CN1796571A - 多重荧光pcr－改良分子信标检测食源性致病菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多重荧光PCR－改良分子信标检测食源性致病菌的方法，根据待测多种致病菌的特异基因序列设计多对引物和多个改良分子信标探针，采用荧光PCR－改良分子信标扩增待测多种致病菌特异基因的序列，利用分子信标与扩增产物的杂交，检测反应体系的荧光强度，以达到设定的阈值时所需的循环次数Ct值作为结果判断的标准，Ct值为0或40：阴性；Ct小于38：阳性。本发明的方法灵敏度高，特异性强，操作简单，结果观察直观明了，适用于两种、三种和四种等多种细菌的随机组合和多种食源性致病菌的快速同时检测以及大量样品的检验。
Description
技术领域
本发明涉及荧光PCR分子信标检测食源性致病菌的方法。
背景技术
食源性疾病发病率较高，例如霍乱弧菌引起霍乱，伤寒沙门氏菌和志贺氏菌分别引起伤寒和痢疾。霍乱、伤寒、痢疾属我国的重点传染病。副溶血弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、变形杆菌等引起的食物中毒，其发病率在我国食源性疾病发病率中占较高的比例。目前这些食源性致病菌仍以传统细菌分离培养和鉴定的方法进行检测。这种传统检测方法操作繁琐，耗时耗力，一般需5天时间，最长的还需要一个月的时间，而且生化试验和血清学试验不稳定；检测灵敏度低。
随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的诊断。例如中国专利公开号为CN1526825的专利申请，披露了一种利用副溶血弧菌pR72H序列的特异性，通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等现代分子生物学手段检测副溶血弧菌的方法。然而该PCR技术易污染，造成检测失败，还需电泳。自1995年美国PE公司提出实时PCR检测原理后，实时PCR以快速、定量、无需后电泳、无交叉污染等突出优点而被广泛采用。
分子信标是1996年Tyagi等提出来的一种具有颈环构型的分子探针，是基于核酸碱基配对原则和荧光共振能量现象设计的，在PCR扩增的退火阶段，分子信标与生成的靶序列结合发出荧光，在延伸阶段，则脱离靶序列而不干扰扩增，随着循环次数的增加，与模板结合的分子信标的量亦增加，最终的荧光强度与模板量成正比。
但目前所采用的实时PCR方法为单一荧光PCR方法，只能检测一种致病菌，且检测速度和灵敏度仍不能满足要求。随着生态环境的变化和抗生素的滥用，许多致病菌引起的临床症状越来越不典型，常常需要同时检测多种细菌才能确定病原。这就对快速诊断技术提出了更高的要求：又快又能同时检测多种病原微生物。因此急需开发同时快速诊断多种细菌的方法。
发明内容
为了克服现有技术操作繁琐、耗时长等缺点，以及不能同时快速地检测多种食源性致病菌的缺陷而提供一种多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是，一种多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法，其包括以下步骤：
(1)根据待测各种致病菌的特异基因序列设计多对引物和多个改良分子信标探针；
(2)配制荧光PCR-改良分子信标扩增基因序列的反应体系；
(3)用步骤(1)的各种荧光PCR-改良分子信标同时扩增待测多种致病菌特异基因的序列；
(4)利用分子信标与扩增产物的杂交，检测反应体系的荧光强度，以达到设定的阈值时所需的循环次数Ct值作为结果判断的标准，Ct值为0或40：阴性；Ct小于38：阳性。
荧光PCR-改良分子信标扩增基因序列的反应体系为：
1×PCR缓冲液
MgCl2 0.5～5mmol
dNTP各 0.05～1.5mmol
各对引物 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol
各条探针 0.1～1.0μmol
Taq酶 0.2～10U
模板 1～20μL
总体积 20～100μL
所述荧光PCR-改良分子信标扩增特异基因序列的反应条件是90～100℃预变性3～10分钟，40～50个循环中92～95℃变性15～60秒，50～60℃退火15～60秒，70～72℃延伸15～120秒。
所述致病菌为选自霍乱弧菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌，以及O157：H7大肠杆菌中的一种或多种的组合。
