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CN1788005A - 作为酶底物的新吩噁嗪酮衍生物及其在检测具有肽酶活性的微生物中作为指示剂的用途 - Google Patents

作为酶底物的新吩噁嗪酮衍生物及其在检测具有肽酶活性的微生物中作为指示剂的用途 Download PDF

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CN1788005A
CN1788005A CNA2004800128762A CN200480012876A CN1788005A CN 1788005 A CN1788005 A CN 1788005A CN A2004800128762 A CNA2004800128762 A CN A2004800128762A CN 200480012876 A CN200480012876 A CN 200480012876A CN 1788005 A CN1788005 A CN 1788005A
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Abstract

本发明涉及具有下列通式(I)的新酶底物，其中R1，R2，R3，R4，R5，R6，A和X如权利要求1所定义，包括该底物的反应介质，及该底物在检测和/或鉴别和/或定量表达至少一种肽酶活性的微生物中的应用。上述是用于诊断学。

Description

作为酶底物的新吩噁嗪酮衍生物及其 在检测具有肽酶活性的微生物中作为指示剂的用途
本发明涉及检测肽酶活性的新显色酶底物。这些底物可被用在包括产生物理化学信号的酶促水解步骤的应用中，特别是在微生物学、生物化学、免疫学、分子生物学、组织学等等。和大部分是发荧光的现有底物相比，本发明的显色底物可被特别用于检测微生物的凝胶培养基，因为它们生成的显色在反应介质中不扩散并因此在菌落中聚集。
本发明也涉及包含上述底物的反应介质，涉及所述底物或所述介质在检测表达肽酶活性的革兰氏阴性细菌，革兰氏阳性细菌和酵母中的应用，也涉及使用方法。
氨肽酶通常用以命名能够水解裂解氨基酸的酰基和伯胺之间所生成酰胺基的酶，肽酶通常用以命名能够水解裂解肽的酰基残基和伯胺之间所生成酰胺基的酶。在本申请中，视情况而定，术语″肽酶″可以表示如上所述的肽酶和氨肽酶。
不扩散的检测肽酶活性的显色酶底物已经在现有技术中描述并被熟知。因此，这样的底物受到申请人的专利申请WO-A-98/04735和WO-A-99/38995的保护。然而，这些底物表现出各种各样的缺点：它们很难合成，纯度和得率低。另外，用于培养基，必须很精确限定培养基成分以便观察到颜色。其它已知的底物无一可被用于在固体培养物中检测混合培养物中的微生物。
众所周知，吩噁嗪酮(phenoxazinone)衍生的分子具有产生荧光的能力。它们能被用作：
-充当酸碱指示剂，如Stuzka，V.等人，1963，CollectionCzech.Chem.Commun.，28，1399-1407所述，
-充当荧光标记，例如用于示踪蛋白质结构修饰，如Nakanishi J.等人，2001，Analytical Chemistry，73(13)，2920-2928.所述。
从未有吩噁嗪酮衍生物被用作酶底物。
根据本发明，提出用于检测表达肽酶活性的微生物的新显色酶底物。本发明也涉及包含上述底物的反应介质，也涉及该底物或该介质检测肽酶活性的应用，以及使用方法。
实际上，申请人已经令人惊讶地发现，有可能通过使用显色吩噁嗪酮衍生物检测表达肽酶活性的微生物，它产生的显色不在反应介质中扩散，并因此聚集在菌落中，在培养基中通过菌落颜色的变化表明肽酶活性。
在用待测微生物接种含本发明底物的反应介质之后，当后者不能够水解该底物时，观察到呈无色到白色的菌落。另一方面，当它们能够水解本发明的底物时，观察到显色的菌落。
本发明的吩噁嗪酮衍生物都显色并发出荧光，而且具有检测灵敏度高的优点。
因此，本发明的主题是式(I)的显色酶底物：
Figure A20048001287600081
其中
-R1和R2与它们连接的苯环组成下式的萘环：：
或下式的任选取代的香豆素环：
Figure A20048001287600091
-或者R1和R2各自独立地表示氢原子，C1-C6烷基，卤族原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基，-SO3H基或者氨磺酰基，
-R3和R4与它们连接的苯环组成下式的任选取代的萘环：
-或者，R3和R4各自独立地表示氢原子，卤素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基，SO3H基或氨磺酰基，可以认为：
(i)R1/R2和R3/R4中至少之一与其连接的苯环组成如上所述任选取代的萘环或香豆素环，和
(ii)当R1和R2与它们连接的苯环组成任选取代的香豆素环时，R3和R4与它们连接的苯环不组成任选取代的萘环，
-R5和R6各自独立地表示氢原子，卤素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基或C1-C6烷基，
应当理解，当R1/R2和R3/R4与它们连接的苯环分别组成萘环时，R6表示卤素原子，
-R7和R8各自独立地表示氢原子，C1-C6烷基，芳烷基，芳基，羧烷基，羧基或磺酸基，
-或者R7和R8与它们连接的两个碳原子一起组成C4-C6环，
-R9表示氢原子，溴原子，氯原子，苯甲酰基，-CO2H基或-SO3H基，
应当理解，如果R9非氢原子，那么R5是氢原子，
-R’表示氢原子或C1-C6烷基，
-R”表示氢原子或C1-C6烷基，
-或者R’和R”一起与它们连接的氮原子组成含一个或多个杂原子的杂环，
-A表示至少一个氨基酸，和
-X表示封端剂或无。
根据本发明，术语“芳基”尤其指C6-C10芳环，特别是苯基，苯甲基，1-萘基或2-萘基。芳烷基的芳基部分同样如此。
本发明的芳烷基和羧基烷基中的烷基也是C1-C6。
术语″C1-C6烷基″指含1到6个碳原子的直链或支链烷基。举例来说，上述可以是甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，叔丁基，戊基，异戊基，和己基。
术语″卤素原子″是指氯、溴、碘和氟。
术语″杂原子″指不同于碳原子的原子，例如O，N或S。
R’和R”形成的杂环可以是任意大小，但优选含5到7个环成员。
杂环的实例包括吗啉，哌嗪，哌啶，吡咯烷和咪唑烷环。
根据本发明说明书，取代基R1/R2和R3/R4组成的各种萘和香豆素环由包括连同相应取代基的虚线表示以为了清楚，并可能显示所述环在本发明的吩噁嗪酮衍生物结构式(I)中的位置。
本发明的封端剂包括本领域技术人员已知能够保护胺类的任何封端剂。例如叔丁氧基羰基(N-tBOC)，9-芴氧羧基，增溶剂例如琥珀酰，或非代谢性的即非天然的氨基酸例如2-哌啶酸。
该封端剂不是系统地存在于本发明的化合物中。在这种情况下，当本发明的化合物无封端剂时(X是无)，本发明的化合物是盐形式，例如氯化物，溴化物或三氟醋酸盐。
在结构式(I)中A表示的氨基酸是本领域技术人员已知的任何氨基酸。
根据本发明的一个实施方案，A表示氨基酸或最多含10个相同或不同氨基酸的肽。优选地，出于对底物成本的考虑，A表示氨基酸或最多含4个相同或不同氨基酸的肽。
根据某一实施方案，本发明的化合物具有结构式(I)：
其中
-R1和R2与它们连接的苯环组成下式的萘环：
Figure A20048001287600112
或下式的任选取代的香豆素环：
-或者R1和R2各自独立地表示氢原子，C1-C6烷基，卤素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基，-SO3H基或者氨磺酰基，
-R3和R4与它们连接的苯环组成下式任选取代的萘环：
-或者R3和R4各自独立地表示氢原子，卤素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基，-SO3H基或氨磺酰基，可以认为：
(i)R1/R2和R3/R4中至少之一与其连接的苯环组成如上所述任选取代的萘环或香豆素环，和
(ii)当R1和R2与它们连接的苯环组成任选取代的香豆素环时，R3和R4与它们连接的苯环不组成任选取代的萘环，
-R5和R6各自独立地表示氢原子，卤素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基或C1-C6烷基，
应当理解
(i)R6表示氢原子，当R1和R2与它们连接的苯环组成萘环或香豆素环时，和
