CN1786179A - S－(+)－2,2－二甲基环丙甲酰胺的微生物制备方法 - Google Patents
S－(+)－2,2－二甲基环丙甲酰胺的微生物制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种新的S－(+)－2，2－二甲基环丙甲酰胺的微生物制备方法，其中包括用新的微生物Rhodococcuss equi CCTCC No.M 205114催化外消旋2，2－二甲基环丙甲腈生产外消旋2，2－二甲基环丙甲酰胺和用新的微生物Delftia tsuruhatensis CCTCC No.M 205115选择性催化水解外消旋2，2－二甲基环丙甲酰胺生产S－(+)－2，2－二甲基环丙甲酰胺的方法，或CCTCC No.M 205114和CCTCC No.M 205115联合转化外消旋2，2－二甲基环丙甲腈制备S－(+)－2，2－二甲基环丙甲酰胺，产率为47％以上，e.e值大于98％。
Description
技术领域
本发明涉及一种从土壤及污水中筛选到的新的两种微生物用于催化外消旋2，2-二甲基环丙甲腈生产外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺，再选择性水解外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺生产S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的方法。
背景技术
腈类化合物是自然界中广泛分布的一类物质，也是一种重要的C1源，能转化为胺、亚胺、酰胺、脒、羧酸和羰基化合物等，传统的化学法水解腈类物质能耗大、副产物多，而且需在强酸或强碱的条件下进行，因此只局限于那些不含易水解基团的腈类化合物，而且不具选择性。相反，通过微生物把腈类化合物转化为相应的酰胺和酸具有条件温和、环境污染小、能够实现化学选择性、区域选择性和立体对映选择性等优点。目前，微生物源腈水合酶已被成功地应用于生物催化生产丙烯酰胺、烟酰胺等。
腈类物质的微生物降解有氧化、还原和水解等三种途径。后者又可以根据参与水解反应的酶系不同分成两类：一种是腈水解酶(nitrilase，E.C.3.5.5.1)，直接将腈水解为羧酸和氨；另一种途径是先在腈水合酶(nitrile hydratas，E.C.4.2.1.84)的作用下将腈水解成酰胺，如果微生物中还存在酰胺酶(amidase，E.C.3.5.1.4)，则在其作用下进一步生成羧酸和氨，反应需两步完成。
S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺是西司他丁的重要中间体。西司他丁，化学名为(+)-(Z)-7-[(2R)-(2-氨基-2-羧乙基)硫]-2-[(1S)-(2，2-二甲基环丙甲酰胺基)]-2-庚烯酸，是第一个应用临床的肾脱氢肽酶抑制剂，能有效避免体内肾脱氢肽酶降解亚胺培南，增强亚胺培南的抗菌活性。
K.Robins等(US Patent 5273903、5427934)曾报道，从外消旋的2，2-二甲基环丙甲酰胺出发，通过含光学选择性酰胺酶的微生物Comamonas acidovorans A：18(DSM No.6315)、Comamonas acidovoransTG 308(DSM No.6552)、Pseudomonas sp.NSAK：42(DSM No.6433)、Bacterium sp.VIII：II(DSM No.6316)的动力学拆分，将其中的R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺转化为相应的酸来制备S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺。LIM，Kwang-Min等报道先将外消旋的2，2-二甲基环丙甲酸衍生化为对应的乙酯，通过光学选择性脂酶选择性水解其中的S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸乙酯为对应的酰胺和乙醇，再通过S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸的加氨来制备S-酰胺(WO2004/005241 A1)。
Mei-Xiang Wang等(Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2002，18：267-272)曾报道以外消旋的2，2-二甲基环丙甲腈为底物，以Rhodococcus sp.AJ270为催化剂来制备R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺和S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸。
