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CN1756849A - 蛋白质功能性的调控 - Google Patents

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CN1756849A
CN1756849A CN 200380110049 CN200380110049A CN1756849A CN 1756849 A CN1756849 A CN 1756849A CN 200380110049 CN200380110049 CN 200380110049 CN 200380110049 A CN200380110049 A CN 200380110049A CN 1756849 A CN1756849 A CN 1756849A
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CN
China
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leu
ser
glu
ala
gly
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Pending
Application number
CN 200380110049
Other languages
English (en)
Inventor
D·L·费林
P·A·彼得里洛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Deciphera Pharmaceuticals LLC
Original Assignee
Deciphera Pharmaceuticals LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Deciphera Pharmaceuticals LLC filed Critical Deciphera Pharmaceuticals LLC
Publication of CN1756849A publication Critical patent/CN1756849A/zh
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  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

提供了合理鉴别能够与天然产生的特定蛋白质相互作用的分子的新方法，以便产生新的药理学上重要的化合物和治疗模态。概括地说，所述方法包括鉴别形成感兴趣的特定蛋白质的一部分的开关控制配体，以及还鉴别形成蛋白质的一部分并与所述开关控制配体相互作用的互补的开关控制口袋的步骤。所述配体在体内与口袋相互作用以调节蛋白质的构象和生物活性，这样在配 体－口袋相互作用时所述蛋白质呈第一构象和第一生物活性，在所述配体－口袋相互作用不存在时呈第二种不同的构象。然后提供呈第一和第二构象的所述蛋白质的相应样品，并通过使样品与分子接触来筛选一种或多种候选分子。从而可鉴别在口袋区域结合蛋白质的小分子。还提供了新的蛋白质－调制剂加合物和改变蛋白质活性的方法。

Description

蛋白质功能性的调控
相关申请的相互参照
本申请要求2002年12月31日提交的题为“调控蛋白质功能的方法”(Process ForModulating Protein Function)的临时申请S/N 60/437,487、2002年13月31日提交的题为“抗癌药物”(Anti-Cancer Medicaments)的临时申请S/N 60/437,403、2002年12月31日提交的题为“抗炎药物”(Anti-Inflammatory Medicaments)的临时申请S/N 60/437,415、2002年12月31日提交的题为“抗炎药物”(Anti-InflammatoryMedicaments)的临时申请S/N 60/437,304，和2003年4月18日提交的题为“治疗神经变性疾病或糖尿病的药物”(Medicaments For the Treatment ofNeurodegenerative Disorders or Diabetes)的临时申请S/N 60/463,804的优先权。这些申请分别纳入本文作为参考。
发明背景
发明领域
本发明一般涉及新的鉴别作为蛋白质活性调制剂的分子的合理方法，以及新的蛋白质-调制剂加合物。更具体地，本发明涉及所述方法和加合物，在优选的方式中，采用涉及开关控制配体(switch control ligand)和互补的开关控制口袋(switchcontrol pocket)之间相互作用的蛋白质构象改变机制。
现有技术的描述
近来基础研究为生命科学研究机构提供了大量人类遗传编码信息以及由这些编码所产生的蛋白质。在2001年报道了人类基因组的全序列(Lander，E.S.等，InitialSequencing and Analysis of the Human Genome；Nature(2001)409：860；Venter，J.C.等，The Sequence of the Human Genome，Science(2001)291：1304)。全球的研究机构现在正在将这些遗传序列编码的50,000多蛋白质进行分类，更重要的是试图鉴别那些成为治疗不足的主要人类疾病原因的蛋白质。除了人类基因组及其蛋白质提供的信息价值，尤其是在蛋白质功能构象控制区域，制药工业用以开始开发小分子治疗剂的方法和策略在用天然蛋白质结合位点以结合小分子治疗剂方面没有显著进展。这些天然位点通常被蛋白质用来进行必需的细胞功能，通过结合并加工天然底物或从天然配体转导信号。由于这些天然位点被蛋白质家族内的许多其它蛋白质广泛使用，所以与它们相互作用的药物通常缺乏选择性，结果是不足以使治疗窗达到最大功效。这些小分子还有副作用和毒性，无论是在临床前发现、临床试验或以后在市场上。副作用和毒性仍是药物开发过程中高损耗的主要原因。就蛋白质的激酶蛋白家族而言，这些天然位点的相互作用最近已被综述：参见J.Dumas，Emerging Pharmacophores：1997-2000，Expert Opinion on Therapeutic Patents(2001)11：405-429；J.Dumas编，Current Topics如Medicinal Chemistry(2002)2：第9期。
已知蛋白质是柔性的，这种柔性已被报道并被用来发现与蛋白质可能的柔性活性位点结合的小分子。对于此论题的综述可参见例如Teague，Nature Reviews/DrugDiscovery，卷2，pp.527-541(2003)。也可参见Wu等，Structure，卷11，pp.399-410(2003)。然而，这些报道关注的是仅在蛋白质天然活性位点结合蛋白质的小分子。Peng等，Bio.Organic and Medicinal Chemistry Ltrs.，卷13，pp.3693-3699(2003)，和Schindler等，Science，卷289，p.1938(2000)描述了abl激酶的抑制剂。这些抑制剂在WO出版物No.2002/034727中被鉴别。这类抑制剂结合ATP活性位点，同时也以诱导激酶催化环移动的方式结合。Pargellis等，Nature Structural Biology，卷9，p.268(2002)报道的抑制剂p38α-激酶也揭示在WO出版物No.00/43384和Regan等，J Medicinal Chemistry，卷45，pp.2994-3008(2002)中。这类抑制剂还在与激酶活化环伴随移动有关的ATP活性位点与激酶相互作用。
最近，已揭示激酶利用活化环和激酶结构域调节口袋来控制它们的催化活性状态。最近已综述：参见M.Huse和J.Kuriyan，Cell(2002)109：275。
发明概述
本发明涉及鉴别与特定的天然产生的蛋白质(例如哺乳动物尤其是人类蛋白质)相互作用以调节蛋白质活性的分子的方法，并涉及新的蛋白质-小分子调制剂加合物。在其方法方面，本发明采用天然产生的蛋白质的特征，即蛋白质可根据蛋白质活性的相应变化在体内改变它们的构象。例如，一种构象的给定蛋白质可被作为一种酶生物上调，而另一种构象的相同蛋白质可被生物下调。此外，本发明优选采用天然产生的蛋白质所利用的构象变化机制，通过蛋白质内称为“开关控制配体”和“开关控制口袋”的相互作用。
附图简述
本专利或申请文件包含至少一张彩色图。函索并支付必需的费用之后办公室将提供本专利或专利申请公开文本和彩图的副本。
图1是本发明所述天然产生的哺乳动物蛋白质的示意图，包括“开”和“关”开关控制口袋、瞬时可修饰的开关控制配体和活性ATP位点；
图2是图1所示蛋白质的示意图，其中说明开关控制配体处于与关开关控制口袋的结合关系，从而使蛋白质呈第一生物下调构象；
图3与图1类似，但说明开关控制配体处于其电荷修饰状态，其中某些氨基酸残基的0H基团被磷酸化；
图4与图2类似，但该蛋白质中的开关控制配体处于与“开”开关控制口袋的结合关系，从而使蛋白质处于不同于图2的第一构象的第二生物活性构象；
图4a是放大的图，说明磷酸化的开关控制配体残基和“开”开关控制口袋上的互补残基之间的结合；
图5与图1类似，但说明可能的小分子化合物处于与“开”和“关”开关控制口袋结合的关系；
图6是蛋白质的示意图，其中开关控制配体部分与“开”开关控制口袋形成了复合开关控制口袋，并有小分子与复合口袋结合关系；
图7是蛋白质的示意图，其中组合开关控制口袋是由“开”开关控制口袋的部分、开关控制配体序列和活性ATP位点形成的，并有小分子与组合开关控制口袋结合关系；
图8是说明处于生物上调状态的胰岛素受体激酶蛋白质的“开”构象的X射线晶体结构带状图(X-ray crystal structural ribbon diagram)；
图9与图8类似，但描述处于生物下调状态的“关”构象的蛋白质；
图10是abl激酶的SURFNET显像，其中“开”开关控制口袋用蓝色表示；
