CN1842591A - 提高植物中油脂水平的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种通过表达HOI001 GBSS等位基因来提高玉米核仁组织油脂水平I的方法。本发明还提供了编码HOI001 GBSS多肽的分离的核酸分子。
Description
本申请要求申请日为2003年6月27日、申请号为U.S.60/483,491的临时申请的优先权，其以引用方式并入本文。
本申请涉及核酸化学和农业生物技术领域。特别是，本发明直接涉及编码用于增加玉米植物中油脂水平的蛋白质的核酸的鉴定以及包含这类核酸的玉米植物的制备。
植物是用于饲料、食品和工业用途的油脂的主要来源。虽然大多数植物物种的组织中都只含有少量的油脂，但是，在很大英亩面积上种植某些植物种类也能使得大量的植物油脂得以生产。如果能增加这类植物中的油脂含量，则可以更高效地生产植物油脂。例如，#2黄臼齿形玉米(yellow#2，dent corn)中常规油脂含量为约4％。如果玉米的油脂含量可被增加至8％或甚至12％，那么在不显著影响产量的情况下，即可从一半或甚至三分之一英亩数的种植面积中生产出同等量的油脂。
目前，通过传统的育种和选择方法，可以逐步增加油籽(oilseed)作物中的油脂水平。几乎没有什么参考文献涉及油脂水平提高的转基因植物。相反地，通过在油籽中导入或操纵各种植物脂肪酸的生物合成基因，可提高某些重要(strategic)脂肪酸的比例。例如，Voelker等，Science，257：72-74(1992)中记载：在十字花科(Brassicaceae)植物中表达来源于California Bay的中链脂酰-ACP硫酯酶，可增加月桂酸(12∶0)含量。Hitz等，Proc.9th InternationalCambridge Rapeseed Congress UK，pp 470-472(1995)记载了通过用编码植物微粒体FAD-2(Δ12)去饱和酶的正义构建体进行共抑制来增加大豆(Glycine max)植物中油酸的比例。虽然采用这些植物转基因可实现增加油菜(canola)中的月桂酸的产量并且改变大豆中油酸的比例，但是没有证据表明其增加了这些转基因植物中的总脂肪酸含量，或增加了油脂产量。
某些人试图通过对油脂生物合成途径基因进行操作来增加或调节植物中的油脂含量。例如，Gengenbach等的美国专利U.S.6,268,550中提供了用于改变植物油脂含量的玉米乙酰CoA羧化酶的核酸。此外，Ohlrogge等的美国专利U.S.5,925,805中提供了可用于增加植物油脂含量的拟南芥(Arabidopsis)乙酰CoA羧化酶基因。然而，脂肪酸的合成需要许多酶的协同作用，其中没有一种酶被发现具有如下属性：当仅单独正调其表达时可以大幅增加油脂含量。
因此，需要一种改进的方法用于改变植物中的油脂含量，特别是增加植物和种子中的油脂含量。
除了油脂之外，玉米中的淀粉同样具有农业和经济上的重要意义。淀粉构成了动物饲料和人类食物的主要成分。淀粉同样可被工业应用，其用于造纸、纺织、塑料、和粘合剂的生产，以及用于提供用于某些生物反应器的原材料。
在高等植物中，淀粉由分别被称作直链淀粉和支链淀粉的直链和支链葡聚糖构成。在不同植物中发现了具有多种含量的直链淀粉和支链淀粉的淀粉。典型地，玉米淀粉含有约25％的直链淀粉，其余的为支链淀粉。支链淀粉含有短链和长链，短链介于5-30葡萄糖单位之间，长链介于30-100或更多葡萄糖单位之间。直链与支链淀粉的比例，以及支链淀粉组分中的短链长链的分布均可影响淀粉的物理特性(例如，热稳定性、凝沉和粘度)。
玉米的WAXY基因座确定了花粉和核仁胚乳中的直链淀粉含量，(Shure等，Cell，35(1)：225-233(1983))，从而产生了具有独特特性的淀粉。编码颗粒结合型淀粉合酶(granule bound starchsynthase，GBSS)的玉米WAXY基因座处的大多数突变可在胚乳、花粉和胚囊中产生具有光滑、结实的非角质淀粉的不透明胚乳，其由大多数支链淀粉和减少量的直链淀粉构成(″WAXY表型″)(参见Okagaki和Wessler，Genetics，120(4)：1137-1143(1988))。当在纯合WAXY突变型中合成无功能GBSS时，其同时也缺乏直链淀粉(Echt和Schwartz，Genetics，99：275-284(1981))。
此外，当与#2黄玉米相比时可以发现，典型的、隐性WAXY只能很微弱(约0.5％的增加)地影响核仁的油脂含量(Pfahler和Linskens，Tlteoretical and applied Genetics，41(1)：2-4(1971))。相比较而言，近交系HOI001，记载于公开号为No.20030172416的美国专利中的显性WAXY突变近交体，具有比#2黄玉米高出4倍的总核仁油脂含量，上述专利以引用方式并入本文。
发明内容
本发明记载和提供了编码HOI001 GBSS多肽的核酸分子。此外，本发明涉及与编码HOI001 GBSS多肽的核酸分子互补的核酸分子。此外，本发明涉及包含这些核酸分子的表达盒。此外，本发明涉及含有这类表达盒的转基因玉米植物。此外，本发明涉及这类转基因玉米植物的种子。本发明进一步涉及来源于这类转基因玉米植物种子的油脂和动物饲料。
在另一实施方案中，本发明涉及能在植物细胞中发挥功能的重组DNA构建体，其包含与启动子可操纵连接的编码HOI001 GBSS多肽的核酸分子，并且与植物中油脂产量的增加相关。
本发明记载和提供了一种通过表达HOI001 GBSS基因来增加玉米植物中油脂的方法。本发明进一步提供了一种通过表达HOI001 GBSS基因来改变玉米植物中核仁组分的方法。本发明进一步记载和提供了来源于玉米(Zea mays)的HOI001 GBSS基因序列。本发明进一步提供了用于植物转化和组织特异性表达HOI001 GBSS基因的载体构建体。本发明进一步提供了用GBSS基因转化过的玉米植物，其与具有相同或类似遗传背景但不含插入的HOI001 GBSS基因的植物相比具有更高的油脂水平。本发明进一步提供了来源于这类玉米植物的种子。本发明进一步提供了来源于采用HOI001 GBSS基因转化过的玉米植物的核仁，其与具有相同或类似遗传背景但不插入的含HOI001 GBSS基因的玉米植物核仁相比具有更高的油脂水平。本发明还提供了来源于这些种子和核仁的油脂和动物饲料。
本发明进一步提供了一种用于在玉米中产生高油脂水平的标记辅助育种方法。
附图简述
图1显示了分离自HOI001的颗粒结合型淀粉合酶基因(HOI001GBSS，pMON72506)[SEQ ID NO：1]与来源于近交体LH59的颗粒结合型淀粉合酶基因(GBSS)(pMON72510)，以及记载于Shure等，supra，中的GBSS基因的公开序列(X03935)间的核酸序列对比(sequencealignment)。为了进一步比较，给出了公开的GBSS基因的编码序列(CDS22509)。
图2显示了分别来源于分离自HOI001的GBSS基因(来源于pMON72506的HOI001 GBSS)相应的预测氨基酸序列[SEQ ID NO：3]与来源于记载于前述Shure等中的GBSS基因(X03935)相应的预测氨基酸序列[SEQ ID NO：4]间的对比。
图3显示了分别来源于分离自近交体LH59的Zea mays GBSS基因的相应预测氨基酸序列[SEQ ID NO：10]与记载于前述Shure等中的Zea mays颗粒结合型淀粉合酶基因相应的预测氨基酸序列间的对比。
图4描绘了pMON72506质粒图谱。
图5描绘了pMON72510质粒图谱。
图6A和6B以图表的方式表示了采用含有来源于HOI001的GBSS(SEQ ID NO：1，6A)的pMON72506转化过和采用含有来源于LH59的GBSS(SEQ ID NO：8，6B)的pMON72510转化过的植物核仁中的油脂水平差异。每一事件中均进行了对基因阳性和基因阴性核仁的比较。在6A中仅列出了具有统计学上显著的油脂变化(29分之14)的事件。
图7描绘了pMON81464质粒图谱。
图8描绘了pMON68298质粒图谱。
图9描绘了pMON81465质粒图谱。
序列简述
SEQ ID NO：1为来自HOI001的颗粒结合型淀粉合酶基因(来源于pMON72506的HOI001 GBSS)的核酸序列。
SEQ ID NO：2为来自前述Shure等的Zea mays GBSS的公开的核酸序列。
SEQ ID NO：3为来源于pMON72506的HOI001 GBSS的预测氨基酸序列。
SEQ ID NO：4为前述Shure等发表的Zea mays GBSS的预测氨基酸序列。
SEQ ID NO：5为引物编号14543的引物序列。
SEQ ID NO：6为引物编号14547的引物序列。
SEQ ID NO：7为编码来源于玉米系LH59的GBSS的DNA分子的核酸序列。
SEQ ID NO：8为来源于玉米系LH59的GBSS的预测氨基酸序列。
SEQ ID NO：9为引物编号20095的引物序列。
SEQ ID NO：10为引物编号20092的引物序列。
SEQ ID NO：11为HOI001的GBSS的cDNA编码区。
发明详述
如下定义用于帮助理解对本发明的详细说明。
短语“编码序列”，“编码区”，“结构序列”和“结构核酸序列”是指包含核苷酸顺序排列的物理结构。核苷酸以一系列三联体排列而成，其中每一三联体形成一密码子。每一密码子编码一特定的氨基酸。从而编码序列、结构序列和结构核酸序列编码一系列的氨基酸，从而形成蛋白质、多肽或肽序列。编码序列、结构序列和结构核酸序列可被包含在更大的核酸分子、载体等中。此外，这些序列中核苷酸的顺序排列可以以序列表、图、表、电子介质等的形式来记载。
短语“密码子简并性”是指遗传密码的差异(divergence)，其允许核苷酸序列变化而不影响其编码的多肽的氨基酸序列。因此，本发明涉及下述任何核酸片段，其包含编码完整或大部分的本文所述的氨基酸序列的核苷酸序列。本领域熟练技术人员在采用核苷酸密码子表现特定氨基酸的应用中，完全知晓特定宿主细胞所表现出的“密码子偏好性”。因此，当合成用于提高宿主细胞中的表达的核酸片段时，对核酸片段加以设计，从而使其密码子使用频率接近宿主细胞优选密码子使用频率是人们所需要的。
术语“cDNA”是指来源于mRNA并且与其互补的双链DNA。
短语“DNA序列”、“核酸序列”和“核酸分子”是指包含核苷酸顺序排列的物理结构。DNA序列或核苷酸序列可以包含在更大的核苷酸分子、载体等中。此外，这些序列中核酸的顺序排列可以以序列表、图、表、电子介质等形式来记载。
“表达”是指：基因转录产生相应的mRNA和该mRNA翻译产生相应的基因产物(例如肽、多肽或蛋白质)。
“反义RNA的表达”是指：DNA转录产生能与第二RNA分子杂交的第一RNA分子，其中第二RNA分子编码被理想地负调的基因产物。
如本文中的应用，“基因”是指表达特定蛋白质的核酸片段，其包括编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指天然发现的并携带其自身调控序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的，包含天然状态不一起存在的调控和编码序列的任何基因。从而，嵌合基因可包括不同来源的调控序列和编码序列，或相同来源的、但以不同于天然存在方式排列的调控序列和编码序列。“内源基因”是指存在于物种基因组中天然位点的天然基因。“外源基因”或“转基因”是指通过转化步骤导入基因组的非天然基因。
“半合的(hemizygous)”是指只具有一个拷贝的特定基因的二倍体个体(例如，由于染色体缺失)。“纯合的”是指两个同源染色体中的具有相同等位基因的基因对。
“异源的”是指来源于不同来源的两个或多个核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果所述复合体不是正常天然存在的，则启动子对于编码序列来说是异源的。此外，特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说可以是“异源的”(例如，不是天然存在于该特定细胞或生物体中)。
“同源性”是指两个或多个核酸或氨基酸序列在位置同源性百分比(例如序列相似性或同源性)方面的相似水平。同源性还指不同核酸或蛋白质中的相似功能性质的概念。
“杂交”是指：当两条核酸链具有足够的序列互补性时，核酸第一链与第二链通过氢键碱基配对的能力。如本文中的应用，如果两条核酸分子显示出完全互补性，则其中一条核酸分子被认为是另一核酸分子的“互补体”。如本文中的应用，当一分子的每一核苷酸与另一分子的核苷酸互补时，该两分子被认为是表现出“完全互补性”。当两条核酸链可具有足够的稳定性彼此杂交，进而允许其在适当的条件下彼此保持退火状态时，所述两条核酸链被认为是具有足够的互补性。
短语“标记辅助筛选”或“标记辅助育种”是指遗传标记在确定和筛选具有优势表型潜能的植物方面的应用。通过标记基因作和性状基因座间的连锁特征，可采用在先确定的与一个或多个性状基因座相关的遗传标记来揭示性状基因座的基因型。可根据其连锁标记基因座的基因型来选择含有目的特征等位基因的植物。
短语“育种群”是指基于鉴定一个或多个具有目的表型特征的个体的目的所产生的遗传异质(heterogeneous)群体。术语“表型”是指所观察到的一种或多种植物特征的表达。
“遗传标记”是以形态学、生物化学或核酸为基础的任意表型差异，其反应了DNA多态性。遗传标记的例子包括但不仅限于RFLPs，RAPDs，等位酶，SSRs，和AFLPs。
短语“标记基因座”是指遗传标记揭示的DNA多态性的遗传确定的位置。“性状基因座”是指一个或多个基因(等位基因)集合的遗传确定的位置，所述基因与观察到的特征有关。
短语“限制性片段长度多态性”(RFLP)是指以DNA为基础的遗传标记，其中通过杂交可观察到限制性内酶切产生的DNA片段的大小差异(Botstein等，Am.J.Huni..Gene t.，32：314-331(1980))。
短语“随机扩增多态性DNA”(RAPD)是指以DNA为基础的遗传标记，其中使用了短的、序列随机的引物，同时所获得的扩增产物大小不一，并且观察到扩增模式中存在差异(Williams etal.，NucleicAcids Res.，18：6531-6535(1990))。
短语“简单序列重复”(SSR)是指以DNA扩增为基础的遗传标记，其中扩增了串联重复序列基元(motifs)的短扩增片段，同时所获得的扩增产物大小不一，并且观察到核苷酸重复的长度存在差异(Tautz，Nucleic Acids Res.，112：4127-4138(1989))。
术语“AFLP”是指以DNA扩增为基础的遗传标记，其中限制性内切酶产生的DNA片段与有助于限制性DNA片段扩增的短DNA片段相连接(Vos等，Nucleic Acids Res.，23：4407-4414(1995))。扩增片段大小不一，并且观察到扩增模式中存在差异。
短语“可操纵连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性空间排列。例如，启动子区域可位于核酸序列相关的位置，该位置使得可通过启动子区域来指导核酸序列的转录。由此，启动子区域“可操纵连接”于核酸序列。
术语“启动子”或“启动子区域”是指通常存在于编码序列上游(5′)，能指导核酸序列转录成mRNA的核酸序列。启动子或启动子区域典型地提供了RNA聚合酶和正确启动转录所需的其它因子的识别位点。如本文所示的那样，启动子或启动子区域包括：通过插入或缺失调节区域，使启动子随机或定点突变等方法产生的启动子的变体。可根据其产生的RNA的量，或在细胞或组织中累积的蛋白质的量，相对于采用类似方法测量的第二启动子来测量启动子的活性或强度。
短语“3′非编码序列”是指位于编码区下游、包括多聚腺苷酸识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列的核苷酸序列。多聚腺苷酸信号通常以影响多聚腺苷酸短链添加至mRNA前体的3’末端为特征。不同的3′非编码序列的应用在Ingelbrecht等，Plant Celt 671-680(1989)中有记载。
“翻译前导序列”或“5′非翻译区”或“5′-UTR”均是指位于基因启动子序列和编码序列之间的核苷酸序列。所述的5′-UTR存在于翻译起始序列的完全加工的mRNA上游。所述的5′-UTR可能会影响初级转录子被加工成为mRNA的过程、mRNA稳定性或翻译效率。翻译前导序列的例子在(Turner and Foster，MolecularBioteclanology，3：225(1995))中有记载。
“RNA转录子”是指RNA聚合酶催化DNA序列转录产生的产物。当所述RNA转录子为DNA序列的优选互补拷贝时，是指它可以是初级转录产物，或者它可以是来源于对初级转录产物进行转录后加工的RNA序列，或者是指作为成熟RNA。“信使RNA”(mRNA)是指不包括内含子并可被细胞翻译成多肽的RNA。“正义RNA”是指包括mRNA从而可被细胞翻译成为多肽的RNA转录子。“反义RNA”是指与目的mRNA互补的RNA转录子，从而能产生特定的RNA：RNA二体，这是通过反义RNA反应物和目的mRNA之间的碱基配对形成的。
“重组载体”是指下述任意的介质，通过该介质或在其中，感兴趣的核酸可以扩增、表达、或储存，例如质粒、粘粒、病毒、自主复制序列、噬菌体，或线状单链、环状单链、线状双链、或环状双链的DNA或RNA核酸序列。所述重组载体可以是任何来源的，并且能够进行基因组整合或自主复制。
“调控序列”是指位于编码序列上游(5′)，之中，或下游(3′)的核苷酸序列。此外，内含子也可能具有调控活性。典型地，编码序列的转录和表达受到调控序列的存在和缺失的影响。
“基本上同源”是指利用Omiga程序采用默认参数(Version 2.0；Accelrys，San Diego，CA)，经过CLUSTAL W方法计算得出两个序列间至少有约90％的序列相同性。
“基本上纯化”是指与其天然状态下通常结合的其它分子基本上分离的分子。更优选地，基本上纯化的分子是在制剂中存在的主要种类。基本上纯化的分子可以多达约60％不含，更优选约75％不含，进一步优选约90％不含，和最优选约95％不含存在于天然混合物中的其它分子(除了溶剂之外)。短语“基本上纯化”不试图包括以其天然状态下存在的分子。
