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CN1774513A - 表征多核苷酸的方法 - Google Patents

表征多核苷酸的方法 Download PDF

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CN1774513A
CN1774513A CNA2004800103290A CN200480010329A CN1774513A CN 1774513 A CN1774513 A CN 1774513A CN A2004800103290 A CNA2004800103290 A CN A2004800103290A CN 200480010329 A CN200480010329 A CN 200480010329A CN 1774513 A CN1774513 A CN 1774513A
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CN
China
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polynucleotide
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signal sequence
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joint
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CNA2004800103290A
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P·莱克斯奥
E·拉格希尔德斯特维特
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Lingvitae AS
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Lingvitae AS
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Abstract

本发明方法用于识别样品中目标多核苷酸的特定特征，包括如下步骤：i)将对所研究的特征具有特异性的多核苷酸信号序列附着于样品中每一目标多核苷酸的一端；ii)将目标多核苷酸与一种分子接触，如果该特征存在，所述分子可与目标多核苷酸反应；iii)将多核苷酸接头序列附着于可与步骤(ii)中的分子相互作用的目标多核苷酸上，接头附着于目标多核苷酸上与信号序列附着位置相对的一端；iv)对同时包含接头和信号序列的目标多核苷酸进行多核苷酸扩增反应，可选重复步骤(i)到(iv)以识别其他特征；v)确定哪些信号序列存在于扩增产物上，以何种顺序，从而确定每一目标多核苷酸的特征。

Description

表征多核苷酸的方法
技术领域
本发明涉及将目标多核苷酸转换成可读信息链，以随后测定目标多核苷酸序列的方法。
背景技术
分子研究的发展，部分是由于用于鉴定分子或其生物反应的技术的进步所导致。具体地说，DNA和RNA核酸的研究受益于序列分析和杂交作用研究这些技术的不断发展。
大规模DNA测序通常使用的主要方法为链末端终止法。该方法由Sanger和Coulson首先开发(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1977；74：5463-5467)，依赖于在聚合酶反应中使用四种核苷酸的双脱氧衍生物掺入新生的多核苷酸链中。掺入后，双脱氧衍生物终止聚合酶反应的进行，然后通过凝胶电泳分离产物，并分析确定特定的双脱氧衍生物掺入链中的位置。
尽管该方法被广泛使用并且结果可靠，但是它费时费力且价格昂贵。
US-A-5302509公开了对固定在固体支持物上的多核苷酸进行测序的方法。该方法依赖于在DNA聚合酶的存在下，将具有不同荧光标记的3-封闭的碱基A、G、C和T掺入固定的多核苷酸中。聚合酶引入一个与目标多核苷酸互补的碱基，但是3’-封闭基团可阻止其进一步延伸。然后测定所引入碱基的标记，通过化学裂解除去封闭基团以便发生进一步的聚合反应。然而，本方法需要除去封闭基团，很费时间，必须高效率地操作。
WO-A-00/39333记载了通过将目标多核苷酸序列转换成含有确定的序列和位置信息的第二多核苷酸而对多核苷酸进行测序的方法。据称目标多核苷酸的序列信息在第二多核苷酸中被“放大”，以便更加容易地区分目标分子上的单个碱基。这要通过使用预定序列的“放大标签”来实现。目标分子上的每一个碱基——腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶都由一个放大标签来代表，这样就将原始目标序列转换成放大序列。然后可以使用常规技术测定放大标签的顺序，从而就得到了目标多核苷酸的具体序列。
在优选的测序方法中，每个放大标签包含一个标记(如荧光标记)，该标记随后可以识别并用于鉴定该放大标签。
尽管在该专利公布文本中所公开的方法具有很多优点，但是仍然需要有测定目标多核苷酸序列的改进的方法。
发明内容
根据本发明的第一方面，一种识别存在于样品中的目标多核苷酸的特定特征的方法，包括如下步骤：