(ii)R6表示卤素原子，当R1/R2和R3/R4与它们连接的苯环分别组成苯环时，
-R3和R8分别独立地表示氢原子，C1-C6烷基，芳烷基，芳基，羧基烷基，羧基或磺酸基，
-或者R3和R8与它们连接的两个碳原子一起组成C4-C6环，
-R9表示氢原子，溴原子，氯原子，苯甲酰基，-CO2H基或-SO3H基，
应当理解，当R9非氢原子时，那么R5是氢原子，
-R’表示氢原子或C1-C6烷基，
-R”表示氢原子或C1-C6烷基，
-或者R’和R”与它们连接的氮原子一起组成含一或多个杂原子的杂环，
-A表示至少一个氨基酸，和
-X表示封端剂或无。
根据另一个实施方案，本发明的化合物选自结构式(I)的化合物，其中R1和R2与它们连接的苯环组成萘环，或R1和R2与它们连接的苯环组成香豆素环，或者R3和R4与它们连接的苯环组成萘环，其它取代基如上定义，应当理解当R1/R2与它们连接的苯环组成萘环或香豆素环的时候，R3/R4不会与它们连接的苯环同时组成萘环，反之亦然。
因此，根据此实施方案，酶底物是下列结构式(I)的化合物：
其中
-R1和R2与它们连接的苯环组成下式萘环：
或下式任选取代的香豆素环：
-或者R1和R2各自独立地表示氢原子，C1-C6烷基，卤素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基，-SO3H基或者氨磺酰基，
-R3和R4与它们连接的苯环组成下式任选取代的萘环：
-或者R3和R4分别独立地表示氢原子，卤素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基，-SO3H基或氨磺酰基，
应该理解：R1/R2和R3/R4当中有一个且仅有一个与它们连接的苯环组成如上所述的任选取代的萘环或香豆素环，
-R5和R6分别独立地表示氢原子，卤素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基，或C1-C6烷基，
-R7和R8分别独立地表示氢原子，C1-C6烷基，芳烷基，芳基，羧基，羧基烷基，羧基或磺酸基，
-或者R3和R8与它们连接的两个碳原子一起组成C4-C6环，
-R9表示氢原子，溴原子，氯原子，苯甲酰基，-CO2H基或-SO3H基，
应该理解，当R9非氢原子时，那么R5是氢原子，
-R’表示氢原子或C1-C6烷基，
-R”表示氢原子或C1-C6烷基，
-或者R’和R”与它们连接的氮原子一起组成含一或多个杂原子的杂环，
-A表示至少一个氨基酸，和
-X表示封端剂或无。
根据本发明的一个实施方案，A表示氨基酸或最多含10个相同或不同氨基酸的肽。优选地，A表示氨基酸或最多含4个相同或不同氨基酸的肽。
根据某一具体实施方案，本发明的化合物是具有下列结构式(Ia)的酶底物：
其中R5，R6和A和X如上所述。
结构式(Ia)的化合物是结构式(I)的化合物，其中R1和R2基与它们连接的苯环组成萘环，而R3和R4分别是氢原子。
优选地，在结构式(Ia)的化合物中，R5表示氢原子，R6表示氢原子或例如氯原子的卤素原子，A为选自亮氨酸，脯氨酸和丙氨酸的氨基酸，和X是叔丁氧基羰基封端剂或无。
根据另一个具体实施方案，本发明的化合物是结构式(Ib)的酶底物：
Figure A20048001287600152
其中R5，R7，R8，A和X如上所述。
结构式(Ib)的化合物是结构式(I)的化合物，其中R1和R2与它们连接的苯环组成香豆素环，而R3，R4和R6分别是氢原子。
优选地，在结构式(Ib)的化合物中，R5表示氢原子，R7和R8各自独立地表示氢原子，C1-C6烷基，芳烷基，芳基或羧基烷基，或R7和R8与它们连接的两个碳原子一起组成C4-C6环，A为选自亮氨酸，脯氨酸和丙氨酸的氨基酸，和X是叔丁氧基羰基封端剂或无。
还根据另一个具体实施方案，本发明的化合物是结构式(Ic)的酶底物：
其中R5，R6，R9，A和X如上所述。
结构式(Ic)的化合物是结构式(I)的化合物，其中R3和R4与它们连接的苯环组成萘环，R1和R2分别是氢原子。
优选地，在结构式(Ic)的化合物中，R5，R6和R9基分别表示氢原子，A是选自亮氨酸，脯氨酸和丙氨酸的氨基酸，和X是叔丁氧基羰基封端剂或无。
还根据另一个具体实施方案，本发明的化合物是结构式(Id)的酶底物：
其中R5，R6，A和X如上所述。
结构式(Id)的化合物是结构式(I)的化合物，其中R1/R2和R3/R4与它们连接的苯环分别组成萘环。
依赖于R1/R2和R3/R4基所成的环，本发明的化合物可以按照若干制备方法制备，即R1/R2与它们连接的苯环组成萘环，或R1/R2与它们连接的苯环组成香豆素环，或R3/R4和它们连接的苯环组成萘环，或R1/R2和R3/R4分别与它们连接的苯环组成萘环。
因此，按照以下方案1中表示的方法可以制备结构式(I)的化合物，其中R1和R2与它们连接的苯环组成萘环：
                         方案1
Figure A20048001287600171
根据上述的方案1，结构式(I)化合物(其中R1和R2与它们连接的苯环组成萘环)由适量的2-氨基-5-硝基苯酚化合物(a)与适量的卤化1，4-萘醌(b)制备，，它们已经预先加热到沸点，然后冷却到25℃，使得生成相应的9-硝基-苯并[a]吩噁嗪酮(c)。化合物c接着与乙酰丙酮酸二价铜盐的混合物反应，该乙酰丙酮酸二价铜盐与氢化硼钠预先反应，使得生成化合物(d)。化合物(d)随后与一或多个任选保护的氨基酸(6)在冷却到-12℃的水浴中反应以便生成结构式(I)的化合物。这里应当指出，毫无疑问，当A是单个氨基酸时，化合物(6)中的A’相当于化合物(I)的A，但包括一个另外的羟基。换句话说，当A是单个氨基酸时，A’以-C(O)OH结束，当A通过-C(O)-被连接到-NH-时，脱去-OH。当A是具有至少两个氨基酸的链时，A’的最后一个氨基酸如上所述，即它相对于A的最后一个氨基酸还包括一个另外的羟基。
结构式(Ia)的化合物中R1和R2与它们连接的苯环组成萘环而R6是氢原子，它还可以按照以下方案1a所描述的方法制备。
                       方案1a
Figure A20048001287600181
按照方案1a，在-3℃下由适量的3-乙酰氨基苯酚化合物(1)与亚硝酸盐(2)例如亚硝酸钠(X＝Na)，亚硝酸钾(X＝K)等反应制备结构式(Ia)的化合物。由此得到的亚硝基乙酰氨基苯酚(3)随后与1，3-二羟基萘(4)在溶剂例如丁醇中反应，加热到大约70℃，然后加入浓硫酸并继续加热到90℃，然后冷却，使得生成适量的9-乙酰氨基-苯并[a]吩噁嗪-5-酮。后者化合物随后由适量的浓硫酸加热使得产生9-氨基-苯并[a]吩噁嗪-5-酮。最后的步骤相当于方案1的最后的步骤。
可以按照以下方案2的方法制备结构式(I)的化合物，其中R1和R2与它们连接的苯环组成香豆素环：
                        方案2
Figure A20048001287600191
按照上述的方案2，在有化合物(8)的情况下氧化和氯化适量的对苯二胺衍生物(7)，以便按照Willstaetter和Mayer(1904，Chem.Ber.37：1498)的方法获得N，N’-二氯-对苯醌二亚胺(9)，从而制备结构式(I)化合物，结构式(I)化合物中R1和R2与它们连接的苯环组成香豆素环，并且，如结构式(I)化合物的一般定义表示，R6是氢原子。后者化合物随后在醇溶液与5，7-二羟基香豆素(10)反应以便获得适量的7-氨基-1，2-吡喃酮基吩噁嗪-3-酮(11)。最后的步骤相当于方案1的最后步骤。
用上述方法无疑可以制备结构式(Ib)的化合物，它是结构式(I)的化合物，其中R1和R2与它们连接的苯环组成香豆素环。
按照以下方案3所示的方法可以制备结构式(I)的化合物，其中R3和R4与它们连接的苯环组成萘环：
                            方案3
Figure A20048001287600192
按照上述的方案3，根据Fischer & Hepp(参考文献36.2，1807，1903)的方法，适量的2-萘酚(12)与适量的4-硝基苯酚(13)缩合以便产生适量的萘吩噁嗪酮(14)，从而可以制备结构式(I)化合物，在结构式(I)化合物中R3和R4与它们连接的苯环组成萘环。后者化合物(14)按照Kehrman & Gottrau(参考文献38，2574，1905)的方法随后与盐酸羟胺(15)反应以便获得羟基亚胺和氨基酮(分别是化合物16和17)。最后的步骤相当于方案1的最后的步骤。
采用上述方法无疑可以制备结构式(Ic)的化合物，它是R3和R4与它们连接的苯环组成萘环的结构式(I)化合物。