术语“转化”是指将核酸导入受体宿主中。术语“宿主”是指细菌细胞、真菌、动物或动物细胞、植物或种子、或任何植物部位或组织，其包括植物细胞、原生质、愈伤组织(calli)、根、块茎、种子、茎、叶、秧苗、胚芽和花粉。
如本文中的应用，“转基因植物”是携带稳定导入其基因组，例如，核或质粒基因组的核酸的植物。
术语“种子”和“核仁”被理解为具有相同的含义。术语核仁经常用于描述玉米或水稻植物的种子。在所有植物中，所述种子是由种皮、胚芽组成的成熟胚珠，在本发明的植物中，是指胚乳。
HOI001 GBSS核酸
本发明提供了编码与分离自近交体植物HOI001的颗粒结合型淀粉合酶(HOI001 GBSS)基本上同源的多肽的核酸。在一实施方案中，本发明上下文中的这些核酸分子用于增加植物组织中的油脂含量。在一实施方案中，本发明提供了编码HOI001 GBSS蛋白质的分离的核酸，所述核酸选自由SEQ ID NO：1及其互补链，以及与SEQ ID NO：3具有至少约94％的序列同源性的核酸构成的组。本发明核酸编码的多肽的百分比序列相同性优选至少约95％，最优选至少约98％。
本发明还提供了包含这类HOI001 GBSS核酸的载体。如下文中的进一步详述，优选的核酸包括与其可操纵连接的适当的调控元件，所述元件有助于在宿主中高效表达本发明的核酸，所述宿主包括但不仅限于细菌、真菌或植物宿主。本发明上下文中使用的载体可包括这类调控元件。
本发明包括的核酸和载体并不需要在文中详细记载其确切核酸序列。相反的，这类核酸和载体的序列可以改变，只要所述核酸展现其预期的功能或具有一些其它的作用，例如，作为用于互补核酸的核酸探针。例如，在HOI001 GBSS核酸的任何部分中，某些序列变异是允许的，只要采用突变或变异的一种或多种多肽转化的植物能产生与HOI001 GBSS基本上类似的表型。最优选地，与具有相同或类似基因型但没有转基因的植物相比，上述序列变异可导致植物组织中油脂累积增加。
SEQ ID NO：1的片段和变异的核酸也包括在本发明中。包括在本发明中的核酸片段存在3种一般类型。第一，非全长、但的确显示出其预期功能的核酸片段包括在本发明中。第二，在此被认为具有杂交探针用途的核酸片段也包括在本发明中。第三，在此被认为可在本领域已知的抑制技术中应用的核酸片段，例如，反义技术或RNA抑制(RNAi)，比如其用于还原植物中的碳流成为油脂，提供更多的碳用于蛋白质或淀粉聚集。因此，核酸序列片段，例如SEQ ID NO：1可以为至少约15个核苷酸，约17个核苷酸，约18个核苷酸，约20个核苷酸，约50个核苷酸，约100个核苷酸或更多的核苷酸。一般来说，本发明的核酸片段可以具有任意的长度上限，只要其在序列上涉及本发明的核酸，不用包括其全长。
如本文中的应用，“变异体”与参考或野生型序列相比具有基本上类似或基本上同源的序列。对编码蛋白质的核酸序列而言，由于遗传密码简并性，变异体还包括编码与参考蛋白质具有相同氨基酸序列的那些序列。变异核酸还包括下述核酸，其编码与本文所确定的蛋白质具有不完全一致氨基酸序列的多肽、但编码氨基酸序列中具有保守变化的活性蛋白质。
本发明不仅限于所述核酸序列的静止改变，其还包括导致本发明多肽氨基酸序列发生保守改变的变异核酸序列。由于确定蛋白质生物功能活性是蛋白质的相互作用能力和特性，可在蛋白质序列中进行某些氨基酸序列取代，当然其基础DNA编码序列也会改变，虽然如此，仍然可以获得具有类似特性的蛋白质。发明者认为，可在本发明的蛋白肽序列或片段中，或编码所述肽的相应DNA序列中进行各种改变，在其生物利用性或活性方面不产生可察觉的损失，也是本发明所包括的。根据本发明，本发明的参考核酸和变异体通过一个或多个取代、添加、插入、缺失、融合和截短，从而在所编码的氨基酸序列方面存在差异，取代、添加、插入、缺失、融合和截短可以任意组合，只要变异体核酸能编码活性HOI001 GBSS蛋白质。这类变异体核酸不会编码与参考核酸完全相同的氨基酸序列，不过其只发生保守序列变化。能编码这类保守氨基酸取代的密码子是本领域公知的。
另一种确定保守氨基酸取代的方法需要考虑氨基酸亲水指数分析。本领域技术人员通常能够理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能方面的重要性(Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.，157：105-132(1982))。一般而言，氨基酸相对亲水性与多肽的二级结构相关，从而决定了所述蛋白质与其它分子，例如，酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。
根据其疏水性和电荷特征对每一种氨基酸进行了亲水指数赋值(Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.，157：105-132(1982))；这些为：异亮氨酸(+4.5)，缬氨酸(+4.2)，亮氨酸(+3.8)，苯丙氨酸(+2.8)，半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)，蛋氨酸(+1.9)，丙氨酸(+1.8)，甘氨酸(-0.4)，苏氨酸(-0.7)，丝氨酸(-0.8)，色氨酸(-0.9)，酪氨酸(-1.3)，脯氨酸(-1.6)，组氨酸(-3.2)，谷氨酸(-3.5)，谷氨酰胺(-3.5)，天门冬氨酸(-3.5)，天门冬酰胺(-3.5)，赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
在进行这类改变时，优选的是亲水指数在±2以内的氨基酸取代，那些在±1以内的特别优选，那些在±0.5以内的更加优选。
本领域中同样可以理解，在亲水性基础上可以有效进行类似氨基酸取代。美国专利4,554,101中记载由其相邻氨基酸的亲水性决定的蛋白质最大位点平均亲水性与蛋白质的生物特性相关。
如美国专利4,554,101中所详述的，对氨基酸残基进行了亲水性赋值：精氨酸(+3.0)，赖氨酸(+3.0)，天门冬氨酸(+3.0±1)，谷氨酸(+3.0±1)，丝氨酸(+0.3)，天门冬酰胺(+0.2)，谷氨酰胺(+0.2)，甘氨酸(0)，苏氨酸(-0.4)，脯氨酸(-0.5±1)，丙氨酸(-0.5)，组氨酸(-0.5)，胱氨酸(-1.0)，蛋氨酸(-1.3)，缬氨酸(-1.5)，亮氨酸(-1.8)，异亮氨酸(-1.8)，酪氨酸(-2.3)，苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。
在进行这类改变时，优选亲水值在±2以内的氨基酸取代，那些在±1以内的特别优选，那些在±0.5以内的更加优选。
可根据与参考核酸的同源性程度，来确定和特征性描绘静止和保守变化的变异体核酸。优选的变异体核酸与本发明的参考核酸基本上同源。如本领域技术人员所知道的，这类基本上类似的核酸可在严谨条件下与本文中SEQ ID NO：1所定义的参考核酸杂交。这类基本上同源的核酸包含在本发明范围中。
可通过标准杂交方法来检测和分离变异体核酸。为了检测或分离这类序列而进行的杂交通常在“中等严谨”，优选在“严谨”条件下进行。本文上下文的核酸杂交实验，如Southern和northern杂交实验中采用的中等严谨杂交条件及其相关的中等严谨和严谨杂交洗涤条件是取决于序列的，并且在不同环境参数下有所不同。较长序列能在较高温度下特异性杂交。核酸杂交的广泛性的指南可参见Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第1页，第2章″Overview of principles of hybridization and the strategyof nucleic acid probeassays″Elsevier，NY(1993)。还可参见J.Sambrook等：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Press，NY，pp 9.31-9.58(1989)；J.Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress，NY(3rd ed.2001)。
本发明还提供了检测和分离编码本文提供的蛋白质的衍生物或变异体核酸的方法。该方法涉及将包含关于HOI001 GBSS相关序列的SEQID NO：1任意部位的核酸的至少部分与样品核酸杂交，从而形成杂交复合体；并检测杂交复合体。复合体的存在与衍生物或变异体核酸的存在相关，可通过核酸测序、RNA和/或蛋白质的表达和用于确定当转化至植物中时，衍生物或变异体是否保持了增加植物组织中油脂水平的能力的试验来进一步鉴定上述核酸。一般而言，用于杂交的、包含SEQ ID NO：1任意部位的核酸部分优选为至少15个核苷酸，并且杂交在足够严谨的杂交条件下进行，从而允许检测和分离到基本上同源的核酸；优选地，所述杂交条件是“中等严谨”的，更优选地，所述杂交条件为“严谨”的，上述条件在本文中和本领域公知的传统分子生物学技术背景中有定义。
一般而言，在确定的离子强度和pH条件情况下，高度严谨杂交和洗涤条件选用比特定双链序列热熔点低约5℃的条件。例如，在“高度严谨条件”或“高度严谨杂交条件”下，核酸与其互补链发生的杂交的程度将比与其它序列杂交的程度更高，这是可检测到的高(例如，至少超出背景2倍)。通过控制杂交和/或洗涤条件的严谨度，100％互补的核酸可被鉴定和分离得到。
典型地，严谨杂交条件为：盐浓度低于约1.5M Na离子，典型地，约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，pH 7.0至8.3，并且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)来说温度至少约30℃，对于长探针来说温度至少约60℃(例如，多于50个氨基酸)。通过添加去稳定剂例如甲酰胺也可实现严谨条件，在该情况下杂交温度可被降低。硫酸葡聚糖(dextran sulfate)和/或Denhardt′s溶液(50×Denhardt′s为5％Ficoll，5％聚乙烯吡咯烷酮，5％BSA)也可包含在杂交反应液中。
低严谨条件的例子包括采用具有30至50％甲酰胺，5×SSC(20×SSC为3M NaCl，0.3M柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠，pH7，5mM EDTA，0.1％SDS(十二烷基磺酸钠)，加入100μg/ml变性鲑鱼精DNA的5×Denhardt′s的缓冲液在37℃下进行杂交，并置于1×至5×SSC(20×SSC为3.0M NaCl和0.3M柠檬酸三钠)，0.1％SDS中在37℃下洗涤。中等严谨条件的例子包括采用具有40至50％甲酰胺，5×SSC，50mM磷酸钠，pH7，5mM EDTA，0.1％SDS，加入100μg/ml变性鲑鱼精DNA的5×Denhardt′s的缓冲液在42℃下进行杂交，并置于0.1×至2×SSC，0.1％SDS中在42℃至55℃下洗涤。高度严谨条件的例子包括采用具有50％甲酰胺，5×SSC，50mM磷酸钠，pH7.0，5mM EDTA，0.1％SDS，加入100μg/ml变性鲑鱼精DNA的5×Denhardt′s的缓冲液在42℃下进行杂交，并置于0.1×SSC，0.1％SDS中在60℃至65℃下洗涤。
在本发明的另一实施方案中，利用本领域公知的分析程序，根据特定核酸与同纲的其它物种间百分比相同性的关系来定义本发明的核酸。这类分析程序包括，但不仅限于：PC/Gene程序中的CLUSTAL(可从Intelligenetics，Mountain View，CA，或Omiga程序version2.0Accelrys Inc.，San Diego，CA获得)；ALIGN程序(Version2.0)；以及Wisconsin Genetics软件包，Version8(可从GeneticsComputer Group(GCG)，575 Science Drive，Madison，WI获得)中的GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA，和TFASTA。采用默认参数，利用这些程序可进行序列比对。CLUSTAL程序详细记载于Higgins等，Gene，73：237-244(1988)；Higgins等，CABIOS，5：151-153(1989)；Corpet等，Nucleic Acids Res.，16：10881-10890(1988)；Huang等，CABIOS，8：155-165(1992)；和Pearson等，Meth.Mol.Biol.，24：307-331(1994)中。ALIGN程序基于Meyers & Miller算法，参见Computer Applic.Biol.Sci.，4：11-17(1988)。Altschul等，J.Mol.Biol.，215：403(1990)中记载的BLAST程序基于Karlin &Altschul算法，参见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87：2264-2268(1990)。基于比较的目的，为了实现缺口比对，可采用记载于Altschul etal.，Nucleic AcidsRes.，25：3389(1997)中的Gapped BLAST(以BLAST 2.0进行)。或者，PSI-BLAST(以BLAST2.0)可用于进行重复检索从而可检测分子间的远近关系。参见Altschul等，supra.。当采用BLAST，Gapped BLAST，PSI-BLAST时，可分别采用所述程序中的默认参数(例如，用于核苷酸序列的BLASTN，和用于蛋白质的BLASTP)。BLAS TN程序(用于核酸序列)采用的默认值为：字节长度(W)11，期望值(E)10，截短100，M＝5，N＝-4，并且进行双链比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序采用的默认值为：字节长度(W)3，期望值(E)10，和BLOSUM62记分矩阵(参见Henikoff& Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：10915(1989))(参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.)。比对还可通过人工观测来进行。
就本发明的目的而言，优选采用运用其默认参数的BLASTN(版本1.4.7或更高)程序，或任何其它等同的程序对核酸序列进行比较，从而确定其与本文所公开的核酸序列间的序列百分比相同性。“等同程序”是指下述任意的序列比较程序，对于进行查询的任意两条序列来说，与优选程序所得的对应比较结果相比，所述程序能产生具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同序列百分比相同性的比对结果。
表达载体和表达盒
本发明的表达载体和表达盒包括编码HOI001 GBSS的核酸。包含HOI001 GBSS的转基因可被亚克隆至表达载体或表达盒中，并且HOI001GBSS的表达可被检测和/或测量。这种筛选方法可用于鉴定为HOI001GBSS表达提供的转基因以及HOI001 GBSS在转化的植物细胞中的表达。
可以在原核和真核细胞中容易地筛选、扩增和转基因转化的质粒载体包括：例如，pUC-系列载体，pSK-系列载体，pGEM-系列载体，pSP-系列载体，pBS-系列载体，用于杆状病毒表达的pFastBac(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)和用于酵母表达的pYES2(Invitrogen)。在这类载体中还可存在另外的元件，包括能使载体自主复制的复制起点，选择性标记基因，其优选编码抗生素或除草剂抗性，能允许向转基因中多位点插入所编码的基因或DNA序列的特定多克隆位点和增强原核和真核细胞转化的序列。一种能用于植物和原核细胞表达的载体为双元Ti质粒(如Schilperoot等的美国专利4,940,838所公开的那样)，例如载体pGA582。该双元Ti质粒载体以前曾在Methods in Enzymology，153：292(1987)中有描述。这类双元Ti载体可在原核细菌，例如E.coli和农杆菌(Agrobacterium)中复制。农杆菌质粒载体还可用于将转基因转移至植物细胞中。所述双元Ti载体优选包括能有效进行植物细胞转化的T DNA左边界和右边界，选择标记基因，位于T边界区域的特定多克隆位点，colE1复制起点和宿主范围广泛的复制子。携带本发明转基因的双元Ti载体可用于转化原核和真核细胞，但是其优选用于转化植物细胞(参见Glassman等，U.S.专利5,258,300)。植物表达载体的例子包括商业化的载体pBI101，pBI101.2，pBI101.3，和pBIN19(Clontech，PaloAlto，CA)。
一般而言，除了编码HOI001 GBSS的核酸外，本发明的表达载体和表达盒还至少包括：能在植物细胞中表达RNA的启动子和终止子。其它元件还可存在于本发明的表达盒中。例如，表达盒还可含有，增强子、内含子、非翻译前导序列、克隆位点、为了消除染色体控制元件影响的基质附着区和本领域熟练技术人员公知的其它元件。
表达盒具有能调控基因表达的启动子。在真核和原核细胞中，启动子区域典型地位于编码区上游DNA序列的侧翼。启动子序列用于调控下游基因序列的转录，并且典型地包括约50至约2000个核苷酸碱基对。启动子序列还包括调控序列，例如可影响基因表达水平的增强子序列。某些分离的启动子序列可用于异源基因，即不同于天然或同源基因的基因的表达。启动子序列可以已知是强的或弱的或诱导型的。强启动子能提供高水平的基因表达，而弱启动子只能提供非常低水平的基因表达。诱导型启动子是能对外源加入的试剂或环境或发育刺激产生应答而开启和关闭基因表达的启动子。启动子还可用于组织特异性或发育调节。对于异源基因来说是强启动子的分离的启动子序列是有益的，因为其能够提供足够水平的基因表达，从而允许容易地检测和筛选转化细胞，并且在希望时，可以提供高水平的基因表达。优先在种子组织中表达，并且在其它植物部位无法检测到的转录起始区域被认为对于种子油脂改良来说是很理想的，这是为了使基因产物的任何破坏性或副作用最小化。