i)将对所研究的特征具有特异性的多核苷酸信号序列附着于样品中每一目标多核苷酸的一端；
ii)将目标多核苷酸与一种分子接触，如果该特征存在，所述分子可与目标多核苷酸反应；
iii)将参加反应的目标多核苷酸与不反应的目标多核苷酸分离；
iv)可选重复步骤(i)到(iii)；
v)确定哪些信号序列存在于分离的目标多核苷酸上，以何种顺序，从而确定每一目标多核苷酸的特征。
本发明方法允许通过容易自动实现的简单方法测定目标多核苷酸的多个特征。在优选的实施方案中，本方法通过将两种多核苷酸分子掺入具有特定特征的目标多核苷酸中，以便发生扩增反应，从而选择性地增加具有所研究特征的目标多核苷酸的数量，有效去除不具有该特征的目标多核苷酸。该方法特别适于目标多核苷酸的测序。
根据本发明的第二方面，一种测定目标多核苷酸序列的方法，包括如下步骤：
i)处理双链目标多核苷酸样品，在5’和3’端生成突出端，每个突出端具有确定数目的碱基；
ii)将样品分为小份，将每一份样品分别与双链多核苷酸信号序列和双链接头多核苷酸接触，每条信号序列代表5′突出端的特定多核苷酸序列，并且包括一个可与目标多核苷酸的3′端杂交和连接的突出端，每个接头包括一个与信号序列所代表的序列为互补序列的突出端；
iii)使用可与信号序列和接头序列杂交的引物在样品中进行聚合酶反应，其中聚合酶反应产物包括可使接头酶切的限制位点以及目标多核苷酸中形成5’-突出端的部分，以形成新的5’-突出端，可选重复步骤(i)到(iii)使用限制酶产生突出端；
v)确定哪些信号序列存在于扩增产物上，以何种顺序，从而测定目标多核苷酸的序列。
附图说明
本发明参照附图进行描述，其中：
图1为信号序列示意图，显示将目标多核苷酸的一部分转换为确定的信号序列；
图2为使用本发明进行多核苷酸测序实验的示意图；
图3为在转换过程中使用带有特异性信号序列的不同小格的示意图；
图4显示转换结果，进行三个循环形成一系列代表目标多核苷酸碱基序列的信号序列；
图5是每个循环中测定三碱基序列的多核苷酸测序实验的示意图；
图6显示转换结果，表明将特定信号序列引入目标多核苷酸。
具体实施方式
本发明方法是WO-A-00/39333中所公开的转换方法的改进。总的来说，本发明能够通过引入特定信号序列识别目标多核苷酸的特定特征。将信号序列引入存在于样品中的所有目标多核苷酸，但只有包含特定特征的才被分离和表征。
该方法特别适于目标多核苷酸的测序。使用本方法，位于目标多核苷酸一端的确定数目的序列可转换成位于目标多核苷酸另一端的确定的信号序列。经过一系列步骤，目标的“已测序”端被切除，同时构建了信号序列端，由此产生一系列确定的信号序列，这些序列可在随后的识别步骤中测定。
术语“多核苷酸”为本领域所公知，指一系列相连的核酸分子，如DNA或RNA。核酸模仿物，如PNA、LNA(锁核酸)和2′-氧-甲基RNA也涵盖在本发明的范畴之中。
本领域技术人员应理解，本文使用的碱基的标识符号A，T(U)、G和C，是指核苷酸碱基腺嘌呤、胸腺嘧啶(尿嘧啶)、鸟嘌呤和胞嘧啶。本领域技术人员亦应理解，当多核苷酸为RNA时，以尿嘧啶替代胸腺嘧啶，或者可以使用dUTP将尿嘧啶引入DNA中。
本文使用目标多核苷酸的5′和3′端这样的标识符号。在某些实施方案中目标多核苷酸为双链，所以每一端都同时包含5′和3′端。然而，说到5′和3′端指的是目标上的正在研究或测序的那条链。还有一点很明显，当本说明书提及5’端为测序端时，还可以将过程修改为对3’端进行测序，即信号序列和接头均连接于本文所指明的相对端。
在范围最宽的方面，本发明可识别目标多核苷酸的特定特征。特征可以是多核苷酸的序列。另外，特征也可以是目标多核苷酸结合其他分子(如DNA结合性蛋白)的能力，或者与互补多核苷酸杂交的能力。本方法还可用于识别和鉴定位于目标多核苷酸序列中的限制酶位点。
通过与一种分子反应来识别每一特征，所述分子可与具有该特征的目标多核苷酸相互作用，区分开不具有该特征的目标多核苷酸。可与该分子相互作用的目标多核苷酸使用对应于该特征的特定的信号序列标记，以使该特征在随后的读出步骤中被确定。
本发明依赖于将信号序列引入样品中所有目标多核苷酸中，该信号序列代表所研究的特定特征。然后将目标多核苷酸与一种分子接触，分离相互作用的目标多核苷酸。用这种方法，可以通过识别信号序列来识别该特征。
可以使用多种方法分离与所述分子相互作用的目标分子。例如，所述分子可以包括结合性部分，以便分离目标多核苷酸/分子复合物。适合的结合性部分包括抗体和生物素/链亲和素。还可以使用大小分离法(size separation)，这种方法可以将目标/分子复合物与非复合物组分区分开来。
本发明优选的实施方案依赖于将多核苷酸信号序列和多核苷酸接头序列引入目标多核苷酸分子中，进行扩增反应以扩增可与特定分子反应的目标多核苷酸。聚合酶反应产物可以通过重复下列步骤进一步表征：将目标与一种分子反应，再引入一种代表所研究特征的信号序列。
本发明方法优选使用多个反应小格进行，每个小格测定一种所研究的假定存在的特征。每个反应小格具有对该小格有特异性的相关信号序列。含有目标多核苷酸的样品分入反应小格，在每条目标多核苷酸的一端附着(如连接)一段信号序列。该段信号序列附着于小格内所有的目标多核苷酸上，无论目标是否具有该特定特征。下一步即为通过将每个目标与一种分子反应来验证该特征，所述分子可与包括该特征的目标发生特异性相互作用。因此该分子可以是多核苷酸结合性蛋白、酶或其他多核苷酸。然后分离可与该分子相互作用的目标。在优选的实施方案中，该分子包含接头序列。因此，通过目标与该分子相互作用，该分子(包含接头)就附着或连接于目标上。然后扩增同时包含信号序列和接头的目标。