然而，国内外并未见以外消旋的2，2-二甲基环丙甲腈为底物，通过微生物催化法制备相应的酰胺，再将酰胺选择性水解生产S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的报道。从相同的物质出发，化学法通过将二甲基环丙腈在6mol/L的KOH水溶液中回流8～16h来制备酰胺。但是这一过程涉及强碱及高温高压的反应条件，会对环境造成污染，而且其中会不可避免地产生副产物2，2-二甲基环丙甲酸(J.Am.Chem.Soc，1957，79：3467～3469)。因此，通过微生物法催化合成2，2-二甲基环丙甲酰胺，为进一步的动力学拆分提供原料，再将其选择性水解，具有经济和社会的双重价值。
发明内容
本发明分别提供从土壤和污水中筛选到的能将外消旋的2，2-二甲基环丙甲腈转化为对应的酰胺的新的微生物，及再将酰胺选择性水解的新的微生物。其次提供利用该新微生物转化生产酰胺及通过选择性水解生产光学活性酰胺的方法。
涉及2，2-二甲基环丙甲酰胺及S-2，2-二甲基环丙甲酰胺合成原理反应式如下：
2，2-二甲基环丙甲腈 2，2-二甲基环丙甲酰胺
2，2-二甲基环丙甲酰胺 S-2，2-二甲基环丙甲酰胺 R-2，2-二甲基环丙甲酸
本发明提供的产腈水合酶的微生物为红球菌属(Rhodococcus)的马红球菌(Rhodococcuss equi)，该菌株已于2005年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC No.M205114。
该新菌株的特征如下：
菌落形态：30℃培养2天，在牛肉膏蛋白胨平板培养上的菌落呈圆形，直径2毫米，隆起形状为凸镜状，淡红色，边缘整齐，光滑。
细胞形态：呈直的细杆状，0.3～0.8μm×1.5～8.0μm；细胞以单个成对出现，无芽孢形成，不运动。
生理生化特征：触酶阳性，硝酸盐还原阳性，吡嗪胺酶阴性，吡咯烷酮基芳胺酶阴性，碱性磷酸酶阳性，β-葡糖醛酸酶阴性，β-半乳糖甙酶阴性，α-葡糖甙酶阳性，N-乙酰-β-葡萄糖胺酶阴性，七叶灵水解阴性，脲酶阴性，明胶水解阴性。不能利用葡萄糖、核糖、木糖、甘露醇、丙二酸盐、乳糖、蔗糖、肝原。综合上述结果，该菌株被鉴定为Rhodococcuss equi。
本发明提供的产光学选择性酰胺酶的微生物为代尔夫特菌属(Delftie)的Delftia tsuruhatensis(查不到中文名)菌，该菌株已于2005年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC No.M 205115。
该新菌株的特征如下：
菌落形态：30℃培养3天，在牛肉膏蛋白胨平板培养上的菌落呈圆形，直径3毫米，隆起形状为塔尖状，边缘整齐，光滑。
细胞形态：呈稍弯曲的杆状，长1.4～4.0μm，宽0.6～1.3μm，单个或成对出现，无芽孢形成，能运动。
生理生化特征：从土壤中筛选到的新的菌株，革兰氏阴性，精氨酸双水解酶阳性、氧化酶阳性、过氧化氢酶阳性、酯酶(Tween 80)阳性、细胞色素氧化酶阳性。葡萄糖产酸阴性，果糖产酸阳性。硝酸盐、亚硝酸盐还原阴性。不能利用鼠李糖、N-乙酰葡萄糖胺、核糖、肌醇、蔗糖、糖原、D-葡萄糖、水杨素、D-蜜二糖、L-岩藻糖、D-山梨醇、L-阿拉伯糖、L-丝氨酸作为碳源。能利用衣康酸、辛二酸盐、丙二酸盐、乙酸盐、DL-乳酸盐、L-丙氨酸、5-酮基-葡萄糖酸盐、3-羟基-苯甲酸盐、甘露醇、丙酸盐、癸酸盐、戊酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、3-羟基-丁酸盐、L-脯氨酸、对苯二甲酸盐为碳源。综合上述结果，该菌株被鉴定为Delftia tsuruhatensis。
本发明所涉及的微生物是通过以下的程序筛选得到的：
1)将采回的土样和污水样接种到富集培养基中，在30℃，150rpm的摇床上培养4天，待培养基变混浊后，取1ml培养液转接到新鲜的富集培养基中，再培养4天。如此重复4～5个循环。富集培养基以1～2.5g/L 2，2-二甲基环丙甲腈(用于筛选CCTCC No.M 205114)或2，2-二甲基环丙甲酰胺(用于筛选CCTCC No.M 205115)为唯一氮源，再加入其他物质配方如下(g/L)：Na2HPO4·12H2O：1.0～2.5，KH2PO4：1.0～2.0，MgSO4·7H2O：0.2～0.5，FeSO4·7H2O：0.01～0.05，CoCl2：0.01～0.05，CaCl2：0.01～0.06，以自来水配制，用1.0mol的盐酸或NaOH溶液调节pH值6.0～8.0。