所述致病菌的特异基因序列分别为霍乱弧菌肠毒素基因ctxA序列、副溶血弧菌耐热直接溶血素基因TDH序列、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因NUC、单增李斯特氏菌的溶血素基因hly的序列、沙门氏菌的侵袭基因ivnA序列、志贺氏菌的编码侵袭性质粒抗原H基因ipaH序列，以及O157：H7大肠杆菌的溶血素基因rfbE序列。
所述改良分子信标的引物和探针分别为：
ctxA基因的一对引物：
ctxA-F：5′-TCCGGAGCATAGAGCTTGGA-3′，
ctxA-R：5′-TCGATGATCTTGGAGCATTCC-3′
ctxA基因的探针：
HEX-5′-
CCGTGGATTCATCATGCACCGCCACGG-3′Dabcyl，
TDH基因的一对引物：
TDH-F：5′-AAACATCTGCTTTTGAGCTTCCA-3′，
TDH-R：5′-CTCGAACAACAAACAATATCTCATCAG-3′，
TDH基因的探针：
FAM5′-CCGGGGTG
TCCCTTTTCCTGCCCCCGG-Dabcyl，
NUC基因的一对引物：
NUC-F：5’-GGCAATACGCAAAGAGGTT-3’
NUC-L：5’-CTTCTTCTATTTACGCCGTTATC-3’
NUC基因的探针：
ROX-5’-CGATGCA
GTCTAAGTAGCTCAGCAAATGCATCG-3’-DABCYL
hly基因的一对引物：
hly-F：5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’
hly-L：5’-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3’
hly基因的探针：
FAM-5’-CGCG
CTTGTATATACTTATCGATTTCATCCGCGCG-3’-DABCYL
invA基因的一对引物：
invA-F：5’-GCGGAATATC(I)ATGACGCAGCT-3’
invA-L：5’-CGCTACGTTTTGCTTCACGG-3’
invA基因的探针：
5’-FAM-CCG
CCATTTGTATTGGTTGTTACGGCGG-DABCYL-3’
ipaH基因的一对引物：
ipaH-F：5’-TGAAGGAAATGCGTTTCTATG-3’
ipaH-L：5’-AGGGAGAACCAGTCCGTAAA-3’
ipaH基因的探针：
CY55’-CACG
GCCGAAGCTATGGTCAGAAGCCGTG-3’-DABCYL
rfbE基因的一对引物：
rfbE-L：5’-AGGTGAAGGTGGAATGGTTGTC-3’
rfbE-R：5’-GCTTGTTCTAACTGGGCTAATC-3’
rfbE基因的探针：
5’-FAMC
GGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCCG-DABCYL-3’
其中划线部分为改良分子信标探针的靶序列。
多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌是两重、三重、四重或多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌。
所述的多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法还进一步包括对待测样品处理和模板提取步骤。
所述样品包括食品样品、粪便、呕吐物标本，其中处理粪便、呕吐物标本及提取模板是根据粪便和呕吐物量的多少，用100-200μL生理盐水悬浮，煮沸，10000rpm离心2分钟，取5μL上清液即可用于实时PCR反应；食品样品的处理和模板的提取是将食品样品在针对待测细菌的增菌液中增菌后，共取1.2mL增菌液10000rpm离心5分钟，弃其上清液后，加30uL三蒸水煮沸，再取5μL上清液即可用于实时PCR反应；或加入裂解液裂解，经酚-氯仿抽提，且乙醇沉淀后，加入20μL水溶解，取5μL溶液用于实时PCR反应。
本发明的有益效果是：本发明在改良分子信标技术的基础上，建立了多重实时PCR同时检测多种细菌的方法，此方法：
(1)可根据需要，随机两重、三重、四重或多重组合同时测试多种致病菌；(2)灵敏度高，32-100cfu/mL细菌即可检出；(3)特异性强，与对照组十几种细菌无交叉反应；(4)操作简单，结果观察直观明了，可一次检测96份标本(含阴阳性对照)；(5)检测速度快，检测大便和呕吐物标本仅需2小时检测时间，检测食品标本仅需1-2天时间(包括样品的前期处理)。
附图说明
图1至图3为本发明荧光PCR-改良分子信标检测曲线图。
具体实施方式
本发明以食源性致病菌的检测为例，可随机组合，来分析多重荧光PCR-改良分子信标的检测方法，从而实现快速准确地同时检测多种致病菌。