扩增反应可以使用任何适当方法进行。优选方法为使用常规聚合酶反应在本领域公知的条件下进行。应该理解，还可以进行其他的扩增反应，包括等温pcr和在细菌中扩增。
一个优选的实施方案是使用该方法对目标多核苷酸测序。该方法通过下列步骤进行：在目标多核苷酸的一端识别确定数目的碱基(如三或四个碱基)，然后将此信息转换成位于相对端的信号序列，从而可以继续发生转换循环而无需去除前面循环中引入的信号序列。
该测序方法可以通过下列过程实现：获取目标多核苷酸，使用一系列限制酶处理以在该目标多核苷酸的每一端形成确定的突出端区域，以便在每一转换步骤中引入信号序列和接头。
“信号序列”是包含独特的核酸序列“单元”的单链或双链多核苷酸。目标上的每个特征(如A、T(U)、G和C每一种碱基)均由一个独特的预先确定的单元或独特的单元组合来代表。每个单元优选包含两个或多个核苷酸碱基，优选2～50个碱基，更优选2～20个碱基，最优选4～10个碱基，例如6个碱基。每个单元中至少包含两种不同的碱基。在优选的实施方案中，每个单元含有三种不同的碱基。单元的设计原则是能够在“读出”步骤中区分不同的单元，例如，包括在聚合反应中引入可检测性标记的核苷酸，或者与互补性寡核苷酸杂交。例如，如果所研究的特征为目标的序列，目标上的每种碱基均由单元中特定的一系列碱基来代表。
在优选的实施方案中，每个信号序列包括两个独特序列单元，可代表目标上的所有的四种碱基。根据本实施方案，这两个单元可作为二进制系统，其中一个单元代表“0”，另一个单元代表“1”。目标上的每种碱基均由这两个单元的组合来表征。例如，如图1所示，可用“0”+“0”代表腺嘌呤，“0”+“1”代表胞嘧啶，“1”+“0”代表鸟嘌呤，“1”+“1”代表胸腺嘧啶。有必要将这些单元区分开来，所以可在每个单元中引入“终止”信号。根据碱基位于目标(模板)多核苷酸的奇数或偶数位置，还优选使用不同的单元代表“1”和“0”。
该方法举例说明如下：
奇数模板序列：
″0″：ATTTTTAT(CC)
″1″：GTTTTTGT(CC)
偶数模板序列：
″0″：ACCCCCAC(TT)
″1″：GCCCCCGC(TT)
适当的信号序列还记载在WO-A-00/39333。
“接头”为单链或双链多核苷酸。接头的作用是提供进行扩增的必需序列。在优选的实施方案中，接头为双链多核苷酸，并且包含可与目标多核苷酸的互补区杂交和连接的确定的突出端。互补区通常位于目标上与信号序列引入位置相对的一端。接头为扩增反应提供所需的引物结合位点。在优选的实施方案中，接头设计成可与目标多核苷酸的被测序部分(即目标多核苷酸的5’-突出端部分)杂交。如果目标上的5’-突出端是4个碱基，那么接头上的互补性突出端也是4个碱基。这样便于发生连接反应以形成双链多核苷酸。假如目标的5’-突出端为未知序列，通常有必要使用包括(例如)4碱基序列的所有排列方式的接头的组合。不同序列的接头用于不同的反应，如下所述。
每个接头通常要引入一个限制酶识别位点，以使之在以后的步骤中被切除。这可用于产生新的5’-突出端。
本优选实施方案的测序方法通常包括以下步骤：
消化
目标多核苷酸样品首先使用一种或多种限制酶处理，以在目标上产生带有确定数目碱基(如3个碱基)的突出端，可在该过程中随后用于连接信号序列(突出端)。在目标多核苷酸的相对一端也产生一突出端(5’-突出端)。这个突出端才是在转换过程中被信号序列识别(代表)的突出端，并与接头连接。
连接
含有目标多核苷酸的样品平均分入代表待测序突出端的所有排列方式的反应小格中。例如，如果待测序突出端是4个碱基，就使用256个反应小格。在第一个小格中，目标多核苷酸与代表例如AAAA(当待测序突出端为4个碱基时)的信号序列接触，该信号序列与所有目标多核苷酸的3’-突出端连接。另加入带有突出端TTTT的接头多核苷酸，但它只与包含AAAA突出端的目标多核苷酸特异性连接，而带有其他突出端序列的多核苷酸的突出端仍未连接。其他小格进行相同的操作，每个小格代表4个碱基序列可能的不同组合。每种情况下，接头与信号序列所代表的序列互补。
尽管信号序列优选代表突出端的所有碱基，但测定的碱基数目可以少于突出端的碱基数目。例如，如果突出端包含4个碱基，信号序列可以只代表其中的3个碱基。这种情况将在以下公开的实施例中说明。
扩增
进行连接步骤之后，可以汇集样品进行聚合酶反应。使用针对信号序列和接头端的引物进行聚合酶反应，因此只有同时成功连接于信号序列和接头序列的分子才能指数扩增，而只包含信号序列的分子由于进行线性扩增而被除去。结果生成一组转换后的多核苷酸片段，其中，最初产生于目标多核苷酸一端的4碱基突出端已经被位于目标多核苷酸另一端的代表该4碱基的信号序列所代替。
在优选的实施方案中，使用甲基-dCTP进行聚合酶反应，可确保天然限制酶位点失活。接头分子引入其他限制酶位点，因而可发生后续转换循环。聚合酶反应中使用的引物对信号序列和接头中发现的序列有特异性，因而可确保只在信号序列和接头均连接于目标多核苷酸时，才发生扩增步骤。
另外，信号序列和接头的不同组合中优选使用不同的引物结合性位点，即在一个转换循环中使用的信号序列和接头中包含与前面循环使用的信号序列和接头不同的引物结合性位点。这可确保只扩增正确的序列。