本发明的启动子通常包括但是不仅限于，在细菌、植物细胞、或质体中具有功能的启动子。用于细菌表达的有用的启动子是lacZ，T7，T5，或E.coli glg C启动子。植物细胞中有用的启动子包括小麦高分子量麦谷蛋白启动子(Genbank登记号X12928的2647-3895bp，版本X12928.3，原始记载于Anderson等，Nucleic AcidsRes.，17：461-462(1989))，球蛋白启动子(参见Belanger和Kriz，Genet.，129：863-872，(1991))，γ玉米蛋白Z27启动子(参见U.S.SerialNumber 08/763,705；和Lopes等，Mol Gen Genet.，247：603-613(1995))，L3 oleosin启动子(U.S.专利6,433,252)，CaMV35S启动子(Odell等，Nature，313：810(1985))，CaMV 19S(Lawton等，Plant Mol.Biol.，9：31F(1987))，nos(Ebert等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，84：5745(1987))，Adh(Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，84：6624(1987))，蔗糖合成酶(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，87：4144(1990))，微管蛋白，肌动蛋白(Wang等，Mol.Cell.Biol.，12：3399(1992))，cab(Sullivan等，Mol.Gen.Genet.，215：431(1989))，PEPCase启动子(Hudspeth等，Plant Mol.Biol.，12：579(1989))，或那些与R基因复合体相关的启动子(Chandler等，The Plant Cell，1：1175(1989))。
事实上，在一种优选实施方案中，所采用的启动子在胚乳中高度表达。启动子的例子包括那些来源于玉米蛋白(zein)的启动子，它们是在玉米胚乳中发现的一组贮存蛋白。对于玉米蛋白基因的基因组克隆也被分离到(Pedersen等，Cell，29：1015-1026(1982)和Russell等，Transgenic Res.，6(2)：157-168(1997))，来自这些克隆的启动子也可采用，所述的启动子包括15KD，16KD，19KD，22KD，和27KD基因(Z27，U.S.序列编号08/763,705；以及Reina等，Nucl.AcidsRes.，18：6426(1990)，Lopes等，Mol.Gen.Genet.，247：603-613(1995))。已知在玉米和其它植物中具有功能的其它优选启动子包括用于如下基因的启动字：WAXY(颗粒结合型淀粉合酶；Shure等，Cell，35：225-233(1983)；Russell等，Transgenic Res.，6(2)：157-168(1997))，Brittle 2和Shrunken 2(ADP葡萄糖焦磷酸化酶(pryophosphorylase)，Anderson等，Gene，97：199-205(1991)，Russell等，Transgenic Res.，6(2)：157-168(1997))，Shrunken1(蔗糖合酶，Yang和Russell，Proc.Natl.Aca d.Sci.U.S.A，87：4144-4148(1990))，分支酶I和II，水稻WAXY启动子(Terada等，Plant Cell Physiology，41(7)：881-888(2000))，脱支酶，谷蛋白(Zheng等，Plant J.，4：357-366(1993)，Russell等，Transgenic Res.，6(2)：157-168(1997))，和Betll(基底胚乳转移层；Huero s等，Plant Physio.，121：1143-1152(1999))。本领域熟练技术人员已知的、本发明实施中有用的其它启动子，也包括在本发明中。
此外，转录增强子或增强子副本可用于增加来自特定启动子的表达。这类增强子的例子包括但不仅限于，来源于CaMV 35S启动子和章鱼碱合酶基因的元件(Last等，U.S.专利5,290,924)。介于转录起始位点和编码序列起始点之间的DNA序列，即非翻译前导序列可影响基因的表达，技术人员也希望能采用特定的前导序列。本领域熟练技术人员能够获得的任意前导序列均可采用。优选的前导序列能指导所附基因的最优水平的表达，例如，通过增加或保持mRNA稳定性和/或通过防止翻译不正确的起始(Joshi，Nucl.Acid.Res.，15：6643(1987))。由本领域熟练技术人员来判断这类序列的选择。来源于在高等植物以及特别是在大豆、玉米和油菜中高效表达的基因的序列被包括在内。
本发明的表达盒还包括在所述表达盒3′端附近的序列，其作为信号发生作用，以终止来源于异源核酸的转录，同时指导所获得的mRNA多聚腺苷酸化。其通常被称作3′非翻译区或3′UTRs。可作为转录终止信号使用的某些3′元件包括小麦HSP17 3′UTR(GenBank X13431的532-741bp位，版本X13431.1，McElvain and Spiker，Nucleic AcidsRes.，17：1764(1989))，那些来源于Agrobacterium tumefacìens的胭脂氨酸合酶基因的3′UTR(Bevan等，Nucl.Acid Res.，11：369(1983))，napin 3′UTR(Kridl等，Seed Sci Res.，1：209-219(1991))，球蛋白3′UTR(Belanger and Kriz，Genetics，129：863-872(1991))，或者来源于玉米蛋白基因，例如Z27的3′UTR(Lopes等，Mol Gen Gebiet.，247：603-613(1995))。本领域熟练技术人员已知的其它3′元件均可在本发明的载体中使用。
当希望时，调控元件，例如Adh内含子1(Callis等，GenesDevelop.，1：1183(1987))，水稻肌动蛋白内含子(McElroy等，Mol.Gell.Genet.，231(1)：150-160(1991))，蔗糖合酶内含子(Vasil等，Plant Physiol.，91：5175(1989))，玉米HSP70内含子(Rochester等，EMBO J.，5：451-458(1986))或TMVω元件(Gallie等，The Plant Cell，1：301(1989))也可进一步包括在内。可采用如An，Methods inEnzymology，153：292(1987)所述的方法来获得这些3′非翻译调控序列，这类序列还可存在于可从商业来源购得的质粒中，例如Clontech，Palo Alto，CA。3′非翻译调控序列可以可操纵地与本发明载体包含的表达盒所表达的任意异源核酸的3′末端相连接。本发明实施中有用的其它这类调控元件属于本领域熟练技术人员公知的技术，其也可置于本发明的载体中。
可采用编码相同氨基酸的其它密码子来替换一个或多个密码子来使所述多肽能在载体导入的植物种的翻译机制下进行最佳的翻译，从而优化本发明的载体和本文要求保护的编码区在植物中的表达。
选择性标记
选择性标记基因或报告基因也可用于本发明。这类基因可给表达标记基因的细胞带来独特的表型，从而能允许将这类转化的细胞与不携带标记的细胞区分开。选择性标记基因具有一种可通过化学手段，也就是通过使用选择性试剂(例如，除草剂、抗生素或其类似物)来“选择”的特性。报告基因，或筛选基因具有可通过观察和测试，也就是“筛选”(例如，R-位点特性)来鉴定的特征。显然，很多合适的标记基因的例子为本领域所公知，并且可在本发明的实施中采用。
很多选择性标记基因为本领域已知，并且可在本发明中应用。可在本发明中应用的优选的选择性标记基因包括对诸如草甘膦的除草剂具有抗性的基因，例如EPSP(Della-Cioppa等，Bio/Teclmology，5(6)：579-84(1987))。特别优选的选择性标记基因包括编码变异的EPSP合酶蛋白的基因(Hinchee等，Biotech.，6：915(1988))。可与本发明联合使用的其它可能的选择性标记包括但不仅限于：neo基因(Potrykus等，Mol.Gen.Genet.，199：183(1985))，其编码卡那霉素抗性并可通过加入卡那霉素、卡那霉素类似物例如geneticin(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)等来筛选；编码双丙氨膦抗性的bar基因；腈水解酶基因，例如来源于Klebsiellaozaenae的bxn，其对溴草腈具有抗性(Stalker等，Science，242：419(1988))；突变体乙酰乳酸合酶基因(ALS)，其赋予对咪唑啉酮、磺酰脲类或其它ALS抑制化合物的抗性(EP 154 204A1(1985))；甲氨喋呤抗性的DHFR基因(Thill et al.，J.Biol.Chem.，263：12500(1988))；对除草剂茅草枯具有抗性的茅草枯脱卤酶基因。当采用突变EPSP合成酶基因时，通过掺入适当的质体转运肽(CTP)可获得额外的效果。
可采用的可筛选标记包括但不仅限于：β-葡萄糖醛酸酶或uidA基因(GUS)，其编码具有多种已知显色底物的酶；R-基因座基因，其编码的产物能对植物组织中花色素苷色素(红素)的生产进行调控(Dellaporta等，In Chromosome Structure and Function，pp.263-282(1988))；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75：3737(1978))，其编码具有多种已知显色底物的酶(例如，PADAC，一种显色头孢菌素)；xylE基因(Zukowsky等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：1101(1983))，其编码转化显色儿茶酚的儿茶酚二加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikuta等，Biotech.，8：241(1990))；酪氨酸酶基因(Katz等，J.Gen.Microbiol.，129：2703(1983))，其编码能将酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌(dopaquinone)的酶，上述物质浓缩可形成容易检测的复合黑色素；β-半乳糖苷酶基因，其编码一种具有显色底物的酶；荧光素(lux)酶基因(Ow等，Science，234：856(1986))，其允许生物发光检测的进行；或水母发光蛋白(Aequorin)基因(Prasher等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，126：1259(1985))，其可在钙敏感生物发光检测中采用，或绿色荧光蛋白基因(Niedz等，Plant Cell Reports，14：403(1995))。在优选实施方案中，可筛选标记基因与如Kriz等，在美国专利6,307,123中所记载的麦粉蛋白粒特异性启动子可操纵地连接。
除了植物核转化，本发明还包括直接向植物质体基因组的转化。因此，通过直接将基因运送至细胞内腔室也可以实现基因产物靶向至植物细胞内的细胞腔室。在一些实施方案中，直接进行质体基因组转化可带来超出核转化之外的益处。例如，直接进行HOI001 GBSS质体转化则无需质体靶向多肽和，以及对从相应核转化子获得的前体蛋白质的进行的翻译后转运和加工过程。植物质体转化记载于P.Maliga，Current Ppinion in Plant Biology，5：164-172(2002)，Heifetz，Biochimie，82：655-666(2000)，Bock，J.Mol.Biol.，312：425-438(2001)，和Daniell等，Trends in Plant Sicence，7：84-91(2002)及其引用的参考文献中。
在构建了含有HOI001 GBSS的转基因后，然后可将表达载体或表达盒导入植物细胞中。根据植物细胞的类型、基因表达的水平和基因编码的酶活性，将编码HOI001 GBSS的DNA导入植物细胞可使植物组织中的油脂含量增加。
植物转化
采用核酸构建体，例如载体转化植物细胞、植物组织、植物器官或植物的技术是本领域已知的。例如，这类方法包括植物组织培养技术。如本文中的应用，“转化”是指：将核酸导入受体宿主并在宿主中进行表达。
植物细胞、植物组织、植物器官或植物可通过本领域已知的任何适当的方式与载体接触。优选地，产生出能表达目的蛋白质的转基因植物。用于将编码目的蛋白质的目的多核苷酸序列导入植物细胞中的各种方法包括但不仅限于：(1)物理方法，例如显微注射(Capecchi，Cell，22(2)：479-488(1980))，电穿孔(Fromm等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，82(17)：5824-5828(1985)；U.S.专利5,384,253)，以及微粒轰击介导的转化(Christou等，Bio/Technology，9：957(1991)；Fynan等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，90(24)：11478-11482(1993))；(2)病毒介导的转化方法(Clapp，Clin.Perinatol.，20(1)：155-168(1993)；Lu等，J.Exp.Med.，178(6)：2089-2096(1993)；Eglitis & Anderson，Biotechniques，6(7)：608-614(1988)；和(3)Agrobacterium介导的转化方法。
转化植物细胞最常用的方法是Agrobacterium介导的DNA转化方法(Fraley等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，80：4803(1983))和微粒轰击介导的方法。典型地，核转化是理想的，但是对质体，例如叶绿体或淀粉形成体进行特定转化也是理想的，在特定的植物物种中，例如烟草、拟南芥(Arabidopsis)、马铃薯和芸苔(Brassiaca)物种中，可采用微粒轰击介导的转化方法将目的多核苷酸转化至植物质体中。
通过采用农杆菌(Agrobacterium)属的经遗传工程改造的土壤细菌可以实现农杆菌介导的转化。一些农杆菌物种可介导被称作“T-DNA”的特定DNA的转移，“T-DNA”可经遗传工程改造从而能将任何目的DNA片段导入许多植物物种中。标志T-DNA介导的致病过程发生的重要事件是：毒性基因的导入，加工，T-DNA的转移。该过程是许多参考文献的主题(Ream，Ann.Rev.Plrytopatlaol.，27：583-618(1989)；Howard & Citovsky，Bioassays，12：103-108(1990)；Kado，Crit.Rev.Plant Sci.，10：1-32(1991)；Zambryski，Annual Rev.Plant Pliysiol.Plant Mol.Biol.，43：465-490(1992)；Gelvin，In Transgenic Plants，Kung and Wu，(eds.)，Academic Press，SanDiego，CA，pp.49-87(1993)；Binns and Howitz，In BacterialPathogenesis of Plants and Animals，Dang，(ed.).Berlin：Springer Verlag，pp.119-138(1994)；Hooykaas andBeijersbergen，Ann.Rev.Phytopathol.，32：157-179(1994)；Lessl and Lanka，Cell，77：321-324(1994)；Zupan and Zambryski，Annual Rev.Phytopathol.，27：583-618(1995))。
农杆菌介导的植物遗传转化涉及许多步骤。第一步，先将致病农杆菌和植物细胞相互接触，其通常被称作“接种”。通过倒掉或吸出的方式将含有农杆菌的液体从与外植体接触的状态移开。接种后，使农杆菌和植物细胞/组织在适合生长和T-DNA转移的条件下一起生长数小时至几天或更长的时间。该步骤被称作“共培养”。共培养和T-DNA运送后，采用杀菌剂或抑菌剂来处理植物细胞，从而杀死与外植体和/或含有外植体的容器中残留的农杆菌。如果该步骤是在缺乏能促进转基因细胞比非转基因植物细胞优先生长的任何选择性试剂的情况下进行的，那么该步骤典型地被称作“延迟”步骤。如果是在存在有利于转基因植物细胞的选择性压力情况下进行的，那么它被称作“选择”步骤。当使用“延迟”时，典型地，跟随有一个或多个“选择”步骤。“延迟”和“选择”步骤都典型地包括能杀死任何残留农杆菌细胞的杀菌剂或抑菌剂，这是因为在感染(接种和共培养)步骤之后，农杆菌细胞的生长是人们不想见到的。
许多携带Ti或Ri质粒的野生型和温和型(disarmed)根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)都可用于向植物进行基因转化。所述农杆菌宿主含有温和型Ti或Ri质粒，其不含能导致肿瘤发生或生根的致癌基因，其可作为载体使用，并且含有随后被导入植物中的感兴趣的基因。优选的菌株包括但不仅限于：根癌农杆菌菌株C58，这是用于介导DNA转化至植物细胞的胭脂碱型(nopaline-type)菌株；章鱼碱型(octopine-type)菌株例如LBA4404；或succinamopine-型菌株，例如EHA101或EHA105。以DNA组合物形式体外制备的核酸分子被导入至合适的宿主例如E.coli中，并与农杆菌杂交，或直接转化至感受态农杆菌中。这些技术均为本领域熟练技术人员所公知。