图11是abl激酶的GRASP显像，其中“开”开关控制口袋用黄色圈出；
图12是abl激酶蛋白质的带状图，标出了“开”开关控制口袋的重要的氨基酸残基；
图13是激酶蛋白质的带状图，说明组合开关控制口袋(“开”开关控制口袋/开关控制配体序列/ATP活性位点)；
图14是p38激酶的SURFNET显像，其中“开”开关控制口袋用蓝色表示；
图15是p38激酶的GRASP显像，其中“开”开关控制口袋用黄色圈出；
图16是p38激酶蛋白质的带状图，标出了“开”开关控制口袋的重要的氨基酸残基；
图17是Gsk-3β激酶蛋白质的SURFNET显像，其中双功能性开-关开关控制口袋用蓝色表示；
图18是Gsk-3β激酶蛋白质的GRASP显像，其中双功能性开-关开关控制口袋用黄色圈出；
图19是Gsk-3β激酶蛋白质的带状图，标出了组合开-关开关控制口袋的重要的氨基酸残基；
图20是鉴定处于其未磷酸化状态的半纯化的abl激酶结构域蛋白质的SDS-PAGE凝胶；
图21是鉴定处于其未磷酸化状态的纯化的abl激酶蛋白质的SDS-PAGE凝胶；
图22是半纯化的abl激酶结构域蛋白质的色谱洗脱图；
图23是纯化的abl激酶结构域蛋白质的色谱洗脱图；
图24是TEV标记剪切之前(泳道2-4)和之后(泳道5-8)鉴定abl激酶蛋白质的SDS-PAGE凝胶；
图25是纯化的abl蛋白质的UV光谱，该蛋白质的ATP位点结合有小分子抑制剂PD 180790；
图26是通过镍亲和层析和Q-琼脂糖层析纯化时abl构建物5蛋白质(abll-531，Y412F突变体)的色谱洗脱图；
图27是纯化的abl构建物5蛋白质的SDS-PAGE凝胶；
图28是处于其未磷酸化状态的纯化的p38-α激酶蛋白质的色谱洗脱图；
图29是处于其未磷酸化状态的纯化的p38-α激酶蛋白质的SDS-PAGE凝胶；
图30是处于其磷酸化状态的活化的Gsk3-β蛋白质的质谱；
图31是处于其未磷酸化状态的未活化的Gsk3-β蛋白质的质谱；
图32是用抗磷酸酪氨酸抗体对磷酸化的Gsk3-β蛋白质进行Western印迹分析染色；和
图33是用抗磷酸酪氨酸抗体对未磷酸化的Gsk3-β蛋白质进行Western印迹分析染色。
优选实施方案的详细描述
本发明提供了合理开发与天然产生的蛋白质(例如哺乳动物尤其是人类蛋白质)相互作用以调节蛋白质活性的新的小分子调制剂的方法。也提供了新的蛋白质-小分子调制剂加合物。本发明优选采用天然产生的蛋白质，其具有一种构象性质，从而该蛋白质可根据蛋白质活性的相应变化在体内改变它们的构象。例如，一种构象的给定蛋白质可作为一种酶被生物上调，而另一种构象的相同蛋白质可被生物下调。此外，本发明优选采用天然产生的蛋白质所利用的构象变化机制，通过蛋白质内称为“开关控制配体”和“开关控制口袋”的相互作用。
“开关控制配体”在这里是指天然产生的蛋白质内的一个区域或结构域，其中具有一个或多个氨基酸残基，通过生化修饰(通常是磷酸化、硫酸化、酰化或氧化)可在各个状态之间在体内瞬时修饰这些残基。类似地，“开关控制口袋”是指天然产生的蛋白质内的许多毗邻或不毗邻的氨基酸残基，并包含残基，残基能够在体内结合处于其各个状态的开关控制配体的瞬时修饰残基，以诱导或限制蛋白质的构象从而调节蛋白质的生物活性，和/或残基能够结合非天然产生的开关控制调制剂分子以诱导或限制一种蛋白质构象从而调节蛋白质的生物活性。
本发明所述的蛋白质-调制剂加合物包括具有开关控制口袋的天然产生的蛋白质以及在所述开关控制口袋区域与蛋白质结合的非天然产生的分子，所述分子可通过诱导或限制蛋白质的构象而至少部分用来调节所述蛋白质的生物活性。优选地，所述蛋白质还含有相应的开关控制配体，所述配体在体内与所述口袋相互作用以调节蛋白质构象和生物活性，这样在配体-口袋的相互作用时所述蛋白质呈第一构象和第一生物活性，并在所述配体-口袋相互作用不存在时呈第二种不同的构象和生物活性。
可参考图1-4理解开关控制配体/开关控制口袋相互作用的特性。具体地，在图1中，以示意形式说明的蛋白质100包括″开″开关控制口袋102，和″关’开关控制口袋104，以及开关控制配体106。此外，图示的蛋白质还包括ATP活性位点108。在图1的示范性蛋白质中，配体106有三个具有侧链OH基团110的氨基酸残基。关口袋104含有相应的X残基112，开口袋102有Z残基114。在示范性例子中，蛋白质100将根据配体106上OH基团110的电荷状态改变其构象，即当OH基团未被修饰时呈现中性电荷，但当这些基团被磷酸化时呈现负电荷。
可参考图2-4理解口袋102、104和配体106的功能。在图2中，配体106与关口袋104操作性相互作用，从而OH基团110与X残基112相互作用形成口袋104的一部分。这种相互作用主要是由于OH基团110和残基112之间的氢键。如图所见，这种配体/口袋相互作用使蛋白质100呈不同于图1所见的构象，并与蛋白质的关构象或生物下调构象相一致。
图3说明配体106从图2所示的关口袋相互作用构象移开和OH基团110已被磷酸化赋予该配体负电荷的状态。在这种状态下，该配体具有强烈的与开口袋102相互作用的倾向，从而将蛋白质构象改变成开状态或生物上调状态(图4)。图4a说明配体106上的磷酸化基团与正电荷残基114结合以获得离子样稳定的键。注意，在图4的开构象中，蛋白质构象不同于图2的关构象，并存在ATP活性位点，蛋白质具有激酶功能。
图1-4说明蛋白质显示不连续的口袋102和104以及配体106的简单状态。然而，在许多情况下观察到更复杂的开关控制口袋模式。图6所示的状态中，由配体106和例如口袋102的氨基酸残基形成了与小分子相互作用的合适的口袋。这被称为“复合开关控制口袋”(composite switch control pocket)，由配体106和口袋的残基构成，并用数字120表示。出于蛋白质调制的目的，小分子122与口袋120相互作用。
图7描述了更复杂的开关口袋，其中口袋包括开口袋102的残基和ATP位点108以形成所谓的“组合开关控制口袋”(combined switch control pocket)。这种组合口袋用数字124表示，也可包含配体106的残基。出于蛋白质调制的目的，有合适的小分子126与口袋124结合。
应该理解，在图1-4所示的简单口袋状态中，小分子将与简单口袋102或104相互作用，在图6和7所示的更复杂的状态中，相互作用口袋处于口袋120或124区域。因此，概言之，小分子“在各个开关控制口袋区域”相互作用。
图8和9是胰岛素受体激酶结构域蛋白质X射线晶体学分析的带状图，其中图8说明处于其开构象或生物上调构象的蛋白质，用蓝色表示。在该照片中，黄色的链是开关控制配体序列，品红色部分代表形成与配体序列相互作用以维持蛋白质处于生物上调构象的互补的开-开关控制口袋的关键残基。另一方面，图9用醒目的黄铜色表示了处于其关构象或生物下调构象的蛋白质。在该图中，再次用黄色表示开关控制序列，并用绿色表示关-开关控制口袋的关键残基。同样，开关控制配体和关-开关控制口袋之间的相互作用维持蛋白质处于所述生物下调构象。
再参考所述的示意图，图8的图与图4相对应，其中配体106与开口袋102相互作用。同样，图9与图2相对应，其中配体106与口袋104相互作用。
本领域的技术人员将知道，一给定蛋白质将随时间变化在上调和下调构象之间“转换”，这取决于会使蛋白质变为开口袋相互作用的配体106的磷酸化，或从配体会使蛋白质变为关口袋相互作用构象的磷酸基团中的剪切。因此，开关控制配体/开关控制口袋相互作用导致的构象变化是性质动态的并最终受胞内条件控制。
还应该理解，蛋白质构象的异常可导致或加重疾病。例如，如果一给定蛋白质不幸留在关构象或生物下调构象，则将阻止需要活性蛋白质的代谢过程，就可能发生延迟或不希望的副作用。同样，如果蛋白质不幸留在开构象或生物上调构象，则代谢过程可被过度促进，这也可导致严重的健康问题。
然而，已经发现可开发一些小分子化合物来调制蛋白质活性以在体内复制或接近正常的蛋白质活性。参考图5，将见小分子116可与关口袋104相互作用从而抑制配体106与口袋104相互作用。在这个简单化的假设中，蛋白质100然后将具有较大的留在开构象或生物上调构象的趋势。或者，如图所示，小分子118与开口袋102相互作用以抑制配体106与口袋102相互作用。在这种简单的过程下，将导致配体106与关口袋104相互作用的较大趋势，从而使蛋白质转为关构象或生物下调构象。
因此，通过分析蛋白质以确定相互作用的开关控制配体和开关控制口袋的位置和序列，以及理解这些相互作用是如何转换在生物上调构象和下调构象之间的蛋白质，将提供可用于为设计和开发可调制蛋白质活性的小分子化合物的有力工具。
一般来说，鉴别与特定的天然产生的蛋白质相互作用以调制蛋白质活性的分子的方法首先包括鉴别形成该蛋白质的一部分的开关控制配体以及形成该蛋白质的一部分并与配体相互作用的开关控制口袋。所述配体和口袋协同相互作用以调节蛋白质的构象和生物活性，从而可在配体-口袋相互作用时使蛋白质呈第一构象和相应的第一生物活性，并在配体-口袋相互作用不存在的情况下呈第二种不同的构象和生物活性。
在下面的步骤中，提供了处于其第一和第二构象的蛋白质的相应样品，这些蛋白质样品用于筛选测定候选小分子。这种筛选一般包括使候选分子与至少一种样品接触，并鉴定哪些小分子在鉴定的开关控制口袋区域与蛋白质结合。
本发明的方法可用于各种天然产生的哺乳动物(例如，人)蛋白质，它可以是野生型共有序列蛋白质、疾病多形体、疾病融合蛋白和/或人工构建的变体蛋白。可使用的蛋白质类型包括酶、受体和信号蛋白；更具体有激酶、磷酸酶、磺基转移酶、硫酸酯酶、转录因子、核激素受体、g-蛋白偶联受体、g-蛋白、gtp酶、激素、聚合酶、以及其它包含核苷酸调节位点的蛋白质。大多数情况下，感兴趣的蛋白质的分子量至少为15kDa，更通常大于约30kDa。
在本发明的方法中，可用许多技术来鉴别开关控制配体序列和开关控制口袋，以及确定候选小分子调制剂的上调或下调作用。一般来说，这些方法包括生物信息学分析、X射线晶体学、核磁共振(NMR)、圆二色性(CD)和亲和碱基筛选。此外，所有的常规技术如定向诱变和标准生化试验也可以辅助。