可用多种方法生成突出端，尽管在优选的实施方案中使用限制酶，如II型限制酶。这些酶对所切割的序列不表现特异性，因此可在所有类型的碱基组合中生成突出端。可定位限制酶结合位点以使突出端形成于实际的目标多核苷酸内部。实践中优选可产生3～4个碱基对的突出端的酶。
II型限制性内切核酸酶已为公知，并记载在WO-A-00/39333。
在一个实施方案中，目标多核苷酸首先使用接头多核苷酸处理，该接头多核苷酸引入限制酶BbvI的识别序列，然后该多核苷酸使用该限制酶处理以在5’端生成特定的突出端。首先通过甲基化作用处理目标多核苷酸以使BbvI的天然识别位点失活。生成第一个突出端以后，随后的5’端的突出端优选使用限制酶SfaNI来生成。这要通过在5’端连接特定的接头序列以引入SfaNI的识别序列来实现。
生成位于3’端的最初的突出端优选通过与带有特定突出端的多核苷酸连接来实现。该特定突出端使第一信号序列在3’端杂交和连接。在另一实施方案中，目标多核苷酸首先使用带有限制酶MmeI和EarI(或其同切点酶Eam1104I)的识别序列的接头多核苷酸处理。然后将该多核苷酸使用限制酶MmeI处理以从目标分子中切去20碱基对，并且使之与接头多核苷酸连接。然后将含有限制酶SfaNI的识别序列的第二接头多核苷酸，通过由MmeI产生的突出端连接于连接有接头的目标多核苷酸。进行PCR扩增以扩增含有20bp目标多核苷酸的、两侧带有两个接头多核苷酸的片段。为了保护内部位点不被随后加入的EarI和SfaNI消化，进行PCR时在dNTP混合物中使用甲基化dCTP替代通常的dCTP。为了避免扩增带有由MmeI产生的突出端的目标多核苷酸(即消化的副产物)，可使用去磷酸化的第二接头。位于5’端的特定突出端通过使用限制酶SfaNI(或等同物)消化PCR产物来生成。位于3’端的确定的突出端通过使用限制酶EarI(或Eam1104I)消化PCR产物来生成。该信号序列带有限制酶位点，优选带有限制酶EarI的位点。在随后的循环中使用限制酶EarI和SfaNI进行酶切和引入，整个过程如图2所示。
转换循环在图3中做进一步说明，该图显示从本过程使用的256个小格中随机选取的三个反应小格中的五种不同片段的反应情形。首先将片段均匀分入256个小格中。在小格56中，被识别的突出端为“TCTA”，代表该碱基组合的信号序列被加入并连接于目标多核苷酸左端的3碱基3’突出端上。无论该多核苷酸右端的4碱基5’-突出端如何组合，连接反应都会发生。然后将只与带有3′TCTA-5′突出端的片段连接的特异性接头加入并使之连接。在“封闭”接头的存在下进行连接反应，可减少接头的错配连接。封闭接头具有与特异性接头不同的突出端序列，因此可连接于具有与特异性接头非互补的突出端的目标多核苷酸。然后在最终的扩增反应中选择性扩增连接有特异性接头的片段，因而除去其他连接有不正确的信号序列的片段。小格141和194中进行相同的过程，只有一点不同，信号序列和接头的组合要根据该孔要识别的突出端作出相应调整(3′-ATAG-5′和3′-CAAT-5′)。
256小格中的目标多核苷酸优选汇集到一个反应管中，然后进行扩增反应，这样就避免了分别进行256次扩增反应所带来的不便。
随后的转换循环完成之后，位于目标多核苷酸5’端的序列缩短，引入目标多核苷酸3’端的信号序列延长，延长序列以确定的方式与现在“已测序的”目标多核苷酸对应。测定信号序列的种类和顺序可使用下列文献公开的方法进行：WO-A-00/39333或者以LingVitae的名字提交的、要求GB0308852.3优先权的共同未决的国际专利申请。
扩增反应可能会生成一些不希望出现的产物，可以采用几个步骤减少或除去它们。例如优选地，不同信号序列(还可选不同接头)上的引物识别位点不相同，这样就会减少引物与内部信号序列结合并扩增增大的转换目标的可能性。
还优选将信号序列设计成相邻的或随后的信号序列包含独特的碱基序列。这可确保被引入与终端信号序列杂交的引物不会与内部信号序列杂交，导致扩增步骤中产生片段。
一种或多种限制酶的不完全消化也可能是副产物的来源之一。使用高特异性和高活性的限制酶将减轻这个问题。
还可以通过凝胶纯化或者限制酶消化前固定产物的手段除去副产物；未完全消化的产物将保持固定状态而与已经完全消化的产物分开。
扩增前除去过量的接头和目标也会减少副产物的产生。
以下实施例解释本发明。
实施例1
使用BbvI初始制备且无大小限制
目标多核苷酸在DNA片段化之前(或之后)进行甲基化反应，以使天然识别位点失活。使用BbvI作为限制酶，使用M.Bbv(兆碱基搜索产物，Megabase Research Products)使其天然位点失活。将目标多核苷酸使用HydroShear设备(GeneMachines)进行机械剪切后随机断裂成500～1000碱基对的片段。与超声波降解相结合，甚至可产生更短的片段。为了提高随后的钝端接头连接步骤的效率，剪切后的多核苷酸可选使用DNA聚合酶处理，利用其外切核酸酶功能填充或除去突出端。为实现此目的，通常将T4DNA聚合酶和Klenow大片段单独或结合使用。
两类多核苷酸接头钝端连接于目标多核苷酸片段。一类带有BbvI位点，另一类带有随后可连接于信号序列的突出端。每个接头有10～20个碱基对，以超出10倍的摩尔量加入目标多核苷酸中。接头发生磷酸化，这其中除了BbvI接头的一条链例外。另外，该接头的相对链带有3’脱氧基团以防止在连接反应时发生多联反应(concatemerization)。根据制造商推荐的钝端连接的优化条件进行连接反应。
