CN1849139A - 使用针对淀粉样β肽的抗体及其组合物治疗阿尔茨海默氏病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了针对淀粉样β肽的单克隆抗体以及使用所述单克隆抗体治疗和预防阿尔茨海默氏病和唐氏综合征的方法。

Description

使用针对淀粉样β肽的抗体及其组合物治疗 阿尔茨海默氏病的方法

相关申请的相互参考

本申请要求2002年10月9日提交的美国临时申请系列号60/417,232、2003年2月13日提交的美国临时申请系列号60/447,611、2003年4月22日提交的美国临时申请系列号60/464,754和2003年6月20日提交的美国临时申请系列号60/480,353的权利，它们被全文引入作为参考。

技术领域

本发明总体上涉及检测和治疗与淀粉样β肽(Aβ)表达相关的疾病，如阿尔茨海默氏(Alzheimer’s)病和唐氏(Down’s)综合征。本发明更具体涉及针对Aβ和其前体βAPP的抗体。因此，本发明提供用于检测和治疗与Aβ和βAPP过量表达(或累积)相关的疾病的免疫治疗组合物和方法。

发明背景

阿尔茨海默氏病(AD)是退化性脑功能障碍，其临床特征为渐进性的记忆缺失、精神错乱、渐进的体质恶化、最后死亡。全球大约有1千5百万人患有阿尔茨海默氏病，并且预计该数量随着寿命的延长会急剧上升。从组织学上讲，该疾病的特征是首先发现于皮质联合区(associationcortex)、边缘系统和基底神经节的神经炎斑(neuritic)。这些神经炎斑的主要成分是β淀粉样前体蛋白(βAPP或APP)的切割产物——淀粉样β肽(Aβ)。APP是含有大的异位N端结构域、跨膜结构域和小的细胞质C端尾的I型跨膜糖蛋白。21号染色体上单一APP基因转录物的选择性剪接产生具不同氨基酸数目的几种同种型。

Aβ在阿尔茨海默氏病的神经病理学中似乎扮演重要角色。该疾病的家族型与APP和早老素(presenilin)基因的突变有关(Tanzi等，1996，Neurobiol.Dis.3：159-168；Hardy，1996，Ann.Med.28：255-258)。这些基因中与疾病相关的突变导致42个氨基酸型的Aβ的产量增加，该型是淀粉样蛋白斑中的主要形式。此外，用人Aβ免疫过量表达与疾病相关的突变型APP的转基因小鼠可降低蛋白斑的负荷量和相关的病状(Schenk等，1999，Nature 400：173-177)，并且外周施用针对Aβ的抗体也可降低脑中蛋白斑的负荷量(Bard等，2000，Nature Medicine 6(8)：916-919)。

因此，抗体治疗提供了一种有希望的治疗和预防阿尔茨海默氏病的方法。仍需要提高针对Aβ，并且适合于人类患者使用的抗体和其它免疫治疗剂的功效。

在整个申请中，参考了多种出版物(包括专利和专利申请)。因此，将这些出版物所公开的内容全文引入为参考。

发明概要

本发明提供了与Aβ肽(SEQ ID NO：1)(表6)结合的经分离的单克隆抗体。更为具体地，提供了与Aβ肽的氨基酸1-16、16-28或28-40位结合的抗体。优选地，所述抗体竞争地抑制具有SEQ ID NO：4、6、8或10(表9和11)所示氨基酸序列的单克隆抗体的结合，或者竞争地抑制命名为8A1.2A1、3C6.1F9或10B10.2E6的杂交瘤产生的单克隆抗体的结合。在一些实施方案中，所述单克隆抗体与Aβ肽结合的亲和力约为200nM或更小、约为100nM或更小、约为60nM或更小，优选地约为30nM或更小，更为优选地约为3nM或更小、约为2nM或更小、以及约为1nM或更小。在一些实施方案中，单克隆抗体的Fab片段与Aβ肽结合的亲和力约为200nM或更小、约为100nM或更小、约为60nM或更小、约为30nM或更小、约为3nM或更小、约为2nM或更小、以及约为1nM或更小。在优选的实施方案中，抗体与下述单克隆抗体结合同一Aβ表位，所述单克隆抗体具有SEQ ID NO：4、6、8或10所示氨基酸序列或由命名为8A1.2A1、3C6.1F9或10B10.2E6的杂交瘤产生。本发明也提供了命名为8A1.2A1、3C6.1F9或10B10.2E6的杂交瘤产生的单克隆抗体。此处所述的单克隆抗体可任选地与治疗剂缀合和/或用可检测标志物进行标记。

另一方面，本发明提供了优先与Aβ肽(SEQ ID NO：1)(表6)28-40位氨基酸结合的经分离的抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体优先与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合。在一些实施方案中，抗体与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合，但未显示出与Aβ_1-42和/或Aβ_1-43肽显著的交叉反应。在一些实施方案中，抗体与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)36-40位氨基酸的表位结合。在一些实施方案中，抗体与包括Aβ肽(SEQ IDNO：1)36-40位氨基酸的表位结合，但未显示出与Aβ_1-42和/或Aβ_1-43肽显著的交叉反应。在一些实施方案中，抗体与Aβ肽(SEQ ID NO：1)结合的亲和力约为200nM或更小、约为100nM或更小、约为60nM或更小、约为30nM或更小、约为3nM或更小、约为2nM或更小、约为1nM或更小。在一些实施方案中，抗体的Fab片段与Aβ肽(SEQ ID NO：1)结合的亲和力约为200nM或更小、约为100nM或更小、约为60nM或更小、约为30nM或更小、约为3nM或更小、约为2nM或更小、约为1nM或更小。在一些实施方案中，优先与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合的抗体Fab片段，与Aβ肽(SEQ ID NO：1)结合的亲和力约为200nM或更小、约为100nM或更小、约为60nM或更小、约为30nM或更小、约为3nM或更小、约为2nM或更小、约为1nM或更小。在一些实施方案中，优先与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)36-40位氨基酸的表位结合的抗体Fab片段，与Aβ肽(SEQ ID NO：1)结合的亲和力约为200nM或更小、约为100nM或更小、约为60nM或更小、约为30nM或更小、约为3nM或更小、约为2nM或更小、约为1nM或更小。在一些实施方案中，抗体竞争地抑制包含SEQ ID NO：4和/或6所示氨基酸序列的单克隆抗体、或命名为8A1.2Al的杂交瘤产生的单克隆抗体与Aβ_1-40肽(SEQ ID NO：1)结合。在一些实施方案中，抗体与包含SEQ IDNO：4和/或6所示的氨基酸序列的单克隆抗体、或命名为8A1.2Al的杂交瘤产生的单克隆抗体结合的表位结合。在一些实施方案中，抗体是人抗体。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO：4和6所示的氨基酸序列，或由命名为8A1.2A1的杂交瘤产生。

另一方面，本发明是来源于包含SEQ ID NO：4和/或6所示氨基酸序列的单克隆抗体、或由命名为8A1.2A1的杂交瘤产生的单克隆抗体的人源化抗体。在一些实施方案中，人源化抗体具有包含SEQ ID NO：4和/或6所示氨基酸序列的单克隆抗体、或由命名为8A1.2A1的杂交瘤产生的单克隆抗体的一个或多个CDR。另一方面，本发明提供与包含SEQ IDNO：4和/或6所示氨基酸序列的单克隆抗体、或由命名为8A1.2A1的杂交瘤产生的单克隆抗体结合相同表位的人源化抗体。一般地，本发明的人源化抗体包含一个或多个(一个、两个、三个、四个、五个、六个)CDR，这些CDR与包含SEQ ID NO：4和/或6所示氨基酸序列的单克隆抗体、或由命名为8A1.2A1的杂交瘤产生的单克隆抗体的CDR相同和/或来源于它们。

另一方面，本发明是包含来源于单克隆抗体重链和轻链可变区的可变区以及来源于人抗体重链和轻链恒定区的恒定区的嵌合抗体，这些单克隆抗体包含SEQ ID NO：4和/或6所示氨基酸序列、或由命名为8A1.2A1的杂交瘤产生。

在一些实施方案中，此处所公开的抗体的亲和力约为100pM或更小、约50pM或更小、约25pM或更小、约15pM或更小、约10pM或更小、约5pM或更小、或约2pM或更小。

此外，本发明提供与βAPP(SEQ ID NO：2)(表7)结合、并且竞争地抑制命名为25E12.1F9.1H8(BP26)、24H4.2E10.1F5(BP27)、1F10.8E6.2A2(BP80)、13E12.1C5(BP81)或14D9.1G8(BP82)的杂交瘤产生的单克隆抗体结合的经分离单克隆抗体。

也提供包含一个或多个本发明抗体的组合物。在一些实施方案中，组合物包含至少两种抗体，针对Aβ肽16-28位氨基酸的第一个抗体和针对Aβ肽28-40位氨基酸的第二个抗体。可选择的是，组合物还包含生理学上可接受的载体。

本发明还提供编码此处所述单克隆抗体的分离的多核苷酸、以及包含此多核苷酸的载体和含有此载体的宿主细胞。这种表达系统可用于产生免疫反应性多肽如本发明抗体的方法，其包括培养宿主细胞，并且回收从培养的宿主细胞中产生的多肽。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸或载体包含SEQ ID NO：3和/或5(表8)所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸或载体包含SEQ ID NO：7和/或9(表10)所示的核苷酸序列。本发明也提供含有此处所述载体的宿主细胞。另一方面，本发明也提供产生免疫反应性多肽的方法，包含培养此处所述的宿主细胞以及回收这样产生的多肽。本发明也提供通过培养此处所述宿主细胞、并且回收这样产生的多肽而产生的免疫反应性多肽。

本发明也提供包含此处所述有效量的任一多肽(包括任一抗体)或多核苷酸以及可药用载体的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含优先与Aβ肽16-28位氨基酸结合的抗体。在一些实施方案中，药物组合物包含优先与Aβ肽(SEQ ID NO：1)28-40位氨基酸结合的抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，药物组合物包含优先与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合的抗体。在一些实施方案中，与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合的抗体与Aβ_1-42和/或Aβ_1-43肽没有显著的交叉反应。在一些实施方案中，与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)36-40位氨基酸的表位结合的抗体与Aβ_1-42和/或Aβ_1-43肽没有显著的交叉反应。在一些实施方案中，与Aβ肽(SEQ ID NO：1)28-40位氨基酸结合的抗体与Aβ肽(SEQ ID NO：1)结合的亲和力约为200nM或更小、100nM或更小、60nM或更小、30nM或更小、3nM或更小、2nM或更小、1nM或更小。在一些实施方案中，抗体的Fab片段与Aβ肽(SEQ ID NO：1)结合的亲和力约为200nM或更小、100nM或更小、60nM或更小、30nM或更小、3nM或更小、2nM或更小、1nM或更小。在一些实施方案中，优先与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合的抗体Fab片段，与Aβ肽(SEQ IDNO：1)结合的亲和力约为200nM或更小、100nM或更小、60nM或更小、30nM或更小、3nM或更小、2nM或更小、1nM或更小。在一些实施方案中，优先与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)3-40位氨基酸的表位结合的抗体Fab片段，与Aβ肽(SEQ ID NO：1)结合的亲和力约为200nM或更小、100nM或更小、60nM或更小、30nM或更小、3nM或更小、2nM或更小、1nM或更小。在一些实施方案中，抗体竞争地抑制包含SEQ ID NO4和/或6所示氨基酸序列的单克隆抗体、或命名为8A1.2A1的杂交瘤产生的单克隆抗体的结合。在一些实施方案中，抗体与Aβ肽(SEQ ID NO：1)的表位结合，该表位与包含SEQ ID NO：4和/或6所示氨基酸的抗体、或命名为8A1.2A1的杂交瘤所产生的单克隆抗体结合。在其它实施方案中，药物组合物包含人抗体、来源于任一此处所述抗体的人源或嵌合抗体。

本发明也提供命名为8A1.2A1、3C6.1F9或10B 10.2E6的杂交瘤。

本发明也提供预防、治疗、抑制、或延缓阿尔茨海默氏病和其它与Aβ或βAPP的表达改变、或Aβ肽积累相关疾病的发展的方法，如唐氏综合征、帕金森氏病、多发性脑梗塞痴呆。本方法包含对受试者施用包含本发明的抗体(包括多肽)或多核苷酸的有效剂量的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含优先与Aβ肽16-28位氨基酸结合的抗体。在一些实施方案中，抗体优先与Aβ肽(SEQ ID NO：1)的28-40位氨基酸结合。在一些实施方案中，抗体优先与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合。在一些实施方案中，抗体优先与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)36-40位氨基酸的表位结合。在一些实施方案中，与包括Aβ肽(SEQ IDNO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合的抗体，未显示出与Aβ_1-42和/或Aβ_1-43肽显著的交叉反应。在一些实施方案中，与包括Aβ肽(SEQ IDNO：1)36-40位氨基酸的表位结合的抗体，未显示出与Aβ_1-42和/或Aβ_1-43肽显著的交叉反应。在一些实施方案中，与Aβ肽(SEQ ID NO：1)28-40位氨基酸结合的抗体，与Aβ肽(SEQ ID NO：1)结合的亲和力约为200nM或更小、100nM或更小、60nM或更小、30nM或更小、3nM或更小、2nM或更小、1nM或更小。在一些实施方案中，抗体的Fab片段与Aβ肽(SEQID NO：1)结合的亲和力约为200nM或更小、100nM或更小、60nM或更小、30nM或更小、3nM或更小、2nM或更小、1nM或更小。在一些实施方案中，优先与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合的抗体Fab片段，与Aβ肽(SEQ ID NO：1)结合的亲和力约为200nM或更小、100nM或更小、60nM或更小、30nM或更小、3nM或更小、2nM或更小、1nM或更小。在一些实施方案中，优先与包括Aβ肽(SEQ IDNO：1)36-40位氨基酸的表位结合的抗体Fab片段，与Aβ肽(SEQ IDNO：1)结合的亲和力约为200nM或更小、100nM或更小、60nM或更小、30nM或更小、3nM或更小、2nM或更小、1nM或更小。在一些实施方案中，抗体竞争地抑制包含SEQ ID NO：4和/或6所示氨基酸序列的单克隆抗体、或命名为8A1.2A1的杂交瘤产生的单克隆抗体的结合。抗体可以是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体，并且可以是抗体的片段。抗体片段的实例包括，但不限于Fab、F(ab′)₂和Fv片段。抗体也可以是包含一个或多个抗体片段的单链、双特异性或多特异性抗体。抗体可进一步与治疗试剂连接，或与治疗试剂一起施用。

本发明也提供延缓与阿尔茨海默氏病或其它与Aβ肽在被试体内积累有关的疾病相关病征的发展的方法，包括对受试者施用包含本发明抗体(包括多肽)或多核苷酸的有效剂量的药物组合物。

本发明也提供抑制受试者中淀粉样蛋白斑形成的方法，包括对受试者施用包含本发明抗体(包括多肽)或多核苷酸的有效剂量的药物组合物。在一些实施方案中，淀粉样蛋白斑位于受试者的脑中。

本发明也提供减少受试者淀粉样蛋白斑的方法，包括对受试者施用包含本发明抗体(包括多肽)或多核苷酸的有效剂量的药物组合物。在一些实施方案中，淀粉样蛋白斑位于受试者的脑中。

本发明也提供移去或清除受试者淀粉样蛋白斑的方法，包括对受试者施用包含本发明抗体(包括多肽)或多核苷酸的有效剂量的药物组合物。在一些实施方案中，淀粉样蛋白斑位于受试者的脑中。

此外，本发明提供抑制组织中Aβ肽积累的方法，包含将组织与本发明的单克隆抗体接触。

本发明也提供减少个体脑中Aβ肽(包括可溶和沉淀型)的方法，包括对个体施用有效剂量的本发明抗体。在一些实施方案中，脑中Aβ肽的积累得到抑制和/降低。在一些实施方案中，Aβ肽的毒性作用得到抑制和/降低。因此，本发明的方法可用于治疗任何存在或怀疑Aβ肽积累的疾病，如阿尔茨海默氏病、唐氏综合征、帕金森氏病、多发性脑梗塞痴呆。

在此处所述方法的一些实施方案中，通过全身注射施用组合物。在一些实施方案中，通过腹膜内注射施用组合物。

在上述本发明方法中施用的组合物也包括这样的组合物，其包含与包括Aβ_1-43(SEQ ID NO：12)42和/或43位氨基酸的表位结合的抗体、与Aβ_1-43(SEQ ID NO：12)的C端结合但与Aβ_1-42(SEQ ID NO：11)和/或Aβ_1-40(SEQ ID NO：1)未显示出显著交叉反应的抗体、与包括Aβ_1-42(SEQID NO：11)41和/或42位氨基酸的表位结合的抗体、或与Aβ_1-42(SEQ IDNO：11)的C端结合但与Aβ_1-43(SEQ ID NO：12)和/或Aβ_1-40(SEQ IDNO：1)未显示出显著交叉反应的抗体的组合物。

本发明的抗体可进一步用于检测、诊断和监测阿尔茨海默氏病和其它与Aβ或βAPP表达改变相关的疾病，如唐氏综合征。本方法包括将怀疑Aβ或βAPP表达改变的患者样本与本发明的抗体接触，并确定Aβ或βAPP的水平是否与对照或比较样本不同。

在进一步的实施方案中，本发明提供制成品和含有可用于治疗病理疾病(如阿尔茨海默氏病或其它与Aβ或βAPP表达改变相关的疾病)，或检测或纯化Aβ或βAPP的材料的试剂盒。制成品包括带标签的容器。合适的容器包括如瓶子、小瓶、试管。容器可以不同材料(如玻璃或塑料)制备。容器中装有含可有效治疗病理疾病或检测或纯化Aβ或βAPP的活性剂的组合物。组合物中的活性剂是抗体，并且优选地包含Aβ或βAPP特异的单克隆抗体或任何其它的本发明组合物。如上所述，容器上的标签表示组合物用于治疗病理疾病(如阿尔茨海默氏病)或检测或纯化Aβ或βAPP，也可指示用于体内或体外使用。