生物信息学分析无需试验便可鉴别相关的配体和口袋。例如在一些情况下可通过使用PUBMED等现有数据库严格确定有关蛋白质数据。因此，最初步骤可以是有关感兴趣的蛋白质的已知结构查询PUMBED，其包含序列信息。然后可进行BLAST搜索以确定含有所选最小严格性的其它序列(例如，至少60％)。这可揭示感兴趣的点突变或多形态现象，以及异常融合蛋白，所有这些都可成为疾病的原因；这些还可提供深入了解鉴别造成疾病的功能或功能异常的开关控制配体序列和/或口袋。这种生物信息学分析的具体例子叙述在下面的实施例1中。
X射线晶体学技术首先需要蛋白质表达以提供高纯化的蛋白质。可用全基因合成技术来化学合成蛋白质基因，最好使用特殊的表达系统。可用常规技术从合成的寡核苷酸迅速合成任何基因。用软件(Gene BuilderTM)和相关的分子生物学方法可合成任何基因。全基因分析优于常规克隆方法，因为可迅速合成基因的密码子最优模式以进行最佳表达。此外，可在一个步骤而不是顺序地制造复杂突变(例如许多不同突变的组合)。策略性置换限制性位点有助于根据需要快速加入其它突变。因此这种技术能在较短时间内创建更多的基因构建物。用系统发育分析、分子建模和结构预测、已知表达、功能筛选数据和报道的文库数据的组合来确定蛋白质序列选择，以开发生产蛋白质的方法。可用市售载体制造表达构建物以在杆状病毒感染的昆虫细胞内表达蛋白质。大肠杆菌(E.coli)表达系统可用来生产其它蛋白质。可通过加入亲和标记修饰基因。还可通过产生缺失、点突变和蛋白质融合来修饰基因以改进表达、帮助纯化和易于结晶。
蛋白质纯化：可通过氮气气蚀、弗氏压碎或微流体来破裂来自表达试验的全部细胞浆，微流化被证明是最有效的释放可溶蛋白的方法。用机械装置对提取物平行进行蛋白质纯化，该装置使多个柱(包括Glu-mAb、金属螯合物、Q-seph、S-Seph、苯基-Seph和Cibacron Blue)在标准程序下同时平行运行，然后通过SDS-PAGE分析组分。将该信息与公布的纯化方法结合以迅速制定纯化方案。一旦纯化就可对蛋白质进行各种生物物理学测定(动态光散射、UV吸收、MALDI-ToF、分析型凝胶过滤等)。
晶体生长和X射线衍射量分析：在两种或多种温度下建立有或没有配体的稀疏矩阵聚焦结晶屏幕。所得没有配体的晶体(apo晶体)用于配体浸透试验(ligand soakingexperiment)。基于最初结果优化用于蛋白质晶体的晶体生长条件。一旦得到合适的蛋白质晶体，并可在R-AXIS IV成像平板系统(imaging plate system)和X-STREAM恒冷箱上对它们进行筛选以确定它们在各种深低温保藏条件下的衍射性质。充足衍射质量的蛋白质晶体用来收集X射线衍射数据，或被储存在液氮中并保存以便随后在同步加速器X射线辐射源中进行数据收集。蛋白质晶体衍射极限是用φ主轴设定偏离90°的至少两个衍射图象确定的。在衍射图象收集期间φ主轴摆动1°。用HKL-2000序列的X射线数据分析和还原软件处理这两个图象。蛋白质晶体的衍射分辨率被接受作为分辨壳(resolution shell)的较高分辨率限度，其中50％或更高的加标反射的强度为1δ或更高。
X射线衍射数据收集：如果发现蛋白质晶体在R-AXIS IV系统或同步加速器上衍射到3.0_，则是同步加速器中收集的完整数据组。完整数据组被定义为在已收集的最高分辨壳中具有所有反射的至少90％。用HKL-2000序列的X射线衍射数据处理软件处理X射线衍射数据(还原成独特的反射和强度)。
结构确定：使用在蛋白质数据库(PDB)中获得的一个或多个蛋白质搜索模型通过分子置换(MR)确定蛋白质-小分子复合物的结构。如果需要的话，采用多重同晶置换(MIR)和重原子和/或多波长反常衍射(MAD)法可促进结构确定。如果晶体的EXAFS扫描(在没有重原子的母液或冷冻保护剂中洗涤之后)揭示了合适的重原子信号，则对重原子浸透的晶体收集MAD同步加速器数据组。用CCP4计算机程序结晶套装完成对重原子衍生数据组的分析。用(|FPH|-|FP|)2差异Patterson图和(F+|-|F-|)2异常差异Patternson图鉴别重原子位点。
高场核磁共振(NMR)光谱法可用来鉴别开关控制配体序列和口袋。已报道NMR研究可阐述蛋白质尤其是蛋白激酶的结构。(Wuthrich，K；“NMR of Proteins andNucleic Acids”Wiley-Interscience：1986；Evans，J.N.S.，Biomolecular NmrSpectroscopy，Oxford University Press：1995；Cavanagh，J.等，N.Protein NmrSpectroscopy：Principals and Practice，Academic Press：1996.；Krishna，N.R.；Berliner，L.J.Protein Nmr for the Millenium(Biological Magnetic Resonance，20)，Plenum Pub Corp：2003。
在过去20年中，NMR已经发展成探索蛋白质结构、蛋白质与其它生物分子的相互作用以及显示小分子-蛋白质相互作用细节的有效技术。NMR方法是X射线结晶法的补充，这两种方法的结合为揭示蛋白质/小分子相互作用的性质提供了有力手段。一种特别有利的NMR技术包括制备15N和/或13C标记的蛋白质并分析化学位移微扰(chemical shift perturbation)，这种微扰在由蛋白质开关控制配体序列与其各自的开关控制口袋相互作用或小分子调制剂与开关控制口袋区域相互作用而导致蛋白质构象变化时发生。
圆二色性(CD)是一种适合研究蛋白质构象的技术(Johnson，W.C.，Jr.；CircularDichroism Spectroscopy and the vacuum ultraviolet region；Ann.Rev.Phys.Chem.(1978)29：93；Johnson，W.C.，Jr.；Protein secondary structure and CircularDichroism：A practicalguide″Proteins：Sttr.Func.Gen.(1990)7：205；Woody，R.W.″Circular Dichroism of peptides″(第2章)The Peptides卷71985Academic Press；Berova，N.，Nakanishi，K.，Woody，R.W.，Circular Dichroism：Principles andApplications，第二版，Wiley-VCH，New York，2000；Schmid，F.X.；T.E.Creighton编写的Spectral methods of characterizing protein conformati on andconformational changes in Protein Structure，a practical approach，IRL Press，Oxford 1989)，据报道尤其适合研究蛋白激酶的构象变化。(Bosca，L；Moran，F.；Circular Dichroism analysis of ligand-induced conformational changes inprotein kinase C.Mechanism of translocation of the enzyme from the cytosolto the membranes and its implications.Biochemical J.(1993)290：827；Okishio，N.；Tanaka，T.；Fukuda，R.；Nagai，M.；Differential Ligand Recognition bythe Src and Phosphatidylinositol 3-Kinase Src Homology 3Domains：CircularDichroism and Ultraviolet Resonance Raman Studies；Biochemistry(2003) 42：208；Deng，Z.；Roberts，D.；Wang，X.；Kemp，R.G.；Expression，characterization，and crystallization of the pyrophosphate-dependent phosphofructo-1-kinaseof Borrelia burgdorferi.Arch.Biochem.Biophys.(1999) 371.：326；Reed，J；Kinzel，V；Kemp，B.E.；Cheng，H.C.；Walsh，D.A.；Circular dichroic evidence for anordered sequence of ligand/binding site interactions in the catalyticreaction of the cAMP-dependent protein kinase.Biochemistry(1985) 24：2967；Okishio，N.；Tanaka，T.；Nagai，M.；Fukuda，R.；Nagatomo，S.；Kitagawa，T.；Identification of Tyrosine Residues Involved in Ligand Recognition bythe Phosphatidylinositol 3-Kinase Src Homology 3Domain：Circular Dichroismand UV Resonance Raman Studies.，Biochemistry(2001) 40：15797；Okishio，N.；Tanaka，T.；Fukuda，R.；Nagai，M.；Role of the Conserved Acidic ResiduesAsp21 in the Structure of Phosphatidylinositol 3-Kinase Src Homology 3 Domain：Circular Dichroism and Nuclear Magnetic Resonance Studies，Biochemistry(2001)40：119；Mattsson，P.T.