所述农杆菌可通过直接接种甘油贮存液至液体培养基(例如，Luria Burtani(LB)培养基)，或取甘油贮存液划线培养至固化培养基的方式来制备，其中让细菌在适当的选择性条件，一般约26℃-30℃，或约28℃下培养，并从平板中挑取单克隆或一小接种环农杆菌接种至含有选择性试剂的液体培养基中。农杆菌的培养方法和适合的培养条件，以及随后的接种步骤均为本领域的熟练技术人员所熟悉。用于接种的农杆菌培养物的密度和农杆菌细胞与外植体的比例可根据系统的不同而变化，因此对于这些参数的优化对于任何转化方法来说都是希望的。
典型地，农杆菌培养物接种自划线平板或甘油贮存液中，并培养过夜，并且采用适于接种外植体的培养基来洗涤和重悬上述细菌细胞。
至于微粒轰击技术(U.S.专利5,550,318；5,538,880；和5,610,042；以及PCT公开号WO 95/06128；每一篇均以全文引用的方式并入本文)，采用核酸包被颗粒并通过推进器导入细胞中。颗粒的例子包括钨、铂、和优选的金。值得注意的是，在一些情况下，DNA沉积至金属颗粒上不是利用微粒轰击技术将DNA导入受体细胞所必需的。不过，值得注意的是颗粒可以含有DNA而不是被DNA包被。因此，虽然DNA包被的颗粒可增加DNA经颗粒轰击导入细胞的水平，但是其本身并不是必需的。
对于轰击技术来说，悬浮的细胞需要浓缩至薄膜或固体培养基上。或者，未发育的胚芽或其它目的细胞可排列于固体培养基上。待轰击的细胞被按照适当的距离置于微粒停止板下。
通过微粒轰击方法将DNA导入植物细胞的一种示例性实施方案为Biolistics Particle Delivery System(BioRad，Hercules，CA)，其可用于推进DNA或细胞包被的颗粒穿过一网板(screen)，例如不锈钢或Nytex网板，到达覆盖有悬浮培养的单子叶植物细胞的过滤板表面。所述的网板可使颗粒分散开，从而颗粒不会以大团聚集物的方式导入受体细胞。可以相信，插入投射装置和待轰击细胞之间的网板能减少投射聚集物的大小，而且通过降低了投射物过大造成的受体细胞损害，从而有利于提高转化的频率。
为了进行微粒轰击实验，实验者将DNA附着(也就是“包被”)在微粒上，从而DNA以适于其转化的方式被导入受体细胞。在这方面，为了进行转化，至少一些待转化的DNA必须到达目的细胞，同时在DNA导入过程中所述DNA必须附着在微粒上。因此，当微粒导入目的细胞后，从微粒上获得DNA可以包括待转化DNA和微粒之间连接键的物理逆转过程。不过，当目的细胞获得DNA是DNA或其它包含到微粒的物理附着的分子的未结合片段断裂的结果时，则情况就不必这样了。作为待转化DNA和其它直接或间接附着至微粒上的分子之间的结合键断裂的结果，可进一步实现所述的DNA获得。进一步值得注意的是目的细胞的转化是通过待转化DNA和受体细胞基因组DNA间的直接重组而实现的。因此，如本文中的应用，“被包被”的微粒可以是能用于转化目的细胞的微粒，其中所述的待转化DNA可以被导入目的细胞，并且所述目的细胞可以获得该DNA进而实现转化。
任何允许待转化DNA导入目的细胞的包被微粒的技术均可采用。已证实可很好的应用于本发明的包被微粒的方法在本文中已进行了详细的说明。不过也可采用其它的技术将DNA结合至微粒上。例如，可采用链霉亲和素(streptavidin)和具有长链硫醇(Thiol)可裂解生物素化核苷酸链标记的DNA末端来包被颗粒。所述DNA通过链霉亲和素-生物素间的相互作用附着至颗粒上，但是细胞中存在的还原剂使硫醇连接键还原从而使DNA在细胞中释放。
或者，可通过使金氧化颗粒的表面被功能化，提供游离胺基团来制备颗粒。携带强负电荷的DNA可与功能化颗粒结合。此外，带电荷颗粒可以沉积至在PDS-1000Biolistics装置中使用的聚酯薄膜飞盘表面上的受控阵列中，从而有助于控制导入目的组织的颗粒分布。
如上文所述，进一步说明，用于包被微粒的DNA的浓度可影响含单拷贝转基因的转化子的回收。例如，较低的DNA浓度不会必然改变转化效率，反而有可能增加单拷贝插入事件的比例。基于这种考虑，每1.8mg初始微粒可使用约1ng至2000ng的转化DNA。在本发明的另一实施方案中，每1.8mg初始微粒可使用约2.5ng至1000ng，2.5ng至750ng，2.5ng至500ng，2.5ng至250ng，2.5ng至100ng，或2.5ng至50ng的转化DNA。
微粒轰击技术可广泛使用，并且事实上可用于转化任何植物物种。可通过微粒轰击技术转化的物种的例子包括：单子叶物种，例如玉米(PCT申请号WO 95/06128)、大麦、小麦(U.S.专利5,563,055，其全文以引用方式并入本文)、水稻、燕麦、黑麦、甘蔗和高梁；以及许多双子叶植物，通常包括烟草和大豆(U.S.专利5,322,783，其全文以引用方式并入本文)、向日葵、花生、棉花、西红柿和豆类(U.S.专利5,563,055，其全文以引用方式并入本文)。
对于本发明中的微粒轰击转化技术来说，其物理和生物学参数均可被优化。物理因子是那些涉及对DNA/微粒沉淀进行操纵或那些影响大型或微型颗粒射程(flight)和速度的因子。生物因子包括在轰击前和轰击后紧接着的涉及细胞操纵的全部步骤，例如对目的细胞的渗透调节从而协助减轻轰击造成的损伤，未发育胚芽或其它目的组织相对于粒子弹道的定向，以及待转化DNA的属性，例如线性DNA或完整的超螺旋质粒。可以相信，预轰击操纵对于未发育胚芽的成功转化是非常重要的。
因此，值得注意的是实验者希望可以在小规模研究中调整各类轰击参数，从而充分地优化条件。实验者特别希望能调整物理参数，例如DNA浓度、缺口距离、射程距离、组织距离和氦压力。进一步值得注意的是氦的等级可影响转化效率。实验者还可通过修改那些能影响受体细胞生理状况进而影响转化和整合效率的条件来优化损伤修复因子(TRFs)。例如，为了优化转化，可调整渗透压状况，组织水合作用，和受体细胞的亚克隆状态或细胞周期。
细胞转化的其它方法也可以采用，其包括但不仅限于：通过直接将DNA转入花粉(Hess等，Interna Rev.Cytol.，107：367(1987)；Luo等，Plant Mol Biol.Reporter，6：165(1988))，通过直接将DNA注射入植物繁殖器官(Pena等，Nature，325：274(1987))，通过直接将DNA注射入未发育的胚芽细胞并随后使干燥的胚乳水化(Neuhaus等，Tlzeor.Appl.Genet.，75：30(1987))，来将DNA导入植物。
从单一植物原生质体转化体或各类转化的外植体再生、发育和培养植物的方法均是本领域公知的(Weissbach and Weissbach，In：Methodsfor Plant Molecular Biology，Academic Press，SanDiego，CA，(1988))。上述再生和培养过程典型地包括如下步骤：对经转化细胞的选择、培养上述个体化细胞经过胚芽发育的常规阶段和生根苗阶段。随后，将得到的转基因生根苗种植于适当的植物生长媒介，例如土壤中。
含有编码感兴趣蛋白质的外源基因的植物的再生或发育是本领域公知的。优选地，再生的植物进行自花授粉从而产生纯合体的转基因植物。或者，可将来源于再生植物的花粉与来源于农业重要品系的能产生种子的植物进行杂交。相反，可将来源于这类重要品系的植物花粉用于对再生植物进行授粉。含有目的多肽的本发明的转基因植物可采用本领域熟练技术人员公知的方法进行培养。
存在多种从植物组织中产生再生植物的方法。再生的具体方法由起始的植物组织和待再生的具体植物物种来确定。
在通过聚乙烯乙二醇处理、电穿孔或粒子轰击将核酸分子导入植物细胞的基础上，发展出了基于克隆核酸构建体的瞬时表达的基因表达实验(Marcotte等，Nature，335：454-457(1988)；Marcotte等，Plant Cell，1：523-532(1989)；McCarty等，Cell，66：895-905(1991)；Hattori等，Genes Dev.，6：609-618(1992)；Goff等，EMBO J.，9：2517-2522(1990))。瞬时表达细胞可用于功能区分基因构建体(一般参见Maliga等，Methods in Plant MolecularBiology，Cold Spring Harbor Press(1995))。
本发明的任何核酸分子均可与其它遗传元件，例如载体、启动子、增强子等一起以永久或暂时的方式导入植物细胞。此外，本发明的任何核酸分子均可以以允许所述核酸分子编码的蛋白质或其片段表达或过量表达的方式导入植物细胞中。
转基因植物可应用于对蛋白质或其它分子，例如油脂的商业化生产，其中所述的感兴趣的分子提取或纯化于植物的部分、种子等。还可以对来自上述植物的细胞或组织进行培养、体外生长或发酵，来制备这类分子。
由重组DNA编码的改良可被转移，例如，从一种物种的细胞到其它物种的细胞，例如通过原生质体融合的方式。转基因植物还可被用于商业育种程序，或可用于与相关作物物种的植株进行杂交或育种。例如，可通过杂交将与启动子可操纵连接的本发明的核酸导入特定的植物品种中，而无需直接转化该给定品种的植株。因此，本发明不仅包括直接由根据本发明方法转化的细胞再生所得到的植物，还包括这类植物的后代。
本发明还提供一种在植物中稳定表达感兴趣的HOI001 GBSS的方法，其包括，在能有效地将载体转化和整合至细胞核基因组的条件下，使植物细胞与本发明的携带编码感兴趣的HOI001 GBSS的核酸的载体相接触。所述表达盒中的启动子可以是本文提供的任意启动子，例如，组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或种子特异性启动子。这类启动子可实现编码的HOI001 GBSS在目的时间，或目的发育阶段，或预定的组织中表达。所述载体还可包括选择性标记基因。当将载体用于根癌农杆菌时，所述的载体可携带根癌农杆菌的复制起始点。
植物
与本发明的载体一起使用的植物优选包括单子叶植物，特别是产油脂的物种，最优选为玉米(Zea mays)。本发明包括的其它物种包括苜蓿(Medicago sativa)，水稻(Oryza sativa)，大麦(Hordeumvulgar)，小米(Panicum miliaceum)，黑麦(Secale cereale)，小麦(Triticum aestivum)和高梁(Sorghum bicolor)。
本发明的任何植物或植物部位可被用于生产饲料、粗粉、蛋白质或油脂制剂。对于该目的来说特别优选的植物部位是种子。生产种子、粗粉、蛋白质和油脂制剂的方法是本领域已知的。参见，例如U.S.专利4,957,748；5,100,679；5,219,596；5,936,069；6,005,076；6,146,669；和6,156,227。
经转化植物的特性
可采用本领域公知的各类技术来证实再生植物中转基因的存在。这些技术的例子包括但不仅限于：(a)DNA整合或RNA表达分子实验，例如Southern或northern印迹杂交，TAQMAN技术(AppliedBiosystems，Foster City，CA)和PCR；(b)检测蛋白质产物是否存在的生物化学实验，例如ELISA，western印迹杂交或通过酶功能实验；(c)对目标植物部位的化学分析，例如对种子组织进行关于油脂、蛋白质或淀粉的定性和定量测定。
如下实施例用于举例说明本发明，其并不试图从任何途径来限制本发明。
实施例1
本实施例记载了从玉米系HOI001中分离HOI001 GBSS基因并对其进行测序的方法。HOI001是来源于MGSC 915E的近交体植物(MaizeGenetic Stock Center，Urbana，IL)，其被更详细地记载于美国专利公开文本Nos.20030172416中20030154524，这两份文献均以引用方式并入本文。
采用如下方法，在授粉22天后，从来自HOI001的玉米胚芽组织中提取基因组DNA。将50-100mg切碎的胚芽组织与提取缓冲液和玻璃珠一起置于Bio101 Multimix管中(Qiagen，Carlsbad，CA，Cat.No.657-601)。所述提取缓冲液由100mM Tris-HCl(pH8.0)、50mMEDTA、100mM NaCl、5mM DTT和1％SDS组成。随后采用Bio 101FASTPREP仪(Qiagen)脉冲3次每次20秒来破碎组织。65℃温育15分钟后，向每管中加入330μl 5M醋酸钾。随后将试管在0℃温育20分钟使SDS沉淀，随后在12,000rpm(Eppendorf Model 54172)下离心10分钟。随后将上清液转移至新的管中并加入100μl 5M醋酸铵(pH 7.0)和700μl异丙醇，以沉淀DNA。将试管颠倒混合并在14,000rpm下离心10分钟。弃去上清后，将沉淀重悬于500μl 70％的乙醇中，并通过14,000rpm离心5分钟回收沉淀。将含有DNA的回收沉淀重悬于50μl TE缓冲液中，并在4℃下贮存。
采用改编自Advantage GC(BD Biosciences Clontech，PaloAlto，CA)的PCR技术，从提取的基因组DNA中分离出HOI001 GBSS基因。根据Shure等，Cell，35(1)：225-233(1983)中公开的玉米GBSS序列[SEQ ID NO：2]，设计了如下引物：
5′端引物(引物编号14543)
5′-TCAGCCGTTCGTGTGGCAAGATTCATCTGTTGTCTC-3′[SEQ ID NO：5]
3′端引物(引物编号14547)
5′-TCAGCGGGATTATTTACTCCACCACTACAGGTCCATTT-3′[SEQ ID NO：6]。
收集如下PCR反应物至总体积50μl；
37μl PCR级水
5μl 5×Advantage GC PCR缓冲液
1μl 50×dNTP混合物(每种10mM)
1μl 50×Advantage GC聚合酶混合物
2.5μl引物14543
2.5μl引物145471
1μl基因组DNA
循环参数为：95℃1分钟，35个循环的95℃30秒，以及68℃3分钟。
通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，可观察到含有感兴趣基因的4.7kB的片段。利用与上述相同的引物和条件，取5微升原始PCR反应液作为模板进行另外的扩增。采用琼脂糖凝胶电泳来分离来自独立扩增反应的4.7kB扩增产物，采用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)将其克隆至PCR 2.1克隆载体中，随后转化至E.coli宿主中。从每一菌落培养的培养物中制备质粒DNA，随后对来源于3个独立质粒制备产物的插入片段进行测序。对这些序列进行序列比对可产生一共同序列，其与公开的GBSS基因高度同源但不完全一致，虽然没有具体的插入序列完全等价于该共同序列。一种克隆(命名为pCGN9480-2)具有相对于共同序列来说发生最少序列变化的插入序列。通过对非共同序列进行限制性内切酶介导的切割，将其与含有共同序列的片段重新连接从而制备得到含有共同序列的克隆，所述含有共同序列的片段是通过对其它克隆进行消化或从HOI001基因组DNA进行PCR扩增获得的。包括转录起始位点上游1.5kB和终止密码子下游约300个碱基对的共同序列，如SEQ ID NO：1所示。
采用上文所述的方法和引物，分离得到来源于优良玉米近交品系LH59的GBSS基因[SEQ ID NO：7]，并将其克隆至双元载体pMON68203。所获得的含有LH59GBSS的质粒被命名为pMON72510(图5)。
图1显示了利用Omiga软件包2.0，(Accelrys Inc.，San Diego，CA)，对HOI001 GBSS[SEQ ID NO：1]与前述Shure等中公开的序列[SEQ ID NO：2]，以及来源于LH59的GBSS序列[SEQ ID NO：7]进行核酸序列比对的结果。比对结果显示，如下多态性特异存在于HOI001GBSS序列中，而在LH59 GBSS序列或前述Shure等中公开的序列中均不存在：
1.单核苷酸多态性
a.在第158位，T＞C
b.在第337位，G＞A
c.在第343位，C＞A
d.在第349位，C＞A
e.在第441位，G＞A
f.在第666位，C＞T
g.在第777位，G＞C
h.在第878位，T＞A
i.在第980位，C＞T
j.在第1210位，T＞A
k.在第1216位，C＞T
l.在第1450位，A＞T
m.在第1709位，T＞C
n.在第1720位，A＞G
o.在第1721位，T＞A
p.在第1722位，G＞C
q.在第1761位，C＞T
r.在第1836位，G＞A
s.在第1852位，C＞T
t.在第1953位，G＞A
u.在第2043位，C＞T
v.在第2109位，C＞T
w.在第2110位，C＞G
x.在第2115位，G＞C
y.在第2448位，A＞T
z.在第2454位，C＞T
aa.在第2609位，T＞G
bb.在第2929位，A＞G
cc.在第2933位，G＞T
dd.在第2946位，C＞T
ee.在第3875位，G＞T
ff.在第4008位，T＞A
gg.在第4018位，T＞C
hh.在第4023位，T＞G
ii.在第4025位，C＞A
jj.在第4169位，C＞T
kk.在第4225位，A＞T
ll.在第4562位，C＞A
2.插入：
a.在第632位，序列g
b.在第1185-1189位，序列atgc
c.在第1456-1467位，序列tgcaccagcagc
d.在第1746-1750位，序列atgca
e.在第1868-1874位，序列catcaca
f在第2100-2101位，序列ct
g.在第2488-2491位，序列ccat
h.在第3810-3812位，序列tat
3.缺失：
a.在第288-290位，序列cgt
b.在第704-705位，序列aa
c.在第882位，序列c
d.在第1139-1143位，序列atccg
e.在第1256-1262位，序列ctctctg
f.在第1714-1715位，序列tc
g.在第1917-1932位，序列tgcaactgcaaatgca
h.在第3790位，序列g或a
i.在第4393-4467位，序列cgagccaggggt(t或c)gaaggcgaggagatcgcgccgctcgccaagg
agaacgtggccgcgccctgaagagttcggcct
图2显示了分离自HOI001的GBSS基因的相应预测氨基酸序列[SEQ ID NO：3]和前述Shure等中记载的GBSS基因的相应预测氨基酸序列[SEQ ID NO：4]的序列比对结果。结果表明在HOI001 GBSS的羧基末端存在额外氨基酸残基序列，其从约第1441位开始，以及在氨基酸残基第55-60位区域存在非对齐区域。