最终，按照以下方案4所示方法可以制备本发明的结构式(I)化合物，其中R1/R2和R3/R4基分别与它们连接的苯环组成萘环(结构式(Id)的化合物)：
                        方案4
按照上述的方案4，通过适量的1-氨基-2-萘酚-4磺酸(18)与适量的2-羟基-1，4-萘醌(19)缩合以便生成适量的二萘磺酸噁嗪酮(20)，从而制备结构式(I)化合物，其中R1/R2和R3/R4分别与它们连接的苯环组成萘环。此化合物(20)随后在有铵的情况下加热以便生成氨基二萘噁嗪酮(21)。此方法的最后步骤相当于方案1的最后步骤。
上述方法中，起始反应物(化合物(1)、(2)、(4)、(6)、(7)、(8)、(10)、(12)、(13)、(15)、(18)和(19))为市售，更详细地说是来自Aldrich。
本发明的主题也是一种反应介质，它单独使用至少一种如上定义的结构式(I)的显色酶底物或与至少一种不同于本发明底物所检测的酶活性的其它特异性酶底物联用。
实际上，当表达肽酶活性的微生物接种到含本发明化合物的反应介质内或表面时，出现的显色不会在反应介质内或表面扩散，并因此聚集在菌落中。
术语″本发明的反应介质″是用来指能用于展示至少一种微生物的至少一种酶活性的介质。
此反应介质可以仅用作显色介质或用作培养基和显色介质。在第一种情况下，在接种前培养微生物。而在第二种情况下，反应介质也构成培养基，它组成本发明的具体实施方案。
该反应介质可以是固体、半固体或液体。术语″固体介质″是用来指，例如，凝胶介质。
琼脂是在微生物学上适合培养微生物的常用固体介质，但也有可能使用明胶或琼脂糖。某些制品是市售的，诸如，Columbia琼脂，Trypcase大豆琼脂，Mac Conkey琼脂，Sabouraud琼脂或更通常的，Handbook of Microbiological Media(CRC Press)所述的那些。
优选地，当反应介质也是培养基时，它为凝胶型，
反应介质中琼脂数量是2到40g/l，并优选9到25g/l。
本发明的酶底物可以在宽泛的pH范围内被使用，更详细地在pH5.5和10之间。
反应介质中本发明酶底物的浓度在0.025和0.40g/l之间，而且0.05g/l更好。这是因为在此底物浓度，得到更好的显色对比度。
反应介质可以包括至少一种不同于本发明底物所检测的酶活性的其它特异性底物。其它底物的酶促水解产生不同于本发明底物所检测信号的检测信号，诸如，不同的颜色或荧光产物，以便证明例如检测和/或鉴别和/或定量一种或多种微生物。
作为其它特异性底物，可以提及3-吲哚氧基型底物，例如5-溴-4-氯-3-羟基吲哚-β-D-葡萄糖苷(Biosynth)或5-溴-6-氯-3-羟基吲哚-β-D-半乳糖苷(Biosynth)或所有用于微生物检测的其他底物。
其它特异性酶底物的浓度通常在0.01和2g/l之间。本领域技术人员将能容易地根据使用的底物确定上述的浓度。
反应介质还可以包括一或多种其它成份，例如氨基酸，胨，碳水化合物，核苷酸，矿物质，维生素，抗生素，表面活性剂，缓冲剂，磷酸盐，铵盐，钠盐或金属盐。介质的实例如申请人的专利申请EP656421和WO99/09207所述。
因此本发明的酶底物和反应介质被用于诊断有肽酶活性的微生物。
因此，本发明的主题也是结构式(I)的显色酶底物或如上述定义的反应介质用于检测和/或鉴别和/或定量表达至少一种肽酶活性的微生物的应用。
该发明也涉及一种用于检测和/或鉴别和/或定量表达至少一种肽酶活性的微生物的方法，特征在于该方法包含下列步骤：
·提供如上述定义的反应介质，
·用待测生物样品接种该介质，
·使其孵育，和
·显示至少一种肽酶活性的单独存在或与至少一种不同于前述肽酶活性的其他酶活性的组合存在。
接种和孵育步骤是本领域技术人员公知的。
例如，孵育温度是37℃。至于孵育环境，厌氧或有氧都一样。然而，优选在需氧条件下进行孵育，因为这能增加酶活性。
肉眼观察到可见的显色变化不在反应介质中扩散，并因此聚集在菌落中。
作为利用本发明酶底物可被检出的微生物的例子，可以提及革兰氏阴性细菌，革兰氏阳性细菌和酵母。
作为革兰氏阴性细菌，可以提及下列细菌属：假单胞菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、变形菌属、弯曲杆菌属、嗜血菌属、摩根氏菌属、弧菌、耶尔森氏菌属、不动杆菌属、布兰汉氏球菌属、奈瑟氏球菌属、伯克氏菌属、柠檬酸杆菌属、哈夫尼菌属、爱德华氏菌属和军团菌属。
作为革兰氏阳性细菌，可以提及下列属细菌：肠球菌属、链球菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、李斯特菌属、梭菌属、分枝杆菌属和棒状杆菌属。
酵母的实例包括下列酵母属：假丝酵母、隐球酵母属、糖酵母属和丝孢酵母属。
被分析的生物样品是任何临床样品，例如唾液，血液，尿或大便样品或其他可以有助临床医生进一步诊断的任何样品。样品也可以是源自食物和/或制药工业的产品或基础产品，在该产品中有必要保证无致病微生物或统计污染菌群或者检测特定微生物。
A为丙氨酸的本发明显色底物具有下列优点，即它们有可能将革兰氏阴性细菌与革兰氏阳性细菌区别开。
因此，本发明的另一个主题由一种在细菌中区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的方法组成，特征在于该方法包含下列步骤：
·提供一种如上述定义的反应介质，并且其中显色底物的取代基A是丙氨酸，
·用待测生物样品接种所述介质，
·进行孵育，和
·显示代表一种革兰氏阴性菌或几种革兰氏阴性菌的至少一种显色的存在。
至于A是脯氨酸的显色底物，它们有下列优点，即它们有可能区别白色假丝酵母(Candida albican)以及热带假丝酵母(Candidatropicalis)和Candida glabrata。
因此，本发明的另一个主题涉及一种区分白色假丝酵母物种与热带假丝酵母和Candida glabrata的方法，特征在于该方法包含下列步骤：
·提供一种如上述定义的反应介质，并且其中显色底物的取代基A是脯氨酸，
·用待测生物样品接种所述介质，
·进行孵育，并显示代表白色假丝酵母物种的酵母的存在的至少一种显色的存在。
利用非限制说明给出的下列实施例，可以更清楚地理解本发明。
实施例1：合成9-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮
(R3＝R4＝R5＝H的化合物(5))
1.1   2-亚硝基-5-对乙酰氨基酚的制备
9g的3-乙酰氨基酚(Aldrich)溶于含2.8g氢氧化钠的水溶液(100ml)。使用冰-盐浴冷却溶液到-3℃并加入5g亚硝酸钠的水溶液(12ml)。
使用分液漏斗加入用等量水(25ml)稀释的磷酸溶液到所述搅拌的溶液中。以某一速率进行这样的添加以便温度保持在0℃或低于此温度。然后生成红-褐色沉淀物。在进一步剧烈搅拌一小时后，测定pH以便确保完全酸性(pH＜2)。
过滤由此所获得的粘稠悬浮液并用冷水小心地洗涤残留物以便除去过量的酸和盐。在适当抽气后，在真空干燥器中干燥残余物。以68.6％的得率获得7.36g的2-亚硝基-5-乙酰氨基酚。
1.2  9-乙酰氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮的制备
在上述1.1中得到的1.8g粗产物和1.6g 1，3-二羟基萘(Aldrich)溶解在50ml丁基-1-醇中同时搅拌并加热到70℃。逐滴加入1g浓硫酸到加热的溶液并继续加热到90℃。在30分钟后，让混合物冷却。抽滤除去固相并用少量乙醇完成洗涤。干燥后，以76％的得率获得标题化合物。
在硅胶板上使用醋酸乙酯/甲苯(3∶1)作流动相对所得产物进行薄层色谱分析。得到浅橙黄色斑点(Rf＝0.8)。
1.3   9-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮的制备
上述1.2中所得的1.5g化合物溶解在最少量体积的硫酸和水(1∶1)中，同时搅拌并加热到100℃直到取样并在水中稀释为止，然后在乙酸乙酯中提取，通过薄层色谱法显示没有任何起始产物。搅拌由此所得的深色溶液并加热到沸点若干分钟，然后冷却并倒入冰-水浴(300ml)中。沉淀物被研碎，然后进行加热到40℃并将产物静置过夜。通过沉降让上清液分离，然后过滤产物的悬浮液并用水洗涤。干燥后，以78％的得率获得目标产物。
实施例2：9-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮的氨基酰化
(结构式(I)的化合物，其中R1/R2组成萘环，R3＝R4＝R5＝R6＝H，A＝氨基酸和X＝N-t-BOC)