2)最后一次富集培养液稀释后涂布到平板培养基上，挑取单菌落至斜面保藏。平板培养基为富集培养基中加入1.5％～2.0％的琼脂。
3)挑取的单菌落接种到诱导发酵培养基，组份如下(g/L)：葡萄糖10.0～20.0，酵母膏5.0～10.0，蛋白胨2.0～5.0，NaCl 1.0～3.0，K2HPO4 1.0～2.0，KH2PO4 1.0～2.0，MgSO4 0.2～0.5，FeSO4 0.01～0.05，CoCl2 0.01～0.05，CaCl2 0.05～0.1，己内酰胺1.0～2.0，pH自然(121℃下，灭菌20min)；培养48h～72h，离心后悬浮于磷酸缓冲体系中，加入2，2-二甲基环丙甲腈或酰胺作为底物，进行转化；用气相色谱法分析产物和底物的量。具体的操作条件为：气相色谱仪为GC-14C，毛细管柱为HP-1，进样口、检测器、柱箱的温度分别为180℃、220℃、120℃，分流比为50∶1。用手性液相色谱测定转化产物中R-和S-2，2-二甲基环丙甲酰胺的含量。首先将酰胺衍生化为N，N-二苯甲基酰胺，在Chiralcel OD柱上进行分离，流动相为环己烷/2-丙酮，比例为9∶1，流速为0.4ml/min。
初培养：筛选出来的微生物接种到种子培养基中进行初培养。种子培养基组份如下(g/L)：葡萄糖10.0～20.0，酵母膏5.0～10.0，蛋白胨2.0～5.0，NaCl 1.0～3.0，K2HPO4 1.0～2.0，KH2PO4 1.0～2.0，MgSO40.2～0.5，FeSO4 0.01～0.05，CoCl2 0.01～0.05，CaCl2 0.05～0.1，pH自然(121℃下，灭菌20min)。对种子培养基的要求是要有合适的C/N比，尽量缩短微生物生长的延滞期。合适的碳源还有甘油、麦芽糖、果糖、蔗糖、甘露醇等；合适的氮源有蛋白胨、牛肉膏、黄豆粉、硫酸铵等。培养基的pH应在6～8之间，培养温度为20℃～50℃。在种子培养基中培养24～48h后，可以准备接入发酵诱导培养基。
诱导：由于本发明的微生物包含的腈水合酶为诱导酶，需经诱导后，才有较高酶活。而本发明的微生物包含的酰胺酶为组成酶，不需要诱导，但加入合适的化学物质作为激活剂也可极大提高酶活，如己内酰胺、异丁腈、2，2-二甲基环丙甲酰胺等，激活剂的量为培养基的1.0～2.0g/L。将种子液以一定的比例接种到诱导培养基中，诱导培养基一般为在种子培养基的基础上加入合适的诱导剂，这些诱导剂包括2，2-二甲基环丙甲腈、2，2-二甲基环丙甲酰胺、丙烯酰胺、己内酰胺、乙酰胺、丙烯腈中的一种，诱导剂的合适的量为诱导培养基的1.0～2.0g/L。经60～80h的诱导后，通过离心或过滤收集菌体，为下一步的生物转化提供催化剂。
生物转化：生物转化的过程以本发明的微生物Rhodococcuss equiCCTCC No.M 205114、Delftia tsuruhatensis CCTCC No.M 205115的细胞或细胞处理物为催化剂，进行生物转化的合适体系有磷酸盐缓冲溶液、Tris-盐酸缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液等。缓冲体系的pH范围为6.5～9.0。转化时的温度范围为20～40℃。转化体系中底物量的范围为0.08～2％(wt/v，重量体积比，以下同)，最佳的范围在0.1～2％(wt/v)之间。以Rhodococcuss equi CCTCC No.M 205114的细胞作为催化剂，经过0.5～4h的反应，2，2-二甲基环丙甲腈可完全转化为对应的外消旋酰胺。离心去除细胞后，再向该转化液中加入Delftia tsuruhatensis CCTCC No.M205115的菌体，进一步将其中的R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺转化为相应的酸来制备S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺。由于2，2-二甲基环丙甲酰胺在水中的溶解度较小，转化液经乙酸乙酯萃取后，减压蒸发，将得到的固体溶解于热的甲醇，在冰浴中放置过夜，析出的晶体过滤后，置于蒸发皿中干燥，即得到光学纯的S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺。