图3显示了分离自近交系LH59的玉米GBSS基因的相应预测氨基酸序列[SEQ ID NO：8]，和前述Shure等中记载的颗粒结合型淀粉合酶基因的相应预测氨基酸序列的序列比对较结果。结果表明在HOI001GBSS的羧基末端存在额外氨基酸残基序列，其从约第1441位开始，以及存在位于氨基酸残基第55-60位区域的非对齐区域。
实施例2
本实施例记载了对含有HOI001 GBSS和来源于近交系LH59的GBSS序列[分别为SEQ ID NOs：1和7]的植物转化载体的构建。
利用限制性内切酶EcoR 1从共同序列正确的pMON9480-2版本上切下HOI001 GBSS序列。按照Qiagen miniprep试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)的制造商手册上的记载，来纯化所获得的4.7kb片段。按照Stratagene PCR polishing试剂盒(Stratagene，Inc.，LaJolla，CA)的制造商手册上的记载，来使所述片段的末端成为平末端。随后采用Qiagen Gel提取试剂盒(Qiagen)来通过凝胶纯化所述片段，并克隆至用于植物转化的双元载体pMON68203中。双元载体pMON68203包含用于T-DNA转移的左边界和右边界，CaMV 35S启动子::nptII::nos 3′UTR植物选择性标记元件(记载于美国专利6,255,560)和用于进行胚乳表达的包括1.1kb的Z27启动子的植物表达盒序列(登记号#S78780的19-1117bp，Lopes等，Mol.Gen.Genet.，247(5)：603-613(1995))，玉米hsp70内含子(热休克70外显子2的玉米基因第4-153碱基对，登记号#X03679，Rochester等EMBO J.，5：451-458(1986))，和nos 3′UTR，(根癌农杆菌菌株C58 Ti质粒的第2924-2671碱基对，登记号#AE009420，Wood等，Science，294：2317-2323(2001))。采用Stul消化双元载体pMON68203，通过采用虾的碱性磷酸酶(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)在37℃下温育60分钟使之去磷酸化，并与上文所述的HOI001 GBSS的4.7kb凝胶纯化片段相连接。将得到的质粒命名为pMON72506(图4)。
采用类似的方式将来源于玉米品系LH59的GBSS基因[SEQ ID NO：7]克隆至双元载体pMON68203中，从而形成pMON72510。
实施例3
本实施例记载了通过使用实施例2所述的载体，采用HOI001 GBSS和来源于近交系LH59的GBSS转化玉米的技术方案。
按照如下步骤，采用pMON72506和pMON72510转化载体来转化玉米植物。
在温室中按照标准方法来培养玉米植物。控制植物的授粉。当获得的杂交胚芽长度达到1.5至2.0mm时，通常是授粉后10-15天时收获植物的穗。除去外壳后，通过喷洒或浸泡于80％乙醇中的方式对穗上的核仁进行表面灭菌。
农杆菌菌株ABI和根癌农杆菌双元载体系统被用于进行转化。按照本领域公知的方法，将质粒pMON72506和pMON72510导入根癌农杆菌中。在接种玉米细胞之前，将农杆菌细胞在室温下置于含有适于保持质粒的抗生素和200μM乙酰丁香酮的AB培养基(Chilton等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，71：3672-3676(1974))中培养过夜。紧邻接种之前，通过离心沉淀农杆菌细胞，并将其重悬于CRN122培养基(2.2g/L MS(Murashige and Skoog，Plxysiol.Platzt，15：473-497(1962))基础盐，2mg/L甘氨酸，0.5g/L烟碱酸，0.5g/lL-吡哆醇-HCl，)，0.1g/L硫胺，115mg/L L-脯氨酸，36g/L葡萄糖和68.5g/L蔗糖，pH 5.4)或含有200μM乙酰丁香酮和20μMAgNO3的CRN347培养基(包括0.44g/L MS盐，10g/L葡萄糖，20g/L蔗糖，和100mg/L抗坏血酸，除此之外，与CRN122培养基相同)中。
从单个核仁中切下未发育的玉米胚芽，浸入农杆菌悬液中，并在室温下培养5-15分钟。随后移出农杆菌溶液，将接种的未发育胚芽以角质鳞片侧向上的方式从接种CRN122培养基上转移至含有200μM乙酰丁香酮和20μM硝酸银的共培养CRN123培养基(包括0.5mg/L额外的硫胺-HCl，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，和3mg/L2，4D，除此之外与CRN122相同)上置于23℃下培养1天。或者，切下的胚芽可在211V培养基(3.98g/L Chu N6盐(Chu，C.C.，N6培养基及其在谷类作物花粉囊培养物中的应用参见于：Plant Tissue Culture PlantTissue Culture.Proceedings of the Peking Symposium，Boston，MA(1981)，43-45)，0.5mg/L硫胺HCl，0.5mg/L烟碱酸；1.0mg/L2，4D，20g/L蔗糖，0.69g/L L-脯氨酸，0.91g/L L-天门冬酰胺单水合物，1.6g/L MgCl2六水合物，0.1g/L酪蛋白水解产物，0.5g/LMES，0.1g/L肌醇和16.9mg/L硝酸银，pH 5.8，采用2g/L Gelgro使其凝固)中培养8-11天，用农杆菌CRN347培养基悬液来接种愈伤组织，且不再加入其它培养基，置于23℃下培养3天。
胚芽转移至CRN220选择性培养基(4.4g/L MS盐，1.3mg/L烟碱酸，0.25mg/L吡哆辛HCl，0.25mg/L硫胺HCl，0.25mg/L泛酸钙，30g/L蔗糖，12mM脯氨酸，0.05g/L酪蛋氨基酸，500mg/L羧苄青霉素，200mg/L巴龙霉素，2.2mg/L毒莠定，0.5mg/L 2，4D和3.4mg/L硝酸银，pH5.6采用7g/L的植物用琼脂(Phytagar)使其凝固)中，或者将愈伤组织转移至CRN344选择性培养基(3.98g/L ChuN6盐，1.0mg/L硫胺HCl，0.5mg/L烟碱酸；1.0mg/L2，4D，20g/L蔗糖，0.69g/L L-脯氨酸，0.91g/L L-天门冬酰胺单水合物，1.6g/L MgCl2六水合物，0.1g/L酪蛋白水解产物，0.5g/L MES，0.1g/L肌醇，500mg/L羧苄青霉素，200mg/L巴龙霉素和16.9mg/L硝酸银，pH 5.8，采用6g/L植物用琼脂使其凝固)中。置于27℃下黑暗中2-3周后，将存活的组织转移至相同的选择性培养基中，并再培养2星期或转移至如下文所述的再生培养基中。
通过将可能的转基因愈伤组织从CRN220转移至CRN232培养基(不含毒莠定，2，4-D，和硝酸银，并且含有3.52mg/L苄氨基嘌呤(BAP)和250mg/L羧苄青霉素的CRN220培养基)中，或从CRN344培养基转移至217A培养基(不含硝酸银，2，4-D，和巴龙霉素，并且含有3.52mg/LBAP和250mg/L羧苄青霉素的211 RTTV)并置于27℃下培养5-7天可实现植物的再生。随后将组织从CRN232转移至CRN264培养基(4.4g/L MS盐，1.3g/L烟碱酸，0.25mg/L吡哆辛HCl，0.25mg/L硫胺HCl，0.25mg/L泛酸钙，10g/L葡萄糖，20g/L麦芽糖，1mM L-天门冬酰胺，0.1g/L肌醇，250mg/L羧苄青霉素和100mg/L巴龙霉素，pH 5.8，采用6g/L植物用琼脂使其凝固)中，或者从217A培养基中转移至CRN346培养基(4.4g/L MS盐，MS维生素，60g/L蔗糖，0.05g/L肌醇，250mg/L羧苄青霉素，75mg/L巴龙霉素，pH5.8采用6g/L KOH使其固化)，所述培养基处于Phytatrays中，并且置于光照下28℃培养直至产生发育良好的根(典型地，2-3星期)。将这些正在发育的苗转移至土壤中，在27℃，80％湿度和低光照强度的生长培养腔中培养1周使之锻炼强壮，并随后转移至温室中，R0植株在标准的温室条件下生长。所述R0植株间相互杂交，并且收集每一株获得的植物的未成熟/发育中的核仁和成熟的核仁，用于后续分析。分析的结果记载于实施例6中。
随后将这些正在发育的小植株(plantlet)转移至土壤中，在一27℃，80％湿度和低光照强度的生长培养箱中培养1周使之锻炼强壮，并随后转移至温室中。R0植株在标准的温室条件下生长。将具有繁殖能力的R0植株与非转基因的轮回近交系(recurrent inbread)杂交，其中R0植株在杂交中作为母本或父本(偶尔两者都是)。对如实施例4所述的获得的每一穗的发育中的和成熟的F1核仁均进行收集和分析。分析结果在如下的实施例5中进行报道。
实施例4
本实施例提供了下述分析方法，用于确定含有HOI001 GBSS基因或LH59 GBSS基因的转基因植物核仁中的油脂、蛋白质和淀粉水平。
油脂含量分析：第一代单玉米核仁和切下的胚芽和胚乳中的油脂水平(以质量为基础，以占组织重量的百分比计)通过低分辨率1H核磁共振(NMR)(Tiwari等，JAOCS，51：104-109(1974)；或Rubel，JAOCS，71：1057-1062(1994))方法来检测，其中对单核仁样品的NMR释放时间进行了测量，采用标准曲线基于回归分析，计算得到其油脂水平，所述标准曲线由分析采用加速溶剂提取后经重量分析确定了各种油脂水平的核仁来得到。
为了比较转基因和非转基因核仁的油脂分析，采用位于Hsp70内含子中的一段序列作为5′引物，位于HOI001 GBSS基因中的一段序列作为3′端引物，通过检测转基因特异性的517bp的PCR产物来确定转基因是否存在：
5′引物(引物编号19056)：
5′-ATCTTGCTCGATGCCTTCTC-3′[SEQ ID NO：16]，
3′引物(引物编号18986)：
5′-GCCTTCGCTTGTCGTGGGT-3′[SEQ ID NO：17].
经NI T光谱法来确定预先生产的植物中的油脂水平，其中检测了收集的从单个植物中收获的种子样品的NIT光谱，并且采用标准曲线基于回归分析计算得到了其油脂水平，所述标准曲线由分析采用加速溶剂提取后经重量分析或元素分析(％N)确定了各种油脂水平的核仁来得到。
单因素方差分析和学生T-检验被用于确定标记阳性和标记阴性植物种子间的油脂水平间(％核仁重量)的显著差异。
或者，从单个穗上收集的核仁中的油脂水平可通过低分辨率1H核磁共振(NMR)(Tiwari等，JAOCS，51：104-109(1974)；或Rubel，JAOCS，71：1057-1062(1994))方法来检测，其中对收集的核仁的NMR释放时间进行了检测，并且采用标准曲线基于回归分析，计算得到了其油脂水平，所述标准曲线由分析采用加速溶剂提取后经重量分析确定了各种油脂水平的核仁来得到。
蛋白质分析：为了分析核仁中的蛋白质，通过近红外反射光谱分析，来检测(InfraTec model 1221，Teccator，Hogannas Sweden)用于每种处理的由50-100个核仁组成的的少量样品。该方法基于下述观察结果：典型的谷物样品中的化学组成的量与近红外放射吸收之间存在线性关系。在分析未知样品前，通过校正样品来收集光谱数据，随后采用氮燃烧分析技术(Murray，I.，and P.C.Williams，1987，Chemical Principles of Near-infrared Technology，Iv Near-Infrared Technology in the Agricultural and Food Industries，P.Williams and K.Norris eds.)来进行分析。采用从光谱仪中获得的光谱数据和原始数据建立了多元模型。在本实施例中，采用152个校正样品构建出了PLS-1(最小平方偏回归型I Partial LeastSquares Regression Type I)多元模型。通过光谱仪对每一未知样品扫描至少5次，并且通过每次扫描预测其蛋白质含量。每次扫描样品时，样品都加回到样品比色杯中，从而使与目标化学特性无关的倍增散射效果最小化。多次扫描结果平均即得预测的淀粉含量，对每一样品的结果都进行报告。
淀粉分析：为了分析核仁的淀粉，通过近红外反射光谱分析(InfraTec model 1221，Teccator，Hogannas Sweden)来检测用于每一检测的含50-100核仁的少量样品。该方法基于下述观察结果：典型的谷物样品中的化学组成的量与近红外放射吸收间存在线性关系。在分析未知样品前，通过校正样品来收集光谱数据，随后采用标准湿化学分析技术(Murray，I.，and P.C.Williams，1987，ChemicalPrinciples of Near-infrared Technology，Iv Near-InfraredTechnology in the Agricultural and Food Industries，P.Williams and K.Norris eds.)来对其进行分析。采用从光谱仪中获得的光谱数据和原始数据建立了多元模型。通过光谱仪对每种未知样品扫描至少5次，并且通过每次扫描预测其淀粉含量。每次扫描样品时，样品都加回到样品比色杯中，从而使与目标化学特性无关的倍增散射效果最小化。多次扫描结果平均即得预测的淀粉含量，然后对每种样品的结果都进行报告。
实施例5
本实施例记载了对采用HOI001 GBSS和来源于LH59的GBSS转化的植物的核仁进行的分析。
采用实施例4中记载的方法，对表达HOI001 GBSS转基因等位基因的总共54种转基因事件中的核仁进行分析。表1显示了：采用实施例4中记载的单核仁NMR方法，对来源于20种转基因事件的穗的转基因(阳性)和非转基因(阴性)F1代核仁的总核仁油脂水平进行分析。只列出了具有统计学上意义上的油脂水平显著增加(p＜0.05)的事件的结果。
结果表明，相对于同一穗上的非转基因核仁来说，来源于54种转基因事件中的20种上的穗的转基因核仁的全核仁油脂含量(％干重)具有统计学意义上的显著增加。
表1
| 阳性 | 阴性 | |||||
| 品系 | n | 平均值 | n | 平均值 | δ | Prob＞F |
| ZM_S67336/LH172 | 12 | 4.22 | 12 | 3.19 | 1.03 | 0.0000 |
| ZM_S66829/LH172 | 8 | 4.33 | 16 | 3.44 | 0.89 | 0.0013 |
| ZM_S67359/LH172 | 12 | 4.36 | 12 | 3.52 | 0.84 | 0.0003 |
| ZM_S71593/LH172 | 14 | 3.09 | 10 | 2.40 | 0.69 | 0.0258 |
| ZM_S67345/LH172 | 8 | 3.31 | 15 | 2.67 | 0.64 | 0.0199 |
| ZM_S67335/LH172 | 9 | 3.85 | 15 | 3.25 | 0.61 | 0.0000 |
| ZM_S71577/LH172 | 4 | 3.50 | 20 | 2.92 | 0.59 | 0.0298 |
| ZM_S66804/LH172 | 10 | 3.50 | 14 | 2.94 | 0.56 | 0.0017 |
| ZM_S67348/LH172 | 6 | 3.76 | 16 | 3.20 | 0.56 | 0.0000 |
| ZM_S67351/LH172 | 11 | 3.73 | 13 | 3.19 | 0.54 | 0.0173 |
| ZM_S69437/LH172 | 9 | 3.70 | 15 | 3.16 | 0.54 | 0.0002 |
| ZM_S67331/LH172 | 13 | 3.70 | 11 | 3.17 | 0.53 | 0.0026 |
| ZM_S67330/LH172 | 12 | 3.90 | 12 | 3.43 | 0.47 | 0.0071 |
| LH172/ZM_S71581 | 17 | 3.47 | 7 | 3.07 | 0.40 | 0.0004 |
| ZM_S66805/LH172 | 11 | 3.76 | 13 | 3.37 | 0.39 | 0.0151 |
| LH172/ZM_S69443 | 11 | 3.23 | 13 | 2.86 | 0.37 | 0.0243 |
| LH172/ZM_S67360 | 11 | 3.34 | 13 | 2.98 | 0.36 | 0.0080 |
| LH172/ZM_S67338 | 17 | 3.01 | 7 | 2.68 | 0.34 | 0.0287 |
| ZM_S71569/LH172 | 11 | 2.99 | 12 | 2.74 | 0.25 | 0.0354 |
| LH172/ZM_S66817 | 14 | 3.05 | 9 | 2.83 | 0.22 | 0.0391 |
相对于采用来源于R0父本的转基因花粉(例如，品系LH172/ZM_S66817，阴性)授粉的非转基因品系植物的核仁来说(下文中两个数据对其来说分别为：占分析的植物中的5/37，0.34％显著油脂增加)，采用非转基因品系花粉授粉的R0植株的转基因核仁(例如，品系ZM_S67336/LH172，阳性)具有更高频率的显著油脂增加(占分析的植物中的15/29)和更高的平均显著油脂增加水平(0.61％)。结果表明：由于母系遗传效应造成的在R0植株的核仁胚乳中发现的转基因剂量越大，则造成油脂增加的水平越高。
类似地，对来自含有LH59 GBSS转基因等位基因的总计15种转基因事件的核仁进行了分析。相对于相同穗上的非转基因核仁来说，来自任意事件的穗上的核仁中没有一个其全核仁油脂含量(％干重)具有统计学意义上的显著增加，这说明油脂水平的增加是HOI001 GBSS等位基因所特有的。
实施例6
本实施例记载了来源于田间种植植物的转基因F2代核仁中的油脂水平的增加。