将实施例1中所得0.52g(2mmol)相关的氨基化合物溶解在15ml二甲基甲酰胺(高效液相色谱质量)同时加热，然后溶于10ml的四氢呋喃中。在三颈烧瓶中使用氢气(由硼氢化钠/醋酸产生)以及0.1g的10％披钯碳作催化剂氢化此溶液。暗紫色被出现的绿色荧光所取代。继续氢化30分钟，封闭烧瓶并静置过夜。
3mmol氨基酸保护的N-tBOC溶解在10ml的无水四氢呋喃中并冷却产物到-12℃(冰/盐浴)。加入0.33g(3.3mmol)的N-甲基吗啉到所述冷却的溶液中，然后在-12℃和-9℃之间缓缓加入0.42g(3.1mmol)的氯甲酸异丁酯。5分钟后，将上述的混合酸酐反应混合物倒入还原胺的搅拌溶液，预先冷却混合物到至少-5℃，同时导入氢气以防止再氧化。10分钟后，封闭烧瓶并在室温再搅拌内容物5小时。
过滤反应混合物并通过旋转蒸发除去溶剂(四氢呋喃)。将DMF溶液倒入充分搅拌的水-冰混合物，滤过沉淀物，用水洗涤并自然干燥。粗产物溶解在二氯甲烷(DCM)中并用稀释(0.2M)的氢氧化钠洗涤，再用水洗涤。用硫酸镁干燥后，除去溶剂。
在某些情况下，经硅胶漏斗过滤DCM提取物以除去易被薄层色层分析法检测出的微量原料。
在此实施例中获得的化合物能以下列方法被去保护：产物溶解在少量乙酸乙酯中并用相同量的氯化氢饱和的乙酸乙酯搅拌1小时。加入过量的无水醚，盐酸盐沉淀物被迅速滤过，然后用另外的醚或醚/矿物香精洗涤，并随后在真空中干燥。
实施例3：9-氨基-6-乙氧羰基(carbethoxy)苯并[a]吩噁嗪-5- 酮的合成
(结构式I的化合物，其中R1/R2组成萘和R3＝R4＝R5＝H和R6＝-C(O)OR’，所含R’＝C2H5)
3.1  乙基1，3-二羟萘甲酸酯的制备
按照Meyer和Bloch(Org.Synth.Coll.，Vol 3，p 132)所述的方法由丙二酸二乙酯和苯乙酰氯制备此化合物。
3.2  9-乙酰氨基-6-乙氧羰基苯并[a]吩噁嗪-5-酮的制备
1.8g(10mmol)的2-亚硝基-5-乙酰氨基酚和2.08g(9mmol)的乙基1，3-二羟萘甲酸酯溶解在60ml的丁醇，同时加热并在70℃搅拌混合物。逐滴加入浓硫酸并逐渐加热溶液到大约90℃。在30分钟后，让反应混合物冷却并在5℃保留过夜。
抽滤除去红色产物并用少量乙醇洗涤。
干燥后，以65％的得率获得9-乙酰氨基-6-乙氧羰基苯并[a]吩噁嗪-5-酮。
3.3  9-氨基-6-乙氧羰基苯并[a]吩噁嗪-5-酮的制备
在3.2中获得的9-乙酰氨基-6-乙氧羰基苯并[a]吩噁嗪-5-酮溶解在硫酸(3ml)和乙醇(3ml)的混合物中。在同时逐步加入水(1ml)的时候加热该混合物到80℃。迅速显现胺的特征紫色。继续水解直到样品被水稀释为止，然后在乙酸乙酯中提取，通过薄层色层分析法显示没有任何9-乙酰氨基-6-乙氧羰基苯并[a]吩噁嗪-5-酮。
将反应混合物倒入150ml的冰冻水，通过抽滤收集产物，然后用水洗涤并干燥。以85％的得率获得该产物。
实施例4：9-氨基-6-乙氧羰基苯并[a]吩噁嗪-5-酮的氨基酰化
采用如实施例2所述的方法，使用实施例3中获得的产物并使用适量的被N-t-Boc保护的氨基酸。
对于胺化化合物的去保护，它被溶解在2ml的三氟乙酸中，接着用醚沉淀。通过薄层色谱法由此获得均匀橙色粉末形式的产物。
实施例5：9-氨基-6-氯苯并[a]吩噁嗪-5-酮的合成
(结构式I的化合物，其中R1/R2组成萘，R3＝R4＝R5＝H和R6＝Cl)
5.1  9-硝基-氯苯并[a]吩噁嗪-5-酮的制备
加入1.54g(10mmol)的95％纯2-氨基硝基苯酚(Aldrich)到2.26g(10mmol)的2，3-二氯-1，4-萘醌(Fluka)的乙醇悬浮液，预先加热到沸点，然后冷却到25℃。搅拌混合物并加入1g无水醋酸钠。若干小时后，生成桔褐色沉淀物。连续搅拌24小时后，固体被抽滤分离，干燥，然后从热乙酸中重结晶(得率65％)。
5.2  9-氨基-6-氯苯并[a]吩噁嗪-5-酮的制备
130mg(1mmol)的乙酰丙酮酸二价铜盐，悬浮在10ml的乙醇中，与0.18g(5mmol)的氢化硼钠在室温下搅拌直到来源于此催化作用的褐色化合物生成为止(大约10分钟)。上述5.1中获得的1.29g(4mmol)化合物，在10ml的正丙醇中以悬浮液的形式被加入此混合物，接着加入0.37g(10mmol)的氢化硼钠。该混合物在30℃搅拌3小时。
冷却后，反应混合物被倒入冰/水混合物，然后通过过滤回收粗产物并干燥。它被溶解在热的正丁醇中并被过滤以便除去含铜的产物，从而得到纯化。浓缩后，使标题化合物结晶以产生0.68g的产物。
实施例6：9-氨基-6-氯苯并[a]吩噁嗪-5-酮的氨基酰化
采用如实施例2所述的方法，使用实施例5中获得的产物和适量由N-t-Boc保护的氨基酸。
对于胺化化合物的去保护，也可以采用如实施例2所述的方法。
实施例7：5-氨基苯并[a]吩噁嗪-9-酮的合成
(结构式I的化合物，其中R3/R4组成萘和R1＝R2＝R5＝R6＝R9＝H)
7.1   萘吩噁嗪酮的制备
使用Fisher & Hepp(上文)的方法无须显著的调整，4-亚硝基苯酚和2-萘酚在冰醋酸中使用氯化锌作缩合剂进行缩合。
粗产物从热的甲苯/矿物香精中以25％的得率再结晶。
这里所用的4-亚硝基苯酚是从Fluka获得的市售产品被用下列方式改造：此产物溶解在乙醚中，经Phase-Sep纸过滤并与Norite搅拌一小时，从而得到纯化。过滤后，醚溶液被旋转蒸发减少体积，然后冷却以便获得纯亚硝基苯酚的结晶产物。
7.2   胺产物的制备
按照Kehrmann & Gottrau(上面)的方法，用200ml的纯乙醇混合以上7.1中所得的3g萘吩噁嗪酮和3.0g盐酸羟胺，并将混合物逐渐加热到沸点。萘吩噁嗪酮的红色逐渐被橙色取代而且出现碱的盐酸盐沉淀。滤过除去沉淀物，用少量乙醇洗涤，然后干燥以获得得率63％的盐酸盐。
由此所得的1g盐与水加热被分解，然后通过冷却以便产生游离碱的绿色残余物。产物被滤过，在40℃溶解在几ml的乙醇中，同时加入足量的HCl用于溶解。荧光紫-红溶液与足量的无水醋酸钠加热产生游离基(free base)(暗绿色的金属针状)。滤过产物，用热水洗涤，并干燥以获得97％的得率。
实施例8：7-氨基-1，2-(3’，4’-环戊烯-2’吡喃酮基)- 吩噁嗪-3-酮的合成
(结构式I的化合物，其中R1/R2组成香豆素，R7和R8与它们连接的两个碳原子一起组成环戊烯，R3＝R4＝R5＝R6＝H)
8.1   5，7-二羟-3，4-环戊烯香豆素的制备
3.02g(24mmol)的间苯三酚和3.12g(20mmol)的乙基2-氧环戊烷羧酸酯在小烧瓶中用少量乙醇一起混合。冷却后，30ml的硫酸/水混合物(75％w/w)加入到搅拌的混合物中。在室温下继续搅拌48小时。将半固体产物倒入完全搅匀的冰/水混合物并进行过滤。用水完全洗涤残余物，抽干，然后自然干燥。
从乙醇中再结晶产生薄层层析均匀的产物。产量是2.8g。
8.2   标题化合物的制备
在以上8.1中得到的2.18g(10mmol)5，7-二羟-3，4-环戊烯香豆素溶解在40ml的热乙醇中，而且加入1.74g(10ml)的1，4-二氯-对苯醌二亚胺到搅拌的溶液。让反应混合物在水浴锅上缓慢回流几分钟，在此时间内液体变成深紫色。进一步回流20分钟后，将反应混合物倒入250ml含2g醋酸盐的冰/水混合物。显色物以深蓝色沉淀物的形式被分离。通过抽滤除去由此所得的沉淀物，然后用水洗涤。干燥产物(1.5g)可以从乙酸和正丁醇再结晶。
实施例9：7-氨基-1，2-(4’-甲基-2’-吡喃酮基)吩噁嗪-3- 酮的合成
(结构式I的化合物，其中R1/R2组成香豆素，R8是甲基，R7＝R3＝R4＝R5＝R6＝H)
9.1   5，7-二羟-4-甲基香豆素的制备
2.77g(22mmol)的间苯三酚和2.6g(20mmol)乙酰醋酸乙酯的混合物被一起熔融，冷却混合物，然后迅速加入40ml硫酸/水的混合物(75％w/w)到该半固体物质。搅拌混合物24小时，其间生成半固体物质。将它倒入含5g醋酸钠的冰/水混合物(300ml)，通过抽滤回收沉淀物。
反复用水洗涤并干燥后，粗产物从热乙醇再结晶以产生3.05g的香豆素。
9.2   7-氨基-1，2-(4’-甲基-2’-吡喃酮基)吩噁嗪-3-酮的制 备
1.92g(10mmol)的5，7-二羟-4-甲基香豆素溶解在50ml的无水甲醇。将7.5g(0.125mol)的尿素加入到搅匀的热溶液中以便减少放热并减少产物的氯化。加入1.74g(10mmol)的1，4-二氯苯醌二亚胺到已经搅拌回流24小时的反应混合物。