改良分子信标探针是为了提高杂交效率，在原来分子信标原理基础上提出的。改良分子信标的突出特点是将分子信标的臂部分也作为靶识别序列，而不仅仅是用于形成发夹结构的无关添加序列。对于同样长度的检测靶序列，改良分子信标比分子信标更短，而且由于臂序列不再悬空，因而与靶序列的结合更趋紧密。改良分子信标比分子信标更易设计且成功率更高，同时对扩增条件要求不严格，因此对于多个靶序列的同时检测，改良分子信标的优势更加明显。
根据GenBank公布的食源性致病菌的毒素基因或侵袭基因的保守序列，即霍乱弧菌的ctxA、副溶血弧菌的TDH、沙门氏菌的invA、志贺氏菌的ipaH、金黄色葡萄球菌的NUC和单增李斯特氏菌的hly基因，O157：H7大肠杆菌的溶血性素基因rfbE，分别设计引物和改良分子信标探针，用不同的荧光剂标记探针，同时以十几种细菌作对照，建立改良分子信标—荧光PCR检测食源性致病菌的反应体系。并将此检测体系应用于常见细菌性食物中毒的快速诊断。用多重荧光PCR检测食源性致病菌的方法主要包括以下步骤：
(1)根据GenBank公布的食源性致病菌的毒素基因或侵袭基因的保守序列，分别设计引物和探针；
(2)待测样品处理和模板提取；
(3)荧光PCR扩增；
(4)检测荧光信号，以达到设定的阈值时所需的循环次数Ct值作为结果判断的标准。
步骤(1)中根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因ctxA序列、副溶血弧菌耐热直接溶血素基因TDH序列、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因NUC、单增李斯特氏菌的溶血素基因hly的序列、沙门氏菌的侵袭基因ivnA序列、志贺氏菌的编码侵袭性质粒抗原H基因ipaH序列，以及O157：H7大肠杆菌的溶血性基因rfbE序列，本发明的改良分子信标的引物和探针分别为：
ctxA基因的一对引物：
ctxA-F：5′-TCCGGAGCATAGAGCTTGGA-3′，
ctxA-R：5′-TCGATGATCTTGGAGCATTCC-3′
ctxA基因的探针：
HEX-5′-
CCGTGGATTCATCATGCACCGCCACGG-3′Dabcyl，
TDH基因的一对引物：
TDH-F：5′-AAACATCTGCTTTTGAGCTTCCA-3′，
TDH-R：5′-CTCGAACAACAAACAATATCTCATCAG-3′，
TDH基因的探针：
FAM5′-CCGGGG
TGTCCCTTTTCCTGCCCCCGG-Dabcyl，
NUC基因的一对引物：
NUC-F：5’-GGCAATACGCAAAGAGGTT-3’
NUC-L：5’-CTTCTTCTATTTACGCCGTTATC-3’
NUC基因的探针：
ROX-5’-CGATGCA
GTCTAAGTAGCTCAGCAAATGCATCG-3’-DABCYL
hly基因的一对引物：
hly-F：5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’
hly-L：5’-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3’
hly基因的探针：
FAM-5’-CGCG
CTTGTATATACTTATCGATTTCATCCGCGCG-3’-DABCYL
invA基因的一对引物：
invA-F：5’-GCGGAATATC(I)ATGACGCAGCT-3’
invA-L：5’-CGCTACGTTTTGCTTCACGG-3’
invA基因的探针：
5’-FAM-CCG
CCATTTGTATTGGTTGTTACGGCGG-DABCYL-3’
ipaH基因的一对引物：
ipaH-F：5’-TGAAGGAAATGCGTTTCTATG-3’
ipaH-L：5’-AGGGAGAACCAGTCCGTAAA-3’
ipaH基因的探针：
CY55’-CACG
GCCGAAGCTATGGTCAGAAGCCGTG-3’-DABCYL
rfbE基因的一对引物：
rfbE-L：5’-AGGTGAAGGTGGAATGGTTGTC-3’
rfbE-R：5’-GCTTGTTCTAACTGGGCTAATC-3’
rfbE基因的探针：
5’-FAMC
GGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCCG-DABCYL-3’。
其中划线部分为改良分子信标探针的靶序列。