本发明以2，2-二甲基环丙甲腈为底物，通过生物转化法合成2，2-二甲基环丙甲酰胺，反应条件温和，反应的流程简单，得率较高，对环境的污染少。同时，通过直接向这一步的转化液中投加新筛选到的微生物为催化剂，光学选择性水解外消旋酰胺，生成S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺，减少了中间产物的提取步骤，产率和对应体过量值较高，分别达到43％和98％以上。
具体实施方案
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明。
配制培养基：
(1)富集培养基的组成和配比范围为(g/L)：Na2HPO4·12H2O：1.0～2.5，KH2PO4：1.0～2.0，MgSO4·7H2O：0.2～0.5，FeSO4·7H2O：0.01～0.05，CoCl2：0.01～0.05，CaCl2：0.01～0.06，2，2-二甲基环丙甲腈(筛选CCTCC No.M 205114)或2，2-二甲基环丙甲酰胺(筛选CCTCC No.M 205115)：1.0～2.5，以自来水配制，用1.0mol的盐酸或NaOH溶液调节pH值6.0～8.0。
(2)种子培养基，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/L：葡萄糖10.0～20.0，酵母膏5.0～10.0，蛋白胨2.0～5.0，NaCl 1.0～3.0，K2HPO4 1.0～2.0，KH2PO4 1.0～2.0，MgSO4 0.2～0.5，FeSO4 0.01～0.05，CoCl2 0.01～0.05，CaCl2 0.05～0.1，pH自然。
(3)CCTCC No.M 205114含诱导剂的发酵培养基，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/L：葡萄糖10.0～20.0，酵母膏3.0～5.0，蛋白胨2.0～5.0，NaCl 1.0～3.5，K2HPO4 1.0～2.0，KH2PO4 1.0～2.0，MgSO4 0.2～0.5，FeSO4 0.0l～0.05，CoCl2 0.01～0.05，CaCl2 0.01～0.06，诱导剂1.0～2.0，以自来水配制，用1.0mol的盐酸或NaOH溶液调节pH值6.0～8.0。诱导剂选自2，2-二甲基环丙甲腈、2，2-二甲基环丙甲酰胺、丙烯酰胺、己内酰胺、乙酰胺、丙烯腈中的任一种。
(4)配制CCTCC No.M 205115含激活剂的发酵培养基，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/L：甘露醇10.0～20.0，酵母膏5.0～5.0，蛋白胨2.0～5.0，NaCl 1.0～3.5，K2HPO4 1.0～2.0，KH2PO4 1.0～2.0，MgSO4 0.2～0.5，FeSO4 0.01～0.05，CaCl2 0.01～0.06，激活剂1.0～2.0，以自来水配制，用1.0mol的盐酸或NaOH溶液调节pH值6.0～8.0。激活剂选自异丁腈、己内酰胺、2，2-二甲基环丙甲酰胺中的任一种。
以下实施例均选取自上述各组分范围中的任一组具体数据。
实施例1：含腈水合酶微生物的分离
在9ml0.9％的生理盐水中加入1g土样、适量玻璃珠，摇匀，使成均匀的土壤悬液；吸取0.5ml的土壤悬液接种到装有30ml富集培养基的250ml的三角瓶中，置于30℃，150rpm的摇床培养4天，等富集液出现浑浊后，再吸取0.5ml转接到新鲜的培养基中，继续培养4天；如此重复4～5个循环后，将富集液稀释多个梯度，涂布到分离平板上，获得单菌落；
富集培养基以2，2-二甲基环丙甲腈为唯一氮源，本实施例的组成和配方(g/L)：Na2HPO4·12H2O：2.5，KH2PO4：2，MgSO4·7H2O：0.5，FeSO4·7H2O：0.01，CoCl2：0.01，CaCl2：0.06，2，2-二甲基环丙甲腈：1.5，用自来水配制，pH调为7.0；
挑取的单菌落接种到富集培养基中，培养48h、72h后取样，用气相色谱法检测有没有2，2-二甲基环丙甲酰胺生成；有酰胺生成的，即为所需的微生物Rhodococcuss equi CCTCC No.M 205114。
实施例2：含光学选择性酰胺酶微生物的分离
只将富集培养基中的氮源换为2，2-二甲基环丙甲酰胺(1.5g/L)，其它步骤同实施例1；用手性液相色谱法检测产物S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的对应体过量值(e.e值)，e.e值超过98％的，即为所需的微生物Delftia tsuruhatensis CCTCC No.M 205115。
实施例3：2，2-二甲基环丙甲酰胺的生产