将暗紫色溶液倒入完全搅匀的含10g醋酸钠的冰/水混合物。通过真空过滤除去暗紫色沉淀物并进行干燥。在加热到50℃的200ml甲醇中通过悬浮纯化该粗产物，同时逐步加入到完全搅匀的溶液，该溶液在20ml的水中含5g连二亚硫酸钠和5g碳酸钠。生成黄褐色沉淀物。
迅速过滤反应混合物以便分离二氢形式的显色沉淀物。用含少量连二亚硫酸钠的水/冰混合物将其洗涤，由此湿润的沉淀物被转移到100ml的甲醇中。迅速搅匀的溶液被加热到40℃，然后逐渐地加入水，从而使无色的显色物(二氢形式)再氧化成为可能，并得到略呈暗紫色-褐色的沉淀物。最终，加入100ml的水以便终止显色物的氧化和沉淀，它在滤过除去后被干燥。薄层层析法仅显示单一的紫色化合物和微量的该化合物的二氢形式。
实施例10：7-氨基-1，2-(3’-羧乙基-4’-甲基-2’-吡喃酮 基)吩噁嗪-3-酮的合成
(结构式I的化合物，其中R1/R2组成香豆素，R7＝羧乙基，R8＝甲基和R3＝R4＝R5＝R6＝H)
10.1  乙基5，7-二羟-4-甲基香豆素-3-丙酸酯的制备
2.77g(22mmol)的间苯三酚和4.60g(20mmol)的二乙基乙酰戊二酸酯一起混合，冷却，并与35ml的75％w/w硫酸/水混合物搅拌。继续搅拌48小时。通过倒入搅匀的冰/水混合物并进行抽滤来分离产物。用水彻底洗涤残余物并自然干燥。
通过悬浮在乙醇中并与氢氧化钾水溶液(3摩尔当量)搅拌将产物直接转化成游离酸。4小时后，加入pH2的2M盐酸沉淀酸。抽滤除去大量的沉淀物，用水洗涤并抽干。自然干燥后，得到总量3.8g的目标产物。
10.2   标题化合物的制备
如实施例8.1使用1，4-二氯-对苯醌二亚胺和上述10.1中得到的酸制备所述化合物。反应混合物倒入冰/水混合物，加入盐酸直到获得pH 2，以便确保显色物的游离羧酸形式完全沉淀。所得干燥产物总量是2.2g。
实施例11：表达亮氨酸-肽酶活性的微生物的检测
11.1   检测介质的制备
混合1.4g的biogelytone(bioMérieux)，0.84g的肉提取物(bioMérieux)，2.24g NaCl(Merck)，280μl的IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷，BIOSYNTH)水溶液(浓度10g/l)和4.2g欧洲琼脂(bioMérieux)制备检测介质。
实施例2中所获得的本发明的底物，其中氨基酸是亮氨酸(亮氨酸-9-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮或亮氨酸-ABP)，或者现有技术的底物亮氨酸-氨基甲基香豆素(亮氨酸-AMC，BACHEM)，以下列方式被加入：280ml渗透性水加入到介质，混合物溶解在100℃的水浴锅中。混合物在121℃高压灭菌15分钟并在水浴锅中冷却到50℃。
然后按照下面表1显示的浓度加入溶解在二甲基亚砜(Merck)的底物：
                                 表1
  介质1   介质2   介质3   介质4   介质5   介质6   介质7
  Leu-ABP   0mg/l   25mg/l   50mg/l   100mg/l   200mg/l   400mg/l
  Leu-AMC   50mg/l
该介质然后倒入培养皿中。
11.2   微生物菌株的接种
申请人收集的10个微生物菌株悬浮在生理盐水中，被接种在每个介质的菌落中。培养皿在37℃孵育48小时。所生成的菌落在孵育24和48小时后肉眼检查。记录这些菌落的显色，扩散以及显色强度。
11.3   结果
结果可以表示为使用0到4为基础的人为标度范围的显色强度，扩散时也使用从0到4作为基础的人为标度。下面表2给出这些结果，其中
-Ta相当于孵育时间，Cb相当于毫米为单位的生长直径，Ic相当于显色亮度，Cod相当于菌落颜色和De相当于扩散，
-B相当于荧光蓝和R相当于粉红色
表2
  菌株   Ta          介质1         介质2           介质3           介质4            介质5         介质6           介质7
  Cb   活性   Cb   活性   Cb   活性   Cb   活性   Cb   活性   Cb   活性   Cb     活性
  Ic   Cod   De   Ic   Cod   De   Ic   Cod   De   Ic  Cod   De   Ic   Cod   De   Ic   Cod   De   Ic   Cod De
  大肠杆菌   24h48h   1.81.8   33   BB   44   1.81.8   1.81.8   0.00.25   RR 0.25   1.71.8   0.50.5   RR   0.50.5   1.81.8   0.0   RR   1.71.7   1.81.8   0.75   R
  弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii) 24h48h 0.81 33 BB 44 0.80.8 0.70.7 1.52.5 RR 0.50.5 0.70.7 1.52.5 RR 0.50.75 0.70.7 0.751.5 RR 025 0.80.8 12 RR 0.70.7 22 RR
  肺炎克雷伯氏菌   24h48h   1.81.8   33   BB   44   1.81.8   1.81.8   1.52   RR   0.250.25   1.71.7   1.52.5   RR   0.50.75   1.71.7   1.51.5   RR 0.0   1.71.7   21   RR   1.71.8   2.51   RR
  阴沟肠杆菌   24h48h   0.80.8   33   BB   44   0.70.7   0.70.7   1.52.5   RR   0.50.5   0.50.5   2.53   RR   0.50.75   11.3   33   RR 0.25   1.51.5   33   RR   1.51.7   33   RR
  粘质沙雷氏菌   24h48h   0.50.7   23   BB   44   0.50.7   0.50.7   0.52.5   RR 0.5   0.40.5   13   RR 0.5   0.40.5   0.251.5   RR 0.0   0.40.5 1 R   0.40.5 0.5 R
  铜绿假单胞菌   24h48h   22   13   BB   44   22   22 1 R 0.5   22   0.752.5   RR 1   22   0.752.5   RR 0.5   22   0.52   RR 0.3   22   0.50.5   RR
  金黄色葡萄球菌   24h48h   1.71.7   2.53   BB   44   1.71.7   0.30.7 0.25 R 0.25   0.20.2
  粪肠球菌   24h48h   0.40.4   0.51.5   BB   44   0.40.4   0.30.3   0.00.0   RR   0.250.25   0.30.3   0.00.0   RR   025025   0.30.3 0.0 R 0.0   0.30.3   0.30.3 0.5 R
  白色假丝酵母   24h48h   0.40.5   0251.5   BB   44   0.40.7   0.30.5 0.25 R 0.3
以上表1和2所示结果表明本发明的显色酶底物显然可以检测表达亮氨酸-肽酶活性的微生物，和现有技术的底物相比，在菌落周围观察到极其少量的扩散。
实施例12：表达脯氨酰-肽酶活性的微生物的检测
12.1   检测介质的制备
混合1.68g酵母提取物(bioMérieux)，1.4g biocase(bioMérieux)，1.26g麦芽提取物(bioMérieux)，0.08g葡萄糖(Merck)和3.92g琼脂(bioMérieux)制备检测介质。
280ml渗透性水加入到粉末，然后混合物溶解在100℃的水浴锅中。产物分离到两个烧瓶，每个140ml。在121℃进行高压灭菌15分钟，然后产物在水浴锅中冷却到50℃。
L-脯氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素(Pro-AMC，Bachem)加入到第一个烧瓶作对照，然后加入L-脯氨酰-9-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮(Pro-ABP，实施例2中所得的本发明底物，其中氨基酸是L-脯氨酸)到第二个烧瓶，最终浓度为50mg/l。