已连接的多核苷酸片段使用BbvI消化。消化后进行大小选择(如凝胶分离或柱上分级)，以除去过量接头、切除末端片段以及低于和高于一定阈值(如两倍大小分布)的多核苷酸片段。
实施例2
使用MmeI进行初始制备且有大小限制
将目标多核苷酸使用HydroShear设备(GeneMachines)进行机械剪切后随机断裂成500～1000碱基对的片段。与超声波降解相结合，甚至可产生更短的片段。如实施例1中所讨论，为了提高随后的钝端接头连接步骤的效率，剪切后的多核苷酸可选使用DNA聚合酶处理，填充或除去突出端。将20～40bp的钝端接头以超出10倍的摩尔量与片段化的目标多核苷酸连接。根据制造商推荐的钝端连接的优化条件进行连接反应。只有接头的反义链进行磷酸化以确保单向连接(另外，反义链引入3’双脱氧基团或封闭基团防止发生多联反应)。接头就在其3’端带有MmeI的限制位点，再上游有EarI(或Eam1104I)的限制位点。可方便地使用大小排除或亲和离心柱(如来自Qiagen的MinElutePCR净化器)除去过量的接头以及更换缓冲液。
在最适宜条件下进行MmeI消化，从目标多核苷酸上切下20个碱基对，使之与接头多核苷酸连接。使用离心柱来改变缓冲液(如来自BioRad的BioSpin-6)。然后将包含限制酶SfaNI的限制位点的第二接头多核苷酸通过由MmeI生成的突出端连接于连接有接头的目标多核苷酸(因为MmeI产生一个2碱基3’突出端，所以第二接头是包括3’突出端中的两个碱基的所有16种排列的一组接头)。将SfaNI位点定位在可切去目标序列的末端四个碱基。接头保持非磷酸化以避免包含两个由MmeI产生的突出端的目标多核苷酸(目标多核苷酸消化的副产物)随后发生扩增。进行PCR扩增以扩增含有20bp目标多核苷酸的、两侧连有两个接头多核苷酸的片段。为了保护内部位点不被随后加入的EarI和SfaNI消化，进行PCR时在dNTP混合物中使用甲基化dCTP替代通常的dCTP。
使用PCR净化离心柱除去过量引物、DNA聚合酶以及更换缓冲液。
使用EarI(或Eam1104I)和SfaNI消化PCR扩增材料，以生成信号序列连接和生化转换所需的突出端。通过在PCR中使用生物素化的引物，消化的末端片段可使用亲和方法(如链亲和素包被珠)除去。
实施例3
每次循环转换四个核苷酸的循环转换方法
将核酸碱基转化为可读的信号序列的循环转换方法可通过将目标DNA中的12碱基序列转换为相应的信号链来说明。转换发生于使用一个循环方法的几个步骤中，其中，每个循环转换4个碱基，一共进行3个循环。终产物是一由12个信号元件组成的信号链，这12个信号元件代表目标DNA中的相应碱基序列。图2对上述实验作了示意性描述。
分别使用含有Eam1104I和SfaNI限制位点的引物(图2中顶部的片段)，将来自λ噬菌体基因组(1507～1703)并含有SfaNI和Eam1104I内切位点的一段240个碱基对的目标DNA片段进行PCR-扩增。为了避免以后在内切位点处被切断，PCR反应使用甲基化的脱氧胞嘧啶核苷酸(m5-dCTP)替代通常的脱氧胞嘧啶核苷酸(dCTP)。PCR条件：(50μl)：10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl，0.1％Triton-X-100，pH 8.8(热缓冲液(Thermopol buffer)，New EnglandBiolabs)，2mM Mg2+，200μM dNTP(-dCTP)和200μMm5-dCTP(Amersham Pharmacia Biotech)，20pmolλ引物#328(5’-agactggcgatccctggcatcacccctccagcgtgttttat-3’；SEQ ID No 1)和20mpolλ引物#329(5’-gcactgataggcgtcactcttcgctgtacgctg Iccagatgt-3’；SEQ ID No 2)(MWG biotech)，10ngλ基因组，1U Vent聚合酶(NewEngland Biolabs)。PCR循环在PTC-200(MJResearch)上进行。热起始：95℃，5分钟，进行由95℃，15秒，58℃，20秒，72℃，30秒组成的循环35次。终止延伸步骤：72℃，5分钟。
循环1：
片段进入测序循环(图2，A)并用Eam1104I和SfaNI酶切(由于内切位点被甲基化，受到保护而不会被切断，只有引物区域处发生切断作用)。消化条件：100mM NaCl，50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mM DTT，pH 7.9(NEB3，New England Biolabs)，1μg甲基化的PCR片段，20U Eam1104I，3U SfaNI，37℃保温一个小时。65℃加热20分钟使酶热失活。切好的片段用GibcoBRL PCR纯化系统(Gibco)纯化并用10mM Tris-HCl洗提。切好的片段与那些经过一步初始制备或一次循环的转换(如实施例1中所述)所获得的片段的性质一致，因为这种切好的片段有一个与信号链连接的三个碱基的突出端和一个与特异性右端接头连接的四个碱基的突出端。