将菌种Rhodococcuss equi CCTCC No.M 205114接一环到装有30ml种子培养基的250ml的三角瓶中，种子培养基的组份如下(g/L))：葡萄糖10.0，酵母膏5.0，蛋白胨2.0，NaCl 1.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 1.0，MgSO4 0.2，FeSO4 0.01，CoCl2 0.01，CaCl2 0.05，pH自然(121℃下，灭菌20min)，在30℃培养2天，获得种子液；
将种子液接种到含诱导剂己内酰胺的诱导发酵培养基中，接种量为5％(V/V)；发酵培养基的组份如下(g/L)：葡萄糖10.0，酵母膏5.0，蛋白胨2.0，NaCl 1.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 1.0，MgSO4 0.2，FeSO4 0.01，CoCl2 0.01，CaCl2 0.05，己内酰胺1.0，pH 6.0(121℃下，灭菌20min)，温度20℃，发酵培养60h；
发酵液离心得菌体，经0.9％的生理盐水洗涤后，悬浮于10mM的磷酸缓冲液中(1000ml)，使pH为7.0，缓冲体系的OD值为1，加入2，2-二甲基环丙甲腈，使底物的浓度为0.95g/L，在30℃的水浴摇床中转化0.5h，气相色谱检测，底物已完全转化，转化液离心除去菌体，在减压下，蒸发上清液，最终得产物2，2-二甲基环丙甲酰胺0.93g，得率为97.8％。
实施例4：2，2-二甲基环丙甲酰胺的生产
种子液的制备同实施例3；
将种子液接种到含诱导剂2，2-二甲基环丙甲腈的诱导发酵培养基中，接种量为5％(V/V)；发酵培养基的组份如下(g/L)：葡萄糖10.0，酵母膏5.0，蛋白胨2.0，NaCl 1.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 1.0，MgSO4 0.2，FeSO4 0.01，CoCl2 0.01，CaCl2 0.05，2，2-二甲基环丙甲腈1.0，pH 7.0(121℃下，灭菌20min)，温度30℃，发酵培养72h；
菌体经0.9％的生理盐水洗涤后，悬浮于50mM的Tris-盐酸缓冲液中(1000ml)，使pH为8.9，缓冲体系的OD值为4，加入2，2-二甲基环丙甲腈，使底物的浓度为4.75g/L；在20℃的水浴摇床中转化1.0h，离心去除菌体；在减压下，蒸发转化液，最终得产物2，2-二甲基环丙甲酰胺4.55g，得率为95.7％。
实施例5：2，2-二甲基环丙甲酰胺的生产
种子液的制备同实施例3；
将种子液接种到含诱导剂丙烯酰胺的诱导发酵培养基中，接种量为5％(V/V)；发酵培养基的组份如下(g/L)：葡萄糖10.0，酵母膏5.0，蛋白胨2.0，NaCl 1.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 1.0，MgSO4 0.2，FeSO4 0.01，CoCl2 0.01，CaCl2 0.05，丙烯酰胺1.0，pH 8.0(121℃下，灭菌20min)，温度40℃，发酵培养80h；
菌体经0.9％的生理盐水洗涤后，悬浮于100mM的柠檬酸缓冲液中(1000ml)，使pH为6.0，缓冲体系的OD值为7，加入2，2-二甲基环丙甲腈，使底物的浓度为19g/L；在30℃的水浴摇床中转化2.0h，离心去除菌体；在减压下，蒸发转化液，最终得产物2，2-二甲基环丙甲酰胺17.91g，得率为94.2％。
实施例6：S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的生产
将经斜面活化的菌种Delftia tsuruhatensis CCTCC No.M 205115接一环到装有30ml种子培养基的250ml的三角瓶中，种子培养基的组份如下(g/L)：甘露醇10.0，酵母膏5.0，蛋白胨2.0，NaCl 1.0，K2HPO41.0，KH2PO4 1.0，MgSO4 0.2，FeSO4 0.01，CaCl2 0.05，pH自然(121℃下，灭菌20min)，在30℃培养48h；
将种子液接种到含己内酰胺为激活剂的发酵培养基中，接种量为5％(V/V)，发酵培养基的组份如下(g/L)：甘露醇10.0，酵母膏5.0，蛋白胨2.0，NaCl 1.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 1.0，MgSO4 0.2，FeSO40.01，CaCl2 0.05，己内酰胺1.0，pH6.0(121℃下，灭菌20min)，发酵培养80h；