12.2   微生物菌株的接种
申请人采集的9个微生物菌株悬浮在生理盐水中，被接种在每个介质的菌落中。培养皿在37℃培养48小时。在培养24和48小时后肉眼检查所生成的菌落。记录菌落的大小，它们的显色以及显色亮度。
12.3   结果
按照段落11.3中所述规则和术语在以下表3表示结果。
表3：用现有技术的Pro-AMC底物和本发明的Pro-ABP检测微生物的脯氨酰-肽酶活性
  Ta                     Pro-AMC               Pro-ABP
  Cb   Ic   Cod   Cb   Ic   Cod
  大肠杆菌(Escherichia coli)   24   3   0.5   B   3   0.25   R
48 3 0.5 B 3 3 R
  肺炎克雷白菌(Klebsiella pneumoniae)   24   2.5   0.25   B   2
48 3 0.25 B 3
  粪肠球菌(Enterococcus faecalis)   24   0.8   0.7
48 1.2 0.7
  白色假丝酵母   24   1.2   2   B   0.8   2   R
  48   2.5   3   B   2.5   2   R
  季也蒙氏假丝酵母(Candida guilliermondii)   24   0.4   0.3
48 1.8 3 B 1.8 2 R
  Candida glabrata   24   0.3   0.4
  48   1.7   1.8
  热带假丝酵母   24   1.2   1.2
48 2 1.8
  白吉利氏丝孢酵母(Trichosporon beigelii)   24   0.7   0.25   B   0.5
48 3 2 B 1.8 2 R
  啤酒糖酵母(Saccharomyles cerevisiae)   24   0.3   0.5
48 1.7 2
以上表格所示结果表明本发明的显色酶底物显然可以检测表达脯氨酰-肽酶活性的微生物，并更详细地是区分白色假丝酵母物种与热带假丝酵母和Candida glabrata物种。
实施例13：表达丙氨酰-肽酶活性的微生物的检测
13.1   检测介质的制备
混合3.6g biogelytone(bioMérieux)，2.16g肉提取物(bioMérieux)1.26g麦芽提取物(bioMérieux)，5.76g NaCl(Merck)和10.8g琼脂(bioMérieux)制备检测介质。
720ml渗透性水加入到粉末，然后混合物溶解在50℃的水浴锅中。产物分离到两个烧瓶，每个360ml。在121℃进行高压灭菌15分钟，并在水浴锅中将产物冷却到100℃。
L-丙氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素(Ala-AMC，Bachem)加入到第一个烧瓶作为对照，最终浓度为50mg/l，然后将L-丙氨酰-9-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮(Ala-ABP，实施例2中所获得的本发明底物，其中氨基酸是L-丙氨酸)，加入到第二个烧瓶，最终浓度为25mg/l。
13.2   微生物菌株的接种
申请人采集的二十五个微生物菌株悬浮在生理盐水中，被接种在每个介质的菌落中。培养皿在37℃培养48小时。在培养24和48小时后肉眼检查所生成的菌落。记录菌落的尺寸，它们的显色以及显色亮度。
13.3   结果
按照段落11.3中所述规则和术语在以下表4表示结果。
表4：用现有技术的Ala-AMC底物和本发明的Ala-ABP检测微生物的丙氨酰-肽酶活性
  Ta              Ala-AMC                Ala-ABP
  Cb   Ic   Cod   Cb   Ic   Cod
  鲍氏不动杆菌(Acinetobacter banmanii)   24   1.5   3   B   1.7   3   R
  48   1.5   3   B   1.7   3   R
  鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)   24   1.3   3   B   1   0.5   R
  48   1.5   3   B   1.5   1   R
  Ta             Ala-AMC               Ala-ABP
  Cb   Ic   Cod   Cb   Ic   Cod
  奇异变形菌(Proteus mirabilis)   24   0.7   3   B   1.7   0.5   R
  48   0.7   3   B   1.7   1.5   R
  液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)   24   0.7   3   B   0.7   3   R
  48   1.3   3   B   1.3   3   R
  粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)   24   0.5   3   B   0.5   2   R
  48   0.7   3   B   1   3   R
  蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)   24   0.7   3   B   0.5   0.5   R
48 0.7 3 B 0.5 1.5 R
  迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)   24   0.4   3   B   0.5   1   R
  48   0.5   3   B   0.7   3   R
  肺炎克雷伯氏菌   24   1.2   3   B   1   3   R
  48   1.8   3   B   1.5   3   R
  大肠杆菌   24   1.7   3   B   1.7   1   R
48 1.7 3 B 1.8 1 R
  铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)   24   0.3   0.3   1.7   R
  48   0.5   2   B   0.5   3   R
  阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)   24   0.5   3   B   0.7   1.5   R
  48   0.8   3   B   0.7   2   R
  酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)   24   0.1   0.1
  48   0.2   3   B   0.2
  屎肠球菌(Enterococcus faecium)   24   0.2   0.2
48 0.3 0.25 B 0.3
  无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)   24   0.1   0.10.2
  48   0.2
  粪肠球菌   24   0.3   0.3
  48   0.4   0.3
  Ta                 Ala-AMC              A1a-ABP
  Cb   Ic   Cod   Cb   Ic   Cod
  表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)   24   0.3   0.1
48 0.4 0.1
  腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)   24   0.3   0.1
  48   0.4   0.3
  金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)   24   0.5   0.1
  48   0.7   0.3
  枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)   24   1.7   0.1