步骤(2)样品处理和模板提取，样品适用范围包括食品样品、粪便、呕吐物等标本。对于粪便、呕吐物标本，根据粪便和呕吐物量的多少，用100-200μL生理盐水悬浮，煮沸，10000rpm离心2分钟，取5μL上清液即可用于实时PCR反应。食品样品的处理和模板的提取是将食品样品在针对待测细菌的增菌液中增菌后，共取1.2mL增菌液于10000rpm离心5分钟，弃其上清液后，加30uL三蒸水煮沸，再取5μL上清液即可用于实时PCR反应，或者弃其上清液后加入裂解液裂解，经酚-氯仿抽提，且乙醇沉淀后，加入20μL水溶解，取5μL溶液用于实时PCR反应。因此用多重荧光PCR-改良分子信标检测食品样品时，将形成多个模板。
步骤(3)的荧光PCR扩增反应体系为：
1×PCR缓冲液
MgCl2 0.5～5mmol
dNTP各 0.05～1.5mmol
各对引物 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol
各条探针 0.1～1.0μmol
Taq酶 0.2～10U
模板 1～20μL
总体积 20～100μL
以上试剂组分：1×PCR缓冲液，MgCl2，Taq酶，dNTP均购自中国大连宝生物公司。
反应条件是：90～100℃预变性3～10分钟，40～50个循环中92～95℃变性15～60秒，50～60℃退火15～60秒，72℃下延伸15～120秒。
步骤(4)检测荧光信号的Ct值，是采用iCycler实时PCR扩增仪(Bio-Rad公司)或MX4000荧光PCR扩增仪或Rotor荧光PCR扩增仪退火阶段检测荧光，一次可检测96份样品(包括阴阳对照)。根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：Ct值为0或40表示呈阴性；Ct小于38表示呈阳性；Ct在38-40之间时，样品需重新检测。检测大便和呕吐物标本仅需2小时检测时间，检测食品标本仅需1-2天时间(包括样品的前期处理)。
例一
本例中以双重荧光PCR-改良分子信标检测沙门氏菌和志贺氏菌为例来分析多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法。根据GenBank公布的沙门氏菌的侵袭基因(ivnA)和志贺氏菌的编码侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)的序列并比较分析，分别设计的一对引物和探针同前文所述。
试验用菌株：14种细菌共132株菌株。包括1株产毒性大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli，ETEC)、1株侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive E.coli，EIEC)、1株O157：H7大肠杆菌(O157：H7)、1株致病性大肠杆菌(enteropathogenic E.coli，EPEC)、1株枸橼酸杆菌(Citrobacter)、1株大肠埃希氏菌E.coli、1株副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、1株霍乱(V.cholera)弧菌、1株金黄色葡萄球菌(S.aureus)、1株单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、1株蜡样芽胞杆菌(B.cereus)、1株变形杆菌(Proteus)、70株沙门氏菌(Salmonella)(各种血清型)、50株志贺氏菌(Shigella)(各种血清型)。所有菌株均按照中华人民共和国颁布的《食品微生物学》国家检验标准进行分离和鉴定。
利用上述荧光PCR方法同时检测沙门氏菌和志贺氏菌的方法还包括以下步骤：
(1)样品处理和模板提取：样品适用范围包括食品样品、粪便、呕吐物等标本；对粪便、呕吐物标本的处理与提取与前述方法相同；对于食品样品，其中检测沙门氏菌时，将25g食品放在225mLSC中增菌10个小时；对于志贺氏菌，将25g食品放在225mLGN中增菌10个小时，增菌后，取1mL增菌液，10000rpm离心5分钟，弃其上清液后，加30uL三蒸水煮沸，再取5μL上清液即可用于实时PCR反应。
(2)荧光PCR扩增，配制多重荧光PCR反应体系：
1×PCR缓冲液
MgCl2 1.5mmol
dNTP各 0.05mmol
invA基因的引物 0.2μmol+0.2μmol
ipaH基因的引物 0.2μmol+0.2μmol
invA基因的探针 0.2μmol
ipaH基因的探针 0.2μmol
Taq酶 1U
模板 10μL
总体积 25μL
实时PCR反应：95℃预变性5分钟，45个循环中94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒。