将所述片段与特异性接头及其相应信号序列连接来完成加上选择标记的转换步骤(图2，B)：40mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mMDTT，0.5mM ATP，pH 7.8(连接酶缓冲液，Fermentas)，1.6pmol接头1(5’-生物素-ggctaggtgctgatgaacgcatcg-3’；SEQ ID No 3’退火至5’-tggacgatgcgttcatcagcacctagcc-3’；SEQ ID No 4(MWG-biotech)，1.9pmol信号序列1(1)，7.5Weiss-U T4 DNA连接酶(Fermentas)。室温下(22℃)保温2.5小时。于65℃下，10分钟使连接酶热失活。
实验中所使用的信号序列由以下方法制备：通过退火的寡核苷酸(约45个碱基)制备信号元件(每一个元件代表一个碱基)，将其连接起来产生所需的信号序列(信号元件由可控制连接序列的不同的突出端构成)。将以上信号序列经PCR扩增和SapI酶切以产生将信号序列连接到目标DNA上所必需的互补突出端。由于所有的目标DNA片段均有相同的连接信号序列的突出端，所以不管由SfaNI产生的突出端的序列如何，所有片段在一个特定的反应中都会连接于相同的信号序列。特异性和选择性也因此由接头决定。当其连接到经SfaNI酶切的目标DNA的末端时，只有具有与接头互补的突出端的片段才能连接上。因此，转换预先设定目标DNA，以及与信号序列相连的目标DNA，也具有与接头互补的突出端以便发生与其连接。换句话说，接头确保特异性选择具有与连接的信号序列相应的突出端序列的片段。
碱基转化的选择步骤由选择和扩增那些连接有信号序列和特异性接头(图2，C)的片段组成。这一步骤通过按以下条件进行PCR来完成(50μl)：10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl，0.1％Triton-X-100，pH 8.8(热缓冲液，New England Biolabs)，2mM Mg2+，200μM dNTP(-dCTP)和200μM m5-dCTP(Amersham PharmaciaBiotech)，20pmol接头1引物#332(5’-生物素-ggctaggtgctgatgaacgcatcg-3’；SEQ ID No 5)和20pmol信号序列1-引物#340(5’-taatacgactcactatagcatgactcgagcctcttcgcga  -3’；SEQ ID No 5)(MWG-biotech)，约3.5fmol的连接的目标DNA，1U Vent聚合酶(NewEngland Biolabs)。PCR循环在PTC-200(MJResearch)上进行。热起始：95℃，2分钟，进行由95℃，15秒，66℃，20秒，72℃，30秒组成的循环20次。终止延伸步骤：72℃，5分钟。图2中孔2显示本测序方法的初始循环的结果。由此产生了正确的380个碱基对的片段。
循环2：
为了转换下四个碱基，用GibcoBRL纯化系统(Gibco)纯化PCR产物，然后用SfaNI和Eam1104I进行酶切。由于来自初始循环中的信号序列和接头分别含有Eam1104I和SfaNI的酶切位点，所以本步骤可以发生。由于这些酶切位点存在于引物区域，在PCR过程中，它们没有因为甲基化作用而封闭。为了提高酶切反应的效率，酶切作用在一系列最佳酶切条件下进行。SfaNI酶切条件：100mM NaCl，50mMTris-HCl，10mM MgCl2，1mM DTT，pH 7.9(NEB3，New EnglandBiolabs)，1μg甲基化PCR片段，4U SfaNI。于37℃保温1小时。于65℃下，10分钟使酶SfaNI热失活。用Micro Bio-Spin 6柱(BioRad)纯化该片段。Eam1104I酶切条件：33mM Tris-乙酸盐，10mM乙酸镁，66mM乙酸钾，0.1％mg/ml BSA，pH 7.9(Tango Y+，Fermentas)，经SfaNI消化的PCR片段，10U Eam1104I。于37℃保温1小时，而后于65℃下，20分钟使酶热失活。消化产物用GibcoBRL纯化系统(Gibco)纯化。除了加入一个新的信号序列和与之相应的特异性接头(与序列下四个碱基相应)外，转化的初始步骤与初始循环相同。为了减少潜在的遗留问题，将信号序列2与信号序列1设计成带有不同的突出端。连接条件：40mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，0.5mM ATP，pH 7.8(连接酶缓冲液，Fermentas)，0.5pmol接头2(5’生物素-cgacagtacgacggaccagcatcc-3’；SEQ ID No 6退火至5’-acgcggatgctggtccgtcgtactgtcg-3’；SEQ ID No 7)(MWG-biotech)，1pmol信号序列2(2)，1 Weiss-U T4 DNA连接酶(Fermentas)。于室温下(22℃)保温1.5小时。于65℃下，10分钟使连接酶热失活。除了使用一套新的引物外(接头2-引物#347，5’-生物素-cgacagtacgacggaccagcatcc-3’；SEQ ID No 6’和信号序列2-引物#343，5’-taatacgactcactatagcatcgaatgaccgcctcttccact-3’；SEQ ID No 8)，进行PCR扩增的条件与初始循环相同。对每一测序循环准备不同引物组以减少从前面测序循环中遗留物进行扩增的风险。图4中孔3显示了第二个循环中的PCR扩增结果。产生了正确的523个碱基对的片段。