为了确定HOI001 GBSS基因对田间种植植物的核仁油脂水平的影响，从40种事件中的每一种取24-48粒分离的F1代种子种植于田间苗圃中。采用非致死性卡那霉素抗性实验，针对是否存在转基因表达盒，对正在发育的植株进行筛选，其中抗生素溶液(0.1％(w/v)卡那霉素和0.1％(w/v)巴龙霉素)被施用至叶面表面，抗生素施用1周之后记录枯斑损伤的出现与(非转基因)否(转基因)。从转基因和非转基因植物的穗中分离核仁，随后通过近红外线透射光谱方法来分析核仁的油脂、蛋白质和淀粉含量。
表2显示了来源于含有(阳性)和缺乏(阴性)含选择标记和HOI001GBSS基因的转基因盒的植物穗中全油脂水平的平均值和全核仁油脂水平的增加值(δ)。通过记载于实施例4中的NIT方法来确定油脂水平，并且仅列出了油脂水平具有统计学意义上的显著增加(p＜0.05)的事件。
表2
| 阳性 | 阴性 | |||||
| 事件 | n | 平均值 | n | 平均值 | δ | Prob＞F |
| ZM_S67359 | 8 | 4.76 | 7 | 3.83 | 0.93 | ＜.0001 |
| ZM_S71546 | 5 | 5.42 | 3 | 4.50 | 0.92 | 0.0012 |
| ZM_S67354 | 2 | 4.85 | 13 | 4.02 | 0.83 | ＜.0001 |
| ZM_S66817 | 3 | 4.37 | 1 | 3.70 | 0.67 | 0.0099 |
| ZM_S71577 | 3 | 4.60 | 8 | 3.95 | 0.65 | ＜.0001 |
| ZM_S67343 | 5 | 4.42 | 4 | 3.78 | 0.65 | 0.0142 |
| ZM_S71555 | 5 | 5.10 | 3 | 4.47 | 0.63 | 0.0343 |
| ZM_S71551 | 9 | 4.69 | 6 | 4.07 | 0.62 | 0.041 |
| ZM_S69437 | 3 | 4.57 | 8 | 3.95 | 0.62 | 0.0002 |
| ZM_S66804 | 7 | 5.04 | 7 | 4.44 | 0.60 | 0.0016 |
| ZM_S67338 | 7 | 4.30 | 6 | 3.73 | 0.57 | 0.0068 |
| ZM_S71573 | 3 | 4.87 | 3 | 4.40 | 0.47 | 0.0405 |
| ZM_S67331 | 4 | 4.35 | 12 | 3.92 | 0.43 | 0.0025 |
| ZM_S71594 | 2 | 4.35 | 8 | 3.95 | 0.40 | 0.0037 |
| ZM_S67340 | 12 | 4.04 | 11 | 3.72 | 0.32 | 0.0115 |
| ZM_S66800 | 1 | 4.30 | 8 | 3.95 | 0.30 | 0.0396 |
结果显示，在所分析的36种事件的16种中，相对于非转基因穗来说，转基因穗中的全油脂水平升高了(p＜0.05)。
表3显示了来源于含有(阳性)和缺乏(阴性)含选择标记和HOI001GBSS基因的转基因盒的植物穗中平均核仁淀粉水平(％)和核仁淀粉水平的变化。仅列出了油脂水平具有统计学意义上的显著增加(p＜0.05)的事件。
表4显示了来源于含有(阳性)和缺乏(阴性)含选择标记和HOI001GBSS基因的转基因盒的植物穗中平均核仁蛋白蛋白质水平(％)和核仁蛋白蛋白质水平的变化。仅列出了油脂水平具有统计学意义上的显著增加(p＜0.05)的事件。
基于NIT分析，油脂水平升高的事件中淀粉水平略有降低(表3)，其蛋白蛋白质水平基本保持不变(表4)。
表3
| 阳性 | 阴性 | |||||
| 事件 | n | 平均值 | n | 平均值 | δ | Prob＞F |
| ZM_S67359ZM_S71546ZM_S67354ZM_S66817ZM_S71577ZM_S67343ZM_S71555ZM_S71551ZM_S69437ZM_S66804ZM_S67338ZM_S71573ZM_S67331ZM_S71594ZM_S67340ZM_S66800 | 85233559377342121 | 69.1570.1069.5069.7371.4769.9270.3070.4969.7771.1969.8169.7770.1070.7570.8270.50 | 7313184368763128118 | 70.9471.3371.1270.0071.4071.2071.2371.2371.4072.2771.2570.6771.2371.4071.3571.40 | -1.79-1.23-1.62-0.270.07-1.28-0.93-0.74-1.63-1.09-1.44-0.90-1.13-0.65-0.53-0.90 | 0.00040.04510.00240.52860.87020.01870.1180.1170.00180.00730.00090.13520.00260.19060.02570.16 |
表4
| 阳性 | 阴性 | |||||
| 事件 | n | 平均值 | n | 平均值 | δ | Prob＞F |
| ZM_S67359ZM_S71546ZM_S67354ZM_S66817ZM_S71577ZM_S67343ZM_S71555ZM_S71551ZM_S69437ZM_S66804ZM_S67338ZM_S71573ZM_S67331ZM_S71594ZM_S67340ZM_S66800 | 85233559377342121 | 11.8412.8612.5512.709.5011.4612.5812.2311.8012.1412.2611.3712.1811.8011.4411.40 | 7313184368763128118 | 11.2912.3012.0714.4012.0311.4012.4311.9712.0311.0711.8711.3012.2312.0311.2812.03 | 0.550.560.48-1.70-2.530.060.150.27-0.231.070.390.07-0.05-0.230.16-0.63 | 0.29420.17750.28850.13360.00050.9290.69950.49380.73840.03040.4520.84160.91330.66820.5780.412 |
实施例7
本实施例记载了从来源于田间种植植物的转基因F2代杂交核仁获得的油脂水平升高。
为了确定HOI001 GBSS基因对田间种植的杂交植物的核仁油脂水平的影响，从14种具有足够种子的事件中，每种分别取24-48粒的F1代种子种植于田间苗圃中。如上述实施例6所述，采用非致死性卡那霉素抗性实验，针对是否存在转基因盒，对正在发育的植株进行筛选。来自转基因植物的花粉被用于对硬茎(stiff-stalk)近交系LH244进行授粉。种植生产出的分离的F1代转基因种子，采用非致死性卡那霉素抗性实验，针对是否存在转基因，对得到的植株进行筛选。从转基因和非转基因植物的穗中分离F2代杂交核仁，并如实施例4所述，通过核磁共振分光术来检测核仁油脂。
表5显示了来源于含有(阳性)和缺乏(阴性)含选择标记和HOI001GBSS基因的转基因盒的杂交植物穗中平均全核仁油脂水平(％)和全核仁油脂水平的增加(δ)。采用如实施例4所述的大装置(bulkset)NMR方法来确定油脂水平，并且仅列出了油脂水平具有统计学意义上的显著增加(p＜0.05)的事件。数据表明，在分析的14种事件中的9种中，转基因穗相对于非转基因穗其全油脂水平升高(p＜0.05)。
表5
| 阳性 | 阴性 | |||||
| 事件 | n | 平均值 | n | 平均值 | δ | Prob＞F |
| ZM_S67354 | 6 | 4.43 | 1 | 3.00 | 1.43 | 0.0431 |
| ZM_S67346 | 9 | 3.90 | 8 | 3.13 | 0.78 | 0.0003 |
| ZM_S71546 | 9 | 4.24 | 5 | 3.58 | 0.66 | 0.0016 |
| ZM_S71556 | 10 | 4.12 | 4 | 3.48 | 0.65 | 0.0044 |
| ZM_S71577 | 8 | 3.94 | 6 | 3.30 | 0.64 | 0.0047 |
| ZM_S71594 | 10 | 3.91 | 7 | 3.30 | 0.61 | 0.0041 |
| ZM_S71573 | 10 | 4.02 | 6 | 3.42 | 0.60 | 0.0001 |
| ZM_S67343 | 10 | 3.72 | 4 | 3.15 | 0.57 | 0.0009 |
| ZM_S67331 | 8 | 3.80 | 3 | 3.40 | 0.40 | 0.0281 |
实施例8
本实施例记载了在表达HOI001 GBSS基因的玉米胚乳组织中，GBSS活性的增加。
在授粉后第24天，经非致死性卡那霉素抗性实验针对是否存在转基因盒进行筛选出的F1植株的正在发育的穗被收获，并被立即冷冻。从穗上剥离分离的F2代核仁，随后切割成胚芽和胚乳部分。如实施例4所述，用转基因特异性引物，通过针对从分离自单个胚芽的基因组DNA中PCR扩增转基因盒的部分的能力，从而鉴定单个分离的核仁是转基因型或非转基因型。对于6种事件中的每一种而言，分别收集了来源于相应的转基因和非转基因核仁的约10个胚乳。
在液氮中，采用研钵和研棒将每种胚乳收集物研成细粉末，并按照Shure等，Cell，35(1)：225-233(1983)的方法分三份分离淀粉颗粒。对分离的颗粒采用Vos-Scheperkeuter等，PlantPlzysiol.，82：411-416(1986)的方法检测其颗粒结合型淀粉合酶的活性。
表6显示了含有或缺乏HOI001 GBSS转基因盒的发育中的F2代胚乳中的颗粒结合型淀粉合酶的活性(pmol/min/mg淀粉)。列出了三次重复实验的平均值和标准差。数据表明，转基因核仁的淀粉颗粒通常具有升高的GBSS活性，这说明HOI001等位基因对油脂水平的影响不是降低全部GBSS活性所产生的效果，而是由于加入由HOI001 GBSS基因特异编码的特殊活性所产生的效果。
表6
| 转基因 | 非转基因 | ||||
| 事件 | 平均值 | SE | 平均值 | SE | p＞F |
| S67338S67359S71546S66804S71551S71555 | 585583635587588486 | 41201650924 | 455521540454574464 | 151523201112 | 0.03920.06650.02810.07020.37120.4641 |
实施例9
本实施例记载了从玉米品系HOI001中分离GBSS cDNA编码区和对其进行测序的技术方案。
采用改良自Opsahl-Ferstad等，Plant J.，12(10)：235-246(1997)的方法，授粉后22天，从HOI001的正在发育的玉米胚乳组织中提取mRNA。简而言之，从3个分离的核仁中收集正在发育的胚乳，在液氮中冷冻，随后采用研钵和研棒将其研磨成细粉。采用0.5mL缓冲液(0.5M LiCl，10mM EDTA，5mM二硫苏糖醇，100mM Tris-HCl，pH 8.0，1％(w/v)SDS)提取约50mg的冻干粉末状的胚乳。随后采用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶21)来抽提该水性提取物，弃去有机相部分。通过加入等体积的异戊醇，随后进行离心，从水性部分沉淀出核酸。弃去得到的上清液。采用70％乙醇洗涤含有mRNA的沉淀两次，干燥，随后重悬于含有0.1％(v/v)双乙基焦碳酸的50μL水中。
采用Clontech SMARTTM cDNA合成系统(BD Biosciences)从分离的mRNA来合成第一链cDNA。上述第一链cDNA作为模板用于扩增HOI001 GBSS cDNA序列，所采用的引物含有EcoRV限制性酶切位点，其后跟随着18bp的预测翻译起始位点(5′引物)，还含有Sse83871限制性酶切位点，其后跟随着预测翻译终止位点3′末端的17bp(3′引物)：
5′引物(引物编号20095)：
5′-GGATATCACCATGGCGGCTCTGGCCACG-3′[SEQ ID NO：9]，
3′引物(引物编号20092)：
5′-GTCCTGCAGGCTACACATACTTGTCCA-3′[SEQ ID NO：10].
采用琼脂糖凝胶电泳从独立扩增反应物中分离得到获得的1.8kB扩增产物，采用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)将其独立克隆至PCR
2.1克隆载体中，随后转化至E.coli宿主中。从每一次转化分离出多个菌落，从每一菌落的培养物中制备质粒DNA，随后对每种质粒制备产物的插入片段进行测序。对这些序列进行比对，可产生含有与预测为HOI001 GBSS基因所编码的序列等同的开放阅读框的共同序列，虽然没有特定的插入序列与该共同序列完全相同。一个克隆子(被命名为7345705-10)包含相对于共同序列缺失单个碱基对的插入序列。采用Quick-Change突变基因试剂盒(Stratagene)，通过插入另外的核苷酸，利用上述克隆子构建含有所述共同序列的质粒(被命名为pMON 81463)。上述表示HOI001 GBSS cDNA编码区的序列如SEQ ID NO：11所示。
实施例10
本实施例记载了对含有HOI001 GBSS cDNA编码区[SEQ ID NO：11]的植物转化载体的构建，其被设计为：用于获得表达的不同水平、不同时间和空间模式，以及随后对玉米的转化。
构建了含有HOI001 GBSS编码区的植物转化载体，所述编码区受Z27启动子驱动。采用EcoRV和Sse83871限制性酶切消化pMON81463，从中分离得到HOI001 GBSS编码区，并将其克隆至双元载体pMON71274。该双元载体含有用于TDNA转移的左边界和右边界，水稻肌动蛋白启动子::水稻肌动蛋白内含子::CP4::nos3′UTR，植物选择性标记元件和用于胚乳表达的、包含1.1kb的Z27启动子(GenbankAccession#S78780的bp19-1117，Lopes et al.，Mol.Gen.Genet.，247(5)：603 613(1995))的植物表达盒序列；玉米hsp70内含子(热休克70外显子2的玉米基因第4-153碱基对，Genbank登记号#X03679，Rochester等EMBO J.，5：451-458(1986))和球蛋白3′UTR。将获得的质粒命名为pMON81467(图7)。
构建了含有小麦高分子量麦谷蛋白启动子(Genbank登记号X12928的bp2647-3895位，版本X12928.3，原始记载于Anderson等，Nucleic Acids Res.，17：461-462(1989))和玉米hsp70内含子的第二植物表达双元载体，其与和小麦HSP17n 3′UTR(Gen Bank登记号X13431的bp532-741位，版本X13431.1，McElvain and Spiker，Nucleic Acids Res.，17：1764(1989))融合的GBSS编码区融合。从中间载体中扩增得到：含有与玉米hsp70内含子融合的小麦高分子量麦谷蛋白启动子的序列，扩增采用分别含有AscI和NotI限制性酶切位点的5′和3′引物：
5′引物(引物编号21084)：
5′-GGCGCGCCGTCGACGGTATCGATAAGCTTGC-3′[SEQ ID NO：12]，
3′引物(引物编号21085)：
5′-GCGGCCGCCCGCTTGGTATCTGCATTACAATG-3′[SEQ ID NO：13].
经琼脂糖凝胶电泳，对含有携带导入的限制性酶切位点的启动子和内含子片段的扩增产物进行纯化，并将其克隆至pCR2.1TOPO(Invitrogen)，从而产生用于E.coli转化的质粒载体(pOP28)。转移至E.coli载体中之后，分离质粒DNA，并采用AscI和NotI对其进行消化，将纯化的片段克隆至双元载体pMON71274中，从而产生一含有表达盒的载体(pOP29)，所述表达盒包含玉米HSP70内含子融合的小麦高分子量麦谷蛋白启动子，所述内含子与球蛋白3′UTR融合。采用NotI/Sse83871消化pMON81464，分离得到HOI001 GBSS编码区，并将其克隆至pOP29，从而产生双元载体pOP31，该载体包含携带高分子量麦谷蛋白启动子的表达盒，所述启动子与玉米HSP70内含子融合，玉米HSP70内含子与HOI001 GBSS编码区融合，所述编码区和球蛋白3′UTR融合。采用AscI/Sse83871消化pOP31，从而分离得到启动子/内含子/HOI001 GBSS编码区片段，并将其克隆至含有感兴趣的基因表达盒以及TR7 3′UTR的植物双元载体pMON71290(含有具有TR7 3’UTR的目标基因表达盒)中，从而产生pOP35，其含有携带高分子量麦谷蛋白启动子的表达盒，所述启动子与玉米HSP70内含子融合，玉米HSP70内含子与HOI001 GBSS编码区融合，所述编码区与TR7 3′UTR融合。然后采用AscI/Sse83871消化pOP35，分离得到启动子/内含子/HOI001 GBSS编码区片段，并将其克隆至植物双元载体pMON67647中，所述载体含有带有小麦HSP17 3′UTR的目标基因表达盒。所获得的质粒含有携带高分子量麦谷蛋白启动子的表达盒，所述启动子与玉米HSP70内含子融合，玉米HSP70内含子与HOI001 GBSS编码区融合，所述编码区HSP17 3′UTR融合。该命名为pMON68298的质粒如图8所示。
构建了含有HOI001 GBSS的启动子和5′UTR的第三种植物表达双元载体，其与HOI001 GBSS编码区融合，所述编码区与玉米球蛋白3′UTR融合。利用含有PmeI限制性酶切位点的5′引物，通过PCR扩增从pMON72506中扩增分离得到HOI001 GBSS启动子和5′UTR(其还含有第一种预测的内含子)：
5′引物(引物编号20362)：
5′-GATCGTTTAAACGTTCGTGTGGCAGATTCATC-3′[SEQ ID NO：14]，
3′引物(引物编号20363)：
5′-GACGTGGCCAGAGCCGCCATGCCGATTAATCCACTGCATAG-3′[SEQ ID NO：15].