  48   1.8   0.5
  假白喉棒杆菌(Corynebacteriumpseudodiphteritium)   24   0   0
  48   0.4   2   B   0
  无害李斯特氏菌(Listeria innocua)   24   0.2   0.2
  48   0.3   0.3
  啤酒糖酵母   24   0.1   0
  48   0.2   0.2
  克鲁斯氏假丝酵母(Candida krusei)   24   0.7   0.5
  48   1.5   0.25   1
  (Candida glabrata)   24   0.2   0.1
  48   0.3   0.3
  白色假丝酵母   24   0.3   0.3
  48   0.5   2   B   0.5   2   R
以上表格所示结果表明本发明的显色酶底物显然可以检测表达丙氨酰-肽酶活性的微生物，更详细地是区分革兰氏阴性细菌(表达活性)和革兰氏阳性细菌(不表达活性)。
实施例14： 表达β-丙氨酸肽酶活性的微生物的检测
14.1   检测介质的制备
300ml Columbia介质熔解在100℃的水浴锅中并在121℃高压灭菌15分钟。然后产物在水浴锅中冷却到50℃。
介质被分离到100ml的三个烧瓶，然后在50℃作为底物加入实施例4和6的那些底物，其中氨基酸是β-丙氨酸(分别为β-丙氨酸-9-氨基-6-乙氧羰基苯并[a]吩噁嗪-5-酮或β-Ala-ACAP和β-丙氨酸-9-氨基-6-氯苯并[a]吩噁嗪-5-酮或β-Ala-ACHP)，按照以下表5所示浓度溶解在二甲基亚砜中。
表5
  介质1   介质2   介质3
  β-Ala-ACAP   60mg/l
  β-Ala-ACHP   60mg/l
然后介质倒入培养皿。
14.2   微生物菌株的接种
申请人采集的九个微生物菌株悬浮在生理盐水中，按照以100000cfu/spot的比例多点接种，被接种在以上14.1制备的介质上。培养皿在37℃培养48小时。在培养24和48小时后肉眼检查所生成的菌落(每菌株一个菌落)。
14.3   结果
按照段落11.3中所述规则和术语在以下表6表示结果，其中RP表示浅桃红。
表6
  Ta          介质1          介质2         介质3
  Cb   Ic   Cod   Cb   Ic   Cod   Cbu   Ic   Cod
  铜绿假单胞菌1   24   3   3   1   R   3   2   R
  48   3   3   3   R   3   2   RP
  铜绿假单胞菌2   24   3   3   2   R   2   2   R
  48   3   3   2   R   3   2   RP
  铜绿假单胞菌3   24   1   1   2   R   1   2   R
  48   2   2   3   R   2   2   RP
  洋葱伯克霍尔德氏菌1(Burkholderiacepacia)   24   3   2   2
  48   3   2   2
  洋葱伯克霍尔德氏菌2   24   3   2   2
  48   3   2   2
  大肠杆菌(NCTC 10418)   24   3   2   2
  48   3   3   3
  阴沟肠杆菌(NCTC 11936)   2448   33   33   23
  粪肠球菌(NCTC 775)   24   3   2   1
  48   3   2   1
  白色假丝酵母(NCTC)   24   3   2   2
  48   3   2   2
以上表格所示结果表明本发明的显色酶底物显然能检测特异于铜绿假单胞菌的β-丙氨酸肽酶活性，所有其它菌株用这些底物显示酶活性是阴性的。
实施例15：使用A最少为两个氨基酸的底物检测表达丙氨酸肽酶 活性的微生物
15.1  检测介质的制备
1000ml的Columbia介质熔解在100℃的水浴锅中，并在121℃高压灭菌15分钟。然后它在水浴锅中冷却到50℃。
此介质分离到5个200ml的烧瓶中，在50℃作为底物加入实施例2中的底物，其中A是：
-介质1：L-丙氨酸(L-丙氨酸-9-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮或A-ABP)
-介质2：L-丙氨酸-L-丙氨酸(L-丙氨酸-L-丙氨酸-9-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮或AA-ABP)，
-介质3：L-丙氨酸-L-丙氨酸-L-丙氨酸(L-丙氨酸-L-丙氨酸-L-丙氨酸-9-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮或AAA-ABP)，
-介质4：L-丙氨酸-甘氨酸，(L-丙氨酸-甘氨酸-9-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮或AG-ABP)，和
-介质5：甘氨酸-L-丙氨酸(甘氨酸--L-丙氨酸-9-氨基苯并[a]吩噁嗪-5-酮或GA-ABP)，
每个底物溶解在DMSO中并以50mg/l的最终浓度使用。
然后介质倒入培养皿。
15.2  微生物菌株的接种
申请人采集的九个微生物菌株悬浮在生理盐水中，按照以15000cfu/spot的比例多点接种，被接种在以上15.1制备的介质上。培养皿在37℃培养48小时。在培养24和48小时后肉眼检查所生成的菌落。
15.3   结果
按照段落11.3中所述规则和术语在以下表7和8表示结果，其中R＝粉红色，RP＝浅桃红和I＝无色。
表7
  Ta        介质1          介质2        介质3
  Cb   Cob   Cb   Cob   Cb   Cob
  单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)(NCTC 11994)   24   2   I   2   R   2   R
48 2 R 2 R 2 R
  藤黄微球菌(Micrococcus luteus)(NCTC 611)   24   0   0   1   R
48 0 0 3 R
  金黄色葡萄球菌(NCTC 6571)   24   0   3   I   3   I
  48   2   I   2   I   3   I
  表皮葡萄球菌(NCTC 11047)   24   0   2   I   2   I
48 0 2 I 2 I
  鲍氏不动杆菌(ATCC 19606)   24   3   R   3   R   3   R
  48   3   R   3   R   3   R
  阴沟肠杆菌(NCTC 11936)   24   3   R   3   R   3   R
  48   3   R   3   R   3   R
  大肠杆菌(NCTC 10418)   24   3   R   3   R   3   R
  48   3   R   3   R   3   R
  铜绿假单胞菌(NCTC 10038)   24   3   R   3   R   3   R
48 3 R 3 R 3 R
表8
  Ta        介质1       介质4        介质5
  Cb   Cob   Cb   Cob   Cb   Cob
  单核细胞增生李斯特氏菌(NCTC 11994)   24   2   I   2   I   2   I
  48   2   R   3   I   2   R
  藤黄微球菌(NCTC 611)   24   0   1   I   0
  48   0   3   R   0
  金黄色葡萄球菌(NCTC 6571)   24   0   3   I   3   I
48 2 I 3 I 3 I
  表皮葡萄球菌(NCTC 11047)   24   0   3   I   l   I
  48   0   3   I   2   I
  鲍氏不动杆菌(ATCC 19606)   24   3   R   3   RP   3   R
  48   3   R   3   R   3   R
  阴沟肠杆菌(NCTC 11936)   24   3   R   3   R   3   R
  48   3   R   3   R   3   R
  大肠杆菌(NCTC 10418)   24   3   R   3   R   3   R