本发明的试剂盒包含如上所述的容器和另一含有缓冲液的容器。可进一步包括满足商品化和用户需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器，并且包装带有用于此处所述任一方法的说明书。

本发明也提供用于此处所述任何用途的任何所述组合物(如抗体)，不管是用作药剂和/或用于药剂的制备。

附图简述

图1是说明针对Aβ的单克隆抗体不与βAPP交叉反应的条形图。

图2是说明所有针对Aβ的单克隆抗体捕获可溶Aβ的条形图。

图3是说明杂交瘤8A1.2A1产生的抗体与包括Aβ_1-40 39和/或40位氨基酸的表位优先结合的条形图。

图4显示颅内注射抗体2286、2324、2289或抗遗忘症的对照抗体后，对额皮质和海马染色定量总Aβ、硫黄素-S(thioflavine-S)和MHC-II。

图5显示抗Aβ2286F_(ab′)2片段不激活小神经胶质，也不能如完整抗Aβ2286IgG那样有效移去致密的淀粉状蛋白沉淀，A-D图显示海马中CD45的免疫组织化学。E-H图显示海马中总Aβ的免疫组织化学。I-L图显示海马中硫黄素-S染色。用完整的抗Aβ2286IgG(A、E和I)、抗Aβ2286F_(ab′)2片段(B、F和J)、对照(抗遗忘症)IgG(C、G和K)、或对照(抗遗忘症)F_(ab′)2片段(D、H和L)注射小鼠。放大倍数＝40×，刻度线＝120μm。

图6显示颅内注射抗Aβ2286抗体和抗Aβ2286 F_(ab′)2片段后，CD45和总Aβ的免疫组织化学和硫黄素-S染色定量。A图显示CD45免疫组织化学右侧与左侧的比例。B图显示Aβ免疫组织化学右侧与左侧的比例。C图显示硫黄素-S染色的右侧与左侧的比例。实心条显示额皮质的值，空心条显示海马的值。X轴上，IgG-Cont指对照(抗遗忘症)的完整IgG、F(ab′)2-Cont指对照(抗遗忘症)的F_(ab′)2片段、IgG-Aβ指抗Aβ的完整IgG；F(ab′)2-Aβ指抗AβF_(ab′)2片段。“***”表示与两个对照抗体组比较，P＜0.001，“*”表示与两个对照抗体组比较P＜0.05。条形图上的线表示所示特异两组之间比较的P值。

图7显示全身注射抗体2286后，Aβ的血清水平(上图)和血清中抗Aβ抗体的浓度(底图)。图中每一点表示所示条件下治疗的一只小鼠的Aβ血清水平或抗Aβ抗体浓度。图中的线表示在所示条件下治疗的小鼠的平均Aβ血清水平或抗Aβ抗体浓度。

图8显示抗体2286和抗体2324与不同Aβ肽变体的结合。

发明详述

本发明提供Aβ肽和βAPP特异的单克隆抗体。此处公开的抗Aβ抗体以高亲和力结合，并且与βAPP无交叉反应，这使它们尤其适用于检测和治疗阿尔茨海默氏病和其它与Aβ表达改变相关的疾病(如唐氏综合征)的方法。在一个实施方案中，本发明提供针对Aβ肽C末端部分的抗体。在一个实施方案中，抗体针对的Aβ肽C末端部分包括28-40位氨基酸。在一些实施方案中，抗体优先与包括Aβ_1-4039和/或40位氨基酸的表位结合。在一些实施方案中，抗体优先与包括Aβ_1-40氨基酸36-40的表位结合。在一些实施方案中，抗体与Aβ_1-40C端部分结合的亲和力约为200nM或更小、150nM或更小、100nM或更小、60nM或更小、30nM或更小、3nM或更小、2nM或更小、1nM或更小。在一些实施方案中，抗体优先与包括Aβ_1-4039和/40位氨基酸的表位结合，亲和力约为200nM或更小、150nM或更小、100nM或更小、60nM或更小、30nM或更小、3nM或更小、2nM或更小、1nM或更小。在一些实施方案中，抗体优先与包括Aβ_1-4036-40位氨基酸的表位结合，亲和力约为200nM或更小、150nM或更小、100nM或更小、60nM或更小、30nM或更小、3nM或更小、2nM或更小、1nM或更小。针对Aβ肽C末端部分的抗体的治疗效用是基于令人惊奇的发现，即抗体可移去阿尔茨海默氏病动物模型的脑组织中的Aβ沉淀和硫黄素-S沉淀(毒性纤维形式沉淀的指征)。

与其它报告相反，发现针对Aβ28-40位氨基酸(在一些实施方案中，包括Aβ(SEQ ID NO：1)39和/40位氨基酸或Aβ(SEQ ID NO：1)氨基酸36-40位氨基酸的表位)的抗体可有效移去阿尔茨海默氏病动物模型中的纤维沉淀。如Schenk的综述(2002年10月，Nat Rev Neurosci.3(10)：824-8)并非所有抗Aβ抗体可有效减轻脑中的病状，并且可减轻病状的抗体限于针对Aβ前16个氨基酸(Bacskai等，2002，J Neurosci.22(18)：7873-8；Bard等，2000，Nature Med.6：916-919)，或氨基酸16-28(DeMattos等，2001，Proc.Natl Acad.Sci，98(15)：8850-55；DeMattos等，2002，Science，295(5563)：2264-7；Dodart等，2002 Nat.Neuroscience，5(5)：452-7)的抗体。相反，针对羧基端(例如氨基酸33-42)的抗体不能降低脑中的淀粉状蛋白负荷(Bacskai 2002，见上文、Bard 2000，见上文)。

定义

本申请中使用的所有科学和技术术语具有本领域通常使用的含义，除非另外说明。如本申请使用的，下述单词或短语具有指定的含义。

如此处使用的，“抗体”包括完整的免疫球蛋白或抗体分子、多克隆抗体、多特异性抗体(例如从至少两个完整抗体形成的双特异性抗体)和免疫球蛋白片段(如Fab、F(ab’)₂或Fv)，只要它们可显示出此处所述的任何需要的特异结合特性。抗体通常是表示出与特异抗原特异结合的蛋白质或多肽。

如此处使用的，“单克隆抗体”指从一群基本上同源的抗体中获得的抗体，即构成群体的每个抗体是相同的，除了可能以少量存在的自然发生的突变外。针对单一抗原位点的单克隆抗体是高特异性。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表示从基本同源的抗体群中获得的抗体的特征，不要理解为需要通过任何特殊的方法产生该抗体。例如，依照本发明所使用的单克隆抗体可根据Kohler和Milstein，1975，Nature，256：495首次描述的杂交瘤方法制备、或根据重组DNA方法(如美国专利号4,816,567描述的)制备 。例如，也可从使用McCafferty等，1990，Nature，348：552-554描述的技术产生的噬菌体库中分离单克隆抗体。

如此处所使用的，“人源”抗体指特异的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链、或其含有来源于非人免疫球蛋白最小序列的片段(如Fv、Fab、Fab′，F(ab′)₂或抗体的其它抗原结合序列)的非人抗体(例如鼠)型。在极大程度上，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体互补决定区(CDR)的残基被非人物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠或兔)CDR中具有所需特异性、亲和力和容量的残基置换。在一些实例中，人类免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基置换。此外，人源化抗体可以包含既未在受体抗体中发现、也未在输入的CDR或框架序列中发现的残基，包含所述残基是为了进一步改善和优化抗体性能。一般而言，人源化抗体基本上完全包含至少一个、通常为两个可变区，其中可变区中相应于所有或基本上所有CDR区非人免疫球蛋白的CDR，并且所有或基本上所有FR区是与人类免疫球蛋白一致的序列。人源化抗体最好也包含至少免疫球蛋白恒定区或功能域(Fc)的一部分，通常是人类免疫球蛋白。优选具有按WO99/58572中所述进行修饰的Fc区的抗体。人源化抗体的其它形式具有一个或多个(一个、两个、三个、四个、五个、六个)相对于原始抗体有所改变的CDR，也称为“来源于”原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。

重链和和轻链的每个可变区由三个互补决定区(CDR)(也是公知的超变区)连接起来的四个构架区(FR)组成。每条链的CDR通过FR紧密结合，与其它链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点。至少有两种技术确定CDR：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即Kabat等《Sequencesof Proteins of Immunological Interest》(第五版，1991，National Institutesof Health，Bethesda MD)；(2)基于抗原-抗体复合体的结晶学研究的方法(Chothia等，(1989)Nature 342：877)。如此处所使用的，CDR指通过一种方法或两种方法的组合而定义的CDR。

如此处所使用的，“人抗体”表示具有人产生的抗体相应部分氨基酸序列的抗体，和/或使用任一本领域公知或此处公开的制备人抗体的技术而制备的抗体。人抗体的定义包括包含至少一条人重链多肽或至少一条人轻链多肽的抗体。这样的一个实例是含有鼠轻链和人重链多肽的抗体。可使用本领域公知的多种技术产生人抗体。在一个实施方案中，人抗体从表达人抗体的噬菌体库(Vaughan等，1996，Nature Biotechnology，14：309-314；Sheets等，1998，PNAS，(USA)95：6157-6162；Hoogenboom和Winter，1991，J.Mol.Biol.，227：381；Marks等，1991，J.Mol.Biol.，222：581)中选择。也可通过将人类免疫球蛋白基因座引入转基因动物而制备人抗体，转基因动物例如已部分或完全失活内源性免疫球蛋白基因的小鼠。这种方法在美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016中已得到描述。作为备选，可通过无限增殖产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞来制备人抗体(这种B淋巴细胞可从个体中回收或体外进行免疫)。见，例如Cole等《单克隆抗体和癌症治疗》，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner等，1991，J.Immunol.，147(1)：86-95和美国专利号5,750,373。

“嵌合抗体”指重链和轻链中每条氨基酸序列的一部分与来源于特定物种或属于特定种类的抗体的相应序列同源、但链的其它片段与另一抗体的相应部分同源的那些抗体。通常，在这些嵌合抗体中，两条重链和轻链的可变区模拟来源于一种哺乳动物的抗体的可变区，而恒定区与来源于另一物种抗体的序列同源。这种嵌合型的一个明显的优点是，例如使用容易得到的杂交瘤或来自非人宿主机体的B细胞，可方便地从目前公知的来源中得到可变区，并与来源于如人细胞制剂的恒定区结合。可变区具有易于制备的优点，并且其特异性不受其来源的影响，当注射抗体时，人源的恒定区与来自非人来源的恒定区比，更不易引起人受试者的免疫反应。然而，本定义不限于这种特殊的实例。

“功能Fc区”具有至少一种天然序列Fc区的效应子功能。代表性的“效应子功能”包括C1q结合、补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)、吞噬、下调细胞表面受体(例如B细胞受体，BCR)等。这种效应子功能一般需要与结合结构域(如抗体可变结构域)联合的Fc区，并可使用多种本领域公知的评估这种抗体效应子功能的试验进行评估。

“天然序列Fc区”包含与自然界中发现的Fc区氨基酸序列相同的氨基酸序列。“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰而与天然序列Fc区不同，但仍保留至少一个天然序列Fc区的效应子功能的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区比较，变体Fc区具有至少一个氨基酸置换，例如在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中，约有一个至约十个氨基酸置换，优选地约一个至约五个氨基酸置换。此处的变体Fc区优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽Fc区具有至少约80％的序列同一性，最为优选的至少约90％的序列同一性，更为优选的至少约95％的序列同一性。

如此处使用的，“抗体依赖的细胞介导细胞毒性”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcRs)的非特异细胞毒细胞(例如自然杀伤细胞(NK)、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后导致靶细胞裂解。使用体外ADCC试验(如美国专利号5,500,362或5,821,337所描述的)可评估目标分子的ADCC活性。用于这类试验的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和NK细胞。作为备选、或此外，目标分子的ADCC活性可在体内进行评估，例如在Clynes等，1998，PNAS(USA)，95：652-656所公开的动物模型中评估。

如此处使用的，“人效应子细胞”指表达一个或多个FcR，并可执行效应子功能的白细胞。优选地，细胞至少表达FcγRIII，并可执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。可从天然来源(例如血或PBMC)中分离效应细胞。

如此处所使用的，“Fc受体”和“FcR”描述与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。此外，优选的FcR结合IgG抗体(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括等位基因变体和作为备选的这些受体的剪接。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有类似氨基酸序列，主要差别在它们的胞浆区。在Ravetch和Kinet，1991，Ann.Rev.Immunol.，9：457-92；Capel等，1994，Immunomethods，4：25-34和de Haas等，1995，J.Lab.Clin.Med.，126：330-41对FcR进行了综述。“FcR”也包括负责将母体IgG转移至胎儿的新生受体FcRn(Guyer等，1976，J.Immunol.，117：587和Kim等，1994，J.Immunol.，24：249)。

“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”指补体存在时靶细胞的裂解。补体激活途径通过补体系统的第一组分(C1q)与和关连抗原复合的分子(例如抗体)结合而激活。为评估补体激活，可进行如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods，202：163(1996)中所描述的CDC试验。

如此处使用的，“亲和力成熟的”抗体指在其一个或多个CDR中具有一个或多个改变的抗体，与没有改变的亲本抗体相比，改变使抗体对抗原的亲和力提高。优选的亲和力成熟抗体对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟抗体通过本领域公知的方法(Marks等，1992，Bio/Technology，10：779-783；Barbas等，1994，Proc Nat.Acad.Sci，USA91：3809-3813；Schier等，1995，Gene，169：147-155；Yelton等，1995，J.Immunol.，155：1994-2004；Jackson等，1995，J.Immunol.，154(7)：3310-9、Hawkins等，1992，J.Mol.Biol.，226：889-896)产生。

如此处使用的，抗体的“免疫特异性”结合指发生在抗体的抗原结合位点和抗体识别的特异抗原(即在ELISA或其它免疫测定中，抗体与该蛋白质反应，但不与可探测的无关蛋白质反应)之间的抗原特异结合的相互作用。

与抗体或多肽“特异结合”或“优先结合”(此处可交换使用)的表位是本领域充分理解的术语，测定这种特异或优先结合的方法也是本领域众所周知的。如果一种分子与特殊的细胞或底物的反应或结合与别的细胞或底物相比具有更长持续时间和/或更大亲和力、更为频繁、更为迅速，就认为该分子显示“特异结合”或“优先结合”。如果抗体与靶标与其它底物结合相比以更大的亲和力、亲合力、更容易和/或以更长持续时间结合，则抗体与靶标“特异性结合”或“优先结合”。例如，特异地或优先地与Aβ_1-40结合的抗体，与该抗体和其它Aβ_1-40表位或非-Aβ_1-40表位结合相比，是以更大亲和力、亲合力、更容易和/或以更长持续时间地与该表位结合的抗体。通过阅读本定义也可理解，例如特异或优先地与第一靶标结合的抗体(或部分或表位)可以或不可以特异或优先地与第二靶标结合。同样地，“特异结合”或“优先结合”不必需要(虽然包括)专一的结合。一般地，但并非必需，涉及的结合表示优先的结合。

如此处使用的，“多肽”包括蛋白质、蛋白质片段和肽，不管是从天然来源分离、通过重组技术产生、还是化学合成的。本发明的多肽通常包含至少约6个氨基酸。

如此处使用的，“载体”可在宿主细胞中传递并优选可表达一个或多个目的基因或序列的构建体。载体的实例包括(但不限于)病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子浓缩试剂相关的DNA或RNA表达载体、包裹在脂质体中的DNA或RNA表达载体和某些真核细胞(如生产细胞)。

如此处使用的，“表达控制序列”指指导核苷酸转录的核苷酸序列。表达控制序列可以是启动子如组成型或诱导型启动子、或增强子。表达控制序列与待转录的核苷酸序列有效连接。

如此处使用的，“核酸”或“多核苷酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核苷酸多聚体，除非有其它方面的限制，还包括与天然存在核苷酸类似的方式与核苷酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。

如此处使用的，“可药用的载体”包括当与活性成分组合时，允许该成分保留其生物学活性，并且不与受试者的免疫系统反应的任何物质。实例包括(但不限于)任何标准的药物载体，如磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂(如油/水乳剂)和多种润湿剂。气溶胶或肠胃外给药的优选稀释剂是磷酸缓冲盐或生理盐水(0.9％)。

通过众所周知的常规方法(参见，例如《Remington′s PharmaceuticalSciences》第18版，A.Gennaro编，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990和Remington《The Science and Practice of Pharmacy》第20版.MackPublishing，2000)配制包含这种载体的组合物。

如此处使用的，“佐剂”包括通常在本领域用来促进免疫应答的那些佐剂。佐剂的实例包括(但不限于)辅助肽、铝盐(如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝)、弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)、Merck佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)、AS-2(Smith-Kline Beecham)、QS-21(Aquilla Biopharmaceuticals)、MPL或3d-MPL(Corixa Corporation，Hamilton，MT)、LEIF、钙、铁或锌盐、酰化酪氨酸的不溶悬液、酰化蔗糖、阳离子或阴离子衍生的多糖、聚偶磷氮(polyphosphazene)、可生物降解的微球、单磷脂酰类脂A和quilA、胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺、或免疫刺激复合体，包括细胞因子(例如GM-CSF或白介素-2、-7或-12)和免疫刺激DNA序列。在一些实施方案中，如使用多核苷酸疫苗时，可通过编码佐剂的多核苷酸提供如辅助多肽或细胞因子之类的佐剂。