通过琼脂糖凝胶电泳纯化扩增产物，扩增产物为：含有预测的HOI001 GBSS翻译起始位点上游的1125bp和来自pMON72506的预测编码序列的20bp的片段(相应于SEQ ID NO：1的bp 17-1162位)，将其克隆至pCR2.1TOPO(Invitrogen)，以产生pMON81466。
从pMON81463中切下HOI001 GBSS编码区，并将其克隆至载体pMON81466从而产生pMON81468，其含有与HOI001 GBSS编码区融合的HOI001 GBSS启动子/5′UTR，在启动子/UTR和编码区元件之间具有45bp长的外源多接头(polylinker)序列。通过采用MluI酶切消化pMON81468，以除去跨越外源序列的780bp的片段，随后与类似的735bp片段(缺少外源序列)再次退火，产生pMON81469。上述735bp的片段是通过利用MluI消化pMON72506并分离产物片段而获得的。随后采用PmeI和Sse83871消化pMON81469，来分离得到完整的启动子/UTR/编码区序列，并将其克隆至双元载体pMON71274中，以产生双元载体pMON81465。该载体含有携带与GBSS编码区融合的HOI001GBSS基因的启动子和5′UTR的表达盒，所述编码区与玉米球蛋白3′UTR融合(图9)。
将该三种植物转化载体转化至优良玉米近交系(LH244)(CornStates Hybrid Serv.，LLC，Des Moines，IA)中。简而言之，在授粉后约10天，收获含有未成熟胚芽的穗，并置于4℃冷冻直至使用(收获后5天)。对该转化方法而言，优选的胚芽大小为约1.0-2.0mm。在温室中通常授粉后10天可达到上述大小，其中生长条件为：平均温度87°F，由GE 1000Watt高压钠灯提供补充光照，日照长度为14小时。
从表面灭菌的穗中分离未成熟的胚芽，并直接浸于盛装在1.5-mL微量离心管中的制备好的农杆菌细胞悬液中。上述分离持续15分钟。随后将试管放置一旁5分钟，从而对个体胚芽的总接种时间达5至20分钟。采用尖头无菌移液管除去农杆菌细胞悬液后，将未成熟的胚芽转移至共培养培养基中(表7)。然后将所述胚芽以角质鳞片侧向上的方式置于培养基上培养。所述胚芽置于黑暗的培养箱中(23℃)培养约24小时。
随后将胚芽转移至经过改良的MS培养基中(MSW50，表7)，所述培养基中添加有0.1或0.25mM草苷膦和250mg/L羧苄青霉素，其用于抑制培养皿(100mm×25mm)中的农杆菌。所述培养物在黑暗的培养室中于27℃培养2-3周。随后将所有的愈伤组织块分别转移至添加有相同水平草苷膦的第一种再生培养基(MS/6BA，表7)上培养。培养物在该培养基上生长，并置于温度为27℃，16小时光照/8小时黑暗光周期的培养室中培养5-7天。随后将它们转移至置于培养皿(100mm×25mm)中的第二种15再生培养基(MSOD，表7)，培养约2周。将所有具有再生根和存活的组织的愈伤组织块转移至置于植物平皿(phytatrays)中的相同培养基中培养，以便在转移至土壤中(约2-4周)之前，根能进一步生长。上述再生培养基(MS6BA和MSOD)均添加有250mg/L羧苄青霉素和0.1或0.25mM草苷膦。
随后将这些发育中的小植株转移至土壤中，并置于27℃、80％湿度和低光密度的培养腔中培养约1周，使之锻炼强壮，随后转移至温室中，在标准温室条件下培养。收集获得的核仁，并按照实施例4所述的方法进行分析。结果表明，不同的启动子对基于HOI001 GBSS编码区表达强度和时机的油脂聚集可产生不同的影响。
表7用于玉米转化的培养基的组成
| 成分 | 共培养培养基 | MSW50 | MS/6BA | MSOD |
| MS盐 | 2.2g/L | 4.4g/L | 4.4g/L | 4.4g/L |
| 蔗糖 | 20g/L | 30g/L | 30g/L | |
| 麦芽糖 | 20g/L | |||
| 萄萄糖 | 10g/L | 10g/L | ||
| 1-脯氨酸 | 115mg/L | 1.38g/L | 1.36g/L | |
| 酪蛋氨基酸 | 500mg/L | 50mg/L | ||
| 甘氨酸 | 2mg/L | 2mg/L | ||
| 1-天冬酰胺 | 150mg/L | |||
| 肌醇 | 100mg/L | 100mg/L | 100mg/L | |
| 烟碱酸 | 0.5mg/L | 0.5mg/L | 1.3mg/L | 1.3m/L |
| 吡唑辛HCl | 0.5mg/L | 0.5mg/L | 0.25mg/L | 0.25mg/L |
| 硫胺-HCl | 0.5mg/L | 0.6mg/L | 0.25mg/L | 0.25mg/L |
| 泛酸钙 | 0.25mg/L | 0.25mg/L | ||
| 2，4-D | 3mg/L | 0.5mg/L | ||
| 毒莠定 | ||||
| 硝酸银 | 1.7mg/L | |||
| BAP | 3.5mg/L |
采用5.5mg/l低EEO琼脂糖来固化共培养培养基。用于NPTII筛选时，所有其它培养基都采用7g/l植物用琼脂来固化，用于草苷膦筛选时，都采用3g/l植物用琼脂糖(phytagel)来固化。
实施例11
本实施例记载了HOI001 GBSS基因中的多态性作为分子标记的用于，其用于加速HOI001 GBSS序列多态性掺入至其它玉米种质中，从而获得核仁油脂水平的升高。
本发明提供了一种核仁油脂增加的玉米植物，其是应用标记辅助育种筛选得到的，其中针对HOI001 GBSS基因(SEQ ID NO：1)所特有的多态序列的存在来筛选植物种群。上述实施例1中列出了HOI001GBSS序列所特有的多态性，其在LH59 GBSS序列或公开的序列(前述Shure等)中都不存在。
对携带用于高油脂水平的HOI001 GBSS基因的植物进行的筛选包括：在筛选过程中，采用探针与所获得植物的基因组DNA杂交，以探测用于HOI001 GBSS基因的分子标记的存在。所述分子标记为代表HOI001 GBSS基因中特有多态性的DNA分子，其作为探针或引物，靶向植物基因组中目标HOI001 GBSS来发挥作用。所选择的多态性可以是或者可以不来源于基因的编码区。含有HOI001 GBSS基因的植物被用于继续育种和筛选过程。
序列表
<110>Ravanello，Monica P
Foley，Terry J
LeDeaux，John R
Wyrick，Annette E
Savage，Thomas J
<120>提高植物中油脂水平的方法
<130>REN-00-119
<140>US 60/483,491
<141>2003-06-27
<160>17
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>4470
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<400>1
aattcgccct ttcagccgtt cgtgtggcag attcatctgt tgtctcgtct cctgtgcttc 60
ctgggtagct tgtgcagtgg agctgacatg gtctgagcag gcttaaaatt tgctcgtaga 120
cgaggagtac cagcacagca cgttgcggat ttctctgcct gtgaagtgca acgtctagga 180
ttgtcacacg ccttggtcgc gtcgatgcgg tggtgagcag agcagcaaca gctgggcgac 240
ccaaagttgg attccgtgtc ttcgtcgtac gtacgcgcgc gccggggaca cgcagagagc 300
ggagagcgag ccgtgcacgg ggaggtggtg tggaagtgaa gccgcgcgcc cggccgcccg 360
cgcccggtgg gcaacccaaa agtacccacg acaagcgaag gcgccaaagc gatccaagct 420
ccggaacgca tcagccacaa gcagccgaga accgaaccgg tgggcgacgc gtcgtgggac 480
ggacgcgggc gacgcttcca aacggggcca cgtacgccgg cgtgtgcgtg tgtgcgtgca 540
gacgacaagc caaggcgagg cagcccccga tcgggaaaag cgtcaagtag gtgcgccggg 600
ctttggcttt gggcgcgagc gctggcgtgc gggtcagtcg ctggtgcgca gtgccggggc 660
gaacgggtat cgtggggggc gcgggcggag gagagcgtgg cgagggccga gagcagcgcg 720
cggccgggtc acgcaacgcg ccccacgtac agcctccccc tccgcgcgcg ctagaaatac 780
cgaggcctgg accgggggcc ccccggcaca tccatccatc gaccgatcga tcgatcgcca 840
cagccaacat cacccgccga ggcgacgcga cagccgccag gaggaaggaa taaactcact 900
gccagccagt gaagggggag aagtgtactg ctccgtcgac cagtgcgcgc accgcccggc 960
agggctgctc atctcgtcga cgaccaggtt ccgttccgtt ccgatccgat cctgtccttg 1020
agtttcgtcc agatcctggc gtgtatctgc atgcgtgttt gatgatccag gttcatcgaa 1080
tctaaatctg tccgtgcaca tgtcttctct ctctctgtct gctatgcagt ggattaatcg 1140
gcatggcggc tctggccacg tcgcagctcg tcgcaacgcg cgccggcctg ggcgtcccgg 1200
acgcgtccac gttccgccgc ggcgccgcgc agggcctgag gggggcccgg gcgtcggcgg 1260
cggcggacac gctcagcatg cggaccagcg cgcgcgcggc gcccaggctc cagctgcacc 1320
agcagcagca gcaggcgcgc cgcggggcca ggttcccgtc gctcgtcgtg tgcgccagcg 1380
ccggcatgaa cgtcgtcttc gtcggcgccg aggtggcgcc gtggagcaag accggcggcc 1440
tcggcgacgt cctcggcggc ctgccgccgg ccatggccgt aagcgcgcgc accgagacat 1500
gcatccgttg gatcgcgtct tcttcgtgct cttgccgcgt gcatgatgca tgtgtttcct 1560
cctggctcgt gtatgtgact gacgtgtgtg ttcgggcatg caatgcatgc aggcgaatgg 1620
gcaccgtgtc atggtcgtct ctccccgcta cgaccagtac aaggacgcct gggacaccag 1680
cgtcgtgtcc gaagtacggc caccgagatc agattcagat cacacatcac agtcacacac 1740
accgtcatat gaacctttct ctgctctgat gcctgcagat caagatggga gacaggtacg 1800
agacggtcag gttcttccac tgctacaagc gcggagtgga ccgcgtgttc gttgaccacc 1860
cactgttcct ggagagggtg agatgagatc tgatcactcg atacgcaatt accaccccat 1920
tgtaagcagt tacagtgagc cttttttttt gcccccgcct ggtcgctggt ttcaggtttg 1980
gggaaagacc gaggagaaga tctacgggcc tgtcgctgga acggactaca gggacaacca 2040
gctgcggttc agcctgctat gccaggtcag gatggcttgc tactacaact tcagatcatc 2100
tgtatgcagc agtatacacc gatgagaaat gcatgctgtt ctgcaggcag cacttgaagc 2160
tccaaggatc ctgagcctca acaacaaccc atacttctcc ggaccatacg gtaagagttg 2220
tagtcttcgt atatatatct gttgagctcg agaatcttca caggaaacgg cccatcagac 2280
ggactgtctt tttatactga ctactgctgc tgctcttcgt ccatccatcc atacaagggg 2340
aggacgtcgt gttcgtctgc aacgactggc acaccggccc tctctcgtgc tacctcaaga 2400
gcaactacca gtcccacggc atctacaggg acgcaaaggt tgccttctcg gaactgaaca 2460
acgccgtttt cgttctccat gctcgtatat acctcatctg gtggtggtgc ttctctgaaa 2520
ctgaaactga aactgactgc atgtctgtct gaccatcttc acgtactacc taccagaccg 2580
ctttctgcat ccacaacatc tcctaccagg gccggttcgc cttctccgac tacccggagc 2640
tgaacctccc cgagagattc aagtcgtcct tcgatttcat cgacgggtct gttttcctgc 2700
gtgcatgtga acattcatga acggtaaccc acaactgctc gcgtcctgct ggttcattat 2760
ctggccttga ttgcattgta gctacgagaa gcccgtggaa ggccggaaga tcaactggat 2820
gaaggccggg atcctcgagg ccgacagggt cctcaccgtc agcccctact acgccgagga 2880
gctcatctcc ggcatcgcca ggggctgcga gctcgacaac atcatgcgcc tcaccggcat 2940
caccggcatc gtcaacggca tggacgtcag cgagtgggac cccagcaggg acaagtacat 3000
cgccgtgaag tacgacgtgt cgacggtgag ctggctagct agctgattct gctgcctggt 3060
cctcctgctc atgctggttc ggttctgacg cggcaagtgt acgtacgtgc gtgcgacggt 3120
ggtgtggtgt ccggttcagg ccgtggaggc caaggcgctg aacaaggagg cgctgcaggc 3180
ggaggtcggg ctcccggtgg accggaacat cccgctggtg gcgttcatcg gcaggctgga 3240
agagcagaag ggccccgacg tcatggcggc cgccatcccg cagctcatgg agatggtgga 3300
ggacgtgcag atcgttctgc tggtacgtgt gcgccggccg ccacccggct actacatgcg 3360
tgtatcgttc gttctactgg aacatgcgtg tgagcaacgc gatggataat gctgcagggc 3420
acgggcaaga agaagttcga gcgcatgctc atgagcgccg aggagaagtt cccaggcaag 3480
gtgcgcgccg tggtcaagtt caacgcggcg ctggcgcacc acatcatggc cggcgccgac 3540
gtgctcgccg tcaccagccg cttcgagccc tgcggcctca tccagctgca ggggatgcga 3600
tacggaacgg tacgagagaa aaaaaaacat cctgaatcta tcctgacgag agggacagag 3660
acagattgat tatgaatgct tcatcgattt gaattgattg atctatgtct cccgctgcga 3720
ctcttgcagc cctgcgcctg cgcgtccacc ggtggactcg tcgacaccat catcgaaggc 3780
aagaccgggt tccacatggg ccgcctcagc gtcgacgtaa gcctacctct gccatgatct 3840
ttcttccttc tgtatgtatg tatgtatgta tgaatcagca ccgccattct tgtttcgtcg 3900
tcctctcttc ccagtgcaac gtcgtggagc cggcggacgt caagaaggtg gccaccacct 3960
tgcagcgcgc catcaaggtg gtcggcacgc cggtgtacga ggagatggtg aggaactgca 4020
tgatccagga tctctcctgg aaggtacgtt cgcccgcccc gccagagcag agcgccaaga 4080
tcgatcgatc gaccgaccac acgtacgcgc ctcgctcttg tcgctgaccg tggtttaatt 4140
tgcgaaatgc gcagggccct gccaagaact gggagaacgt gctgctcagc ctcggggtcg 4200
ccggcggtgc agggcccctg atctcgcgcg tggtgcaaag atgttgggac atcttcttat 4260
atatgctgtt tcgtttatgt gatatggaca agtatgtgta gatgcttgct tgtgctagtg 4320
taatgtagtg tagtggtggc cagtggcaca acctaataag cgcatgaact aattgcttgc 4380
gtgtgtagtt aagtaccgat cggtaatttt atattgcgag taaataaatg gacctgtagt 4440
ggtggagtaa ataatcccgc tgaaagggcg 4470
<210>2
<211>1818
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<400>2
atggcggctc tggccacgtc gcagctcgtc gcaacgcgcg ccggcctggg cgtcccggac 60
gcgtccacgt tccgccgcgg cgccgcgcag ggcctgaggg gggcccgggc gtcggcggcg 120
gcggacacgc tcagcatgcg gaccagcgcg cgcgcggcgc ccaggcacca gcagcaggcg 180
cgccgcgggg gcaggttccc gtcgctcgtc gtgtgcgcca gcgccggcat gaacgtcgtc 240
ttcgtcggcg ccgagatggc gccgtggagc aagaccggcg gcctcggcga cgtcctcggc 300
ggcctgccgc cggccatggc cgcgaacggg caccgtgtca tggtcgtctc tccccgctac 360
gaccagtaca aggacgcctg ggacaccagc gtcgtgtccg agatcaagat gggagacggg 420
tacgagacgg tcaggttctt ccactgctac aagcgcggag tggaccgcgt gttcgttgac 480
cacccactgt tcctggagag ggtttgggga aagaccgagg agaagatcta cgggcctgtc 540
gctggaacgg actacaggga caaccagctg cggttcagcc tgctatgcca ggcagcactt 600
gaagctccaa ggatcctgag cctcaacaac aacccatact tctccggacc atacggggag 660
gacgtcgtgt tcgtctgcaa cgactggcac accggccctc tctcgtgcta cctcaagagc 720
aactaccagt cccacggcat ctacagggac gcaaagaccg ctttctgcat ccacaacatc 780
tcctaccagg gccggttcgc cttctccgac tacccggagc tgaacctccc ggagagattc 840
aagtcgtcct tcgatttcat cgacggctac gagaagcccg tggaaggccg gaagatcaac 900
tggatgaagg ccgggatcct cgaggccgac agggtcctca ccgtcagccc ctactacgcc 960
gaggagctca tctccggcat cgccaggggc tgcgagctcg acaacatcat gcgcctcacc 1020
ggcatcaccg gcatcgtcaa cggcatggac gtcagcgagt gggaccccag cagggacaag 1080
tacatcgccg tgaagtacga cgtgtcgacg gccgtggagg ccaaggcgct gaacaaggag 1140
gcgctgcagg cggaggtcgg gctcccggtg gaccggaaca tcccgctggt ggcgttcatc 1200
ggcaggctgg aagagcagaa gggccccgac gtcatggcgg ccgccatccc gcagctcatg 1260
gagatggtgg aggacgtgca gatcgttctg ctgggcacgg gcaagaagaa gttcgagcgc 1320
atgctcatga gcgccgagga gaagttccca ggcaaggtgc gcgccgtggt caagttcaac 1380
gcggcgctgg cgcaccacat catggccggc gccgacgtgc tcgccgtcac cagccgcttc 1440
gagccctgcg gcctcatcca gctgcagggg atgcgatacg gaacgccctg cgcctgcgcg 1500
tccaccggtg gactcgtcga caccatcatc gaaggcaaga ccgggttcca catgggccgc 1560
ctcagcgtcg actgtaacgt cgtggagccg gcggacgtca agaaggtggc caccacattg 1620
cagcgcgcca tcaaggtggt cggcacgccg gcgtacgagg agatggtgag gaactgcatg 1680
atccaggatc tctcctggaa gggccctgcc aagaactggg agaacgtgct gctcagcctc 1740
ggggtcgccg gcggcgagcc aggggtcgaa ggcgaggaga tcgcgccgct cgccaaggag 1800
aacgtggccg cgccctga 1818
<210>3
<211>620
<212>PRT
<213>玉米(Zea mays)
<400>3
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1 5 10 15
Gly Val Pro Asp Ala Ser Thr Phe Arg Arg Gly Ala Ala Gln Gly Leu
20 25 30
Arg Gly Ala Arg Ala Ser Ala Ala Ala Asp Thr Leu Ser Met Arg Thr
35 40 45
Ser Ala Arg Ala Ala Pro Arg Leu Gln Leu His Gln Gln Gln Gln Gln
50 55 60
Ala Arg Arg Gly Ala Arg Phe Pro Ser Leu Val Val Cys Ala Ser Ala
65 70 75 80
Gly Met Asn Val Val Phe Val Gly Ala Glu Met Ala Pro Trp Ser Lys
85 90 95
Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Leu Gly Gly Leu Pro Pro Ala Met Ala
100 105 110
Ala Asn Gly His Arg Val Met Val Val Ser Pro Arg Tyr Asp Gln Tyr
115 120 125
Lys Asp Ala Trp Asp Thr Ser Val Val Ser Glu Ile Lys Met Gly Asp