；Lappalainen，I.；Backesjo，C.-M.；Brockmann，E.；Lauren，S.；Vihinen，M.；Smith，C.I.E.；“Six X-linked agammaglobulinemia-causing missense mutations in the Src homology 2 domain of Bruton’s tyrosinekinase：phosphotyrosine-binding and circular dichroism analysis.”J.Immun.(2000) 164：4170；Raimbault，C.；Couthon，F.；Vial，C.；Buchet，R.；“Effectsof pH and KCl on the conformations of creatine kinase from rabbitmuscle.Infrared，circular dichroic，and fluorescence studies.”Euro.J.Biochem.(1995) 234：570；Shah，J.；Shipley，G.G.；Circular dichroic studies of proteinkinase C and its interactions with calcium and lipid vesicles.Biochim.Biophys.Acta(1992) 1119：19)。
与通过CD可观察到的下调状态相比，更明确的螺旋组构和构象移动发生在激酶活化(上调)时。基于开关控制口袋的小分子调制可导致优势构象状态的稳定。小分子调制剂存在时得到的CD谱与不存在调制剂时得到的CD谱的相互性可用来确定小分子结合的性质，并将这种结合与常规的ATP竞争性抑制剂的结合区分开。
许多生物分析方法可为小分子提供对蛋白质的结合亲和性。采用毛细管区带电泳(CZE)的基于亲和性的筛选方法可被用于候选小分子调制剂的早期筛选阶段。可获得直接确定小分子调制剂-蛋白质相互作用的Kd(解离常数)。(Heegaard，N.H.H.；Nilsson，S.；Guzman，N.A.；Affinity capillary electrophoresis：importantapplication areas and some recent developments；J.Chromatography B(1998)715：29-54；Yen-Ho Chu，Y.-H.；Lees，W.J.；Stassinopoulos，A.；Walsh，C.T.；Using Affinity Capillary Electrophoresis To Determine BindingStoichiometries of Protein-Ligand Interactions，Biochemistry(1994) 33：10616-10621；Davis，R.G.；Anderegg R.J.；Blanchard，S.G.，Iterative size-exclusion chromatography coupled with liquid chromatographic massspectrometry to enrich and ident ify tight-binding ligand from complexmixtures，Tetrahedron(1999) 55：11653-1166；Shen Hu，S.；Dovichi，N.J.；Capillary Electrophoresis for the Analysis of Biopolymers；Anal.Chem.(2002)74：2833-2850；Honda，S.；Taga，A.；Suzuki，K.；Suzuki，S.；Kakhi，K.，Determinationof the association constant of monovalent mode protein-sugar interaction bycapillary zone eletrophoresis，J.Chromatography B(1992) 597：377-382；Colton，I.J.；Carbeck，J.D.；Rao，J.；Whitesides，G.M.，Affinity CapillaryElectrophoresis：A physical-organic tool for studying interaction  inbiomolecular recognition，Electrophoresis(1998) 19：367-382。
另一种基于亲和性的筛选方法使用与候选蛋白质结合的受体荧光探针(fluoroprobe)。在这种荧光探针测定法中筛选候选小分子调制剂。通过荧光探针受体荧光性的减弱可测量结合蛋白质的化合物。该方法描述在下面的实施例1中。
本发明还提供了小分子调制剂-蛋白质加合物。这种类型的蛋白质以前已被定义。就调制剂而论，它们应该具有与开关控制口袋区域内的活性残基互补的官能团，以使调制剂-蛋白质的结合最大化。例如，在激酶情况下，已发现具有1-3个二羰基键的调制剂通常是有用的。当发现具有阳离子性质的开关控制口袋时，小分子调制剂通常是有酸性官能团或部分，例如磺酸基、磷酸基或羧酸基。就分子量而言，优选的调制剂的分子量通常约为120-650 Da，更优选约为300-550 Da。如果要在全细胞环境中研究这些小分子调制剂，它们的特性应当与很好理解的原则相一致，即优化用于细胞穿透性的小分子调制剂(Lipinski’s Rule of 5，Advanced Drug DeliveryReviews，卷23，1-3期，pp 3-25(1997))。
本发明还提供了改变蛋白质生物活性的方法，该方法一般包括首先提供具有开关控制口袋的天然产生的蛋白质的步骤。然后在一定条件下使这种蛋白质与非天然产生的分子调制剂接触以使调制剂在口袋区域与蛋白质结合，以便通过诱导或限制蛋白质的构象而至少部分调节蛋白质的生物活性。
以下实施例列出了本发明的代表性方法。然而应该理解，这些实施例是通过说明提供的，而不应作为对本发明总范围的限制。
                             实施例1
在该实施例中，说明了鉴别和/或开发小分子的技术，所述小分子将与形成天然产生的蛋白质一部分的开关控制口袋区域相互作用，以在体内调节蛋白质的生物活性。具体地，用本发明的方法分析了已知的激酶蛋白质家族，即abl、p38-α、Gsk-3β、胰岛素受体-1、蛋白激酶B/Akt和转化生长因子B-1受体激酶。
步骤1：激酶蛋白质内的开关控制配体的鉴别和分类
通常，如果存在足够详细的特征信息，便可用各自激酶的序列和结构数据鉴别激酶的开关控制配体。因此，该方法的这一步骤无需试验便可完成。用已知的激酶数据容易鉴别瞬时可修饰的氨基酸残基，这在这些蛋白质被磷酸化或酰化修饰的情况下。然后可推论出完整的开关控制配体序列的可能范围。对激酶而言，另一个有用的因数是通常从残基的DFG序列(文中使用单字母氨基酸编码)开始的配体。abl激酶
全长BCR-Abl序列在这里用SEQ ID NO.34表示。abl激酶和bcr-abl融合蛋白激酶的一个开关控制配体序列由以下序列构成：D381、F382、G383、L384、S385、R386、L387、M388、T389、G390、D391、T392、Y393、T394、A395、H396(配体1)(SEQ ID NO.1)。Y393在(bcr)abl活化时通过上游调节激酶或通过自发磷酸化而变为磷酸化，从而是瞬时修饰的残基(Tanis等，Moleulcar and Cellular Biology(2003)23：3884；Brasher和Van Etten，The Journal of Biological Chemistry(2000)275：35631)。开关控制配体序列开始于DFG并以H396结束。
另一种开关控制配体具有序列Myr-
G2Q3Q4PSG6K7V8L9G10D11Q12R13R14P15S16L17(配体2)(SEQ ID NO.2)。对abl激酶同种型1B特异的配体2是abl蛋白质序列的N-末端帽，尤其是位于G2(甘氨酸2)的N-末端肉豆蔻酰基团(Jackson和Baltimore，(1989)EMBOJournal 8：449；Resh，Biochem Biophys.Acta(1999)1451：1)。
p38-α激酶
p38-α激酶的开关控制配体序列(SEQ ID NO.3)由以下序列构成：D168、F169、G170、L171、A172、R173、H174、T175、D176、D177、E178、M179、T180、G181、Y182、V183、A184、T185、R186、W187、Y188、R189(SEQ ID NO.4)。T180和Y182在p38-α活化时通过上游调节激酶变为磷酸化(参见Wilson等，Chemistry & Biology(1997)4：423以及其中提到的参考资料)，由此是瞬时可修饰的残基。
Gsk-3β激酶
全长Gsk-3β激酶序列在这里用SEQ ID No.32表示。Gsk-3β激酶序列相应于1GNG晶体结构(在这里用SEQ ID NO.33表示)。Gsk-3β激酶蛋白质的开关控制配体序列由以下序列构成：D200、F201、G202、S203、A204、K205、Q206、L207、V208、K209、G210、E211、P212、N213、V214、S215、Y216、I217、C218、S219、K220(Gsk配体1)(SEQ ID NO.5)；Y216在活化时通过上游调节激酶变为磷酸化(Hughes等，觑EMBOJournal(1993)12：803；Lesort等，Journal of Neurochemistry(1999)72：576；ter Haar等，Nature Structural Biology(2001)8：593以及其中提到的参考资料。