如此处使用的，“有效剂量”或“有效量”的药物、化合物或药物组合物是足够达到有利或所需结果的量。对于预防性用途，有利或需要的结果包括这样的结果，如消除或降低风险、减轻严重性、或延缓疾病的起始，包括疾病的生物化学的、组织学的和/或行为的征兆、其病发症和疾病发展过程中出现的过渡病理表型。对于治疗性用途，有利或需要的结果包括这样的临床结果，如抑制或压制淀粉状蛋白斑的形成、减少、移去、或清除淀粉状蛋白斑、提高识别或逆转认知的下降、隔离在生物液体中循环的可溶Aβ肽、减弱一个或多个该疾病导致的(生物化学、组织学和/或行为学的)症状，包括其病发症和疾病发展过程中出现的过渡病理表型、提高那些患有该疾病的患者的生存质量、减少治疗该疾病需要的其它药物的剂量、增强其它药物的效果、延缓疾病的进程和/或延长病人的生存期。有效剂量可通过一次或多次给药而进行施用。为本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足够直接或间接实现预防性或治疗性治疗的量。如临床语义中所理解的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可以是或可以不是与另外的药物、化合物或药物组合物协力而实现的。因此，可按施用一种或多种治疗性试剂的语义考虑“有效剂量”，并且如果与一种或多种其它试剂协力可能或能够实现所需结果，可考虑给予有效量的单一试剂。

如此处使用的，“治疗”是获得有利或所需结果(包括临床结果)的方法。为本发明的目的，有利或预想的临床结果包括(但不限于)下列各项中的一项或多项：抑制或压制淀粉状蛋白斑的形成、抑制或压制淀粉状蛋白斑的形成、减少、移去、或清除淀粉状蛋白斑、提高识别或逆转认知的下降、隔离在生物液体中循环的可溶Aβ肽、减少组织(如脑)中的Aβ肽(包括可溶的和沉淀的)、抑制和/或减少脑中Aβ肽的积累、抑制和/或减少组织(如脑)中Aβ肽的毒性作用、减弱由该疾病引起的症状、提高那些患有该疾病的患者的生存质量、减少治疗该疾病需要的其它药物的剂量、延缓疾病的进程和/或延长病人的生存期。

如此处使用的，“延缓”阿尔茨海默氏病的发展指推迟、阻碍、减缓、延迟、稳定和/或搁置该疾病的发展。这种延缓的时间长度不同，依赖于病史和/或治疗的个体。如对本领域技术人员很明显的，足够或显著的延缓实际上包括预防，因为个体尚未发展成为疾病。与不使用此方法相比，“延缓”阿尔茨海默氏病发展的方法是在给定时间范围降低疾病发展的可能性和/或在给定的时间范围降低疾病程度的方法。这种比较通常基于使用具有统计学显著意义的受试者数量的临床研究。

阿尔茨海默氏病的“发展”指个体阿尔茨海默氏病的发作和/或进程。使用此处所述的标准临床技术可检测阿尔茨海默氏病的发展。然而，发展也指最初不能检测到的疾病进程。为本发明的目的，进程指疾病状态的生物学过程，如通过标准的神经系统检查或病人会诊确定，或通过更专业的测试而可以确定的情况。各种这类诊断性测试包括(但不限于)神经影像(neurorimaging)、检测血清或脑脊液中特异蛋白质(例如淀粉状肽和Tau)水平的改变、计算机体层摄影(CT)和磁共振成象(MRI)。“发展”包括发生、复发和发病。如此处使用的，阿尔茨海默氏病的“发病”或“发生”包括起始发病和/或复发。

如此处使用的，“处于危险中的”个体是有发展为阿尔茨海默氏病的危险的个体。处于危险中的个体可能具有也可能不具有可检测到的疾病，并且在此处所述的治疗方法之前，可能已经显示出，也可能没有显示出可检测到的疾病。“处于危险中”表示个体具有一项或多项所谓的危险因素，它们是可测量的与阿尔茨海默氏病发展有关的参数。具有一项或多项这种危险因素的个体与没有这些危险因素的个体相比，发展为阿尔茨海默氏病的可能性更大。这些危险因素包括(但不限于)年龄、型别、种族、饮食、之前病史、先兆疾病的出现、基因(即遗传)因素和环境暴露。

除非另有说明，如此处使用的，“一”或“一”表示至少一个。

抗体

本发明提供与Aβ肽(SEQ ID NO：1)结合的经分离的单克隆抗体(包括本发明的人、人源化或嵌合抗体)。更具体地，提供与Aβ肽的1-16、16-28或28-40位氨基酸结合的抗体。在一些实施方案中，抗体优先与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合。与包含SEQ IDNO：11-40位氨基酸的Aβ肽结合，但不与包含SEQ ID NO：11-38位氨基酸的Aβ肽结合(如本领域技术人员所了解的，非显著地结合)的抗体，是优先与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合的抗体。在一些实施方案中，抗体与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)36-40位氨基酸的表位结合。在一些实施方案中，抗体与Aβ肽(SEQ ID NO：1)28-40位氨基酸结合的亲和力约为200nM或更小、60nM或更小、30nM或更小、3nM或更小、或者1nM或更小。在一些实施方案中，抗体优先与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合的亲和力约为60nM或更小、30nM或更小、3nM或更小。在一些实施方案中，抗体优先与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合的亲和力约为3nM或更小。优选地，抗体竞争地抑制具有SEQ ID NO：4、6、8和/或10所示的氨基酸序列的单克隆抗体的结合、或竞争地抑制命名为8A1.2A1、3C6.1F9或10B10.2E6的杂交瘤产生的单克隆抗体的结合。在一些实施方案中，单克隆抗体与Aβ肽结合的亲和力约为60nM或更小、优选的约为30nM或更小、以及更为优选的约为3nM或更小。在优选的实施方案中，抗体与具有SEQ ID NO：4、6、8和/或10所示的氨基酸序列的单克隆抗体、或由命名为8A1.2A1、3C6.1F9或10B10.2E6的杂交瘤产生的单克隆抗体结合相同的Aβ表位。单克隆抗体可任选地与治疗剂缀合和/或用可检测的标记物进行标记。

在一些实施方案中以及如此处所述(本领域所公知的)，使用抗体相应的Fab片段测量亲和力。

此外，本发明提供与βAPP(SEQ ID NO：2)结合，并竞争地抑制命名为25E12.1 F9.1H8(BP26)、24H4.2E10.1F5(BP27)、1F10.8E6.2A2(BP80)、13E12.1C5(BP81)或14D9.1G8(BP82)的杂交瘤所产生单克隆抗体的结合的经分离单克隆抗体。

另一方面，本发明提供来源于单克隆抗体的人源化抗体，其中单克隆抗体具有SEQ ID NO：4和/或6所示氨基酸序列，或由命名为8A1.2A1的杂交瘤产生。抗体的人源化形式可能具有或可能不具有与衍生出它的单克隆抗体相同的CDR。本领域技术工作人员熟悉CDR区的确定。在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个CDR的抗体，该CDR与至少一个CDR、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个衍生出它的单克隆抗体(或在一些实施方案中，与单克隆抗体的所有六个CDR基本同源，或来源于单克隆抗体)的CDR基本同源。其它实施方案包括具有至少两个、三个、四个、五个或六个与单克隆抗体的至少两个、三个、四个、五个或六个基CDR同源，或来源于单克隆抗体的CDR的抗体。就本发明的意图而言，可以理解的是，一般保留了结合特异性和/或全部活性(可以根据Aβ沉淀的清除)，虽然与命名为8A1.2A1的杂交瘤产生的单克隆抗体相比，活性范围可能会改变。本发明也提供制备任何这些抗体的方法。制备抗体的方法是本领域公知的，并且在此处有所描述。

通过识别相同或空间重叠表位，可使用竞争试验确定两个抗体是否与相同的表位结合。通常，将抗原固定于多孔板，并且测量未标记抗体阻断标记抗体的结合的能力。用于这种竞争试验的通用标记是放射性标记或酶标记。

测定抗体与Aβ肽的亲合力的一种方法是测量抗体单功能Fab片段的亲和力。为获得单功能Fab片段，抗体，例如可用木瓜蛋白酶切割IgG或重组表达。单克隆抗体的抗Aβ Fab片段的亲和力可通过表面胞质共振系统(Surface Plasmon Resonemce)(SPR)(BIAcore 3000TM，BIAcore，Inc.，Piscaway，NJ)测定。根据厂商的说明使用SA芯片(链亲和素)。生物素化的Aβ肽1-40(SEQ ID NO：1)可稀释于HBS-EP(100mM HEPES pH7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％P20)，并以0.005mg/mL的浓度注射到芯片上。在每个芯片通道上使用可变的流动时间，可达到两种范围的抗原密度：用于详细的动力学研究的10-20反应单位(RU)，以及用于浓度的500-600RU。再生研究显示，Pierce洗脱缓冲液和4M NaCl的混合物(2∶1)可有效移去结合的Fab，而在200次以上的注射后仍保留芯片上Aβ肽的活性。对所有BIAcore试验，可将HBS-EP缓冲液作为电泳缓冲液使用。系列稀释(0.1-10x估计的KD)的纯化Fab样品以100μL/min注射2分钟，并且允许30h min的解离时间。使用已知浓度的Fab标准品(通过氨基酸分析确定)，Fab蛋白质的浓度可通过ELISA和/或SDS-PAGE电泳确定。使用BIA评价程序，通过使数据符合1∶1朗谬尔(Langmuir)结合模型(Lofas & Johnsson，1990)而同时获得动力学结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)值以koff/kon计算。

本发明提供单体、双体和多价体形式的抗体。例如，可使用此处公开的抗体制备双特异性抗体、对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。制备双特异性抗体的方法是本领域公知的(参见，例如Suresh等，1986，Methods in Enzymology 121：210)。传统上，双特异性抗体的重组产物是基于共表达两种免疫球蛋白的重链-轻链对，而这两种重链具有不同的特异性(Millstein和Cuello，1983，Nature305，537-539)。

根据制备双特异性抗体的一种方法，将具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)融合至免疫球蛋白恒定结构域序列。优选与包含至少部分铰合部、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区结构域融合。优选在至少一个融合中具有包含轻链结合所必须的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合和免疫球蛋白轻链(如果需要)的DNA插入单独的表达载体，并且共转染进入合适的宿主生物。当构建中使用的不同比例的三种多肽链提供最佳产量时，这为调节实施方案中三种多肽片段的突变比例提供了极大的灵活性。然而，当至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时，或当比例不是特别重要时，可以将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。

在一种方法中，双特异性抗体由在一个臂中的具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链和在另一个臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。这种免疫球蛋白轻链仅为双特异性分子的一半的非对称结构，便于从不需要的免疫球蛋白链的组合中分离所需的双特异性化合物。公布于1994年3月3日的PCT公开号WO94/04690描述了本方法。

包含两个共价连接抗体的异源缀合抗体也属于本发明的范围。这种抗体已经用于将免疫系统细胞靶向不必要的细胞(美国专利号4,676,980)，以及用于HIV感染的治疗(PCT申请公开号WO91/00360和WO92/200373、EP03089)。可使用任一方便的交联方法制备异源缀合抗体。合适的交联剂和技术是本领域众所周知的，并且在美国专利号4,676,980中有所描述。

在某些实施方案中，免疫反应性分子是抗体片段。已经发展了多种技术以产生抗体片段。这些片段可通过蛋白水解消化完整抗体(参见，例如Morimoto等，1992，J.Biochem.Biophys.Methods 24：107-117和Brennan等，1985，Science 229：81)来获得，或直接通过重组宿主细胞产生。例如，Fab′-SH片段可直接从大肠杆菌中回收，并通过化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter等，1992，Bio/Technology 10：163-167)。在另一个实施方案中，使用亮氨酸拉链GCN4促进F(ab′)2分子的装配以形成F(ab′)2。根据另一种方法，直接从重组宿主细胞培养物中分离Fv、Fab或F(ab′)2。

可以以药物组合物的形式提供本发明的单克隆抗体，任选连同载体。

抗体也可包埋在微囊里，例如通过凝聚技术、或界面聚合(例如分别是羟甲基纤维素或明胶剂-微囊和poly(methylmethacylate)微囊)、在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米胶囊)中、或在巨乳剂(marcoemulsion)中制备。这种技术在《Remington′sPharmaceutical Sciences》第18版，A.Gennaro编，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990和Remington《The Science and Practice of Pharmacy》第20版.Mack Publishing，2000中已经公开。如美国专利5,739,277所描述的，为增加抗体的血清半衰期，可将补救受体(salvage receptor)结合表位整合入抗体(尤其是抗体片段)。如此处使用的，术语“补救受体结合表位”指负责提高体内IgG分子血清半衰期的IgG分子(例如IgG1，IgG2，IgG3，or IgG4)Fc区的表位。

此处公开的抗体也可配制成免疫脂质体。包含抗体的脂质体通过本领域公知的方法制备，如Epstein等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688、Hwang等，1980，Proc.Natl Acad.Sci.USA 77：4030和美国专利号4,485,045和4,544,545中所描述的方法。具有循环时增加的脂质体公开于美国专利号5,013,556。使用含有磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物，通过反向蒸发方法可产生极为有用的脂质体。将脂质体挤过确定孔径的过滤器以产生具有所需直径的脂质体。此外，通过二硫互换反应，可将本发明抗体的Fab′片段缀合至Martin等，1982，J.Biol.Chem.257：286-288所述的脂质体。

在一些实施方案中，本发明的抗体是单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白质、人源化抗体、嵌合抗体、双功能(diabody)线性抗体、单链抗体以及免疫球蛋白分子的任一修饰构型。

抗体的产生

可使用杂交瘤方法(如Kohler和Milstein，1975，Nature 256：495所述的那些方法)制备单克隆抗体。在杂交瘤方法中，通常用免疫试剂免疫小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物，以引起产生或可产生特异地与该免疫原结合的抗体的淋巴细胞。作为备选，可在体外免疫淋巴细胞。

单克隆抗体也可通过重组DNA方法(如美国专利号4,816,567中所述的那些方法)制备。使用常规方法分离并测序编码单克隆抗体的DNA，如使用可特异地与编码单克隆抗体重链和轻链的基因结合的多核苷酸探针。DNA一旦被分离，将其置入表达载体，然后将载体转染进宿主细胞(如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白蛋白质的骨髓瘤细胞)以在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。

例如，通过将非免疫球蛋白多肽的全部式部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价连接，可对此DNA进行修饰。具有此处所述单克隆抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂交”抗体以此种方式制备。通常，将这种非免疫球蛋白多肽替换本发明抗体的恒定结构域或本发明抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生嵌合双价抗体，这种嵌合双价抗体包含一个对Aβ(或βAPP)的表面表位具有特异性的抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一抗原结合位点。

本发明也包括人源化抗体。治疗性抗体常常引发副作用，部分是由于引起了针对施用抗体的免疫反应。这可导致药物效能降低、排斥具有靶抗原的细胞以及引起不需要的炎症应答。为避免上述问题，产生了重组的抗Aβ人源化抗体。抗体的多核苷酸序列(如SEQ ID NO：3和/或5)可用于基因操作，以产生“人源化”抗体，或提高抗体的亲和力或其它特性。抗体人源化的普遍原理包括，保留抗体抗原结合部分的基本序列，而用人抗体序列交换抗体的非人剩余部分。人源化单克隆抗体有四个一般步骤。它们是：(1)测定起始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸序列和预测的氨基酸序列；(2)设计人源化抗体，即决定在人源化过程中使用的抗体构架区；(3)有效的人源化方法/技术；和(4)人源化抗体的转染和表达。例如，如果抗体用于临床试验和人类的治疗，可将恒定区可改造得更像人恒定区，以避免免疫反应。参见，例如美国专利号5,997,867和5,866,692。

在重组人源化抗体中，可修饰Fcγ部分，以避免与Fcγ受体和补体免疫系统相互作用。剑桥大学病理学系的Mike Clark博士设计了这种修饰，并且在1999年11月18日公布的WO99/58572中描述了制备这种抗体的技术。

已有对于若干包含来源于非人免疫球蛋白的抗原结合位点的“人源化”抗体的描述，包括具有啮齿类动物V区和它们的与人恒定结构域融合的相关互补决定区(CDR)的嵌合抗体。参见，例如Winter等，Nature 349：293-299(1991)；Lobuglio等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：4220-4224(1989)、Shaw等，J Immunol.138：4534-4538(1987)和Brown等.CancerRes.47：3577-3583(1987)。其它参考文献描述了啮齿类动物CDR在融合至合适的人抗体恒定结构域之前，移植进人支持构架区(FR)。参见，例如Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988)和Jones等，Nature 321：522-525(1986)。另一篇参考文献描述了由重组拼接(veneer)的啮齿类构架区支持的啮齿类CDR。参见，例如欧洲专利公开号519,596。这些“人源化”分子是设计来将针对啮齿类抗人的抗体分子的有害免疫反应降至最低，这些免疫反应限制治疗药物在人受者中治疗应用的持续时间和有效性。还可利用的其它人源化抗体的方法公开于Daugherty等，Nucl.Acids Res.，19：2471-2476(1991)和美国专利号6,180,377、6,054,297、5,997,867、5,866,692、6,210,671、6,350,861和PCT WO01/27160中公开。

然而，在另一个备选方案中，通过使用商业上获得的、已被改造来表达特异人免疫球蛋白蛋白质的小鼠，可获得完全的人抗体。设计来产生更合意的(例如，完全人抗体)、或更强免疫反应的转基因动物，也可用于产生人源化或人抗体。这种技术的实例是Abgenix公司(Fremont，CA)的Xenomouse^TM与Medarex公司(Princeton，NJ)的HuMAb-Mouse&commat和TC Mouse^TM。