130 135 140
Arg Tyr Glu Thr Val Arg Phe Phe His Cys Tyr Lys Arg Gly Val Asp
145 150 155 160
Arg Val Phe Val Asp His Pro Leu Phe Leu Glu Arg Val Trp Gly Lys
165 170 175
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210 215 220
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225 230 235 240
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260 265 270
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325 330 335
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355 360 365
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500 505 510
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<210>4
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<212>PRT
<213>玉米(Zea mays)
<400>4
Met Ala Ala Leu Ala Thr Ser Gln Leu Val Ala Thr Arg Ala Gly Leu
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Arg Gly Ala Arg Ala Ser Ala Ala Ala Asp Thr Leu Ser Met Arg Thr
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Ser Ala Arg Ala Ala Pro Arg His Gln Gln Gln Ala Arg Arg Gly Gly
50 55 60
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Met Arg Leu Thr Gly Ile Thr Gly Ile Val Asn Gly Met Asp Val Ser
340 345 350
Glu Trp Asp Pro Ser Arg Asp Lys Tyr Ile Ala Val Lys Tyr Asp Val
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Ser Thr Ala Val Glu Ala Lys Ala Leu Asn Lys Glu Ala Leu Gln Ala
370 375 380
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Gly Arg Leu Glu Glu Gln Lys Gly Pro Asp Val Met Ala Ala Ala Ile
405 410 415
Pro Gln Leu Met Glu Met Val Glu Asp Val Gln Ile Val Leu Leu Gly
420 425 430
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435 440 445
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>6
tcagcgggat tatttactcc accactacag gtccattt 38
<210>7
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<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<400>7
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tggagctgac atggtctgag caggcttaaa atttgctcgt agacgaggag taccagcaca 120
gcacgttgcg gatttctctg cctgtgaagt gcaacgtcta ggattgtcac acgccttggt 180
cgcgtcgcgt cgatgcggtg gtgagcagag cagcaacagc tgggcggccc aacgttggct 240
tccgtgtctt cgtcgtacgt acgcgcgcgc cggggacacg cagcgagcgg agaacgagcc 300
gtgcacgggg gaggtggtgt gcaagtggag ccgcgcgccc ggccgcccgc gcccggtggg 360
caacccaaaa gtacccacga caagcgaagg cgccaaagcg atccaagctc cggaacgcat 420
cagccacaag cagccgagaa ccgaaccggt gggcgacgcg tcgtgggacg gacgcgggcg 480
acgcttccaa acgggccacg tacgccggcg tgtgcgtgcg tgcgtgcaga cgacaagcca 540
aggcgaggca gcccccgatc gggaaaaaag cgtcaagtag gtgcgccggg ctttggcttt 600
gggcgcgagc gctggcgtgc gggtcagtcg ctggtgcgca gtgccggggg gaacgggtat 660
cgtgggggcg cgggcggagg agagcgtggc gagggccgag agcagcgcgc ggccgggtca 720
cgcaacgcgc cccacgtact gccctccccc tccgcgcgcg ctagaaatac cgaggcctgg 780
accgggggcc ccccggcaca tccatccatc gaccgatcga tcgatcgcca cagccaacac 840
cacccgccga ggcgacgcga cagccgccag gaggaaggaa taaactcact gccagccagt 900
gaagggggag aagtgtactg ctccgtcgac cagtgcgcgc accgcccggc agggctgctc 960
atctcgtcga cgaccaggtt ccgttccgtt ccgatcctgt ccttgagttt cgtccagata 1020
ctggcgtgta tctgcgtgtt tgatgatcca ggttcttcga acctaaatct gtccgtgcac 1080
atgtcctctc tctctctgtc tctctctgct atgcagtgga ttaatcggca tggcggctct 1140
ggccacgtcg cagctcgtcg caacgcgcgc cggcctgggc gtcccggacg cgtccacgtt 1200
ccgccgcggc gccgcgcagg gcctgagggg ggcccgggcg tcggcggcgg cggacacgct 1260
cagcatgcgg accagcgcgc gcgcggcgcc caggcaccag caccagcagg cgcgccgcgg 1320
ggccaggttc ccgtcgctcg tcgtgtgcgc cagcgccggc atgaacgtcg tcttcgtcgg 1380
cgccgagatg gcgccgtgga gcaagaccgg aggcctcggc gacgtcctcg gcggcctgcc 1440
gccggccatg gccgtaagcg cgcgcaccga gacatgcatc cgttggatcg cgtcttcttc 1500
gtgctcttgc cgcgtgcatg atgcatgtgt ttcctcctgg cttgtgttcg tgtatgtgac 1560
gtgtttgttc gggcatgcat gcaggcgaac gggcaccgtg tcatggtcgt ctctccccgc 1620
tacgaccagt acaaggacgc ctgggacacc agcgtcgtgt ccgaggtacg gccaccgaga 1680
ccagattcag atcacagtca cacacaccgt catgtgaacc tttctctgct ctgatgcctg 1740
caactgcaaa tgcatgcaga tcaagatggg agacgggtac gagacggtca ggttcttcca 1800
ctgctacaag cgcggagtgg accgcgtgtt cgttgaccac ccactgttcc tggagagggt 1860
gagacgagat ctgatcactc gatacgcaat taccacccca ttgtaagcag ttacagtgag 1920
ctttttttcc ccccggcctg gtcgctggtt tcaggtttgg ggaaagaccg aggagaagat 1980
ctacgggcct gtcgctggaa cggactacag ggacaaccag ctgcggttca gcctgctatg 2040
ccaggtcagg atggcttgct actacaactt cagatcatct gtatgcagca gtatacaccg 2100
atgagaaatg catgctgttc tgcaggcagc acttgaagct ccaaggatcc tgagcctcaa 2160
caacaaccca tacttctccg gaccatacgg taagagttgc tgctcttcgt ccatcagacg 2220
gactgtcatt ttacactgac tactgctgct gctcttcgtc catccataca aggggaggac 2280
gtcgtgttcg tctgcaacga ctggcacacc ggccctctct cgtgctacct caagagcaac 2340
taccagtccc acggcatcta cagggacgca aaggttgcct tctctgctga actgaacaac 2400
gccgccttcg ttctccatgc tcgtatatac ctcatctggt ggtggtgctt ctctgaaact 2460
gaaactgaaa ctgactgcat gtctgtctga ccatcttcac gtactaccta ccagaccgct 2520
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aacctccccg agagattcaa gtcgtccttc gatttcatcg acgggtctgt tttcctgcgt 2640
gcatgtgaac attcatgaac ggtaacccac aactgttcgc gtcctgctgg ttcattatct 2700
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tctttctgta tgtatgtatg tatgtacgaa tcagcaccgc cattcttgtt tcgtcgtcct 3840
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gccctga 4207
<210>8
<211>606
<212>PRT
<213>玉米(Zea mays)
<400>8
Met Ala Ala Leu Ala Thr Ser Gln Leu Val Ala Thr Arg Ala Gly Leu
1 5 10 15
Gly Val Pro Asp Ala Ser Thr Phe Arg Arg Gly Ala Ala Gln Gly Leu
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Arg Gly Ala Arg Ala Ser Ala Ala Ala Asp Thr Leu Ser Met Arg Thr
35 40 45
Ser Ala Arg Ala Ala Pro Arg His Gln His Gln Gln Ala Arg Arg Gly
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Ala Arg Phe Pro Ser Leu Val Val Cys Ala Ser Ala Gly Met Asn Val
65 70 75 80
Val Phe Val Gly Ala Glu Met Ala Pro Trp Ser Lys Thr Gly Gly Leu
85 90 95
Gly Asp Val Leu Gly Gly Leu Pro Pro Ala Met Ala Ala Asn Gly His
100 105 110
Arg Val Met Val Val Ser Pro Arg Tyr Asp Gln Tyr Lys Asp Ala Trp
115 120 125
Asp Thr Ser Val Val Ser Glu Ile Lys Met Gly Asp Gly Tyr Glu Thr
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Val Arg Phe Phe His Cys Tyr Lys Arg Gly Val Asp Arg Val Phe Val
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Asp His Pro Leu Phe Leu Glu Arg Val Trp Gly Lys Thr Glu Glu Lys
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Ile Tyr Gly Pro Val Ala Gly Thr Asp Tyr Arg Asp Asn Gln Leu Arg
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Phe Ser Leu Leu Cys Gln Ala Ala Leu Glu Ala Pro Arg Ile Leu Ser
195 200 205
Leu Asn Asn Asn Pro Tyr Phe Ser Gly Pro Tyr Gly Glu Asp Val Val
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Phe Val Cys Asn Asp Trp His Thr Gly Pro Leu Ser Cys Tyr Leu Lys
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Ser Asn Tyr Gln Ser His Gly Ile Tyr Arg Asp Ala Lys Thr Ala Phe
245 250 255
Cys Ile His Asn Ile Ser Tyr Gln Gly Arg Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
260 265 270
Pro Glu Leu Asn Leu Pro Glu Arg Phe Lys Ser Ser Phe Asp Phe Ile
275 280 285
Asp Gly Tyr Glu Lys Pro Val Glu Gly Arg Lys Ile Asn Trp Met Lys
290 295 300
Ala Gly Ile Leu Glu Ala Asp Arg Val Leu Thr Val Ser Pro Tyr Tyr
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325 330 335
Ile Met Arg Leu Thr Gly Ile Thr Gly Ile Val Asn Gly Met Asp Val
340 345 350
Ser Glu Trp Asp Pro Ser Arg Asp Lys Tyr Ile Ala Val Lys Tyr Asp
355 360 365
Val Ser Thr Ala Val Glu Ala Lys Ala Leu Asn Lys Glu Ala Leu Gln
370 375 380
Ala Glu Val Gly Leu Pro Val Asp Arg Asn Ile Pro Leu Val Ala Phe
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Ile Gly Arg Leu Glu Glu Gln Lys Gly Pro Asp Val Met Ala Ala Ala
405 410 415
Ile Pro Gln Leu Met Glu Met Val Glu Asp Val Gln Ile Val Leu Leu
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<213>人工序列
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<212>DNA
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<220>
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gtcctgcagg ctacacatac ttgtcca 27
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<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
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ggccggaaga tcaactggat gaaggccggg atcctcgagg ccgacagggt cctcaccgtc 960
agcccctact acgccgagga gctcatctcc ggcatcgcca ggggctgcga gctcgacaac 1020
atcatgcgcc tcaccggcat caccggcatc gtcaacggca tggacgtcag cgagtgggac 1080
cccagcaggg acaagtacat cgccgtgaag tacgacgtgt cgacggccgt ggaggccaag 1140
gcgctgaaca aggaggcgct gcaggcggag gtcgggctcc cggtggaccg gaacatcccg 1200
ctggtggcgt tcatcggcag gctggaagag cagaagggcc ccgacgtcat ggcggccgcc 1260
atcccgcagc tcatggagat ggtggaggac gtgcagatcg ttctgctggg cacgggcaag 1320
aagaagttcg agcgcatgct catgagcgcc gaggagaagt tcccaggcaa ggtgcgcgcc 1380
gtggtcaagt tcaacgcggc gctggcgcac cacatcatgg ccggcgccga cgtgctcgcc 1440
gtcaccagcc gcttcgagcc ctgcggcctc atccagctgc aggggatgcg atacggaacg 1500
ccctgcgcct gcgcgtccac cggtggactc gtcgacacca tcatcgaagg caagaccggg 1560
ttccacatgg gccgcctcag cgtcgactgc aacgtcgtgg agccggcgga cgtcaagaag 1620
gtggccacca ccttgcagcg cgccatcaag gtggtcggca cgccggtgta cgaggagatg 1680
gtgaggaact gcatgatcca ggatctctcc tggaagggcc ctgccaagaa ctgggagaac 1740
gtgctgctca gcctcggggt cgccggcggt gcagggcccc tgatctcgcg cgtggtgcaa 1800
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tag 1863
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<223>引物序列
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>15
gacgtggcca gagccgccat gccgattaat ccactgcata g 41
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>16
atcttgctcg atgccttctc 20
<210>17
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>17
gccttcgctt gtcgtgggt 19
Claims (20)
1.基本上纯化的核酸分子，其选自由：
a)包含SEQ ID NO：1或其互补物的核酸分子；
b)包含SEQ ID NO：11或其互补物的核酸分子；和
c)编码与SEQ ID NO：3具有至少约94％的氨基酸相同性的多肽的核酸分子
所构成的组。
2.包含权利要求1所述核酸分子的表达盒，其中所述核酸分子与在植物细胞中具有功能的启动子可操纵地连接。
3.包含权利要求2所述表达盒的植物细胞。
4.包含权利要求3所述植物细胞的植物。
5.如权利要求4所述的植物，其中所述植物为单子叶植物。
6.如权利要求5所述的植物，其中所述单子叶植物为玉米。
7.从玉米植物获得的种子，其中所述种子包含权利要求1所述的核酸分子。
8.从权利要求7所述的种子获得的动物饲料。
9.携带有稳定并入其基因组的核酸分子的植物，其中所述核酸分子选自由：
a)包含SEQ ID NO：1或其互补物的核酸分子；
b)包含SEQ ID NO：11或其互补物的核酸分子；和
c)编码与SEQ ID NO：3具有至少约94％的氨基酸相同性的多肽的核酸分子
所构成的组。
10.如权利要求9所述的植物，其中所述植物为单子叶植物。
11.如权利要求10所述的单子叶植物，所述的植物为玉米。
12.从权利要求11所述植物获得的种子。
13.从权利要求12所述种子获得的油脂。
14.从权利要求12所述种子获得的动物饲料。
15.一种方法，用于生产具有增加的油脂生产水平的植物，所述方法包括：
(a)采用包含一种核酸分子的表达盒来转化植物，所述核酸分子选自由：
i)包含SEQ ID NO：1或其互补物的核酸分子；
ii)包含SEQ ID NO：11或其互补物的核酸分子；和
iii)编码与SEQ ID NO：3具有至少约94％的氨基酸相同性的多肽的核酸分子
所构成的组；
其中，所述表达盒进一步包括与所述核酸分子可操纵地连接的、在植物细胞中具有功能的启动子区域；和
(b)培养所述转化的植物。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述植物为单子叶植物。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述单子叶植物为玉米。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述启动子区域为胚乳启动子区。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述启动子区域为Z27启动子。
20.一种筛选玉米种质的方法，其包括如下步骤：
a)确定如SEQ ID NO：1所示的HOI001 GBSS序列特有的至少一种多态性；
b)选择SEQ ID NO：1的片段作为分子标记使用，所述片段中含有所述确定的多态性中的一种的至少一部分；
c)针对所述标记的存在对玉米植物加以检测；和
d)筛选出含有所述标记的植物。
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|---|---|---|---|---|
| CN101056983B (zh) * | 2004-09-13 | 2012-03-14 | 孟山都技术有限公司 | 用于植物的启动子分子 |
| CN115785242A (zh) * | 2022-12-27 | 2023-03-14 | 中国水稻研究所 | 一种创制水稻高产优质的方法 |
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| CN119442173A (zh) * | 2024-10-22 | 2025-02-14 | 云南农业大学 | 一种基于机器学习的普洱茶egcg含量预测方法及系统 |
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20061004 |