另一种开关控制配体序列是：G3、R4、P5、R6、T7、T8、S9、F10、A11、E12(Gsk配体2)(SEQ ID NO.6)；S9通过上游激酶PKB/Akt的作用变为磷酸化(Dajani等，Cell(2001)105：721)Cross等，Nature(1995)378：785)。S9是瞬时可修饰的残基。
胰岛素受体激酶-1
全长IRK-1基因在这里用SEQ ID NO.35表示。其序列相应于1GAG晶体结构(在这里用SEQ ID NO.36表示)。需要注意的是，至少SEQ ID NO：36中的第一个残基不同于SEQ ID NO：35。胰岛素受体激酶-1的开关配体序列由以下序列构成：D1150、F1151、G1152、M1153、T1154、R1155、D1156、11157、Y1158、E1159、T1160、D1161、Y1162、Y1163、R1164、K1165、G1166、G1167、K1168、G1169、L1170(SEQIDNO.7)。Y1158、Y1162和Y1163是瞬时可修饰的残基，并通过胰岛素活化胰岛素受体时变为磷酸化(参见Hubbard等，EMBO Journal(1997)16：5572以及其中提到的参考资料)。
蛋白激酶B/Atk
全长Atkl序列在这里用SEQ ID NO.37表示。唯一的蛋白激酶B/Akt激酶结构域在这里用SEQ ID NO.38表示。需要注意的是，这些序列在N和C末端是不同的。此外，唯一的激酶结构域开始于全长序列的残基143。蛋白激酶B/Atk的开关控制配体由以下序列构成：P468、H469、F470、P471、Q472、F473、S474、Y475、S476、A477、S478(SEQ ID NO.8)。S474是瞬时可修饰的残基，它在通过上游激酶调节蛋白活化时是磷酸化的，从而使PKB/Ptk活性比未磷酸化的PKB/Atk提高1000倍(Yang等，Molecular Cell(2002)9：1227以及其中提到的参考资料)。
转化生长因子B-1受体激酶
TGF-B-I受体激酶的全长序列在这里用SEQ ID NO.39表示。转化生长因子B-1受体激酶的开关控制配体是T185、T186、S187、G188、S189、G190、S191、G192、L193、P194、L185、L196(SEQ IDNO.9)。T185、T186、S187、S189和S191是瞬时可修饰的残基，并在通过转化生长因子B-11受体的激酶活性活性时是被部分或全部磷酸化(Wrana等，Nature(1994)370：341；Chen和Weinberg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：1565)。
步骤2：开关控制口袋的鉴别和分类
当鉴别开关控制配体时，可从公布的激酶数据，尤其是通过X射线晶体学结构分析推论出互补的开关控制口袋。该分析中最初的步骤是鉴别可与以前鉴别的相应的开关控制配体内的瞬时可修饰的残基结合的残基。
abl激酶
abl激酶(SEQ ID NO.30)的X射线晶体结构分析揭示了可能的开关控制口袋序列，基于结构1FPU(SEQ ID NO.10)(Schlindler等，Science(2000)289：1938)和1IEP(SEQIDNO.11)(Nagar等，Cancer Research(2002)62：4236)。开关控制口袋序列与这种激酶以前鉴别的开关控制配体1序列互补，并具有2个碱性氨基酸的簇，它来自α-C螺旋(残基279-293)和催化环(残基359-368)的组合。具体的，α-C螺旋的赖氨酸285和催化环的精氨酸362形成了开关控制口袋的一部分，由于这些残基稳定了来自开关控制配体的瞬时修饰的(磷酸化)残基Y393的结合。有助于开关控制口袋的其它预计的氨基酸残基包括来自富含甘氨酸的环的残基(残基253-279)、N-页(N-lobe)(残基271)、β-5链(残基313-318)、来自α-C螺旋的其它氨基酸(残基280-290)和来自催化环的其它氨基酸(残基359-368)。另外，预计C-页(C-lobe)残基401或416形成了这种口袋的基础。
表1说明形成(bcr)abl激酶的配体1的开关控制口袋的蛋白质序列的氨基酸。氨基酸残基位置的所有参考是相对于全长蛋白质而不是相对于从全长蛋白质第223位开始的SEQ ID NO：30。
                                          表1
  富含甘氨酸的环   N-页   B-5β链
  Y253   D276   E279   K271   I313   T315   E316
  M278   F317   M318
  α-C螺旋
  V280   E281   E282   F283   L284   K285   E286   A287   A288
  V289   M290
  α-E螺旋   F359
  催化环
  F359   I360   H361   R362   D363   N368
  C-页
  F401   F416
abl激酶的X射线晶体结构分析揭示了可能的开关控制口袋序列，基于结构10PL(SEQ ID NOS.12和13)，它与配体2互补。分析abl激酶同种型1B的X射线晶体结构10PL揭示了这种可能的开关控制口袋(Nagar等，Cell(2003)112：859)。
表2说明形成与(bcr)abl激酶配体2互补的开关控制口袋的蛋白质序列的氨基酸。
                  表2
          SH2结构域和C-页螺旋
              开关控制口袋
  α-A螺旋
  S152   R153   N154   E157   Y158
  α-E螺旋
  A356   L359   L360   Y361
  N-页环
  N393
  α-F螺旋
  L448   A452   Y454
  α-H螺旋
  C483   P484   V487   E481
  α-I螺旋
  E513
  I-I’环
  F516   Q517
  α-I’螺旋
  1521   V525   L529
p38-α激酶
p38-α激酶(SEQ ID NO.31)的X射线晶体结构分析揭示了可能的开关控制口袋，基于结构1KV2(SEQ ID NO.14)(Pargellis，等；Nat.Sctruct，Biol.9 pp.268-272(2002)。以前鉴别的开关控制配体序列的开关控制口袋具有2个碱性氨基酸的簇，它来自α-C螺旋(残基61-78)和催化环(残基146-155)的组合。具体地，精氨酸67和/或精氨酸70来自α-C螺旋，精氨酸149来自催化环。有助于开关控制口袋的其它预计的氨基酸包括来自富含甘氨酸的环的残基(残基34-36)、来自α-C螺旋的氨基酸(残基61-78)和来自催化环的氨基酸(残基146-155)。另外，来自C-页残基197-200的氨基酸形成了这种口袋的基础。
表3说明形成开关控制口袋的蛋白质序列的氨基酸。
                                           表3
  富含甘氨酸的环
  Y35
  α-C螺旋
  I62   I63   K66   R67   R70   E71   L74   L75   M78
  催化环
  I146   I147   H148   R149   D150
  C-页
  W197   M198   H199   Y200
Gsk-3β激酶
gsk-3β激酶的X射线晶体结构分析揭示了开关控制口袋，基于结构1GNG(SEQ IDNO.15)、1H8F(SEQ ID NOS.16和17)、1109(SEQ ID NO.18)和109U(SEQ ID NOS.28和29)(Frame等，Molecular Cell，卷7，pp.1321-1327(2001)；Dajani等，Cell，卷105，pp.721-732(2001)；Dajani等，EMBO Journal，卷22，pp.494-501(2003)；和ter Haar等，Nature Structural Biology，卷8，pp.593-596(2001)。与上述鉴别的开关控制配体序列1和2相对应的开关控制口袋具有2个碱性氨基酸的簇，它来自α-C螺旋(残基96-104)和催化环(残基177-186)的组合。具体地，精氨酸96来自α-C螺旋，精氨酸180来自催化环。有助于开关控制口袋的其它预计的氨基酸包括来自富含甘氨酸的环的残基(残基66-68)、来自α-C螺旋的氨基酸(残基90-104)和来自催化环的氨基酸(残基177-186)。另外，来自C-页残基233-235的氨基酸形成了这种口袋的基础。
表4说明形成开关控制口袋的蛋白质序列的氨基酸。
                          表4
  富含甘氨酸的环
  F67
  α-C螺旋
  R96   I100   M101   L104
  催化环
  I177   C178   H179   R180   D181   N186
  C-页
  D233   Y234   T235
胰岛素受体激酶-1
胰岛素受体激酶-1的X射线晶体结构分析揭示了开关控制口袋，基于结构1GAG(SEQ ID NO：19和20)和1IRK(SEQ ID NO：21)(Parang等，Nat.StructuralBiology，8，p.37(2001)；Hubbard等，Nature，372，p.476(1994)。所述开关控制配体序列的开关控制口袋具有2个碱性氨基酸的簇，它来自α-C螺旋(残基1037-1054)和催化环(残基1127-1137)的组合。具体地，精氨酸1039来自α-C螺旋，精氨酸1131来自催化环。有助于开关控制口袋的其它预计的氨基酸包括来自富含甘氨酸的环的残基(残基1005-1007)、来自α-C螺旋的氨基酸(残基1037-1054)和来自催化环的氨基酸(残基1127-1137)。另外，来自C-页残基1185-1187的氨基酸形成了这种口袋的基础。
表5说明形成开关控制口袋的蛋白质序列的氨基酸。