在另一个备选方案中，通过噬菌体展示技术，可重组制备抗体。参见，例如美国专利号5,565,332、5,580,717、5,733,743和6,265,150以及Winter等，Annu.Rev.Immunol.12：433-455(1994)。作为备选，噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature 348：552-553(1990))可用于在体外从未免疫供者的免疫球蛋白可变(V)结构域基因的所有组成成分中产生人抗体和抗体片段。根据这种技术，将抗体V结构域基因按阅读框克隆进丝状噬菌体(如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因，并且以功能性抗体片段在噬菌体颗粒的表面进行展示。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能性特征的选择，也导致编码显示那些特征的抗体的基因的选择。因此，噬菌体模拟了B细胞的一些特征。可以按多种形式实施噬菌体展示，综述参见，例如Johnson，Kevin S和Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3，564-571(1993)。若干V-基因片段来源可用于噬菌体展示。Clackson等，Nature 352：624-628(1991)从来源于免疫鼠的脾的v基因小随机组合文库中分离了一批不同的抗唑酮抗体。按照Mark等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith等，EMBOJ.12：725-734(1993)所述的技术，可构建来源于未免疫人供者的V基因的所有组成成分，并基本上分离针对抗原(包括自体抗原)的一批不同的抗体。在天然的免疫反应中，抗体基因以高速率积累突变(体细胞高变)。在随后的抗原攻击期间，引入的一些变化将赋予更高的亲和力，并且展示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞优先得到复制和分化。通过采用已知为“链改组(chain shuffling)”的技术(Marks等，Bio/Technol.10：779-783(1992))，可模拟这种天然过程。在这种方法中，可通过用从未免疫供者获得的V结构域基因的天然发生的变体(所有组成成分)的所有组成成分依次置换重链和轻链V区基因提高通过噬菌体展示获得的“主要”人抗体的亲和力。这种技术得以产生亲和力在pM-nM范围的抗体和抗体片段。Waterhouse等，Nucl.Acids Res.21：2265-2266(1993)已经描述了制备特大的噬菌体抗体所有组成成分(也已知为“一切根源(mather-of-all)的库”)的策略。基因改组(gene shuffling)也用于从啮齿类抗体中衍生人抗体，其中人抗体与起始的啮齿类抗体具有相似的亲和力和特异性。根据这种也称为“表位印记”(epitope imprinting)的方法，用人V结构域基因的所有组成成分置换通过噬菌体展示技术获得的啮齿类抗体的重链或轻链V结构域基因，以创造啮齿类-人嵌合体。对抗原的选择导致可修补功能性抗原结合位点的人可变区的分离，即表位支配(印记)配偶体的选择。当为置换剩余的啮齿类动物V结构域而重复本过程时，获得了人抗体(参见公布于1993年四月1日的PCT专利申请PCT WO 9306213)。与传统的通过CDR嫁接来人源化对啮齿类抗体不同，这种技术提供了无啮齿类动物来源的框架或CDR残基的完全人源化抗体。明显地，虽然以上讨论涉及人源化抗体，但是所讨论的普遍原理可应用于定制用于狗、猫、灵长类动物、马和牛的抗体。

使用合成蛋白质化学的已知方法(包括那些涉及交联试剂的方法)也可制备嵌合的或杂合的抗体。例如，使用二硫交换反应或通过形成硫醚键，可构建免疫毒素。用于这种目的的合适试剂的实例包括亚氨硫醇化物和4-巯基丁亚胺酸甲酯。

也可产生单链Fv片段，如Iliades等，1997，FEBS Letters，409：437-441中所述。在Kortt等，1997，Protein Engineering，10：423-433中描述了使用多种连接肽偶联这种单链片段。重组产生和操作抗体的多种技术是本领域众所周知的。

变体和经修饰的免疫反应性多肽和抗体

本发明也提供包含本发明抗体氨基酸序列的多肽，所述抗体如具有SEQ ID NO：4和/或6所示氨基酸序列的单克隆抗体、或由命名为8A1.2A1的杂交瘤产生的单克隆抗体。此处所述的免疫活性多肽可用于此处所述的任一组合物、试剂盒和方法。多肽具有此处所述的一种或多种结合特性，并且在一些实施方案中，展示任何一个或多个此处所述的额外功能性特征。在一些实施方案中，多肽包含一个或多个单克隆抗体的轻链和/或重链可变区。在一些实施方案中，多肽包含一个或多个(一个、二个、三个、四个、五个或六个)单克隆抗体的轻链和/或重链CDR。在一些实施方案中，多肽包含单克隆抗体的轻链和/或重链的三个CDR。在一些实施方案中，多肽包含的单克隆抗体的氨基酸序列具有下述任一项：具有该单克隆抗体序列的至少5个连续的氨基酸、至少8个连续的氨基酸、至少约10个连续的氨基酸、至少约15个连续的氨基酸、至少约20个连续的氨基酸、至少约25个连续的氨基酸、至少约30个连续的氨基酸，其中至少3个氨基酸来自于该单克隆抗体的可变区。在一个实施方案中，可变区来自于单克隆抗体的轻链。在另一个实施方案中，可变区来自于单克隆抗体的重链。在另一个实施方案中，5个(或更多)连续的氨基酸来自于单克隆抗体的互补决定区(CDR)。

如此处使用的，多肽“变体”是以一个或多个置换、缺失、添加和/或插入而不同于天然蛋白的多肽，以致多肽的免疫反应性基本上不降低。换言之，与天然蛋白质相比，变体特异地结合抗原的能力可能增强或无变化，或与天然蛋白质相比，减少小于50％，优选的小于20％。多肽变体与鉴定的多肽相比，优选显示至少约80％，更为优选至少约90％和最为优选至少约95％同一性(如此处所述进行确定)。

通过在抗体DNA中引入合适的核苷酸变化、或通过肽合成制备抗体的氨基酸序列变体。这些变体包括，例如此处所述SEQ ID NO：4、6或8的氨基酸序列中缺失和/或插入和/置换残基。为了最终的构建子具有所需的特征，可使用缺失、插入和置换的任一组合获得最终的构建子。氨基酸变化也可能改变抗体的翻译后加工，如改变糖基化位点的数目和位置。

用于鉴定作为诱变优选位置的抗体的某些残基或区域的方法是所谓的“丙氨酸扫描诱变”，并且在Cunningham和Wells，1989，Science，244：1081-1085中有所描述。鉴定了残基或靶残基群体(例如带电荷的残基，如arg、asp、his、lys和glu)，并且用中性或带负电的氨基酸(最为优选的是丙氨酸或多丙氨酸)置换，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后，通过在或对置换位点引入另外或其它的变体，精确确定表现出对置换具有功能敏感性的那些氨基酸位置。因此，当预先确定引入氨基酸序列变体的位点时，不需预先确定突变本身的特性。例如，为了分析给定位点突变的效果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并筛选所表达的抗体变体，以获得所需活性。

氨基酸序列插入物包括长度为一个残基至含有数百或更多残基的多肽的氨基和/或羧基端融合物，以及一个或多个氨基酸残基序列内插入物。末端插入物的实例包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体、或与表位标签融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括与酶或多肽的抗体的N或C端融合物，所述融合物增加抗体的血清半衰期。

置换变体在抗体分子中移去至少一个氨基酸残基，并且在其位置插入一个不同的残基。置换诱变最感兴趣位点包括超变区，但也考虑FR改变。保守置换如表1所示，标题为“优选的置换”。如果这种置换导致生物活性的改变，则可引入表1中命名为“代表性置换”的，或如下参考氨基酸类型进一步描述的更多实质改变，并且筛选表达产物。

表1：保守置换

最初残基	优选的置换	示例的置换
			Ala(A)	Val	Val、Leu、Ile
Arg(R)	Lvs	Lys、Gln、Asn
			Asn(N)	Gln	Gln、His、Asp、Lys、Arg
Asp(D)	Glu	Glu、Asn
			Cys(C)	Ser	Ser、Ala
Gln(Q)	Asn	Asn、Glu
			Glu(E)	Asp	Asp、Gln
Gly(G)	Ala	Ala
			His(H)	Arg	Asn、Gln、Lys、Arg
Ile(I)	Leu	Leu、Val、Met、Ala、Phe、正亮氨酸
			Leu(L)	Ile	正亮氨酸、Ile、Val、Met、Ala、Phe
Lys(K)	Arg	Arg、Gln、Asn
			Met(M)	Leu	Leu、Phe、Ile
Phe(F)	Tyr	Leu、Val、Ile、Ala、Tyr
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr	Tyr、Phe
			Tyr(Y)	Phe	Trp、Phe、Th、Ser
Val(V)	Leu	Ile、Leu、Met、Phe、Ala、正亮氨酸

通过选择在维持(a)置换区的多肽主链结构，例如折叠或螺旋构象；(b)靶位点上分子的电荷和疏水性；或(c)侧链体积的效果上显著不同的置换，可实现抗体生物学特征的实质修饰。基于一般的侧链特征，将自然存在的残基分为如下几组：(1)疏水性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；(2)中性亲水的：Cys，Ser，Thr；(3)酸性的：Asp，Glu；(4)碱性的：Asn，Gln，His，Lys，Arg；(5)影响链的取向的残基：Gly，Pro；和(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。

将这些组中一个组的成员与另一个组的成员交换，造成非保守置换。

也可置换任何与维持抗体的正确构象无关的半胱氨酸残基，一般用丝氨酸，以提高分子的氧化稳定性，并避免异常交联。相反地，可将半胱氨酸键添加至抗体中，以提高其稳定性，尤其当抗体是抗体片段(如Fv片段)时。

特别优选的置换变体类型包含置换亲本抗体的一个或多个超变区残基。一般地，选择进行进一步发展的所得变体与产生它的亲本抗体相比将具有提高的生物学特征。

最优选的是如1999年11月18日公布的WO 99/58572所述进行修饰的抗体。除针对靶分子的结合结构域以外，这些抗体包含具有与人免疫球蛋白重链恒定结构域的全部或部分基本同源的氨基酸序列的效应子结构域。这些抗体可与靶分子结合，而不启动显著的补体依赖的裂解，或对靶的细胞介导的破坏。优选地，效应子结构域可特异性结合FcRn和/或FcγRIIb。这些通常基于来源于两个或多个人免疫球蛋白重链CH2结构域的嵌合结构域。以这种方式修饰的抗体优选用于长期的抗体治疗，以避免常规抗体治疗的炎症和其它副作用。

抗体的糖基化变体是改变抗体糖基化模式的变体。“改变”表示缺失一个或多个发现于抗体的碳水化物部分、添加一个或多个碳水化物部分至抗体、改变糖基化的组合(糖基化模式)、扩大糖基化等。可通过例如在编码抗体的核酸序列中移去、改变和/或添加一个或多个糖基化位点而制备糖基化变体。

抗体在其恒定区的保守位置被糖基化(Jefferis和Lund，1997，Chem.Immunol.65：111-128；Wright和Morrison，1997，TibTECH 15：26-32)。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白质的功能(Boyd等，1996，Mol.Immunol.32：1311-1318；Wittwe和Howard，1990，Biochem.29：4175-4180)和糖蛋白部分之间的分子内相互作用，此分子内相互作用能影响糖蛋白的构象和所呈现的三维表面(Hefferis和Lund，见上文；Wyss和Wagner，1996，CurrentOpin.Biotech.7：409-416)。基于特定的识别结构，寡糖也用于将给定的糖蛋白靶向某些分子。已有报导，抗体的糖基化影响抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。具体地，已报导具有四环素调节表达的β(1，4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII)(催化等分GlcNAc形成的糖基转移酶)的CHO细胞具有提高的ADCC活性(Umana等，1999，Mature Biotech.17：176-180)。

抗体的糖基化通常是N-连接或O-连接。N-连接指碳水化物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列——天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸——是将碳水化物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列，其中X是除脯氨酸外的任一氨基酸。因此，多肽中这些三肽序列二者之一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将N-乙酰氨基半乳糖、半乳糖或木糖中的一个连接至羟氨基酸，虽然也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸，但最为常见的是连接至丝氨酸或苏氨酸。

通常，通过改变氨基酸序列，以使其含有一个或多个上述的三肽序列(N-连接的糖基化位点)，实现了将糖基化位点添加至抗体。改变也可以是添加或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸至原始抗体的序列中(O-连接的糖基化位点)。

可通过多种本领域公知的方法制备编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括(但不限于)从天然源中分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况下)或通过对早期制备的变体或抗体的非变体版本进行寡核苷酸介导(定点)的诱变、PCR诱变和盒式诱变而制备。

也可不经改变基本的核苷酸序列而改变抗体的糖基化模式。糖基化很大程度上依赖于用于表达抗体的宿主细胞。因为用于表达作为潜在治疗剂的重组糖蛋白(例如抗体)的细胞型极少是天然细胞，可预期抗体糖基化模式的改变(参见，例如Hse等，1997，J.Biol.Chem.272：9062-9070)。

除了宿主细胞的选择外，在重组产生抗体期间影响糖基化的因素包括生长方式、培养基制剂、培养密度、氧合、pH、纯化方案等。已提出多种在特殊宿主生物内实现改变糖基化模式的方法，包括引入或过量表达与涉及寡糖产生的某些酶(美国专利号5,047,335、5,510,261和5,278,299)。糖基化或糖基化的某些类型可从糖蛋白中经酶促移去，例如使用内切糖苷酶H(Endo H)。此外，重组宿主细胞可在遗传上改造为对某些类型的多糖加工存在缺陷。这些和类似的技术是本领域众所周知的。

多肽包含蛋白质N-末端的信号(或前导)序列，其中信号序列在翻译时或翻译后介导蛋白质的转移。为易于合成、纯化或鉴定多肽(例如poly-FE)、或为增强多肽与固相支持剂的结合，可将多肽与接头或其它序列缀合。例如，可将多肽与免疫球蛋白Fc区缀合。

也可通过合成的方式，使用本领域普通技术人员所众所周知的技术产生具有少于约100个氨基酸、一般地约50个氨基酸的部分和其它变体。例如，使用任一可商业获得的固相技术，如将氨基酸连续地添加至生长的氨基酸链的Merrifield固相合成方法，可合成这种多肽。参见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2146，1963。可从供应商(如PerkinElmer/Applied BioSystems Division(Foster City，CA))商业获得自动化合成多肽的设备，并且可根据制造商的说明书进行操作。

使用具有HPTU(O-苯并三唑N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸)(O-Benzotriazole N，N，N’，N’-tetramethyluronium hexafluorophosphate)激活的FMOC化学，可在Perkin Elmer/Applied Biosystems Division 430A肽合成仪上合成多肽。可将Gly-Cys-Gly序列添加至多肽的氨基端，以提供结合至固定表面的缀合或标记多肽的方法。使用三氟乙酸∶乙基硫醇∶苯甲硫醚∶水∶苯酚(40∶1∶2∶2∶3)的切割混合物，可将多肽从固相支持体上切下。切割2小时后，在冷甲基叔丁基醚中沉淀多肽。然后，将沉淀的肽溶于含有0.1％三氟乙酸(TFA)的水中，并且在C18反相HPLC纯化之前冻干。可使用溶于水中的0％-60％乙腈(含0.1％TFA)梯度洗脱肽。纯化级分被冻干后，可使用电喷射或其它类型的质谱分析，并通过氨基酸分析，表述多肽的特征。

融合蛋白质

在一些实施方案中，多肽是包含此处所述的多个多肽、或包含至少一个此处所述多肽和无关序列的融合蛋白质。可添加另外的融合配偶体(fusion partner)。

融合配偶体，可作为例如免疫融合配偶体，协助提供T辅助表位，优选的人识别的T辅助表位。如另一个实例，融合配偶体可作为表达增强子，协助以比天然重组蛋白质更高的产量表达蛋白质。某些优选的融合配偶体同时是免疫和表达增强融合配偶体。可选择其它融合配偶体，以增强蛋白质的可溶性或将蛋白质靶向希望的胞内区室。进一步的融合配偶体还包括便于蛋白质纯化的亲和标记物。

一般使用标准技术(包括化学缀合)制备融合蛋白质。优选地，融合蛋白质作为重组蛋白质在表达系统中表达，与非融合蛋白质相比，这提高生产的水平。简要地，编码多肽元件的DNA序列可独立装配，并连入合适的表达载体。在具有或不具有肽连接体的条件下，编码一个多肽元件的DNA序列的3′端被连接到编码第二个多肽元件的DNA序列的5′端，以使序列的读码框同相。这允许翻译成同时保留两种多肽元件的生物活性的单一融合蛋白质。

可利用肽连接体序列将第一和第二多肽元件分开一定的距离，分开的距离足以确保每种多肽可折叠成其二级和三级结构。使用本领域众所周知的标准技术，将这种多肽连接体序列整合入融合蛋白质。选择合适的肽连接体可基于下述因素：(1)采用灵活的可延伸构象的能力；(2)没有采用可与第一和第二多肽上的功能表位相互作用的二级结构的能力；和(3)缺乏可与多肽功能表位反应的疏水或带电荷残基。优选的肽连接体含Gly、Asn和Ser残基。其它近中性氨基酸(如Thr和Ala)也可用于连接体序列。可有效地用作连接体的氨基酸序列包括Maratea等，Gene 40：39-46，1985；Murphy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8258-8262，1986；美国专利号4,935,233和4,751,180中所公开的序列。连接体序列长度一般为1-50氨基酸。当第一和第二多肽具有可用于分离功能结构域并且可阻止空间干扰的非必需N端氨基酸区时，连接体序列并非必需。

连接的DNA序列与合适的转录或翻译调控元件有效连接。负责DNA表达的调控元件位于编码第一多肽的DNA序列的5’端。类似地，终止翻译所需的终止密码子和转录终止信号出现于编码第二或最终多肽的DNA序列的3’端。

