗
由于肿瘤抗原在个体间存在一定的差异，而且即使是相同的肿瘤抗原在机体免疫选择的压力下也容易发生调变，因而某种抗原来源的肽不可能适用于所有肿瘤患者。虽然，所述的抗独特型抗体T细胞表位肽为模拟肿瘤抗原的T细胞表位肽，可以克服肿瘤抗原来源肽的免疫耐受性，但是因MHC限制性问题，也应该考虑联合其他卵巢癌相关的T细胞表位肽共同构建卵巢癌疫苗，以扩大卵巢癌疫苗的适用范围。载体仍可以选择热休克蛋白(具体构建方法如前所述)，只是将所述的抗独特型抗体T细胞表位肽与其他T细胞表位肽(如P53来源)共同用于构建。
七、抗独特型抗体6B11T细胞表位肽在构建检测试剂盒中的应用
(一)理论基础
MHC分子、T细胞表位肽和β2微球蛋白是T细胞受体识别的基本单位，构建此三种分子构成的复合体，可以对具有相应T细胞表位肽受体的T细胞进行检测，从而可以反映表位肽所组成的卵巢疫苗应用后的治疗反应，并能对其疗效进行客观的评价。
(二)构建方案
将MHC分子与β2微球蛋白的基因克隆于原核表达载体，分别在大肠杆菌中表达；将此两种表达产物与T细胞表位肽按摩尔比1:2:40于4℃透析过夜(透析法)，或与肽共同稀释于200ml缓冲液中，10℃孵育(稀释法)；利用BirA酶将上述复合物进行生物素化，生物素化的复合物再与藻红蛋白标记的亲和素按4:1比例混合，从而构建成为Tetramer检测试剂盒。

Claims (4)

1.一种卵巢癌抗独特型抗体6B11的T细胞表位肽在制备卵巢癌疫苗中的应用，其中所述T细胞表位肽的序列为I A L I T T K I A W Y F D V或S Q S T H FP Y T，该T细胞表位肽与热休克蛋白共同构建卵巢癌疫苗。
2.如权利要求1所述的应用，其中该T细胞表位肽与热休克蛋白共同构建融合蛋白。
3.如权利要求1所述的应用，其中该T细胞表位肽与热休克蛋白构成可逆性结合的卵巢癌疫苗。
4.如权利要求1、2或3所述的应用，其中所述热休克蛋白为HSP70或gp96。
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