循环3：
转化下四个碱基及PCR扩增与循环2中所描述的方式相同：经过SfaNI和Eam1104I的一系列酶切作用后，片段连接于信号序列3(3)和接头3(5’-生物素-atcgagcctggcatagcagcatca-3’；SEQ ID No 9退火至5’-aaactgatgctatgccaggctcgat-3’；SE Q ID No 10)(MWG-biotech)。PCR扩增使用引物组：接头3-引物#353(5’-atcgagcctggcatagcagcatca-3’；SEQ ID No 9)和信号序列3-引物#345(5’taatacgactcactatagcaccgggcaggatagactcttcaggt-3’；SEQ ID No11)。图4中孔4显示了循环3的扩增结果。孔4显示形成了两个弱的和一个相对较强的条带。强条带与666个碱基对这一期望长度最为接近。在孔4和孔3中看到的错误长度的弱条带很可能是遗留问题和错误引导的结果。孔3中的弱条带及进一步出现在孔4中的弱条带与前一循环中的PCR片段的大小相同。一个可能的解释是，在一个循环当中经不完全酶切作用的片段在下一个PCR循环中可能作为模板。尽管每一循环中的新的引物组使这类问题稍有减少，但由于引物拥有相同的酶切位点致使错误引导的风险仍然存在。然而，这种类型的错误引导可以通过以下方法消除：在PCR过程中使用更严格的退火条件(例如，Mg2+，温度)，使用区别更大的聚合酶，使Eam1104I酶切位点远离序列链引物的3’端，选择新的序列或者在酶切前固定片段(例如在微珠上的生物素-链亲和素系统)以保证那些进入下一循环的片段经过酶切作用。选择新的引物序列和/或优化PCR条件是对其它类型的错误引导的最好解决方法。由于DNA原料过剩的原因(例如，过剩的接头或未连接的DNA)引起的错误引导能够通过将接头的凹链硫化保护而除去。在PCR前用5’-3’外切酶(例如，T7外切酶或λ外切酶)消化将只留下连接有接头的完整的一条DNA链。在所有的目标序列都是等长的实施方案中，大小选择可以用来在生化转换过程中除去错误长度的片段。
实施例4
每个循环转换三个核苷酸的循环转换方法
将核酸碱基转化为可读的信号序列的循环转换方法可通过将目标DNA中的12碱基序列转换为相应的信号序列来说明。转换发生于使用一个循环方法的几个步骤中，其中，每个循环转换3个碱基，一共进行4个循环。终产物是一由12个信号元件组成的信号序列，这12个信号元件代表目标DNA中的相应碱基序列。图5对上述实验作了示意性描述。
将以下寡核苷酸退火产生一段合成的66碱基对的目标DNA片段：#003(5’-PHO-GATCTTGGCTATTCGTCTCTTGGCTTTTCGTCTGATTGTAGACGCCAACGGGACATGATGATGAT-3’：SEQ IDNo 12)和#004(5’-[PHO-CATCATCATCATCATGTCCCGTTGGCGTCTACAATCAGACGAAAAGCCAAGAGACGAATAGCCAAG-3’；SEQ ID No13)。从该序列中明显看出，目标分子在3’端包含有四个连续的ATG三联体。退火所得的分子与那些经一步初始制备(如实施例2中所述)而获得的片段的性质相一致，因为该分子有一个可连接信号序列的3个碱基的突出端和一个可连接特异性接头的4个碱基的突出端。
附着选择标记的转换步骤(图5，B)通过将1pmol片段与特异性接头及其相应信号序列连接而进行：50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，25ug/ml BSA，pH 7.5(连接酶缓冲液，NewEngland Biolabs)，1pmol接头#005(5′-GATGTAGATGCACTCCCGGACCTC-3′；SEQ ID No 14退火至#0065′-GAGGTCCGGGAGTGCATCTA-3′；SEQ ID No 15)(MWG-biotech)，1pmol信号序列#001(5′-TGTGTCCGCGTGGCTCTTCTGATCTTGGCTTTTCGTCTCTTGGCTATTCGTCT-3′；SEQ ID No 16，退火至#0025′-PHO-ATCAGACGAATAGCCAAGAGACGAAAAGCCAAGATCAGAAGAGCCACGCGGACACA-3′；SEQ ID No 17)(MWG-biotech)，100单位T4DNA连接酶(New England Biolabs)。在PTC-200热循环器(MJResearch)中22℃下保温1小时。同时成功连接于接头和信号序列接头的分子的选择和扩增使用PCR在以下条件下进行(50μ1)：10mM KCl，10mM(NH4)SO4，20mM Tris-HCl，0.1％Triton-X-100，pH 8.8(热缓冲液，New England Biolabs)，2mM Mg2+，200μM dNTP(Amersham Bioscience)，10pmol接头引物#006(5′-GAGGTCCGGGAGTGCATCTA-3′；SEQ ID No 18)(MWG-Biotech)和10pmol信号链引物#007(5′-TGTGTCCGCGTGGCTCTTCT-3′；SEQ ID No 19)(MWG-Biotech)，大约1pmol已连接的目标DNA和0.2U Vent聚合酶(New England Biolabs)。使用PTC-200(MJReasearch)进行PCR循环。热起始：95℃，2分钟，由95℃，15秒，59.3℃，20秒，72℃，20秒组成的25次循环。终止延伸步骤：72℃，60秒。图6中的孔2显示了本测序方法初始循环后所得结果。生成142bp的正确的片段。