发酵液离心得菌体，经0.9％的生理盐水洗涤后，悬浮于10mM的磷酸缓冲液中(1000ml)，使pH为7.0，缓冲体系的OD值为5，加入外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺，使底物的浓度为1.14g/L；在20℃的水浴摇床中转化4h；将转化液离心去除菌体，用氢氧化钠调节上清液的pH为12，用等体积的乙酸乙酯萃取S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺(，含少量的2，2-二甲基环丙甲酰胺)；乙酸乙酯经减压蒸馏后，得到白色粉末；白色粉末溶于热的甲醇重结晶，得到0.55g S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺，得率为48.2％，e.e值大于98％。
实施例7：S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的生产
种子液的制备同实施例6；
将种子液接种到含异丁腈为激活剂的发酵培养基中，接种量为5％(V/V)，发酵培养基的组份如下(g/L)：甘露醇10.0，酵母膏5.0，蛋白胨2.0，NaCl 1.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 1.0，MgSO4 0.2，FeSO40.01，CaCl2 0.05，异丁腈1.0，pH 7.0(121℃下，灭菌20min)，发酵培养72h；
菌体经0.9％的生理盐水洗涤后，悬浮于50mM的Tris-盐酸缓冲液中(1000ml)，使pH为8.9，缓冲体系的OD值为10，加入外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺，使底物的浓度为5.7g/L；在30℃的水浴摇床中转化9h；经乙酸乙酯萃取、重结晶，得到2.71g S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺，得率为47.5％，e.e值大于98％。
实施例8：S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的生产
种子液的制备同实施例6；
将种子液接种到含激活剂2，2-二甲基环丙甲酰胺的发酵培养基中，接种量为5％(V/V)，发酵培养基的组份如下(g/L)：甘露醇10.0，酵母膏5.0，蛋白胨2.0，NaCl 1.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 1.0，MgSO40.2，FeSO4 0.01，CaCl2 0.05，2，2-二甲基环丙甲酰胺1.0，pH 8.0(121℃下，灭菌20min)，发酵培养60h；
菌体经0.9％的生理盐水洗涤后，悬浮于100mM的柠檬酸缓冲液中(1000ml)，使pH为6.0，缓冲体系的OD值为14，加入外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺，使底物的浓度为22.8g/L；在40℃的水浴摇床中转化13h；经乙酸乙酯萃取、重结晶，得到5.52g S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺，得率为48.2％，e.e值大于98％。
实施例9：Rhodococcuss equi CCTCC No.M 205114和Delftiatsuruhatensis CCTCC No.M 205115联合转化外消旋2，2-二甲基环丙甲腈生产S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺
Rhodococcuss equi CCTCC No.M 205114的菌体培养见实施例3；
Delftia tsuruhatensis CCTCC No.M 205115的菌体培养见实施例6；
Rhodococcuss equi CCTCC No.M 205114的菌体经0.9％的生理盐水洗涤后，悬浮于10mM的磷酸缓冲液中(1000ml)，缓冲体系的OD值为4，加入2，2-二甲基环丙甲腈，使底物的浓度为4.75g/L；在30℃的水浴摇床中转化1.0h，离心去除菌体；再将经0.9％的生理盐水洗涤的Delftia tsuruhatensis CCTCC No.M 205115的菌体投加到该转化液中，在30℃的水浴摇床中转化4h；经乙酸乙酯萃取、重结晶，得到2.68g S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺，得率为47％，e.e值大于98％。