                                      表5
  富含甘氨酸的环
  F1007
  α-C螺旋
  R1039   E1043   F1044   N1046   E1047   V1050   M1051   F1054
  催化环
  F1128   V1129   H1130   R1131   D1132
  C-页
  V1185   F1186   T1187
蛋白激酶B/Akt
蛋白激酶B/Akt的X射线晶体结构分析揭示了开关控制口袋，基于结构IGZK(SEQID NO.22)、1GZO(SEQ ID NO.23)和IGZN(SEQ ID NO.24)(Yang等，Molecular Cell(2002)9：1227)。相应的开关控制配体序列的开关控制口袋由来自B-螺旋(残基185-190)、C螺旋(残基194-204)和β-5链(残基225-231)的氨基酸残基构成。具体地，精氨酸202来自C-螺旋。
表6说明形成蛋白激酶B/Akt的开关控制口袋的蛋白质序列的氨基酸。
                                  表6
  αB-螺旋
  K185   E186   Y187   I188   I189   A190
  αC-螺旋
  V194   A195   H196   T197   V198   T199   E200   S201
  R202   V203   L204
  B5链
  L225   C226   F227   V228   M229   E230   Y231
转化生长因子B-1受体激酶
转化生长因子B-I受体激酶的X射线晶体结构分析揭示了开关控制口袋，基于结构1B6C(SEQ ID NO.25)(Huse等，Cell(1999)96：425)。开关控制口袋由来自GS-1螺旋、GS-2螺旋、N-页残基253-266和α-C螺旋残基242-252的氨基酸残基构成。
表7说明形成TGF B-1受体激酶的开关控制口袋的蛋白质序列的氨基酸。
                               表7
  GS-1螺旋
  Y182   I181
  GS-2螺旋
  Q198
  N-页
  M253   L254   R255   F262   I263   A264   A265   D266
  α-C螺旋
  W242   F243   A246   Y249   Q250   V252
第二种开关控制口袋存在于TGF B-1受体激酶中。这种开关控制口袋类似于上述(bcr)abl(表1)、p38-α激酶(表3)和gsk-3β激酶(表4)口袋。虽然TGFB-1不含有明显互补的开关控制配体与这种口袋匹配，但这种口袋在进化上是保守的，并可用于结合小分子开关控制调制剂。这种口袋是由来自富含甘氨酸的环、α-C螺旋、催化环、开关控制配体序列和C-页的残基构成的。
表8说明形成这种开关控制口袋的蛋白质序列的氨基酸
                                表8
  富含甘氨酸的环
  R215   F216
  -Lobe
  F234   R237
  α-C螺旋
  R244   S241   I248   V252
  催化环
  I329   A330   H331   R332   D333   L334
  开关控制配体序列
  D351   L352   G   L   A   V   R   H
  D351   S   A   T   D   T   I   D
  I   A   P   N   H   R   V
  C-页
  H392   F393   E394
第三种开关控制口袋在空间上位于ATP结合口袋和α-C螺旋之间，由来自表9中所鉴别的残基构成。这种口袋是作为结合抑制蛋白FKBP12(SEQ ID NO.26)的“闭合形式”(closed form)的αC螺旋变形的结果提供的(参见Huse等，Molecular Cell(2001)8：671)。
表9说明第三种开关控制口袋的序列。
                                  表9
  富含甘氨酸的环
  F216   G217   V219
  N-页
  K232   F234   S235   S236   L254   I259   L260   G261
  F262   L276   L278   S280
  α-C螺旋
  E245   A246   I248   Y249   V252
步骤3.确定开关控制配体-开关控制口袋相互作用的性质，并鉴别小分子设计的合适基因座。
1.一般的计算方法。开关控制口袋和开关控制口袋/配体相互作用的计算机辅助设示意图用SurfNet的改进形式(Laskowsi，R.A，J.Mol.Graph.，1995，13，323；PASS；G.Patrick Brady，G.P.Jr.；Stouten，P.F.W.，J.Computer-Aided Mol.Des.2000，14，383，Voidoo，G.J.Kleywegt和T.A.Jones(1994)Acta Cryst D50，178-185； http：// www.iucr.ac.uk/journals/acta/tocs/actad/1994/actad5002.html；和Squares；Jiang，F.；Kim，S.-H.；“‘Soft-docking’”：Matching of Molecular Surface Cubes”，J.Mol.Biol.1991，219，79)和同用于口袋显像的GRASP并联(http：//trantor.bioc.columbia.edu/grasp/)。采用SoftDock(http：//www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock/；Morris，G.M.；Goodsell，D.S.；Halliday，R.S.；Huey，R.；Hart，W.E.；Belew，R.K.；Olson，A.J，J.Computational Chemistry，1998，19，1639)和Dock[http：//www.cmpharm.ucsf.edu/kuntz/dock.html；Ewing，T.D.A.；Kuntz，I.D.，J.Comp.Chem.1997，18，1175]以及基于AMBER[http：//www.amber.ucsf.edu/amber/amber.html]在合适时约束分子动态，以便将小分子化学型淘选和停靠(Panning and docking)入这些假设的位点。
口袋分析程序使用的一般方法是确定间隙区域并用这些区域来决定蛋白质表面上可得到何种溶剂可接近的洞。间隙区域或基于球形或基于正方形，首先用球形或正方形(完整的和截短的)填充两个或多个原子之间的区域来确定，然后用这些来计算3D密度图谱，当与其轮相符时便可确定间隙区域的表面。根据Surfnet用户手册，所示一般方法对球形的定义如下：
a.两个原子，A和B，具有一个置于其van der Waals表面中间并恰好与每个原子接触的试验间隙球(trial gap sphere)。
b.然后依次考虑相邻的原子。如果有任何原子穿过间隙球，则减小实验间隙球的半径直到它恰好接触挤入的原子。该过程被重复直到已考虑所有的相邻原子。如果所述球的半径小于预定的最小限度(通常1.0A)它被排斥。否则将保留最终的间隙球。
c.继续该过程直到已考虑所有原子，且间隙区域用球填充。
d.然后采用高斯函数用球来校正格点的3D阵列上的点。
e.校正的结果是，当以100.0的等值水平将格画等值线时，所得3D表面与每个间隙球相对应。
f.当所有的球都已校正格，最终的3D轮廓代表了互穿的间隙球的表面，从而确定了含有表面口袋的原子口袋基团的范围。
影响口袋分析的因素包括格点的间隔、所采用的等值水平以及用来包装间隙的球半径的最小和最大限度。通常，开关控制口袋的大小和性状被描述为通过覆盖由各个单独程序确定的计算开关控制口袋而发现的共有口袋。
如上所述，发现形成了一个开关控制配体与一个或多个开关控制口袋的相互作用，被称为“复合开关口袋”。这种复合开关口袋具有一个序列，包括取自开关控制配体和开关控制口袋的氨基酸残基。
在其它情况下，开关控制口袋或复合开关控制口袋可与一活性位点口袋(例如，激酶的ATP口袋)重叠产生一个“组合开关控制口袋”。这些组合开关控制口袋也可被用作结合作为开关控制抑制剂的小分子的基因座。
当然，对复合开关口袋和组合开关口袋的分析是用上文所述的相同技术连同开关控制口袋一起进行的。
abl激酶
口袋分析的SURFNET图在图10中说明。开关控制口袋用淡蓝色突出显示。该开关控制口袋的GRASP图在图11中说明，其中圈出了蛋白质的复合口袋区域。图12说明构成(bcr)abl激酶复合开关控制口袋的关键氨基酸氨基酸残基。构成复合口袋的氨基酸残基由先前鉴别的开关控制是由配体和开关控制口袋提供的。复合开关控制口袋的示意图列于图6中。
构成复合口袋的特定氨基酸残基列在表10中。
                                      表10
  富含甘氨酸的环   N-页   B-5β链
  Y253   D276   E279   K271   I313   T315   E316
  M278   F317   M318
  α-C螺旋
  V280   E281   E282   F283   L284   K285   E286   A287   A288
  V289   M290
  α-E螺旋   F359
  催化环
  F359   I360   H361   R362   D363   N368
  开关控制配体序列
  D381   F382   G383   L384   S385   R386   L387   M388   T389
  G390   D391   T392   Y393   T394   A395   H396
  C-页   α-F螺旋
  F401   F416