(3)检测：采用iCycler实时PCR扩增仪(Bio-Rad公司)退火阶段检测荧光，一次可检测96份样品(包括阴阳对照)。结果判断：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：Ct值为0或40：阴性；Ct小于38：阳性；Ct在38-40之间：样品需重新检测。
前述14种细菌共132株菌株经本发明的改良分子信标体系检测，只有含ivnA基因的沙门氏菌和含ipaH基因的志贺氏菌有荧光信号，其他细菌无荧光信号，进一步证明了荧光PCR的特异性见表1。
表1 沙门氏菌和志贺氏菌双重实时PCR特异性分析
| 细菌 | 检测数量 | invA实时PCR检测呈阳性的数量 | ipaH实时PCR检测呈阳性的数量 |
| 沙门氏菌 | 70 | 70 | 0 |
| 志贺氏菌 | 50 | 0 | 50 |
| 产毒性大肠杆菌 | 1 | 0 | 0 |
| 致病性大肠杆菌 | 1 | 0 | 0 |
| 侵袭性大肠杆菌 | 1 | 0 | 0 |
| 大肠埃希氏菌 | 1 | 0 | 0 |
| 枸橼酸杆菌 | 1 | 0 | 0 |
| 霍乱 | 1 | 0 | 0 |
| 副溶血弧菌 | 1 | 0 | 0 |
| O157：H7大肠杆菌 | 1 | 0 | 0 |
| 蜡样芽胞杆菌 | 1 | 0 | 0 |
| 变形杆菌 | 1 | 0 | 0 |
| 单增李斯特氏菌 | 1 | 0 | 0 |
| 金黄色葡萄球菌 | 1 | 0 | 0 |
由表1可见，本发明的荧光PCR-改良分子信标特异性强，与对照组十多种细菌无交叉反应。
用前述14种细菌共132株菌株进行实验，用本发明的单一或多重荧光PCR方法分别检测按前述方法配制的不含沙门氏菌或志贺氏菌的空白体系、含有沙门氏菌和志贺氏菌的体系、含有沙门氏菌的体系、以及含有志贺氏菌的体系。采用iCycler实时PCR扩增仪检测退火阶段荧光，荧光信号曲线如图1。其中，图1(a)为空白体系的荧光PCR扩增仪测定的荧光信号曲线，图1(b)为多重荧光PCR检测含有沙门氏菌和志贺氏菌的荧光信号曲线，图1(c)为荧光PCR检测含有沙门氏菌的荧光信号曲线，图1(d)为荧光PCR检测含有志贺氏菌的荧光信号曲线。由图1比较分析，多重荧光PCR检测多重细菌，无交叉反应，相互之间没有干扰和抑制作用，荧光信号没有减弱，特异性强。
灵敏度分析：分别选1株沙门氏菌和1株志贺氏菌作为灵敏度分析的代表株。沙门氏菌菌液灵敏度分析方法：沙门氏菌菌株用SC增菌液培养过夜后，进行10倍稀释，共做10个稀释度，然后依次取10个稀释度的1mL菌液进行实时PCR反应。同时相对应的按中华人民共和国颁布的《食品微生物检验标准》做细菌总数计数。志贺氏菌菌液灵敏度分析：志贺氏菌菌株用肉汤增菌液培养过夜后，其余步骤按“沙门氏菌菌液灵敏度分析”方法操作。结果表明本发明的荧光PCR方法灵敏度高，32-100cfu/mL细菌，即可检出。
重复性试验：分别对1株沙门氏菌和1株志贺氏菌重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不到0.1个循环。
共采集350份样品，包括食品样品和食物中毒样品。350份样品用荧光PCR进行检测的同时采用传统细菌培养方法进行验证。按上述方法对样品进行处理及模板的提取后进行检测，传统检测方法和荧光PCR检测方法的比较见表2。
表2 传统检测方法和荧光PCR检测方法的比较
| 检测项目 | 样品类别 | 样品数量 | 荧光PCR | 传统方法 | ||
| 阳性数 | 检测时间 | 阳性数 | 检测时间 | |||
| 沙门氏菌 | 大便 | 50 | 30 | 2小时 | 30 | 4天 |
| 食品 | 200 | 65 | 1天 | 32 | 4天 | |
| 志贺氏菌 | 大便 | 50 | 1 | 2小时 | 1 | 4天 |
| 食品 | 100 | 0 | 1天 | 0 | 4天 | |
多重荧光PCR方法检测大便和呕吐物标本仅需2小时检测时间，检测食品标本仅需1天时间(包括样品的前期处理)，可同时检测多种细菌。因此多重荧光PCR方法省时省力，准确性高，可满足疾病的快速诊断。而且，荧光PCR方法和传统检测方法结果的符合率为100％，荧光PCR灵敏度高于传统检测方法，样品含100cfu/mL细菌即可检出。
例二
本例中以三重荧光PCR-改良分子信标检测志贺氏菌、O157：H7大肠杆菌、单增李斯特氏菌为例。根据GenBank公布志贺氏菌的编码侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)的序列、O157：H7大肠杆菌的溶血素基因rfbE序列、单增李斯特氏菌的溶血素基因(hly)的序列，分别设计的一对引物和探针及其扩增片段同前文所述。