实施例10：Rhodococcuss equi CCTCC No.M 205114和Delftiatsuruhatensis CCTCC No.M 205115联合转化外消旋2，2-二甲基环丙甲腈生产S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺
Rhodococcuss equi CCTCC No.M 205114的菌体培养见实施例3；
Delftia tsuruhatensis CCTCC No.M 205115的菌体培养见实施例6；
Rhodococcuss equi CCTCC No.M 205114的菌体经0.9％的生理盐水洗涤后，悬浮于50mM的Tris-盐酸磷酸缓冲液中(1000ml)，缓冲体系的OD值为8，加入2，2-二甲基环丙甲腈，使底物的浓度为9.5g/L；在30℃的水浴摇床中转化2.0h，离心去除菌体；再将经0.9％的生理盐水洗涤的Delftia tsuruhatensis CCTCC No.M 205115的菌体投加到该转化液中，在30℃的水浴摇床中转化5h；经乙酸乙酯萃取、重结晶，得到5.41g S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺，得率为47.4％，e.e值大于98％。
Claims (6)
1.一种S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的两步微生物制备方法，其特征是所述的微生物为从土壤和污水中筛选到的红球菌属(Rhodococcus)的马红球菌(Rhodococcuss equi)，CCTCC No.M 205114和代尔夫特菌属(Delftia)的Delftia tsuruhatensis菌，CCTCC No.M 205115，首先利用CCTCC No.M 205114催化外消旋2，2-二甲基环丙甲腈生产外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺，再利用CCTCC No.M 205115选择性水解外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺生产S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺；或利用CCTCC No.M 205114和CCTCC No.M 205115联合转化外消旋2，2-二甲基环丙甲腈生产S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述CCTCC No.M205114催化外消旋2，2-二甲基环丙甲腈生产外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺，其方法：
(1)配制种子培养基，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/L：葡萄糖10.0～20.0，酵母膏5.0～10.0，蛋白胨2.0～5.0，NaCl 1.0～3.0，K2HPO4 1.0～2.0，KH2PO4 1.0～2.0，MgSO4 0.2～0.5，FeSO40.01～0.05，CoCl2 0.01～0.05，CaCl2 0.05～0.1，pH自然；
(2)配制CCTCC No.M 205114含诱导剂的发酵培养基，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/L：葡萄糖10.0～20.0，酵母膏3.0～5.0，蛋白胨2.0～5.0，NaCl 1.0～3.5，K2HPO4 1.0～2.0，KH2PO4 1.0～2.0，MgSO4 0.2～0.5，FeSO4 0.01～0.05，CoCl2 0.01～0.05，CaCl2 0.01～0.06，诱导剂1.0～2.0，以自来水配制，用1.0M的盐酸或NaOH溶液调节pH值6.0～8.0；
(3)制备CCTCC No.M 205114菌体：将经斜面活化的CCTCC No.M 205114接入种子培养基中，培养条件：pH5.0～9.0，温度20～50℃，培养24～48h，将获得的种子液；将种子液接入含诱导剂的发酵培养基中，培养条件：温度20C～40℃，初始pH为6.0～8.0，诱导培养60～80h；诱导培养液经离心或过滤收集，获得菌体；
(4)生物转化制备2，2-二甲基环丙甲酰胺：将上述菌体用0.9％生理盐水洗涤后，悬浮于磷酸盐缓冲溶液、或Tris-盐酸缓冲溶液、或柠檬酸缓冲溶液中，缓冲溶液pH在6.5～9.0之间，加入底物2，2-二甲基环丙甲腈，底物浓度用g/L表示为0.8～20；转化温度20～40℃，时间0.5～4h；