为该复合开关控制口袋设计的最初的小分子集中于化学探针，它可结合取自N-页β链残基(M278)、α-C螺旋(E282、K285)、α-E螺旋(F359)、催化环(I360、H361、R362、D363、N368)、开关控制配体序列(R386、L387、Y393)、C-环残基(F401)和α-F螺旋(F416)的氨基酸。利用这种复合开关控制口袋可设计锚入(bcr)abl激酶复合开关控制口袋的抑制剂。
为筛选而选择的代表性的化合物是N-(4-甲基-3-(4-苯基嘧啶-2-基氨基)苯基)-L-4-(2-氧代-4-苯基-噁唑烷基-3-羰基)苯甲酰胺。
图13说明构成(bcr)abl激酶组合开关控制口袋的关键氨基酸残基。构成该组合口袋的氨基酸残基由先前鉴别的开关控制配体、开关控制口袋和ATP活性位点提供。组合开关控制口袋的示意图列于图7中。
构成所述组合口袋的特定氨基酸残基列在表11中。
                                         表11
  富含甘氨酸的环   N-页   B-5β链
  Y253   D276   E279   K271   1313   T315   E316
  F317   M318
  α-C螺旋
  V280   E281   E282   F283   L284   E286   A287   A288   V289
  V290
  催化环
  F359   I360   H361   R362   D363
  开关控制配体序列
  D381   F382   G383   L384   S385   R386   L387   M388   T389
  G390   D391   T392   Y393   T394   A395   H396
  C-页   α-F螺旋
  F401   F416
  ATP口袋
  K247   L248   G249   Q252   Y253   G254   E255   V256   Y257
  E258   G259   V299   Q300   L301   G303   T315   E316   F317
  M318   T319   G321   N322
利用这种组合开关控制口袋可设计锚入(bcr)abl激酶组合开关控制口袋的抑制剂。
为筛选而选择的代表性的化合物包括：N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-4-(l，1，3-三氧代-[1，2，5]噻二唑烷-2基甲基)-苯甲酰胺；-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-D-4-(2-氧代-4-苯基-噁唑烷基-3-羰基)苯甲酰胺；-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-L-4-(2-氧代-4-苯基-噁唑烷基-3-羰基)苯甲酰胺；-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-基氨基)-苯基]-4-(4，4-二氧代-4-硫代吗啉代甲基)苯甲酰胺；和N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-((l-甲基-3，5-二氧代-1，2，4-三唑烷-4-基)甲基)苯甲酰胺。
p38-α激酶
口袋分析的SURFNET图在图14中说明。复合开关控制口袋用淡蓝色突出显示。该复合开关控制口袋的GRASP图在图15中说明。
图16说明构成p38-α激酶复合开关控制口袋的关键氨基酸氨基酸残基。这些氨基酸取自富含甘氨酸的环(Y35)、α-C螺旋(I62、I63、R67、R70、L74、L75、M78)、α-D螺旋(I141、I146)、催化环(I147、H148、R149、D150、N155)、N-页链(L167)、开关控制配体序列(D168、F169)和α-F螺旋(Y200)。构成所述复合口袋的特定氨基酸残基列在下表中：
表12说明形成复合开关控制口袋的蛋白质序列的氨基酸。
                                     表12
  富含甘氨酸的环
  Y35
  α-C螺旋
  I62   I63   K66   R67   R70   E71   L74   L75   M78
  催化环
  146   I147   H148   R149   D150
  开关控制配体序列
  D168   F169   G170   L171   A172   R173   H174   T175   D176
  D177   E178   M179   T180   G181   Y182   V183   A184   T185
  R186   W187   Y188   R189
  C-页
  W197   M198   H199   Y200
利用这种复合开关控制口袋可设计锚入p38-α激酶的这种开关控制口袋的抑制剂。
代表性的化合物包括：3-14-[3-叔-丁基-5-(3-(4-氯苯基)脲基-1H-吡唑-1-基)苯基]丙酸；3-{4-[3-叔-丁基-5-(3-(萘-1-基)脲基)-1H-吡唑-1-基]苯基}丙酸；3-(3-{3-叔-丁基-5-[3-(4-氯苯基)脲基]-1H-吡唑-1-基)苯基)丙酸；3-(3-{3-叔-丁基-5-[3-(萘-1-基)脲基]-1H-吡唑-1-基)苯基丙酸；1-{3-叔-丁基-1-[3-(氨基甲酰基甲基)苯基)-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲；和1-{3-叔-丁基-1-[3-(2-吗啉代-2-氧代乙基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(萘-1-基)脲。
Gsk-3β激酶
口袋分析的SURFNET图在图17中说明。复合开关控制口袋用淡蓝色突出显示。该复合开关控制口袋的GRASP图在图18中说明。
图19说明构成gsk-3β激酶复合开关控制口袋的关键氨基酸氨基酸残基。这些碱基来自富含甘氨酸的环(F67)、α-C螺旋(R96、I100、M101、L104)、α-D螺旋(I141、I146)、催化环(I177、C178、H179、R180、D181、N186)、开关控制配体序列(D200、F201、S203、K205、L207、V208、P212、N213、V214、Y216)和α-F螺旋(Y200)。利用这种口袋可设计锚入gsk-3β激酶的这种复合开关控制口袋的小分子调制剂化合物。
表13中说明的复合口袋是一种双功能开关控制口袋。当其与互补配体序列1(Gsk配体1)结合时，所述口袋作为上调蛋白质活性的开-口袋。或者，当其与互补配体序列2(Gsk配体2)结合时，所述口袋作为下调蛋白质活性的关-口袋。
表13说明形成复合开关控制口袋的蛋白质序列的氨基酸。
                                     表13
  富含甘氨酸的环
  F67
  α-C螺旋
  R96   I100   M101   L104
  催化环
  I177   C178   H179   R180   D181   N186
  开关控制配体序列
  D200   F201   G202   S203   A204   K205   Q206   L207   V208
  R209   G210   E211   P212   N213   V214   S215   Y216   I217
  C218   S219   R220
  C-页
  D233   Y234   T235
步骤4：表达和纯化静态地限制于不同开关控制状态的蛋白质
基因合成。基因全部是采用Emerald/deCODE genetics，Inc提供的软件(GeneBuilderTM)从具有最佳密码子使用的合成寡核苷酸制备的。整个基因合成能使基因的最佳密码子式样迅速合成。限制性位点的战略置换有助于迅速涵盖所需的其它突变。
蛋白质是在杆状病毒感染的昆虫细胞或在大肠杆菌表达系统中表达的。基因任选被通过掺入亲和标记进行修饰，这样通常可对标记的蛋白质进行一步抗体亲和纯化。构建物最佳供可结晶性、配体相互作用、纯化和密码子使用。使用了两个每月产量超过100L的11L的Wave生物反应器来培养昆虫细胞。
蛋白质纯化。对于蛋白质纯化，可使用AKTA提纯器、AKTA FPLC、Parr氮气气蚀弹(Parr Nitrogen Cavitation Bomb)、EmulsiFlex-C5匀浆器和Protein MakerTM蛋白质制造器(Emerald的自动平行纯化系统)。鉴定纯化的蛋白质的装置包括荧光光谱、MALDI-ToF质谱和动态光散射。
通过氮气气蚀、弗氏压碎或微流体来破碎全细胞浆。用Protein MakerTM装置对提取物进行平行蛋白质纯化。Protein Maker是由Emerald开发的一种机器装置，它可平行运转多个柱(包括Glu-mAb、金属螯合物、Q-seph、S-Seph、苯基-Seph和Cibacron Blue)同时进行纯化。组分通过SDS-PAGE分析。对纯化的蛋白质进行许多生物物理测定(动态光散射、UV吸收、MALDI-ToF、分析型凝胶过滤等)以定量纯度的水平。
abl激酶
对Abl构建物1(激酶结构域、6xHis-TEV标记、残基248-534)、Abl构建物2(激酶结构域、Glu-6xHis-TEV标记、残基248-518)、abl构建物3(激酶结构域、Glu-6xHis-TEV标记、残基248-518、Y412F突变体)、abl构建物4(具有K29R/E30D突变的同种型1B 1-531、TEV-6xHis-Glu)和abl构建物5(具有K29R/E30D/Y412F的同种型1B 1-531)完成全基因分析和亚克隆并在昆虫细胞中进行转染。用类似的方法制备Bcr-abl构建物1(Glu-6xHis-TEV标记、残基1-2029)和bcr-abl构建物2(Glu-6xHis-TEV标记、残基1-2029；Y412F突变体)并转染入昆虫细胞。任选在ATP竞争性抑制剂PD 180790或Gleevec存在时进行Fernbach转染培养以确保产生的(bcr)Abl蛋白在Y245或Y412上未被磷酸化(参见Tanis等，Molecular Cell Biology，卷23，p3884，(2003)；Van Etten等，Journal of Biological Chemistry，卷275，p35631，(2000))。通过免疫沉淀和SDS-Page确定蛋白质表达水平。abl构建物1和2的蛋白质表达水平超过10mg/L。对这些抑制剂存在时表达的纯化的蛋白质进行Py20(抗磷酸酪氨酸抗体)Western印迹以确保Y245或Y412未被磷酸化。