试验用菌株：O157：H7大肠杆菌(O157：H7)、单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、志贺氏菌(Shigella)(各种血清型)。所有菌株均按照中华人民共和国颁布的《食品微生物学》国家检验标准进行分离和鉴定。
利用上述荧光PCR方法同时检测志贺氏菌、O157：H7大肠杆菌、单增李斯特氏菌的方法还包括以下步骤：
(1)样品处理和模板提取：样品适用范围包括食品样品、粪便、呕吐物等标本；对粪便、呕吐物标本的处理及提取方法同例一；食品样品：对于志贺氏菌，将25g食品放在225mLGN中增菌10个小时，对于O157：H7大肠杆菌，将25g食品放在225mL肠道增菌液中增菌10个小时，对于单增李斯特氏菌：25g食品放在225mLLB1中增菌24小时，增菌后，各取0.4mL增菌液，共1.2mL，10000rpm离心5分钟，弃其上清液，加入裂解液裂解，经酚-氯仿抽提，且乙醇沉淀后，加入20μL水溶解，取5μL溶液用于实时PCR反应。
(2)三重荧光PCR扩增的反应体系：
1×PCR缓冲液
MgCl2 1.5mmol
dNTP各 0.05mmol
ipaH基因的引物 0.2μmol+0.2μmol
rfbE基因的引物 0.2μmol+0.2μmol
hly基因的引物 0.2μmol+0.2μmol
ipaH基因的探针 0.2μmol
rfbE基因的探针 0.2μmol
hly基因的探针 0.2μmol
Taq酶 1U
模板 10μL
总体积 25μL
实时PCR反应：95℃预变性5分钟，45个循环中94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒。
(3)检测：采用Rotor荧光PCR扩增仪(Roche公司)退火阶段检测荧光，一次可检测96份样品(包括阴阳对照)。结果判断：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：Ct值为0或40：阴性；Ct小于38：阳性；Ct在38-40之间：样品需重新检测。
用本发明三重荧光PCR方法检测含有志贺氏菌、O157：H7大肠杆菌、单增李斯特氏菌的体系，采用iCycler实时PCR扩增仪检测退火阶段荧光，同时测得三个荧光信号曲线如图2。其中，图2(a)为志贺氏菌体系的荧光PCR扩增仪测定的荧光信号曲线，曲线的条数表示样品数。图2(b)为O157：H7大肠杆菌的荧光信号曲线，图2(c)为荧光PCR检测含有单增李斯特氏菌的荧光信号曲线。由图2比较分析，三重荧光PCR检测多种细菌，无交叉反应，特异性强。
多重荧光PCR方法检测大便和呕吐物标本仅需2小时检测时间，检测食品标本仅需1-2天时间(包括样品的前期处理)，可同时检测多种细菌。因此多重荧光PCR方法省时省力，准确性高，可满足疾病的快速诊断。而且，荧光PCR方法和传统检测方法结果的符合率为100％，荧光PCR灵敏度高于传统检测方法，样品含100cfu/mL细菌即可检出。
例三
本例说明四重荧光PCR-改良分子信标同时检测含有志贺氏菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、O157：H7大肠杆菌的方法。根据GenBank公布志贺氏菌的编码侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)的序列、霍乱弧菌肠毒素基因ctxA的序列、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因NUC序列、O157：H7大肠杆菌的溶血性素基因rfbE序列，分别设计的一对引物和探针及扩增片段同前文所述。
试验用菌株：志贺氏菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、O157：H7大肠杆菌。所有菌株均按照中华人民共和国颁布的《食品微生物学》国家检验标准进行分离和鉴定。
利用上述荧光PCR方法同时检测志贺氏菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、O157：H7大肠杆菌的方法还包括以下步骤：
(1)样品处理和模板提取：样品适用范围包括食品样品、粪便、呕吐物等标本；对粪便、呕吐物标本的处理及提取方法同例一和例二；对于食品样品：对于志贺氏菌，将25g食品放在225mLGN中增菌10个小时，对于O157：H7大肠杆菌，将25g食品放在225mL肠道增菌液中增菌10个小时，对于金黄色葡萄球菌：25g食品放在225mL 7.5％NaCl中增菌10小时，对于霍乱弧菌，25g食品放在225mL碱性蛋白胨水中增菌后，各取0.3mL增菌液，共1.2mL，10000rpm离心5分钟，弃其上清液，加入裂解液裂解，经酚-氯仿抽提，且乙醇沉淀后，加入20μL水溶解，取5μL溶液用于实时PCR反应。