也提供包含本发明多肽以及无关免疫原性蛋白质的融合蛋白质。优选地，免疫原性蛋白质可引发记忆应答。这种蛋白质的实例包括破伤风、结核和肝炎蛋白质(参见，例如Stoute等，1997，New Engl.J.Med.336：86-91)。

在优选的实施方案中，免疫融合配偶体来源于蛋白质D--革兰氏阴性细菌流感嗜血菌B(WO 91/18926)的表面蛋白。优选地，蛋白质D衍生物包含约蛋白质的前三分之一(例如N端前100-110氨基酸)，并且蛋白质D衍生物可以被脂化。在某些优选的实施方案中，N-端包括脂蛋白D融合配偶体的前109个残基，以提供具有额外的外源T-细胞表位的多肽，并增加在大肠杆菌中的表达水平(因此，以表达增强子发挥功能)。脂类尾确保抗原向抗原递呈细胞的最佳递呈。其它融合配偶体包括流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。虽然可使用包括T-辅助表位的不同片段，但通常使用N-末端的81个氨基酸。

在另一个实施方案中，免疫融合配偶体是已知为LYTA的蛋白质或其部分(优选地，是C-端部分)。LYTA来源于合成已知为酰胺酶LYTA(LytA基因编码，Gene43：265-292，1986)的N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。LYTA是特异降解肽聚糖主链中某些键的自溶素。LYTA蛋白质的C-端结构域负责与胆碱或一些胆碱类似物(如DEAR)的亲和力。已利用这种特性开发用于融合蛋白质表达的大肠杆菌CLYTA表达质粒。氨基末端含C-LYTA片段的杂合蛋白质的纯化已有所描述(参见，Biotechnology 10：795-798，1992)。在优选的实施方案中，LYTA的重复部分可整合入融合蛋白质。重复部分发现于从残基178起始的C-端区。特别优选的重复部分合并了残基188-305。

一般而言，如此处所述的多肽(包括融合蛋白质)和多核苷酸是经过分离的。  “分离的”多肽或多核苷酸是从其最初环境中移走的物质。例如，如果天然存在的蛋白质独立于天然系统中一些或所有的共存物质，其可得到分离。

优选地，这种多肽的纯度至少约90％，更为优选至少约95％，以及最为优选至少99％。例如，如果多核苷酸克隆进不是自然环境一部分的载体，认为其可得到分离。

多核苷酸和载体

本发明进一步提供编码此处所述单克隆抗体的经分离的多核苷酸和包含该多核苷酸的载体，以及含此载体的宿主细胞。这种表达系统可用于产生免疫反应性多肽(如本发明的抗体)的方法中，其中培养宿主细胞，并回收通过培养的宿主细胞产生的多肽。编码本发明抗体的多核苷酸也可递送到宿主受试者，以通过宿主受试者的细胞表达抗体。多核苷酸递送至宿主受试者的中枢神经系统和抗早老素(senilin)抗体在宿主受试者的中枢神经系统中表达的策略的实例描述于1998年10月15日公布的PCT申请号W098/44955。

本发明也包括与任一这种序列互补的多核苷酸。多核苷酸可以是单链(编码的或反义的)或双链，可以是DNA(基因组、cDNA、或合成的)或RNA分子。RNA分子包括相应于DNA分子以一对一方式含有内含子的HnRNA分子，以及不含有内含子的mRNA分子。本发明多核苷酸可具有(但非必需)额外的编码或非编码序列，并且多核苷酸可与(但非必需)其它分子和/或支持材料连接。

多核苷酸可包含天然序列(即编码抗体或其部分的内源序列)，或可包含这种序列的变体。多核苷酸变体含一个或多个置换、添加、缺失和/或插入，以便所编码多肽的免疫反应性与天然免疫活性分子相比不会降低。一般地，可如此处所述评估编码多肽的免疫反应性效果。变体与编码天然抗体或其部分的多核苷酸相比，优选地显示至少约70％同一性，更为优选至少约80％同一性和最为优选至少约90％同一性。

当以下述最大对应排列时，如果两条序列的核苷酸或氨基酸序列相同，就认为两个多核苷酸或多肽序列是“一致的”。通常，通过在比较窗口上比较序列以鉴定和比较局部区域的序列相似性，完成两条序列之间的比较。如此处使用的“比较窗口”指至少约20个连续位置的片段，通常30至约75、40至约50，其中对两条序列进行最佳排列后，可将序列与具有相同数目连续位置的参考序列进行比较。

可使用Lasergene suite of bioinformatics软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)中的Megalign程序，利用默认参数(default parameter)可实施用于比较的序列最佳排列。此程序包括下述参考文献所述的几种排列方式：Dayhoff，M.O.(1978)A model of evolutionary change inproteins-Matrices for detecting distant relationships.在Dayhoff，M.O.(编辑)Atlas of Protein Sequence and Structure(National BiomedicalResearch Foundation，Washington DC Vol.5，Suppl.3)一书中的345-358页；Hein J.，1990，Unified Approach to Alignment and Phylogenes，626-645页，Methods in Enzymology vol.183，Academic Press，Inc.，San Diego，CA；Higgins，D.G.和Sharp，P.M.，1989，CABIOS 5：151-153；Myers，E.W.和Muller W.，1988，CABIOS 4：11-17；Robinson，E.D.，1971，Comb.Theor.11：105；Santou，N.，Nes，M.，1987，Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.，1973，Numerical Taxonomy the Principles andPractice of Numerical Taxonomy，Freeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.和Lipman，DJ.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726-730。

优选地，通过在至少20个位置的比较窗口上比较两个最佳排列序列而确定“序列同一性的百分比”，其中与用于两条序列最佳排列的参考序列(不含有缺失或添加)比较，多核苷酸或多肽序列比较窗口中的部分可包含20％或更少的添加或缺失(即缺口)，通常是5-15％，或10-12％。通过测定在两条序列中存在的产生匹配位置数目的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数目用参考序列(即窗口大小)的位置总数除匹配位置的数目，并将结果乘100以产生序列统一性百分比，从而计算出百分比。

变体也(或备选地)与天然基因或其部分或其互补序列基本上同源。这种多核苷酸变体可在适度严紧的条件下与天然存在的编码天然抗体(或互补序列)的DNA序列杂交。

合适的“适度严紧条件”包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mMEDTA(pH8.0)溶液中预先洗涤；在50℃-65℃、5×SSC下过夜杂交，然后在65℃用各含0.1％SDS的2×SSC、0.5×和0.2×SSC洗涤2次，共20分钟。

如此处使用的，“高度严紧条件”或“高严紧条件”是(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如在50℃、0.015 M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠中；(2)在杂交期间采用变性剂，如在42℃、甲酰胺条件下，例如含有0.1％牛血清白蛋白/0.1％菲可/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM含750mM氯化钠的磷酸钠缓冲液(pH 6.5)、75mM柠檬酸钠的50％(v/v)甲酰胺；或(3)在42℃采用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt溶液、超声处理的鲑精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯，在0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中于42℃和在50％甲酰胺中于55℃洗涤，然后于55℃经过由含EDTA的0.1×SSC组成的高严洗涤。技术人员将认识到怎样调节温度、离子强度等以适应如探针长度等因素是必需的。

本领域普通技术人员应当理解，因为遗传密码简并性，存在许多编码此处所述多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任一天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。但是，由于密码子选择差异而变化的多核苷酸在本发明中得到特别的考虑。此外，包含此处所提供多核苷酸序列的基因的等位基因属于本发明的范围。等位基因是由于一个或多个突变(如核苷酸的缺失、添加和/或置换)而导致改变的内源性基因。所得到的mRNA和蛋白质可能(但并非必然)具有改变的结构或功能。使用标准技术(如杂交、扩增和/或数据库序列比较)，可鉴定等位基因。

使用本领域公知的任一技术可制备多核苷酸。从表达抗体mRNA的组织制备的cDNA文库中可获得编码抗体的DNA。抗体编码基因还可从基因组文库中或通过寡核苷酸合成而获得。利用设计用于鉴定目的基因或其编码的蛋白质的探针(如结合配偶体或至少约20-80碱基的寡核苷酸)，可筛选文库。代表性文库包括人肝cDNA文库(人肝5′延伸正链cDNA，Clontech Laboratories，Inc.)和鼠肾cDNA文库(鼠肾5′延伸正链cDNA，Clontech Laboratories，Inc.)。可使用如Sambrook等《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989中所述的标准程序，利用所选探针筛选cDNA或基因组文库。备选地，可使用PCR方法(Sambrook等，见上文；Dieffenbach等，《PCR Primer：A Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995)分离编码抗体的基因。

选为探针的寡核苷酸序列应足够长和明确，以将假阳性降至最低。优选标记寡核苷酸，以便它们与被筛选文库中的DNA杂交后得以检测。标记方法是本领域众所周知的，包括使用放射性标记(如³²P-标记的ATP)、生物素或酶标记。Sambrook等(见上文)中提供了包括中等严紧和高严紧的杂交条件。

这种文库筛选方法所鉴定的序列可与公共数据库(如GenBank或其它私人序列数据库)中存放、并可获得的其它公知序列进行比较和排列。可通过采用多种算法以测量同源性的计算机软件程序，测定分子内限定区域或跨越全长序列的序列同一性(在氨基酸或核苷酸水平)。

通过筛选所选cDNA或基因组文库，并且必需的话，使用如Sambrook等(见上文)所述的常规引物延伸程序可获得具有蛋白质编码序列的核酸分子，以检测可能尚未反转录成cDNA的mRNA的前体和加工中间体。

通常可通过本领域公知的任一方法制备多核苷酸变体，这些方法包括化学合成，例如固相亚磷酰胺化学合成。也可使用标准诱变技术向多核苷酸序列引入修饰，如寡核苷酸定向的位点特异性诱变(参见，Adelman等，DNA 2：183，1983)。备选地，假如将编码抗体或其部分的DNA整合入具有合适RNA聚合酶启动子(如T7或SP6)的载体，可通过在体外或体内转录该DNA序列来产生RNA分子。如此处所述，某些部分可用于制备编码的多肽。另外或备选地，可将部分(核酸)向患者施用，以便在体内(例如，通过利用编码多肽的cDNA构建体转染抗原递呈细胞，如树突细胞，并且对患者施用转染的细胞)产生编码的多肽。

任一多核苷酸可进一步得到修饰以增加在体内的稳定性。可能的修饰包括(但不限于)在5′和/或3′端添加侧翼序列、使用硫代磷酸或2′O-甲基而不是主链中的磷酸二酯键(phosphodiesterase linkages)，和/或包括非常见碱基如肌苷、queosine和wybutosine、以及腺嘌呤、胞苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的乙酰基-、甲基-、硫-和其它修饰形式。

使用建立的重组DNA技术，可将核苷酸序列连接至多种其它核苷酸序列。例如，多核苷酸可克隆进多种克隆载体，包括质粒、噬菌粒、λ-噬菌体衍生物和粘粒。特别相关的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。一般而言，载体包含在至少一种生物中具有功能的复制起点、常规限制内切酶位点和一个或多个选择标志。其它元件依赖于所需用途，并且对本领域普通技术人员是显而易见的。

在某些实施方案中，多核苷酸可能被配制来以允许其进入哺乳动物细胞，并且允许在其中表达。如下所述，这种制剂对于治疗性目的特别有用。本领域普通技术人员理解有多种方法可实现多核苷酸在靶细胞中的表达，并且可采用任一合适的方法。例如，多核苷酸可整合入病毒载体，如(但不限于)腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或牛痘或痘病毒(例如鸟痘病毒)。将DNA整合入这类载体的技术是本领域普通技术人员众所周知的。逆转录病毒载体可额外转移或整合作为选择性标志(以帮助鉴定或选择转导细胞)的基因和/或导向部分(如编码特异靶细胞上受体的配体的基因)以使载体获得靶向特异性。也可通过本领域普通技术人员所公知的方法，使用抗体实现靶向性。

用于治疗性目的的其它制剂包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠和以类脂为基础的系统包括水包油乳剂、微团、混合微团和脂质体。用于体外和体内递送载体的优选胶体系统是脂质体(即人工膜载体)。这种系统的制备和使用是本领域众所周知的。

药物组合物

本发明提供整合入药物组合物的抗体、多肽和/或多核苷酸。在一些实施方案中，药物组合物包含优先与Aβ肽(SEQ ID NO：1)28-40位氨基酸结合的抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，药物组合物包含优先与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合的单克隆抗体。在一些实施方案中，药物组合物包含优先与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)36-40位氨基酸的表位结合的单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体与Aβ肽(SEQ ID NO：1)28-40位氨基酸结合的亲和力约为60nM或更少、约30nM或更少、或约3nM或更少。在一些实施方案中，抗体优先与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合，亲和力约为60nM或更少、约30nM或更少、或约3nM或更少。在一些实施方案中，抗体优先与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)36-40位氨基酸的表位结合，亲和力约为60nM或更少、约30nM或更少、或约3nM或更少。在一些实施方案中，上述抗体未显示与Aβ_1-41和/或Aβ_1-42显著的交叉反应。在一些实施方案中，抗体竞争地抑制包含SEQ ID NO4和/或6所示的氨基酸序列，或命名为8A1.2A1的杂交瘤产生的单克隆抗体的结合。在一些实施方案中，抗体与包含SEQ ID NO4或6所示氨基酸序列的抗体或命名为8A1.2A1的杂交瘤产生的单克隆抗体结合Aβ肽(SEQ IDNO：1)上相同的表位。在其它实施方案中，药物组合物包含来源于任一此处所述抗体的人抗体、人源化或嵌合抗体。药物组合物包含一种或多种这类化合物和任选的生理上可接受的载体。属于本发明范围的药物组合物也可含具生物活性或非活性的其它化合物。在优选的实施方案中，组合物包含至少两种抗体，针对Aβ肽16-28位氨基酸的第一抗体和针对Aβ肽28-40位氨基酸的第二抗体。

药物组合物可含编码一种或多种上述多肽的DNA，以使在原位产生多肽。如上所注释的，DNA可存在于对本领域普通技术人员所公知的多种递送系统中的任一种，包括核酸表达系统、细菌和病毒表达系统。是本领域众所周知多种基因递送技术，如Rolland，1998，Crit.Rev.Therap.DrugCarrier Systems 15：143-198所述和此处所引用的参考文献。适当的核酸表达系统含有在患者中表达所必需的DNA序列(如合适的启动子和终止信号)。

在优选的实施方案中，可使用病毒表达系统(例如牛痘或其它痘病毒、逆转录病毒或腺病毒)引入DNA，所述系统涉及使用不致病的(缺陷的)、具有复制能力的病毒。合适的系统，在例如Fisher-Hoch等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：317-321；Flexner等，1989，Ann.N.Y.Acad Sci.569：86-103；Flexner等，1990，Vaccine 8：17-21；美国专利号4,603,112，4,769,330和5,017,487、WO 89/01973、美国专利号4,777,127、GB 2,200,651、EP 0,345,242、WO 91/02805、Berkner-Biotechniques 6：616-627，1988；Rosenfeld等，1991，Science 252：431-434；Kolls等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：215-219；Kass-Eisler等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11498-11502、Guzman等，1993，Circulation 88：2838-2848和Guzman etal.，1993，Cir.Res.73：1202-1207中已经公开。将DNA引入这种表达系统的技术是本领域普通技术人员所众所周知的。如Ulmer等，1993，Science259：1745-1749和Cohen，1993，Science 259：1691-1692综述中所描述的，DNA也可以是裸露的。通过将DNA包被在可有效地运送至细胞的可生物降解珠上，可增加裸DNA的吸收。

虽然本发明的药物组合物可使用本领域普通技术人员所知的任一合适载体，但是载体类型依赖于给药模式而变化。本发明的组合物可配制来用于任一适当的给药方式，包括，例如局部、口服、鼻、静脉内、颅内、腹膜内、皮下或肌肉内给药。对肠胃外给药，如皮下注射，载体优选包含水、盐、乙醇、脂肪、蜡或缓冲液。对口腔给药，可使用任一以上载体或固体载体，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。生物可降解微球(例如多聚乳酸和多聚乙醇酸)也可作为本发明药物组合物的载体而被使用。合适的生物可降解微球公开于例如美国专利号4,897,268和5,075,109。

这类组合物也可包含缓冲液(例如中性缓冲盐溶液或磷酸缓冲盐溶液)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸(如甘氨酸)、抗氧化剂、螯合试剂(如EDTA或谷胱甘肽)、佐剂(例如氢氧化铝)和/或防腐剂。备选地，本发明的组合物可配制成冻干粉。使用众所周知的技术，化合物也可包裹在脂质体内。

此处所述的组合物可作为持续释放制剂(即如施用后造成缓慢释放化合物的胶囊或海绵之类的制剂)的部分施用。通常使用众所周知的技术制备这种制剂，并且通过如口服、直肠或皮下植入或通过在需要的靶位点植入进行给药。持续释放制剂可含有分散于载体基质和/或包含于速率控制膜所包围的储藏所的多肽、多核苷酸或抗体。用于这类制剂的载体是生物相容的，并且也是生物可降解的，优选地本配制提供相对恒定水平的活性成分释放。持续释放制剂中含有的活性成分的量依赖于植入位点、速率和预期的释放持续时间和治疗或预防条件的性质。

治疗和预防方法

本发明的抗体(包括多肽)、多核苷酸和药物组合物可用于治疗、预防和抑制阿尔茨海默氏病和其它与Aβ或βAPP表达改变、或Aβ肽积累相关的疾病(如唐氏综合征、帕金森氏病和多发性脑梗塞痴呆)的发展的方法。这种方法包含对受试者施用免疫反应性分子、抗体(包括多肽)、多核苷酸或药物组合物。在预防性应用中，对阿尔茨海默氏病易感或处于罹患阿尔茨海默氏病的风险的患者施用药物组合物或药剂，其中药物组合物或药剂的量足够消除或降低风险、减轻严重性或延缓疾病(包括疾病的生物化学、组织学和/或行为学的症状、其并发症和疾病发展期间存在的中间病理学表型)的出现。在治疗性应用中，对疑似或已经患有这种疾病的患者施用组合物或药剂，其中药物组合物或药剂的量足够治愈或至少部分控制疾病(包括其并发症和疾病发展中的中间病理学表型)的(生物化学的、组织学的和/或行为学的)症状。