  48   3   R   3   R   3   R
  铜绿假单胞菌(NCTC 10038)   24   3   R   3   RP   3   RP
  48   3   R   3   R   3   R
以上表7和8所示结果表明，无论本发明的显色酶底物的氨基酸链长度如何，都有可能检测出具有丙氨酸肽酶活性的微生物菌株的酶表达。另外，由于氨基酸的本性和数量，根据研究中的菌株有可能改变用于检测所述菌株的底物的特异性和灵敏度或毒性。
实施例16：通过结组本发明底物和现有技术底物检测微生物
16.1   检测介质的制备
混合3.3g的酵母提取物、2.75g的Biocase、2.475g的麦芽提取物、0.165g的葡萄糖和7.7g的琼脂并加入550ml的渗透性水。
混合物熔解在100℃的水浴锅中并在121℃高压灭菌15分钟。然后在水浴锅中冷却到50℃。
在实施例2中所制备的本发明底物(其中氨基酸是脯氨酸)按0.05g/l的比例加入，同时按0.05g/l的比例加入作为现有技术的其它底物的5-溴-4-氨-3-羟基吲哚-β-D-葡萄糖苷。
然后介质倒入培养皿。
16.2   微生物菌株的接种
申请人采集的十二个微生物菌株悬浮在生理盐水中，被接种在上述16.1所制备介质中。培养皿在37℃培养48小时。在培养24和48小时后肉眼检查所生成的菌落。
16.3   结果
下面表9所示结果表示以mm为单位的生长尺寸，活性和颜色，Ta表示培养时间，R＝粉红色，O＝橙色，V＝绿色，T＝青绿色，M＝褐色，GO＝橙灰色和GV＝灰绿色。
                                 表9
  菌株   Ta   生长   活性   颜色
  大肠杆菌   24h48h   33   23   RO
  粘质沙雷氏菌   24h48h   1.51.7   22   OO
  液化沙雷氏菌   24h48h   1.51.5   22   GVM
  肺炎克雷伯氏菌   24h48h   23   33   GVGO
  摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)   24h48h   22 2 O
  鲍氏不动杆菌   24h48h   33   23   RR
  蜂房哈夫尼菌   24h48h   22.5   0.53   RR
  迟钝爱德华氏菌   24h48h   1.51.7   01.5   OR
  铜绿假单胞菌   24h48h   11.5   23   OM
  无害李斯特氏菌   24h48h   0.50.5   33   TT
  松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)   24h48h   0.50.5   33   TT
  粪肠球菌   24h48h   1.21.2   33   TT
  白色假丝酵母   24h48h   1.21.5   23   RR
以上表9所示的结果表明可以清楚地观察到由菌株显现的酶活性显色特性，如下：
-在菌株仅具有脯氨酸肽酶活性的情况，由本发明底物的水解作用引起粉红色到橙色的显色(大肠杆菌、摩氏摩根氏菌、鲍氏不动杆菌、蜂房哈夫尼菌、迟钝爱德华氏菌和白色假丝酵母)，
-在菌株仅具有β-葡糖苷酶活性的情况，由现有技术底物的水解作用引起青绿色的显色(松鼠葡萄球菌、粪肠球菌)和
-对于具有两种酶活性的菌株为绿色到褐色的显色，源自2种显色粉红色/橙色和青绿色的混合(粘质沙雷氏菌，液化沙雷氏菌，肺炎克雷伯氏菌，铜绿假单胞菌和无害李斯特氏菌)。
因此，根据其代谢作用，有可能检测出每种菌株特有的一些不同酶活性。

Claims (16)

1、一种显色酶底物，其特征在于其符合下列式(I)
Figure A2004800128760002C1
其中
-R1和R2与它们连接的苯环组成下式的萘环：
或下式的任选取代的香豆素环：
-或者R1和R2各自独立地表示氢原子，C1-C6烷基，卤素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基，-SO3H基或者氨磺酰基，
-R3和R4与它们连接的苯环组成下式的任选取代的萘环：
-或者，R3和R4各自独立地表示氢原子，卤素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基，-SO3H基或氨磺酰基，应当理解：
(i)R1/R2和R3/R4中至少之一与其连接的苯环组成如上所述任选取代的萘环或香豆素环，和
(ii)当R1和R2与它们连接的苯环组成任选取代的香豆素环时，R3和R4与它们连接的苯环不组成任选取代的萘环，
-R5和R6各自独立地表示氢原子，卤素原子，-C(O)OR’基，C(O)NR’R”基或C1-C6烷基，
应当理解当R1/R2和R3/R4与它们连接的苯环分别组成萘环时，R6表示卤素原子，
-R7和R8各自独立地表示氢原子，C1-C6烷基，芳烷基，芳基，羧烷基，羧基或磺酸基，
-或者R7和R8一起与它们连接的两个碳原子组成C4-C6环，
-R9表示氢原子，溴原子，氯原子，苯甲酰基，-CO2H基或-SO3H基，
应当理解，如果R9不是氢原子，那么R5是氢原子，
-R’表示氢原子或C1-C6烷基，
-R”表示氢原子或C1-C6烷基，
-或者R，和R”一起与它们连接的氮原子组成含一个或多个杂原子的杂环，
-A表示至少一个氨基酸，和
-X表示封端剂或无。
2、如权利要求1所述的显色酶底物，其特征在于R1/R2和R3/R4之中有且只有一个与它连接的苯环组成如权利要求1所定义的被任选取代的萘或香豆素环。
3、如权利要求2所述的显色酶底物，其特征在于它符合下列式(Ia)：
Figure A2004800128760004C1
其中R5，R6，A和X如权利要求1所定义。
4、如权利要求3所述的显色酶底物，其特征在于R5表示氢原子，R6表示氢原子或卤素原子，A是选自亮氨酸，脯氨酸和丙氨酸的氨基酸，和X是叔丁氧基羰基封端剂或无。
5、如权利要求2所述的显色酶底物，其特征在于它符合下列式(Ib)：
其中R5，R7，R8，A和X如权利要求1所定义。
6、如权利要求5所述的显色酶底物，其特征在于R5是氢原子，R7和R8分别独立地表示氢原子，C1-C6烷基，芳烷基，芳基或羧烷基，或R7和R8与它们连接的两个碳原子一起构成C4-C6环，A是选自亮氨酸，脯氨酸和丙氨酸的氨基酸，和X是叔丁氧基羰基封端剂或无。
7、如权利要求2所述的显色酶底物，其特征在于它符合下列式(Ic)：
Figure A2004800128760004C3
其中R5，R6，R9，A和X如权利要求1所定义。
8、如权利要求7所述的显色酶底物，其特征在于R5，R6和R9分别表示氢原子，A是选自亮氨酸，脯氨酸和丙氨酸的氨基酸，和X是叔丁氧基羰基封端剂或无。
9、如权利要求1所述的显色酶底物，其特征在于它符合下列式(Id)：
其中R5，R6，A和X如权利要求1所定义。
10、反应介质，其只使用权利要求1-9中任一项的至少一种显色酶底物，或联合使用至少一种其它的酶底物，所述其它的酶底物特异于与本发明底物所检测的酶活性不同的酶活性。
11、如权利要求10所述的介质，其特征在于它是一种培养基。
12、如权利要求10或11所述的介质，其特征在于它是凝胶形式。
13、如权利要求1到9任一项所述的显色酶底物，或如权利要求10到12任一项所述的反应介质用于检测和/或鉴别和/或定量表达至少一种肽酶活性的微生物的用途。
14、一种用于检测和/或鉴别和/或定量表达至少一种肽酶活性的微生物的方法，其特征在于该方法包含下列步骤：
·提供一种权利要求10到12任一项所述的反应介质，
·用待测生物样品接种所述介质，
·进行孵育，和
·显示至少一种肽酶活性的单独存在或与至少一种不同于所述肽酶活性的其他酶活性的组合存在。
15、一种在细菌中区分革兰氏阳性微生物和革兰氏阴性微生物的方法，特征在于该方法包含下列步骤：
·提供一种如权利要求10到12任一项所述的反应介质，其中显色底物的取代基A是丙氨酸，
·用待测生物样品接种所述介质，
·进行孵育，和
·显示至少一种代表一种革兰氏阴性微生物或几种革兰氏阴性微生物的存在的显色的存在。
16、一种区分白色假丝酵母物种与热带假丝酵母和Candidaglabrata物种的方法，特征在于该方法包含下列步骤：
·提供一种如权利要求10到12任一项所述的反应介质，其中显色底物的取代基A是脯氨酸，
·用待测生物样品接种所述介质，
·进行孵育，和
·显示至少一种代表白色假丝酵母物种存在的显色的存在。
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