(2)四重荧光PCR扩增，配制四重荧光PCR反应体系：
1×PCR缓冲液
MgCl2 1.5mmol
dNTP各 0.05mmol
ipaH基因的引物 0.2μmol+0.2μmol
ctxA基因的引物 0.2μmol+0.2μmol
NUC基因的引物 0.2μmol+0.2μmol
rfbE基因的引物 0.2μmol
ipaH基因的探针 0.2μmol
ctxA基因的探针 0.2μmol
NUC基因的探针 0.2μmol
rfbE基因的探针 0.2μmol
Taq酶 1U
模板 10μL
总体积 25μL
实时PCR反应的条件同例一及例二。
(3)检测：采用Rotor荧光PCR扩增仪(Roche公司)退火阶段检测荧光，一次可检测96份样品(包括阴阳对照)。结果判断：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：Ct值为0或40：阴性；Ct小于38：阳性；Ct在38-40之间：样品需重新检测。
用本发明四重荧光PCR方法检测含有志贺氏菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、O157：H7大肠杆菌的体系。采用iCycler实时PCR扩增仪检测退火阶段荧光，荧光信号曲线如图3。其中，图3(a)为志贺氏菌体系的荧光PCR扩增仪测定的荧光信号曲线，曲线的条数表示样品数。图3(b)为霍乱弧菌的荧光信号曲线，图3(c)为金黄色葡萄球菌的荧光信号曲线，图3(d)为O157：H7大肠杆菌的荧光信号曲线。由图3比较分析，四重荧光PCR检测多重细菌，无交叉反应，特异性强。
各种其它食源性致病菌，如沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、单增李斯特氏菌、变形杆菌、溶血性链球菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌等，经双重、三重、四重等随机组合，用上述多重荧光PCR-改良分子信标检测方法进行检测，采用iCycler实时PCR扩增仪(Bio-Rad公司)退火阶段检测荧光，各种食源性致病菌检测均出现特异性强的与前述荧光信号曲线相似的曲线，且检测灵敏度高。
多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的检测体系可开发成一序列快速检测试剂盒，满足疾病预防控制机构、检验检疫部门和技术监督部门的日常检验和公共卫生突发事件的快速应对，具有重大的社会效益和经济效益。
Claims (9)
1、一种多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法，其包括以下步骤：
(1)根据待测各种致病菌的特异基因序列分别设计多对引物和多个改良分子信标探针；
(2)配制荧光PCR-改良分子信标扩增基因序列的反应体系；
(3)用步骤(1)的各种荧光PCR-改良分子信标同时扩增待测多种致病菌特异基因的序列；
(4)利用分子信标与扩增产物的杂交，检测反应体系的荧光强度，以达到设定的阈值时所需的循环次数Ct值作为结果判断的标准，Ct值为0或40：阴性；Ct小于38：阳性。
2、如权利要求1所述的多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述荧光PCR-改良分子信标扩增基因序列的反应体系为：
1×PCR缓冲液
MgCl2 0.5～5mmol
dNTP各 0.05～1.5mmol
各对引物 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol
各条探针 0.1～1.0μmol
Taq酶 0.2～10U
模板 1～20μL
总体积 20～100μL
3、如权利要求1所述的多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述荧光PCR-改良分子信标扩增特异基因序列的反应条件是90～100℃预变性3～10分钟，40～50个循环中92～95℃变性15～60秒，50～60℃退火15～60秒，70～72℃延伸15～120秒。
4、如权利要求1至3中任一项所述的多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述致病菌为选自霍乱弧菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌，以及O157：H7大肠杆菌中的一种或多种的组合。