本发明也提供延缓患者中阿尔茨海默氏病相关症状发展的方法，包括对受试者施用有效剂量的含有本发明抗体(包括多肽)或多核苷酸的药物组合物。阿尔茨海默氏病相关症状包括(但不限于)记忆、解决问题、语言、计算、视觉、判断和行为异常。

本发明也提供抑制或压制受试者中淀粉样蛋白斑形成的方法，包括对受试者施用有效剂量的本发明药物组合物。在一些实施方案中，淀粉样蛋白斑位于受试者的脑中。

本发明也提供减少受试者中淀粉样蛋白斑的方法，包括对受试者施用有效剂量的本发明药物组合物。在一些实施方案中，淀粉样蛋白斑位于受试者的脑中。

本发明也提供移去或清除受试者中淀粉样蛋白斑的方法，包括对受试者施用有效剂量的本发明药物组合物。在一些实施方案中，淀粉样蛋白斑位于受试者的脑中。

本发明也提供减少受试者组织(如脑)中Aβ肽、抑制和/或降低组织(如脑)中Aβ肽的积累、以及抑制和/或降低组织(如脑)中Aβ肽的毒性作用的方法，包含对受试者施用有效剂量的本发明药物组合物。

可通过对单位点或多位点在单一时间点或多时间点进行单向注射而实现此处所述方法(包括预防性或治疗性方法)。也可几乎同时对多位点给药。可以在治疗过程中根据需要达到的结果确定并调整给药频率。在一些情况下，本发明抗体(包括多肽)、多核苷酸和药物组合物的持续连续释放制剂可能是适当的。实现持续释放的多种制剂和设备是本领域公知的。

患者、受试者或个体包括哺乳动物，如人、牛、马、犬、猫、猪和羊。优选受试者是人，并且可以是也可以不是正遭受疾病的折磨或将要表现出症状。就阿尔茨海默氏病而言，实际上任何人都处于遭受阿尔茨海默氏病的危险中，只要他或她生命足够长。因此，本方法可预防性地对普遍人群施用，而不需对受试者患者的危险进行任何评估。本发明方法对已知具有阿尔茨海默氏病遗传危险的个体有用。这样的个体包括其亲戚有已经经历这种疾病的那些人，以及通过遗传或生物化学标志分析而确定其危险的那些人。阿尔茨海默氏病危险的遗传标志包括APP基因的突变，尤其是分别称为Hardy和Swedish突变的位点717和位点670与671的突变(参见Hardy(1997)Trends Neurosci.20：154-9)。其它的危险标志是位于早老素基因、PS1和PS2、和ApoE4的突变、AD家族史、血胆甾醇过多或动脉粥样硬化。根据特征性痴呆以及上述上述危险因素的出现，可识别要罹患阿尔茨海默氏病折磨的个体。此外，一些诊断性测试可用于鉴定具有AD的个体。这些包括测量CSF tau和Aβ42的水平。Tau升高和Aβ42水平降低意味着AD的存在。也可通过ADRDA(阿尔茨海默氏病和相关紊乱协会)标准，诊断患有阿尔茨海默氏病的个体。在无症状患者中，治疗可在任何年龄(例如10、20、30)开始。而通常，患者在40、50、60或70岁之前没有必要开始治疗。通常需要在一段时间进行多剂量的治疗。可通过本领域公知的跨越时期的多种方法监测治疗。对于潜在的唐氏综合征患者而言，可通过对母亲施用治疗性试剂而在出生前开始治疗，或出生不久后开始治疗。

可用于以上方法的药物组合物包括(但不限于)优先与Aβ肽(SEQ IDNO：1)28-40位氨基酸结合的抗体、优先与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合的抗体、与Aβ肽(SEQ ID NO：1)28-40位氨基酸的结合亲和力约为60nM或更少、30nM或更少或3nM或更少的抗体、优先与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合并且结合亲和力约为60nM或更少、30nM或更少或3nM或更少的抗体、以及编码此处所述任一抗体和多肽的多核苷酸。在其它实施方案中，可使用以下抗体：与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合、但与Aβ_1-42和Aβ_1-43不显示显著交叉反应的抗体、与Aβ_1-40肽(SEQ ID NO：1)的结合亲和力约为200nM或更少、或1nM或更少的抗体Fab片段、竞争地抑制包含SEQ ID NO：4和6的氨基酸序列的单克隆抗体与Aβ_1-40肽(SEQ ID NO：1)结合的抗体、与包含SEQ ID NO：4和6的氨基酸序列的单克隆抗体结合相同表位的抗体、以及具有任一上述特征组合的抗体。

给药和剂量

优选在载体中对哺乳动物进行施用抗体，优选是可药用的载体。合适的载体和它们的制剂描述于Remington的《Pharmaceutical Sciences》，第18版，A.Gennaro，编，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990和Remington，《The Science and Practiceof Pharmay》第20版.MackPublishing，2000中。通常，在制剂中使用适当量的可药用的盐，以使制剂等渗。载体的实例包括盐溶液、林格液和葡聚糖溶液。溶液的pH优选约5至约8，更优选约7至约7.5。进一步的载体包括持续释放制剂，如含有抗体的固相疏水多体的半透性基质，其中的基质以成形物(例如薄膜、脂质体或微粒)的形式存在。对本领域技术人员显而易见的是，依赖于例如给药途径和施用抗体的浓度，某些载体是更为优选的。

可通过注射(例如全身的、静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、门脉内)或通过其它方法如确保以有效形式递送至血流的灌输，对哺乳动物施用抗体。也可通过孤立灌注技术(如孤立的组织灌注)施用抗体，以发挥局部治疗效果。优选的是静脉内注射。

可以经验确定施用抗体的有效剂量和方案，并且进行这种测定属于本领域的技术范围。本领域技术人员可理解，必须施用的抗体剂量将依赖于例如接受抗体的哺乳动物、给药途径、所使用抗体的特殊类型以及对哺乳动物施用的其它药物而变化。选择适当抗体剂量的指导可见于关于抗体治疗性用途的文献中，例如《Handbook of MonoclonalAntibodies》，Ferrone等编，Noges Publications，Park Ridge，NJ，1985，ch，22和pp.303-357；Smith等，《Antibody in Human Diagnosis and Therapy》，Haber等编，RavenPress，New York，1977，365-389页。

单独使用抗体的通常日剂量约每日1μg/Kg至高达100mg/Kg体重，或更多，这取决于上面所提到的因素。一般地，可使用任一下述剂量：施用至少约50mg/Kg体重的剂量、至少约10mg/Kg体重的剂量、至少约3mg/Kg体重的剂量、至少约1mg/Kg体重的剂量、至少约750μg/Kg体重的剂量、至少约500μg/Kg体重的剂量、至少约250μg/Kg体重的剂量、至少约100μg/Kg体重的剂量、至少约50μg/Kg体重的剂量、至少约10μg/Kg体重的剂量、至少约1μg/Kg体重的剂量、或更多。

在一些实施方案中，可能呈递不只一种抗体。这类组合物可能含有至少一种、至少二种、至少三种、至少四种、至少五种本发明的不同抗体(包括多肽)。

抗体也可与一种或多种有效量的其它治疗试剂组合施用给哺乳动物。抗体可与一种或多种其它治疗试剂相继或同时施用。抗体和治疗试剂的量依赖于例如所使用的药物类型、治疗的病理疾病以及给药方案和途径，但是一般少于每种单独使用。

对哺乳动物施用抗体后，可以技术人员众所周知的多种方法监测哺乳动物的生理状况。

上述的给药原则和剂量可适用于此处所述的多肽。

编码本发明抗体(包括多肽)的多核苷酸也可用于在目的细胞中递送和表达抗体或多肽。显而易见的是，表达载体可用于抗体的直接表达。可于全身、腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、膜内、心室内、口服内、肠内、肠胃外、鼻内、真皮内或通过吸入施用表达载体。例如，表达载体的施用包括局部或全身施用，包括注射、口服施用、基因枪或以导管施用、以及局部施用。本领域技术人员熟悉施用表达载体以获得外源蛋白质在体内表达。参见，例如美国专利号6,436,908、6,413,942和6,376,471。

也可使用靶向递送包含编码本发明抗体的多核苷酸的治疗组合物。受体介导的DNA递送技术描述于，例如Findeis等，Trends Biotechnol，(1993)11：202；Chiou等，《Gene Therapeutics Methods And Applications Of DirectGene Transfer》(J.A.Wolff编)(1994)；Wu等，J.Biol.Chem.(1998)263：621；Wu等，J.Biol.Chem.(1994)269：542；Zenke等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1990)87：3655；Wu等，J.Biol.Chem.(1991)266：338。在基因治疗规程中，含有多核苷酸的治疗组合物的局部给药范围是约100ng-约200mgDNA。在基因治疗规程中，也可使用约500ng-约50mg、约1μg-约2mg、约5μg-约500μg和约20μg-约100μg的浓度范围。可使用基因递送工具递送本发明的治疗多核苷酸和多肽。基因递送工具可以是病毒来源或非病毒来源的(一般参见，Jolly，Cancer Gene Therapy(1994)1：51；Kimura，Human Gene Therapy(1994)5：845；Connelly，Human GeneTherapy(1995)1：185和Kaplitt，Nature Genetics(1994)6：148)。使用内源性哺乳动物启动子或异源启动子诱导这类编码序列的表达。编码序列的表达可以是组成性的，也可以是调节性的。

用于递送和在目的细胞中的表达目的多核苷酸的基于病毒的载体是本领域众所周知的。代表性的基于病毒的运载工具包括(但不限于)重组逆转录病毒(参见，例如PCT公布号WO90/07936、WO94/03622、WO93/25698、WO93/25234、WO93/11230、WO93/10218、WO91/02805；美国专利号5,219,740、4,777127；GB专利号2,200,651和EP0345242)、基于甲病毒的载体(例如辛德比斯病毒载体、西门利克森林病毒(ATCC VR-67、ATCC VR-1247)、Ross River病毒(ATCC VR-373、ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923、ATCC VR-1250、ATCC VR-1249ATCC VR-532)和腺相关病毒(AAV)载体(参见，例如PCT公布号WO 94/12649、WO 93/03769、WO 93/19191、WO 94/28938、WO 95/11984和WO 95/00655)。也可如Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147所述的施用连接至灭活腺病毒的DNA。

也可利用非病毒递送工具和方法，包括(但不限于)与灭活腺病毒连接或未连接的多聚阳离子浓缩的DNA(参见，例如Curiel，Hum.GeneTher.(1992)3：147)、配体连接的DNA(参见，例如Wu，J.Biol.Chem.(1989)264：16985)、真核细胞递送工具细胞(参见，例如美国专利号5,814,482、PCT公布号WO 95/07994、WO 96/17072、WO 95/30763和WO97/42338)和核电荷中和或与细胞膜的融合。也可使用裸DNA。代表性的裸DNA引入方法描述于PCT公布号WO 90/11092和美国专利号5,580,859。可作为基因递送工具的脂质体描述于美国专利号5,422,120、PCT公布号WO 95/13796、WO 94/23697、WO 91/14445和EP0524968。另外的方法描述于Philip，Mol.CellBiol.(1994)14：2411和Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91：1581。

抗体的诊断性用途

本发明的抗体可用于检测、诊断和监测阿尔茨海默氏病和与Aβ或βAPP表达改变相关的其它疾病，如唐氏综合征。方法包括将怀疑具有Aβ或βAPP表达改变的患者样本与本发明的抗体接触，并测定Aβ或βAPP水平是否与对照或比较标样本不同。

对于诊断性应用，通常用可检测的部分标记抗体，其中的可检测部分包括(但不限于)放射性同位素、荧光标记和各种酶-底物标记。将标记与抗体缀合的方法是本领域所公知的。在本发明的其它实施方案中，本发明的抗体不必进行标记，可使用结合本发明抗体的标记抗体检测其存在。

本发明的抗体可应用于任一公知的试验方法，如竞争结合试验、直接和间接夹心试验(sandwich assay)、以及免疫沉淀试验。Zola，《单克隆抗体：技术手册》，147-158页(CRC Press，Inc.1987)。

抗体也可用于体内诊断试验，如体内成象。一般地，抗体用放射性核素(如¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹⁴C、¹³¹I、¹²⁵I或³H)标记，以便使用immunoscintiography定位目标细胞或组织。

按照本领域众所周知的技术，抗体也可用作病理学中的染色试剂。

试剂盒

在进一步的实施方案中，本发明提供制成品和包含可用于治疗病理疾病或检测或纯化Aβ或βAPP的材料的试剂盒，其中的病理疾病如阿尔茨海默氏病、唐氏综合征、或与Aβ或βAPP表达改变相关的其它疾病。制成品包含带有标签的容器。合适的容器包括，例如瓶、小瓶和试管。容器可以由不同的材料(如玻璃或塑料)制成。容器装有具有活性试剂的组合物，其中的活性试剂可有效治疗病理疾病或检测或纯化Aβ或βAPP。组合物中的活性试剂是抗体，并且优选包含特异于Aβ或βAPP的单克隆抗体。在一些实施方案中，活性试剂是与Aβ肽(SEQ ID NO：1)28-40位氨基酸中的表位结合的抗体。在一些实施方案中，抗体优先与跨越Aβ肽(SEQ ID NO：1)38-40位氨基酸的表位结合。在一些实施方案中，抗体以约为60nM或更少、约30nM或更少、约3nM或更少的亲和力优先与Aβ肽(SEQ ID NO：1)28-40位氨基酸结合。在一些实施方案中，抗体以约60nM或更少、约30nM或更少、3nM或更少的亲和力优先与包括Aβ肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合。在一些实施方案中，抗体竞争地抑制包含SEQ ID NO4和/或6所示氨基酸序列的单克隆抗体、或由命名为8A1.2A1的杂交瘤产生的单克隆抗体的结合。在一些实施方案中，抗体与含有SEQID NO4和/或6所示氨基酸序列的抗体、或由命名为8A1.2A1的杂交瘤产生的单克隆抗体结合Aβ肽(SEQ ID NO：1)上相同的表位。在一些实施方案中，活性试剂包含任一此处所述的人源化抗体、嵌合抗体或人抗体。容器上的标签表明组合物是用于治疗病理疾病如阿尔茨海默氏病或检测或纯化Aβ或βAPP，也可指用于体内或体外使用，如上面所描述的。

在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含上述的容器。在另一些实施方案中，本发明的试剂盒包含上述的容器和另一含有缓冲液的容器。可进一步包括满足商业需要或用户立场的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针、注射器和具有指导实施此处所述任一方法(如治疗阿尔茨海默氏病的方法，以及抑制或降低脑中Aβ肽积累的方法)的说明书的包装插件。在用于检测或纯化Aβ或βAPP的试剂盒中，抗体通常用可检测的标志标记，如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。

实施例

介绍下述实施例以对本发明举例说明，并帮助普通技术人员制备和使用本发明。这些实施例并不意味着以任何方式在其它方面限制本发明的范围。

实施例1：针对Aβ的单克隆抗体的产生和特征

本实施例呈现的数据显示，可产生高亲和力、特异性的针对Aβ的抗体，并提供有益的靶向Aβ相关疾病的治疗试剂。小鼠用50-100μg在Ribi佐剂中的Aβ_1-40肽免疫(每脚垫50μl，每只小鼠总共100μl)，以10个连续的周间隔免疫，如Geerligs HJ等，1989，J.Immunol.Methods 124：95-102、Kenney JS等，1989，J.Immunol.Methods 121：157-166和Wicher K等，1989，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.89：128-135中所述。

脾细胞从免疫小鼠中获得，并在聚乙二醇1500存在下，与NSO骨髓瘤细胞以10∶1的比例融合。将杂交瘤细胞(hybrids)种于包含20％马血清和2-草酰乙/丙酮酸/胰岛素(Sigma)的DMEM的96-孔板，并开始次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸苷选择。第8天，将100μl包含20％马血清的DMEM加至所有孔中。通过使用抗体捕获免疫试验筛选杂交瘤细胞的上清。抗体类的确定可利用类特异的第二抗体进行。

选择了一组单克隆抗体产生细胞系以对它们进行表征。描述对应抗体的这些细胞系和信息列于表2中。

表2：单克隆抗体的特征

抗原Aβ	单克隆抗体产生细胞系	同种型	表位	ELISA		亲和力Kd(nM)	交叉反应性
								直接	捕获
					2286		8A1.2A1			IgG1	Aβ28-40	是	是	2.7	否
2287	11A4.1E5	IgG2a	Aβ16-28	是		是		59	否
					2288		23E9.1A1			IgG2b	Aβ1-16	是	是	ND	否
2289	3C6.1F9	IgG2b	Aβ16-28	是		是		2.9	否
					2290		14E10.1F3			IgG2a	Aβ16-28	是	是	9.2	否
2294	13E11.1A12	IgG2b	Aβ28-40	是		是		38	否
					2324		10B10.2E6			IgG2b	Aβ-1-16	是	ND	0.9	否

与不同来源的Aβ和βAPP以及对照肽的结合在夹心分析法中进行试验。受试的Aβ肽是：从Calbiochem(San Diego，CA)获得的β-淀粉样肽1-42和1-40，以及从Bachem(Torrance，CA)获得的β-淀粉样肽1-43。肽固定在板上，加入抗体，并且使用GAMIgG(Fc)HRP检测其结合，以及在490nm读取吸光度。图1中所述的交叉反应性证实，针对Aβ的mAb与βAPP没有交叉反应。