循环2：
为了转换下3个碱基，使用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，然后使用Eam1104I和SfaNI酶切。为了提高酶切反应的效率，酶切反应在一系列最优化的酶切条件下进行。Eam1104I酶切条件：33mM Tris-乙酸盐，10mM乙酸镁，66mM乙酸钾，0.1mg/ml BSA，pH 7.9(Tango Y+，Fermentas)，0.5μg PCR片段，20单位Eam1104I，总反应体系为25μl。37℃保温1小时。使用Micro Bio-Spin6柱(BioRad)纯化片段。SfaNI酶切条件：100mM NaCl，50mMTris-HCl，10mM MgCl2，1mM DTT，pH 7.9(NEB3，New EnglandBiolabs)，0.5μg PCR片段，2.5单位SfaNI。在50μl反应体系中于37℃保温15分钟。
消化产物使用PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)提纯，并从凝胶上使用破碎浸泡法(crush and soak method)纯化。使用Micro Bio-Spin6除去凝胶颗粒，并使用MinElute反应纯化柱(Qiagen)纯化DNA。
转换步骤使用与初始循环相同的信号序列及相应的特异性接头进行。除了消化后使用琼脂糖凝胶和凝胶纯化试剂盒(Qiaexil，Qiagen)纯化样品之外，其余过程如循环1所叙述的模式进行。第二次循环的PCR扩增结果如图6孔3所示。得到172bp的正确的片段。
循环3和4按照循环2所述模式进行。PCR扩增结果如孔4和5所示，得到202bp和232bp的正确的片段。

Claims (15)

1.一种识别存在于样品中的目标多核苷酸的特定特征的方法，包括如下步骤：
i)将对所研究的特征具有特异性的多核苷酸信号序列附着于样品中每一目标多核苷酸的一端；
ii)将目标多核苷酸与一种分子接触，如果该特征存在，所述分子可与目标多核苷酸反应；
iii)将参加反应的目标多核苷酸与不反应的目标多核苷酸分离；
iv)可选重复步骤(i)到(iii)；
v)确定哪些信号序列存在于分离的目标多核苷酸上，以何种顺序，从而确定每一目标多核苷酸的特征。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(iii)通过下列步骤进行：
(a)将多核苷酸接头序列附着于可与所述分子相互作用的目标多核苷酸上；
(b)对同时包含信号序列和接头的目标多核苷酸进行多核苷酸扩增反应。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述方法用以测定目标多核苷酸的核酸序列。
4.根据权利要求2的方法，其中接头多核苷酸包含限制酶识别序列，以便随后在扩增步骤后酶切。
5.根据权利要求2的方法，其中使用聚合酶反应进行扩增。
6.根据权利要求5的方法，其中接头和信号序列包含可供在聚合酶反应中使用的、寡核苷酸引物的识别位点。
7.根据前面所述的任一项权利要求，其中样品分入n个反应小格，n为所研究的不同特征的数目，每个小格的信号序列对该小格有特异性。
8.根据权利要求4的方法，其中限制酶识别序列对第II类酶有特异性。
9.根据权利要求8的方法，其中所述酶为SfaNI或EarI。
10.根据权利要求5的方法，其中使用甲基-dCTP替代dCTP进行聚合酶反应。
11.根据权利要求2的方法，其中接头固定于支持材料上。
12.根据权利要求6的方法，其中连续的信号序列、可选连续的接头包含不同寡核苷酸引物的识别位点。
13.一种测定目标多核苷酸序列的方法，包括如下步骤：
i)处理双链目标多核苷酸样品，在每一端均生成突出端，其中之一为待测序突出端，每个突出端均有确定数目的碱基；
ii)将样品分为小份，将每一份样品分别与双链多核苷酸信号序列和双链接头多核苷酸接触，每条信号序列代表与待测序突出端等长的特定多核苷酸序列，并且包括一个可与目标多核苷酸的待测序端的相对端杂交和连接的突出端，每个接头包括一个与待测序的突出端序列为互补序列的突出端；
iii)使用可与信号序列末端和接头序列末端杂交的引物在样品中进行聚合酶反应，其中聚合酶反应产物包括可使接头酶切的限制位点以形成新的待测序突出端，可选重复步骤(i)到(iii)使用限制酶产生突出端；
v)确定哪些信号序列存在于扩增产物上，以何种顺序，从而测定目标多核苷酸的序列。
14.根据权利要求13的方法，其中与信号序列连接的突出端至少有3个碱基。
15.根据权利要求13或14的方法，其中待测序突出端为4个碱基。
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