5、如权利要求4所述的多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述致病菌的特异基因序列分别为霍乱弧菌肠毒素基因ctxA序列、副溶血弧菌耐热直接溶血素基因TDH序列、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因NUC、单增李斯特氏菌的溶血素基因hly的序列、沙门氏菌的侵袭基因ivnA序列、志贺氏菌的编码侵袭性质粒抗原H基因ipaH序列，以及O157：H7大肠杆菌的溶血素基因rfbE序列。
6、如权利要求5所述的多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述改良分子信标的引物和探针分别为：
ctxA基因的一对引物：
ctxA-F：5′-TCCGGAGCATAGAGCTTGGA-3′，
ctxA-R：5′-TCGATGATCTTGGAGCATTCC-3′
ctxA基因的探针：
HEX-5′-
CCGTGGATTCATCATGCACCGCCACGG-3′Dabcyl，
TDH基因的一对引物：
TDH-F：5′-AAACATCTGCTTTTGAGCTTCCA-3′，
TDH-R：5′-CTCGAACAACAAACAATATCTCATCAG-3′，
TDH基因的探针：
FAM5′-CCGGGG
TGTCCCTTTTCCTGCCCCCGG-Dabcyl，
NUC基因的一对引物：
NUC-F：5’-GGCAATACGCAAAGAGGTT-3’
NUC-L：5’-CTTCTTCTATTTACGCCGTTATC-3’
NUC基因的探针：
ROX-5’-CGATGCA
GTCTAAGTAGCTCAGCAAATGCATCG-3’-DABCYL
hly基因的一对引物：
hly-F：5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’
hly-L：5’-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3’
hly基因的探针：
FAM-5’-CGCG
CTTGTATATACTTATCGATTTCATCCGCGCG-3’-DABCYL
invA基因的一对引物：
invA-F：5’-GCGGAATATC(I)ATGACGCAGCT-3’
invA-L：5’-CGCTACGTTTTGCTTCACGG-3’
invA基因的探针：
5’-FAM-CCG
CCATTTGTATTGGTTGTTACGGCGG-DABCYL-3’
ipaH基因的一对引物：
ipaH-F：5’-TGAAGGAAATGCGTTTCTATG-3’
ipaH-L：5’-AGGGAGAACCAGTCCGTAAA-3’
ipaH基因的探针：
CY55’-CACG
GCCGAAGCTATGGTCAGAAGCCGTG-3’-DABCYL
rfbE基因的一对引物：
rfbE-L：5’-AGGTGAAGGTGGAATGGTTGTC-3’
rfbE-R：5’-GCTTGTTCTAACTGGGCTAATC-3’
rfbE基因的探针：
5’-FAMC
GGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCCG-DABCYL-3’，其中划线部分为改良分子信标探针的靶序列。
7、如权利要求1所述的多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌是双重、三重或四重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌。
8、如权利要求1所述的多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法，其特征在于：还进一步包括对待测样品处理和模板提取步骤。
9、如权利要求8所述的多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述样品包括食品样品、粪便、或呕吐物标本，其中处理粪便、呕吐物标本及提取模板是根据粪便和呕吐物量的多少，用100-200μL生理盐水悬浮，煮沸，10000rpm离心2分钟，取5μL上清液即可用于实时PCR反应；食品样品的处理和模板的提取是将食品样品在针对待测细菌的增菌液中增菌后，共取1.2mL增菌液10000rpm离心5分钟，弃其上清液后，加30uL三蒸水煮沸，再取5μL上清液即可用于实时PCR反应，或弃其上清液后加入裂解液裂解，经酚-氯仿抽提，且乙醇沉淀后，加入20μL水溶解，取5μL溶液用于实时PCR反应。
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