执行捕获试验可证实抗体可捕获可溶性Aβ肽。在本试验中，Aβ肽固定在试验板上，直接加入mAb或在与10μg/mlAβ预孵育后加入mAb，并且使用GAMIgG(Fc)HRP以及在490nm下读取吸光度以检测结合。对照是小鼠抗-βAPP和检测人β-淀粉样肽(Signet，Dedham，MA)的氨基酸残基1-17的单克隆抗体6E10。显示捕获可溶性Aβ的数据显示在图2中。

可在活体外(ex vivo)测定侯选治疗性抗体有效降低体内中枢神经系统噬斑负载的能力，如Bard等，2000，Nature Medicine 6(8)：916-919所述。

实施例2：表征Aβ多肽上针对Aβ的抗体结合的表位

为确定单克隆抗体所识别的Aβ多肽上的表位，使用表面胞质共振(SPR，Biacore 3000)结合分析。将偶连有生物素(Global Peptide Services，CO)的Aβ_1-40多肽(SEQ ID NO：1)固定至链亲和素包被的小板。在缺乏或存在不同的可溶性Aβ肽片段时(1000nM，来源于American PeptideCompany Inc.，CA)，Aβ抗体(100nM)结合至经固定的Aβ_1-40。需要置换结合至Aβ_1-40的单克隆抗体2324、2289和2286(更确切地说，这些抗体从它们各自的杂交瘤细胞系10B10.2E6、3C6.1F9和8A1.2A1中分离)的Aβ肽分别是Aβ_1-16、Aβ_1-28和Aβ_1-40(图3)。可溶性Aβ_1-40可抑制所有三种抗体与Aβ_1-40的结合。然而，Aβ_1-38肽抑制Aβ_1-40与MAb 2324和2289的结合，但不抑制与MAb 2286的结合，这表明MAb 2286结合的表位包括Aβ_1-40肽的氨基酸39和/或40(图3)。

此外，Aβ_1-42和Aβ_1-43肽不抑制MAb 2286与Aβ_1-40的结合，虽然它们容易抑制Aβ_1-40与MAb 2324和2289的结合(图3)。这些结果显示MAb2286优先与Aβ_1-40而不是Aβ_1-42和Aβ_1-43结合。

为进一步评价Mab 2286结合中β-淀粉样肽所涉及的不连续氨基酸残基，通过定点诱变产生最后5个氨基酸(Aβ_1-40的氨基酸残基36-40)分别用丙氨酸(丙氨酸扫描诱变)置换的不同Aβ_1-40变体。这些Aβ_1-40变体(表6中所示的序列)以谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ USA)在大肠杆菌中表达，随后在谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO，USA)上进行亲和纯化。作为对照，野生型(WT)Aβ_1-40(SEQ ID NO：1)和Aβ_1-41(SEQ ID NO：13)也以GST融合蛋白进行表达。然后，将Aβ_1-40、Aβ_1-41和5个不同变体(SEQ ID NO：14-18)固定在试验板上(每孔0.25μg)，并且与Mab 2286或Mab 2324(分别针对Aβ_1-40的氨基酸28-40或1-16的表位，每抗体2nM)孵育。经过10次连续洗涤后，将试验板与生物素偶联的山羊抗小鼠(H+L)抗体(Vector Laboratories，Burllingame CA，USA)孵育，然后与HRP-偶联的链亲和素(Amersham Biosciences Corp.，NJ，USA)孵育。板的吸光度在450nm读取。

如图8所示，针对AβN末端表位的Mab 2324识别所有具有相同强度的变体，并且可作为板上蛋白质浓度和蛋白质完整性的内部阳性对照。Mab2286不识别Aβ_1-41(或如图3所示的Aβ_1-42)，而将C-端的V40突变为Ala不影响结合，这表明蛋白质的氨基羧基末端部分可能直接与Mab 2286表位相关，而V40的侧链可能较不重要。Aβ_1-40变体V39A、G38A、G37A和V36A显示与Mab 2286的结合降低，这表明Mab 2286表位在Aβ_1-40的C末端延伸了至少5个氨基酸。将V和G突变为A是非常保守的，并且不可能在蛋白质中产生重要的构象变化，因此，这些突变对Mab 2286结合的大的影响可能是由于抗体区分Aβ中上述氨基酸之间的氨基酸的能力，并且这些数据证明这种抗体具有非常高的特异性。

实施例3：针对βAPP的单克隆抗体的产生和特征

小鼠用实施例1中所述的APP免疫。对一组单克隆抗体产生细胞系选择以进行鉴定。这些细胞系和描述对应抗体的信息列于表3中。

表3：单克隆抗体特征

抗原APP	单克隆产生细胞系	同种型	ELISA		亲和力Kd(nM)	交叉反应
							直接	捕获
			2312	25E12.1F9.1H8(BP26)		IgG1				是	ND	ND	无
2313	24H4.2E10.1F5(BP27)	IgG1			是		ND	ND	无
			2334	1F10.8E6.2A2(BP80)		IgG2b				是	ND	ND	无
2335	13E12.1C5(BP81)	IgG2b			是		ND	ND	无
			2336	14D9.1G8(BP82)		IgG1				是	ND	ND	无

实施例4：单克隆抗体2286的人源化

通过将重链CDR(Kabat和/或Chothia)植入人胚系受体序列VH3和VH4，并且将轻链Kabat CDR植入人胚系受体序列08，小鼠抗体2286可得到人源化。抗体2286的人源化重链和轻链显示在以下的表4中。

表4：人源化抗体的重链和轻链的氨基酸序列

人源化2286轻链可变结构域(胚系构架O8)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC SASQGISNYLNWYQQKPGKAPKLLIY YTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QQYRKLPYTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO：13)
	人源化2286重链可变结构域(胚系构架VH3)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASgfdf srYWMNWVRQAPGKGLEWVS EINPDSSTINYTPSLKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR QMGYWGQG TTLTVSS(SEQ ID NO：14)
人源化2286重链可变结构域(胚系构架VH4)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSgfdf srYWMNWIRQPPGKGLEWIG EINPDSSTINYTPSLKDRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR QMGYWGQGTLV TVSS(SEQ ID NO：15)

*除了CDRH1外，抗体重链和轻链的CDR边界通过Kabat名称(通过下划线标记)确定，其中CDRH1中的Kabat和Chothia(小写)名称用于限定CDR边界。

使用上述的BIAcore3000^TM表面胞质共振(SPR)系统(BIAcore，INC，Piscaway NJ)，通过“稳态”方法确定抗-Aβ的单克隆抗体Fab片段的平衡解离常数(K_D)值。同时通过将数据匹配至1∶1朗缪尔结合模型(Lofas&Johnsson，1990)，使用计算的BIA评价程序而获得动力学结合速率(kon)和解离速率(K_0ff)。人源化抗体和小鼠抗体2286的亲和力显示在以下的表5中。

表5：人源化抗体的结合亲和力

	K0ff(S-1)	Kon(M-1、S-1)	KD(nM)
				小鼠2286Fab	0.044	5.8×104	76
人源化2286Fab(O8；VH3)	ND	ND	500
				人源化2286Fab(O8；VH4)	ND	ND	500

实施例5：针对Aβ肽的抗体降低阿尔茨海默氏病动物模型中的组织学症状

本实施例表明本发明的单克隆抗体对治疗和预防阿尔茨海默氏病提供了有效的治疗试剂。令人惊讶的是，这些数据显示，在阿尔茨海默氏病小鼠模型中，针对AβC末端(即氨基酸28-40)的抗体与针对N末端(氨基酸1-16)的抗体一样，可有效地清除Aβ、硫黄素-S和增加MHC-II染色。因为靶向AβN末端的抗体由于识别前体和/或干扰淀粉样沉淀聚集的能力增加，其可能是有益的，所以这些结果提供治疗阿尔茨海默氏病有前景的新治疗策略。

为评价抗Aβ抗体的体内治疗效果，将单克隆抗体2324、2286和2289，更确切地说，是从它们各自杂交瘤细胞系10B10.2E6、8A1.2A1和3C6.1F9中分离的抗体，注射入过量表达“Swedish”突变淀粉样前体蛋白质的转基因小鼠(APP；Tg2576；K670N/M671L；Hsiao等，1996，Science 274：99-102)。出现在这些小鼠中的阿尔茨海默氏病样表型已得到很好的描述(Holcomb LA等，1998，Nat.Med.4：97-100、Holcomb LA等，1999，Behav.Gen.29：177-185；and McGowan E，1999，Neurobiol.Dis.6：231-244)。

以下述对于描述或使本发明可行并非一定需要的实验步骤，将抗体颅内注射16月龄的Tg2576转基因小鼠。注射的抗体是单克隆抗体2324(2μl体积中有1.2μg)、2286(2μl体积中有2μg)和2289(2μl体积中有2μg)和针对果蝇称为“遗忘症”的蛋白质的对照单克隆抗体(2μl体积中有2μg)，更确切地说，将从它们各自杂交瘤细胞系10B10.2E6、8A1.2A1和3C6.1F9中分离的抗体进行颅内注射。注射后3天评价小鼠额皮质和海马的组织病理学。从时间过程工作中选择三天的时间点，其中另一个抗体显示在此时间间隔可完全清除淀粉，并且与1天或7天比较其小神经胶质活性是最大的。数据以Aβ、硫黄素-S和MHC-II染色的注射侧和非注射侧之比表示。

虽然本研究所使用的三个抗体针对Aβ肽的不同部分(分别是氨基酸1-16、16-28和28-40)，但是与对照组(抗-遗忘症抗体和载体注射组)比较，它们都以很大的比例(图4，40-80％)去除海马和皮层中的Aβ和硫黄素-S沉淀(后者检测Aβ沉淀的毒性纤维型)。它们也激活小胶质细胞，这一点通过MHC-II染色(图4)评估。在三个Aβ抗体每两两之间，它们在移去这些小鼠的Aβ、硫黄素-S或增加MHC-II染色的能力中没有一致的差别。鉴于以前公布的研究显示针对N端(即氨基酸1-16)而不是C端(即氨基酸28-40)的抗体对Aβ沉淀清除是极为重要的，本发明的这些结果是意料之外的(Solomon，B等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：452-455、Solomon，B等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4109-4112.)。

实施例6：小胶质细胞激活和淀粉状蛋白清除中抗体2286Fc结构域的潜在作用

为调查小胶质细胞激活和淀粉状蛋白清除中抗-Aβ抗体2286Fc结构域的潜在作用，将小胶质细胞激活和淀粉状蛋白清除中的抗体2286的F(ab’)2片段、完整抗体和针对果蝇遗忘症蛋白质的对照单克隆抗体在实施例6中所述的动物模型中进行比较，其中抗体是颅内施用。

制备F(ab′)2片段

使用免疫纯的IgG1Fab和F(ab’)2制备试剂盒(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)制备抗-Aβ单克隆抗体2286的F(ab′)2片段和针对果蝇遗忘症蛋白质的对照单克隆抗体。以下是试剂盒提供的说明书。简要地，将0.5ml 1mg/ml的IgG加入0.5ml小鼠IgG1的温和洗脱液。这用于平衡固定的无花果蛋白酶柱，允许进入柱，并在37℃消化20小时。获得4ml洗脱液，并用于经平衡的固定的蛋白A柱，以从Fc片段和未消化的IgG中分离F(ab’)2。获得四份1ml的产物级分。如通过凝胶电泳所确定的，仅发现第二和第三洗脱部分含有F(ab’)2片段，并且在凝胶上呈现类似的强度。将含有F(ab’)2片段的两个洗脱部分混合，并且使用Centricon离心滤器设备(Millipore Corp.Bedford，MA)浓缩至约200μl的体积。预实验发现，当注射一些小鼠时，注射直接从柱中浓缩的F(ab’)2级分可导致癫痫发作。因此，将初始浓缩物用4ml新鲜的PBS稀释，并再浓缩以稀释残余的可导致癫痫发作的洗脱缓冲液成分。在此处包括的小鼠中未发现癫痫或神经毒性。浓缩产物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上进行电泳。使用Bradford蛋白质试验试剂浓缩(Bio-Rad，Hercules，CA)进行Bradford试验以确立F(ab’)2片段的浓度。

通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析抗-Aβ单克隆抗体2286的F(ab’)2片段和针对果蝇遗忘症蛋白质的对照单克隆抗体。凝胶显示未污染未消化的IgG或Fc片段的非常纯的产物为约105kDa的单一条带，其为F(ab’)2片段的分子量。完整IgG分子产生一条约150kDa、为IgG分子的正确分子量的强烈条带以及约110kDa不太强烈的条带。通过SDS-PAGE确认其纯度后，然后我们进行Bradford试验以评价纯化级分中F(ab’)2的回收率。因为我们将抗-AβF(ab’)2片段溶于比用于起始材料更小的体积中，所以颅内注射的F(ab’)2片段的浓度是1.2μg/μl，而完整抗体的浓度是1μg/μl，这导致F(ab’)2溶液中抗-AβFv结构域的过量。

抗体级分研究

将20个19.5月龄的Tg2576APP转基因鼠分成4个组，所有组接受颅内注射入额皮质和海马。第一组在每一部位接受浓度为2μg/2μl的抗-Aβ抗体2286。第二组在每一部位接受浓度为2.2μg/2μl的从抗-Aβ抗体2286制备的抗-AβF(ab’)2片段。作为完整IgG注射的非特异对照，第三组接受针对果蝇遗忘症蛋白质的IgG。最后一组接受从针对果蝇遗忘症蛋白质的IgG制备的对照F(ab’)2片段，以控制F(ab’)2注射的非特异性作用。手术后72小时，所有小鼠均存活。

手术程序

在手术当天，对小鼠称重，用异氟烷麻醉，并置于立体定位仪器(51603双操作实验室标准，Stoelting，Wood Dale，IL)。使中央切口暴露颅骨，并且按下述坐标在右额皮质和海马上使用牙钻钻两个钻孔：皮质：AP+1.5mm、L-2.0mm；海马：AP-2.7mm，L-2.5mm，都从前囟点开始。连接于10J.l Hamilton(Reno，NV)吸管的26计量注射针在前囟点腹侧下降3mm，并且在2分钟期间注射2μl。切口用盐水清洗，并用手术钉关闭。

组织制备

在处死当天对小鼠称重，过量给予100mg/kg戊巴比妥(戊巴比妥钠溶液，Abbott laboratories，North Chicago IL)、颅内灌注25ml0.9％氯化钠、然后是50ml新鲜制备4％的多聚甲醛(pH＝7.4)。迅速移去脑，并浸入新鲜制备的4％多聚甲醛中固定24小时。然后将脑依次在10、20和30％蔗糖中孵育24小时，以cyroprotect它们。然后使用滑动切片机收集25μm厚的水平切面，并且在含有叠氮钠的DPBS缓冲液中于4℃保存以防止微生物生长。

免疫组织化学方法

选择6至8个跨越注射点的约100μm的切片，对总Aβ(兔抗血清主要与Aβ肽的N末端反应，1∶10000)和CD45(Serotec，Raleigh NC，1∶3000)进行自由飘浮免疫组织化学方法染色，如以前所描述的(Gordon等，2002)。对免疫染色，一些切片不与第一抗体反应以评价非特异免疫组织化学反应。邻近切片放于玻片上，并使用4％硫黄素-S(Sigma-Aldrich，St Louis MO)染色10分钟。应当注意，有限量的切片包括注射部位。下述程序是测量一些可靠的标记，而不是用较少切片获得大量标记。

数据分析

在额皮质和海马的注射区域以及脑对侧对应区域使用视频V150影像分析系统(Oncor，San Diego，CA)，测量所有染色切片上的免疫组织化学反应产物。数据以注射侧和非注射侧的Aβ、硫黄素-S和CD45之比表示。使每个注射点对对应的对侧位点的标准化可降低动物间差异的影响，并允许以更少的小鼠对药物效果进行可靠的测量。为评价可能的与治疗相关的差异，使用StatView software version 5.0.1(SAS Institute Inc.，NC)，通过ANOVA分析每个治疗组的比值，然后进行Fischer′s LSD平均值比较。

结果

在额皮质和海马中颅内注射72小时后，激活小胶质细胞的唯一抗体是完整的抗-Aβ抗体2286。额皮质比海马显示更高的激活程度，然而，在两个区域中，激活显著地比接受对照抗-遗忘症蛋白质IgG、F(ab’)2或抗-Aβ2286F(ab’)2的组更强(图5A、C和D，图6A；在所有比较中P＜0.01或更高)。抗-Aβ抗体2286注射后，海马中的激活模式与当使用抗-Aβ抗体44-352(β-淀粉样蛋白氨基酸1-16结合的单克隆抗体(Biosource，Camarillo，CA))时相似。在齿状回的颗粒细胞层中，有非常强烈的激活区域，伴随着更多填满齿状回剩余部分的弥散激活(图5A)。有趣的是，抗-AβF(ab’)2片段未在额皮质和海马中产生小神经胶质激活(图5B，图6A)。

在两个抗遗忘症蛋白质对照组中，Aβ免疫组织化学在19.5月龄的APP转基因小鼠中显示典型的染色模式(图5G和H)。这种模式性质上与16月龄中观察的相同，虽然量上比3.5月龄的小鼠更高。额皮质和海马中注射72小时后，抗-Aβ抗体和抗-AβF(ab’)2组可将总Aβ免疫组织化学显著地降低至类似的程度。在额皮质中，降低约60％(图6B)。在海马中，降低约65％(图5E和F、图6B)。