(5)2，2-二甲基环丙甲酰胺的提取：转化液离心除去菌体，在减压下，蒸发上清液，得产物2，2-二甲基环丙甲酰胺。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是诱导剂为2，2-二甲基环丙甲腈、2，2-二甲基环丙甲酰胺、丙烯酰胺、己内酰胺、乙酰胺、丙烯腈中的一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述CCTCC No.M205115选择性水解外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺生产S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺，其方法：
(1)配制种子培养基，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/L：葡萄糖10.0～20.0，酵母膏5.0～10.0，蛋白胨2.0～5.0，NaCl 1.0～3.0，K2HPO4 1.0～2.0，KH2PO4 1.0～2.0，MgSO4 0.2～0.5，FeSO40.01～0.05，CoCl2 0.01～0.05，CaCl2 0.05～0.1，pH自然；
(2)配制CCTCC No.M 205115含激活剂的发酵培养基，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/L：甘露醇10.0～20.0，酵母膏5.0～5.0，蛋白胨2.0～5.0，NaCl 1.0～3.5，K2HPO4 1.0～2.0，KH2PO4 1.0～2.0，MgSO4 0.2～0.5，FeSO4 0.01～0.05，CaCl2 0.01～0.06，激活剂1.0～2.0，以自来水配制，用1.0M的盐酸或NaOH溶液调节pH值6.0～8.0；
(3)制备CCTCC No.M 205115菌体：将经斜面活化的CCTCC No.M205115接入种子培养基中，培养条件：pH6.0～8.0，温度20～40℃，培养24～48h，将获得的种子液；将种子液接入发酵培养基中，培养条件：温度20℃～40℃，初始pH为6.0～8.0，培养60～80h；诱导培养液经离心或过滤收集，获得菌体；
(4)生物转化S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺：将上述菌体用0.9％生理盐水洗涤后，悬浮于磷酸盐缓冲溶液、或Tris-盐酸缓冲溶液、或柠檬酸缓冲溶液中，缓冲溶液pH在6.5～9.0之间，加入外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺，底物2，2-二甲基环丙甲酰胺的浓度用g/L表示为1.14～22.8；转化温度20～40℃，时间4～13h；
(5)S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的提取：转化液离心去除菌体，用氢氧化钠调节pH为12，用等体积的乙酸乙酯萃取，减压蒸馏，甲醇重结晶，得到S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是激活剂是己内酰胺、异丁腈、2，2-二甲基环丙甲酰胺中的一种。
6.根据权利要求1或2或4所述的制备方法，其特征是所述CCTCCNo.M 205114和CCTCC No.M 205115联合转化外消旋2，2-二甲基环丙甲腈生产S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺，其方法：
(1)将制备的CCTCC No.M 205114菌体用0.9％生理盐水洗涤后，悬浮于磷酸盐缓冲溶液、或Tris-盐酸缓冲溶液、或柠檬酸缓冲溶液中，缓冲溶液pH在6.5～9.0之间，加入底物2，2-二甲基环丙甲腈，底物浓度用g/L表示为4.75～9.5；转化温度20～40℃，时间0.5～4h；离心除去菌体；
(2)将制备的CCTCC No.M 205115菌体用0.9％生理盐水洗涤后，加入上述除去菌体的含2，2-二甲基环丙甲酰胺的转化液中，继续转化4～6h，转化温度20～40℃；
(3)转化液经乙酸乙酯萃取、重结晶，得到S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺。
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