硫黄素-S染色仅检测致密的纤维状淀粉样蛋白沉淀。接受颅内注射对照抗-遗忘症蛋白质IgG或对照F(ab’)2的小鼠，与在该年龄的APP转基因小鼠中观察的典型染色类似。在海马中，大多数硫黄素-S阳性斑块位于阿蒙氏角和海马沟附近的齿状回的外侧分子层(图5K和L)。在额皮质和海马中，抗-Aβ抗体IgG显著地降低硫黄素-S阳性致密斑块约90％(图6C)。在海马中，没有、或很少有剩余的硫黄素-S阳性沉淀(图5I)。相反，抗-AβF(ab’)2片段没有与完整IgG分子一样有效地移去致密淀粉样蛋白斑块。在额皮质中，当与对照抗体组比较时，硫黄素-S染色没有显著降低(图6C)。在海马中，在抗-AβF(ab’)2组和对照组之间有显著的差别(P＜0.05)，然而，这种降低也显著地低于用完整IgG分子观察到的降低(图5J，图6C，P＜0.02或更高)。

如所预期的，当所有接受抗-AβIgG或抗-AβF(ab’)2、而不管其后续治疗的组的CD45和硫黄素-S值在单一大样本回归分析(single largeregression analysis)中进行比较，使用CD45的log转化值时，在通过CD45免疫组织化学检测所获得的小神经胶质激活水平增加和在额皮质中通过硫黄素-S染色检测所获得的致密斑块清除之间，具有显著的相关性(P＜0.001，R＝0.57)。这种相关性也可在海马中观察到(P＜0.02，R＝0-427)。

实施例7：外周注射抗体2286后血清Aβ浓度增加

全身被动免疫阿尔茨海默氏病的转基因动物模型后，进行本实验测试单克隆抗体2286的功效。19月龄的Tg2576转基因小鼠(Hsiao等，1996，Science 274：99-102)腹膜内(IP)注射单克隆抗体2286或抗-遗忘症抗体(IgG1对照)。抗体每周注射一次，剂量为10mg每Kg体重，周期为1、2或3个月，之后测量血清中Aβ血清浓度和抗-Aβ抗体滴度。

通过使用捕获试验确定Aβ的血清浓度，在该试验中，将抗-Aβ抗体(Clone6E 10，Signet Laboratories Inc.，Dedham，MA)固定在试验板上，并与来源于治疗小鼠的稀释血清样品孵育。10次连续洗涤后，将试验板与第二级生物素连接的抗-Aβ抗体(Clone 4G8，Signet Laboratories Inc.，Dedham MA，USA)孵育，然后加入HRP-连接的链亲和素(AmershamBiosciences Corp.，NJ，USA)。确定试验板在450nm的吸光度，并通过使用已知浓度的合成Aβ_1-40(American Peptide Company Inc.，Sunnyvale CA，USA)作为标准品进行标准化，确定血清样品中的Aβ浓度。为测量血清样品中的2286抗体的滴度，通过低pH解离抗体-Aβ复合体，并与预先包被有合成的Aβ_1-40(0.25μg/孔)的试验板孵育。10次连续洗涤后，将试验板与生物素连接的山羊抗小鼠(H+L)抗体(Vector Laboratories，BurllingameCA，USA)孵育，然后与HRP-连接的链亲和素(Amersham BiosciencesCorp.，NJ，USA)孵育，并测量450nm的吸光度。从采用已知浓度的亲和纯化2286进行相同试验所产生的标准曲线中计算抗-Aβ抗体的浓度。

如图7所示，外周施用2286后，对Tg2576小鼠可观察到血清Aβ浓度的迅速增加，但抗-遗忘症抗体不增加。血清样品中抗-Aβ抗体的滴度，在治疗的转基因小鼠中的血清中抗体浓度和血清Aβ浓度之间显示显著的正相关(通过INSTAT PRISM v.4，GraphPad Software Inc.，San Diego，CA分析数据，r²＝0.5125，F＝26.28，P＜0.0001)。这些数据表明，单克隆抗体2286在CNS和血浆之间可能具有改变的Aβ平衡，并且施用单克隆抗体2286便于从CNS中清除Aβ。为测试这种可能性，测量脑淀粉样蛋白负载以确定血清中Aβ浓度的增加是否与治疗小鼠中脑淀粉样蛋白负载的下降相关。

表6β淀粉样肽和变体的氨基酸序列

1-40(WT)	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG GVV	(SEQ ID NO：1)
			1-42(WT)	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA	(SEQ ID NO：11)
1-43(WT)	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAT	(SEQ ID NO：12)
			1-41(WT)	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVI	(SEQ ID NO：13)
V36A(1-40)	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMAGGVV	(SEQ ID N0：14)
			G37A(1-40)	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVAGVV	(SEQ ID NO：15)
G38A(1-40)	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGAVV	(SEQ ID NO：16)
			V39A(1-40)	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGAV	(SEQ ID NO：17
V40A(1-40)	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVA	(SEQ ID NO：18)

表7人淀粉样β(A4)前体蛋白(APP)(SEQ ID NO：2)：

MLPGLALLLLAAWTARALEVPTDGNAGLLAEPQIAMFCGRLNMHMNVQNGK

WDSDPSGTKTCIDTKEGILQYCQEVYPELQITNVVEANQPVTIQNWCKRGRKQ

CKTHPHFVIPYRCLVGEFVSDALLVPDKCKFLHQERMDVCETHLHWHTVAKET

CSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPLAEESDNVDSADAEEDDSDVW

WGGADTDYADGSEDKVVEVAEEEEVAEVEEEEADDDEDDEDGDEVEEEAEEP

YEEATERTTSATTTTTTTESVEEVVREVCSEQAETGPCRAMISRWYFDVTEGKC

APFFYGGCGGNRNNFDTEEYCMAVCGSAMSQSLLKTTQEPLARDPVKLPTTAA

STPDAVDKYLETPGDENEHAHFQKAKERLEAKHRERMSQVMREWEEAERQA

KNLPKADKKAVIQHFQEKVESLEQEAANERQQLVETHMARVEAMLNDRRRLA

LENYITALQAVPPRPRHVFNMLKKYVRAEQKDRQHTLKHFEHVRMVDPKKAA

QIRSQVMTHLRVIYERMNQSLSLLYNVPAVAEEIQDEVDELLQKEQNYSDDVL

ANMISEPRISYGNDALMPSLTETKTTVELLPVNGEFSLDDLQPWHSFGADSVPA

NTENEVEPVDARPAADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVKMDAEFRHDSGYEVHH

QKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVITLVMLKKKQYTSIHHGVVEVD

AAVTPEERHLSKMQQNGYENPTYKFFEQMQN

表8单克隆抗体2286核酸序列：

重链[可变结构域和恒定结构域1(CH1)]；SEQ ID NO：3：

gaggtgaagcttctcgagtctggaggtgggcctggtgcagcctggaggatccctgaaactctcctgtgcagcctcaggattcga

ttttagtagatactggatgaattgggtccggcaggctccagggaaagggctagaatggattggagaaattaatccagatagca

gtacgataaactatacgccatctctaaaggataaattcatcatctccagagacaacgccaaaaatacgctgtacctgcaaatga

gcaaagtgagatctgaggacacagccctttattactgtgcaagacaaatgggctactggggccaaggcaccactctcacagt

ctcctcagccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtgaccctggg

atgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttccc

agctgtcctgcagtctgacctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacct

gcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgcccagggattgt

轻链；SEQ ID NO：5：

gatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagtgcaagtcaggg

cattagcaattatttaaactggtttcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctattacacatcaagtttacactcagg

agtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctgggacagattattctctcaccatcagcaacctggaacctgaagatattgccac

ttactattgtcagcagtataggaagcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgggctgatgctgcac

caactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctacccc

aaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagca

aagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgagg

ccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgt

表9单克隆抗体2286氨基酸序列：

重链[可变结构域和恒定结构域1(CH1)]；SEQ ID NO：4：

EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMNWVRQAPGKGLEWIGEIN

PDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCARQMGYWGQ

GTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSL

SSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPR

DC

轻链；SEQ ID NO：6：

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWFQQKPDGTVKLLIYYTSSLH

SGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYRKLPYTFGGGTKLEIKRAD

AAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWT

DQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

表10单克隆抗体2324核酸序列：

重链[可变结构域和恒定结构域1(CH1)]；SEQ ID NO：7：

gttactctgaaagagtctggccctgggatattgaagccctcacagaccctcagtctgacttgttctttctctgggttttcactgagc

acttctggtatgggtgtaggctggattcgtcagtcttcagggaagggtctggagtggctggcacacatttggtgggatgatgat

aagtactataacccatccctgaagagccagctcacaatctccaaggatacctccagaaaccaggtattcctcaagatcaccagt

gtggacactgcagatactgccacttactactgtgctcgaaggggggtacgacatagagactactttgactactggggccaagg

caccactctcacagtctcctcagccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctgggtgtggagatacaactggttc

ctccgtgactctgggatgcctggtcaagggctacttccctgagtcagtgactgtgacttggaactctggatccctgtccagcagt

gtgcacaccttcccagctctcctgcagtctggactctacactatgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggccaagt

cagaccgtcacctgcagcgttgctcacccagccagcagcaccacggtggacaaaaaacttgagcccagcgggcccatttca

acaatcaacccc

轻链；SEQ ID NO：9：

gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagcatt

gtacatagtaatggaaacacctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaaactccttatctacaaagtttcca

accgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggct

gaggatctgggagtttattactgctttcaaggttcacgtgttcctctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacggg

ctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaac

aacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactga

tcaggacagcaaagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagcta

tacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgt

表11单克隆抗体2324氨基酸序列：

重链[可变结构域和恒定结构域1(CH1)]；SEQ ID NO：8：

VTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQSSGKGLEWLAHIW

DDDKYYNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARRGVRHRDY

DYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTV

WNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTV

KKLEPSGPISTINP

轻链；SEQ ID NO：10：

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYK

VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSRVPLTFGAGTKL

ELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNG

VLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRN

EC

生物材料的保藏

下述材料保藏在美国典型培养物保藏中心，10801 UniversityBouleVard，Manassas，Virginia 20110-2209，USA(ATCC)：

材料	抗体编号	ATCC保藏号	保藏日
				8A1.2A1	2286	PTA-5199	2003年5月15日

根据为专利程序和其中的规章(布达佩斯条约)而达成的国际共识的微生物保藏的布达佩斯条约进行保藏。这可保证自保藏日起30年仍可维持有活力的培养物。根据布达佩斯条约，并经过Rinat Neuroscience Corp和ATCC的同意，可从ATCC获得保藏物，这保证了自公布相关美国专利或对公众公开任一美国或外国专利申请后(不管何者首先公开)，公众均可永久地和无限制地获得保藏的培养物的子代，并保证了由美国专利和商标局根据35USC 122节和其批准的规则(包括37CFR 1.14节，尤其是自886OG 638)而指定的对象可获得保藏物的子代。

本申请的代理人已同意，当在合适的条件下培养时，如果保藏材料的培养物死亡或丢失或被破坏，将通知迅速以相同的另一份材料替换。对保藏材料的获得并不构成可违背任一政府根据专利法的授权而实施本发明。

认为上述说明书足够使本领域熟练工作人员实施本发明。本发明不限于保藏的构建体的范围，因为保藏的实施方案只用作本发明某些方面的一个例子，并且其任一功能上等同的构建体均位于本发明的范围内。此处材料的保藏既不构成承认此处的书面说明书不足以实施本发明的任一方面(包括其最佳模式)，也不构成将权利要求的范围限制在说明书所示的具体表述中。实际上，除此处所示和描述的以外，对本发明的多种改变对本领域技术人员而言通过以上描述均是显而易见的，并且落入后附的权利要求的范围。

Claims (50)

1.治疗阿尔茨海默氏病的方法，其包括对受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含优先与Aβ_1-40肽(SEQ ID NO：1)28-40位氨基酸结合的抗体和可药用的载体。

2.权利要求1的方法，其中抗体优先与包括Aβ_1-40肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合。

3.权利要求1或2的方法，其中抗体与Aβ_1-42和Aβ_1-43肽不显示显著的交叉反应。

4.权利要求1的方法，其中抗体的Fab片段与Aβ_1-40肽(SEQ ID NO：1)结合的亲和力约为200nM或更小。

5.权利要求1的方法，其中抗体的Fab片段与Aβ_1-40肽(SEQ ID NO：1)结合的亲和力约为1nM或更小。

6.权利要求2的方法，其中抗体的Fab片段与Aβ_1-40肽(SEQ ID NO：1)结合的亲和力约为200nM或更小。

7.权利要求2的方法，其中抗体的Fab片段与Aβ_1-40肽(SEQ ID NO：1)结合的亲和力约为1nM或更小。

8.权利要求1的方法，其中抗体竞争性地抑制包含SEQ ID NO：4和6的氨基酸序列的单克隆抗体与Aβ_1-40肽(SEQ ID NO：1)的结合。

9.权利要求1的方法，其中抗体与包含SEQ ID NO：4和6的氨基酸序列的单克隆抗体结合相同的表位。

10.权利要求1的方法，其中抗体是单克隆抗体。

11.权利要求1的方法，其中抗体是人源化抗体。

12.权利要求1的方法，其中抗体是人抗体。

13.抑制受试者中淀粉样蛋白斑形成的方法，其包括对受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含优先与Aβ_1-40肽(SEQ ID NO：1)28-40位氨基酸结合的抗体和可药用的载体。

14.权利要求13的方法，其中抗体优先与包括Aβ_1-40肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合。

15.权利要求13的方法，其中抗体与Aβ_1-42和Aβ_1-43肽不显示显著的交叉反应。

16.权利要求13的方法，其中抗体的Fab片段与Aβ_1-40肽(SEQ IDNO：1)结合的亲和力约为200nM或更小。

17.权利要求13的方法，其中抗体的Fab片段与Aβ_1-40肽(SEQ IDNO：1)结合的亲和力约为1nM或更小。

18.权利要求14的方法，其中抗体的Fab片段与Aβ_1-40肽(SEQ IDNO：1)结合的亲和力约为200nM或更小。

19.权利要求14的方法，其中抗体的Fab片段与Aβ_1-40肽(SEQ IDNO：1)结合的亲和力约为1nM或更小。

20.权利要求13的方法，其中抗体竞争性地抑制包含SEQ ID NO：4和6的氨基酸序列的单克隆抗体与Aβ_1-40肽(SEQ ID NO：1)的结合。

21.权利要求13的方法，其中抗体与包含SEQ ID NO：4和6的氨基酸序列的单克隆抗体结合相同的表位。

22.权利要求13的方法，其中抗体是单克隆抗体。

23.权利要求13的方法，其中抗体是人源化抗体。

24.权利要求13的方法，其中抗体是人抗体。

25.权利要求13的方法，其中淀粉样蛋白斑位于受试者的脑中。

26.减少受试者中淀粉样蛋白斑的方法，其包括对受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含优先与Aβ_1-40肽(SEQ ID NO：1)28-40位氨基酸结合的抗体和可药用的载体。

27.权利要求26的方法，其中抗体优先与包括Aβ_1-40肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合。

28.权利要求26的方法，其中抗体与Aβ_1-42和Aβ_1-43肽不显示显著的交叉反应。

29.权利要求26的方法，其中抗体的Fab片段与Aβ_1-40肽(SEQ IDNO：1)结合的亲和力约为200nM或更小。

30.权利要求26的方法，其中抗体的Fab片段与Aβ_1-40肽(SEQ IDNO：1)结合的亲和力约为1nM或更小。

31.权利要求26的方法，其中抗体的Fab片段结合Aβ_1-40肽(SEQ IDNO：1)的亲和力约为200nM或更小。

32.权利要求27的方法，其中抗体的Fab片段结合Aβ_1-40肽(SEQ IDNO：1)的亲和力约为1nM或更小。

33.权利要求26的方法，其中抗体竞争性地抑制包含SEQ ID NO：4和6的氨基酸序列的单克隆抗体与Aβ_1-40肽(SEQ ID NO：1)的结合。

34.权利要求26的方法，其中抗体与包含SEQ ID NO：4和6的氨基酸序列的单克隆抗体结合相同的表位。

35.权利要求26的方法，其中抗体是单克隆抗体。

36.权利要求26的方法，其中抗体是人源化抗体。

37.权利要求26的方法，其中抗体是人抗体。

38.权利要求26的方法，其中淀粉样蛋白斑位于受试者的脑中。

39.延缓受试者中与阿尔茨海默氏病相关症状的发展的方法，其包括对受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含优先与Aβ_1-40肽(SEQ ID NO：1)28-40位氨基酸结合的抗体和可药用的载体。

40.权利要求39的方法，其中抗体优先与包括Aβ_1-40肽(SEQ ID NO：1)39和/或40位氨基酸的表位结合。

41.权利要求39的方法，其中抗体与Aβ_1-42和Aβ_1-43肽不显示显著的交叉反应。

42.权利要求39的方法，其中抗体的Fab片段与Aβ_1-40肽(SEQ IDNO：1)结合的亲和力约为200nM或更小。

43.权利要求39的方法，其中抗体的Fab片段与Aβ_1-40肽(SEQ IDNO：1)结合的亲和力约为1nM或更小。

44.权利要求40的方法，其中抗体的Fab片段结合Aβ_1-40肽(SEQ IDNO：1)的亲和力约为200nM或更小。

45.权利要求40的方法，其中抗体的Fab片段结合Aβ_1-40肽(SEQ IDNO：1)的亲和力约为1nM或更小。

46.权利要求39的方法，其中抗体竞争性地抑制包含SEQ ID NO：4和6的氨基酸序列的单克隆抗体与Aβ_1-40肽(SEQ ID NO：1)的结合。

47.权利要求39的方法，其中抗体与包含SEQ ID NO：4和6的氨基酸序列的单克隆抗体结合相同的表位。

48.权利要求39的方法，其中抗体是单克隆抗体。

49.权利要求39的方法，其中抗体是人源化抗体。

50.权利要求39的方法，其中抗体是人抗体。

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