图20和21说明在镍亲和层析(图20)和随后的POROS HQ阴离子交换层析(图21)之后PD180970存在时表达的abl-构建物2的纯度。图22显示了来自镍亲和层析的abl构建物2的洗脱图形，图23描述了来自POROS HQ阴离子交换层析的Abl构建物2的洗脱图形。这种形式的abl处于其未磷酸化的生理状态。
图24说明用tev蛋白酶处理以除去Glu-6xHis-TEV亲和标记之后Abl构建物2的洗脱图形。组分17-19包含具有完整Glu-6xHis-TEV标记的abl蛋白质，而组分20-23包含已除去Glu-6xHis-TEV标记的abl蛋白质。对合并的组分20-23进行UV分析(图25)显示最大吸收在360nm，这说明ATP竞争性抑制剂PD 180970仍与abl ATP口袋结合，从而确保abl蛋白质在表达和纯化过程中保持其未磷酸化的状态。
图26说明通过镍亲和层析和Q-琼脂糖层析纯化时abl构建物5(蛋白质abl1-531、Y412F突变体)的洗脱图形。图27说明对纯化的合并组分进行SDS-Page分析的结果。
p38-α激酶
对p38-α激酶构建物1(6xHis-TEV标记，全长)或构建物2(Glu-6xHis-TEV标记，残基5-354)完成全基因分析，并采用阿拉伯糖可诱导的启动子和T7启动子载体在大肠杆菌中表达蛋白质。用0.5M IPTG(pET15b)或0.2％阿拉伯糖(pBAD)诱导后检测p38-α激酶在两个表达载体(pETl 5b和pBAD)中的表达。通过免疫沉淀和SDS-Page检测蛋白质表达。通过与抗-GLU单克隆抗体免疫沉淀可清楚证明诱导后p38-α在pBAD构建物中的表达。
图28说明Q-琼脂糖层析时p38-α蛋白质的洗脱图形。对合并的纯化的组分进行SDS-Page的结果在图29中说明。
Gsk-3β激酶
对构建物1(6xHis-TEV标记，全长，与1H8F蛋白质序列相同)、构建物2(10xHis，残基27-393，与1GNG蛋白质序列相同)和构建物3(Glu-6xHis-TEV标记，残基35-385)完成全基因分析。在昆虫细胞中进行转染。通过免疫沉淀和SDS-Page确定蛋白质表达。构建物3的表达水平超过5mg/L。对gsk-3β蛋白质的纯化包括能够从相同的表达运转中分离开关控制配体未磷酸化的激酶(GSK-P)和开关控制配体磷酸化的激酶(GSK+P)两种形式。在20mM HEPES缓冲液(pH7.5)中进行镍亲和层析。这一步骤之后进行POROS HS(阳离子交换)层析。图30说明GSK+P蛋白质的MALDI-TOF谱，表明预期的分子离子为42862Da。图31说明GSK-P蛋白质的MADLI-TOF谱，表明预期的分子离子为42781。
图32和33说明通过SDS-Page分析结合抗磷酸酪氨酸抗体PY-20染色分析POROSHS层析组分的结果。组分10-15用PY-20抗体显像，表明开关控制配体酪氨酸残基上存在磷酸。组分17-29通过PY-20抗体不显像，表明不存在酪氨酸的开关控制配体的磷酸化。
步骤5.用候选小分子开关控制调制剂筛选纯化的蛋白质
P38-α激酶筛选/P38 MAP激酶结合测定
以SKF 86002作为荧光探针，基于已公布的方法进行修改(C.Pargellis等，NatureStructural Biology(2002)9，268-272；J.Regan等，J.Med Chem.(2002)45，2994-3008)，采用竞争测定确定了p38 MAP激酶小分子调制剂的结合亲和性。简言之，SKF 86002，p38激酶的有效抑制剂(Kd＝180nM)，当其与激酶结合在340nm处激发时显示约420nm的发射荧光。因此，p38激酶抑制剂的结合亲和性可通过其减弱SKF 86002荧光的能力来测定。SKF 86002是一种荧光探针试剂，作为p38-α激酶ATP活性位点口袋完整性的报告分子。结合入p38-α激酶开关控制口袋的小分子调制剂将改变蛋白质的构象，从而阻断荧光探针SKF 86002的结合能力。因此，小分子阻断荧光探针结合的能力提供了一个与开关控制口袋结合的试验读出。进行对照试验来确定小分子调制剂不与荧光探针结合直接竞争而在ATP口袋上竞争。该试验在Polarstar Optima平板阅读器(BMG)上的384平板(Greiner核384平板)上进行。通常，反应混合物含有1μM SKF 86002、80nM p38激酶和各种浓度的抑制剂，在含有0.15％(w/v)正-辛基葡糖苷和2mM EDTA的20mM二-三丙烷缓冲液(pH 7)中，最终体积为65μl。通过加入酶引发反应。将平板在室温(约25℃)下培育2小时，然后在420nm的发射处阅读并在340nm处激发。通过将rfu(相对荧光单位)值与对照(无小分子调制剂)比较，计算出各个浓度的小分子的抑制百分比。采用Prism，从一定浓度范围的小分子调制剂获得的百分抑制值计算出IC50值。当评定时间依赖型抑制时，在多个反应时间如0.5、1、2、3、4和6小时时阅读平板。在各个时间点计算IC50值。如果IC50值随反应时间而降低(在4小时内超过2倍)则抑制被认为是时间依赖的。
                   表14
  实施例编号   IC50，nM   时间依赖的
  1   292   是
  2   997   否
  2   317   否
  3   231   是
  4   57   是
  5   1107   否
  6   238   是
  7   80   是
  8   66   是
  9   859   否
  10   2800   否
  11   2153   否
  12   约10000   否
  13   384   是
  15   949   否
  19   约10000   否
  21   48   是
  22   666   否
  25   151   是
  26   68   是
  29   45   是
  30   87   是
  31   50   是
  32   113   是
  37   497   否
  38   508   否
  41   75   是
  42   373   否
  43   642   否
  45   1855   否
  46   1741   否
  47   2458   否
  48   3300   否
  57   239   是
反应时间为2小时时获得的IC50值
步骤6.确定蛋白质调制的开关控制机制
通过生化研究来测定发现对蛋白质具有亲和性或对蛋白质活性具有功能性调制的小分子，以确定结合或功能性调制与天然配体位点(例如激酶蛋白质的ATP位点)是非竞争性或反竞争性的。这是采用标准Lineweaver-Burk型分析完成的。
开关控制调制剂与各种蛋白质的结合模式是通过X射线晶体学或NMR技术确定的。以下部分列出了用来确定结合的分子模式的X射线晶体学技术。
用X射线晶体学技术确定蛋白质调制的开关控制机制。
1.结晶实验室：使用用户定制的数据库软件捕获所有结晶试验数据，该软件被用来驱动建立结晶试验的各种机器装置并监控结果。B.计算机硬件：Multiple Linux工作站、Windows 2000服务器和Silicon Graphics 02工作站。C.X射线晶体学软件：HKL2000，包括DENZO和SCALEPACK(X射线衍射数据处理)；MOSFILM；CCP4套装，包括AMORE、MOLREP和REFMAC(各种结晶计算操作，包括通过分子置换取相、MIR和MAD)；用于重原子定位的SnB；SHARP(重原子取相程序)；CNX(各种结晶计算操作，包括模型细分)；EPMR(分子置换)；XtalView(模型显示和建造)。
2.晶体生长和X射线衍射量分析：在两个或多个温度下在有和没有配体时建立稀疏矩阵和聚焦结晶屏幕。一旦获得合适的蛋白质-晶体，便可进行筛选以在R-AXIS IV成像平板系统和X-STREAM恒冷箱的各种深低温保藏条件下确定蛋白质晶体的衍射质量。具有足够衍射质量的蛋白质晶体被用于机构内部X射线衍射数据收集，或储存在液氮中并保存，供随后在Argonne国家实验室的先进光子源(Advanced PhotonSource)的COM-CAT射线束(beamline)或另一同步加速器射线束的同步加速器X射线辐射源上进行数据收集。用φ主轴设定偏离90°的至少两个衍射图象来确定蛋白质-晶体的衍射极限。在衍射图象收集期间φ主轴摆动1度。用HKL-2000序列的X-射线数据分析和还原软件处理这两个图象。蛋白质晶体的衍射分辨率被接受作为分辨壳(resolution shell)的较高分辨率限度，其中50％或更高的加标反射强度为1δ或更高。
3.X射线衍射数据收集：已收集完整数据组，完整数据组被定义为在所收集的最高分辨壳中具有至少90％的所有反射。用HKL-2000序列的X射线衍射数据处理软件处理X射线衍射数据(还原成独特的反射和强度)。
4.结构确定：使用在蛋白质数据库(PDB)中获得的一个或多个蛋白质搜索模型通过分子分子置换(MR)确定蛋白质一小分子复合物的结构。如果需要的话，采用多重同晶置换(MIR)和重原子和/或多波长反常衍射(MAD)法可简化结构确定。如果对晶体的EXAFS扫描(在没有重原子的母液或冷冻保护剂中洗涤之后)揭示了合适的重原子信号，则对浸透重原子的晶体收集MAD同步加速器数据组。用CCP4计算程序结晶套装完成对重原子衍生数据组的分析。用(|FPH|-FP|)2差异Patterson图和(|F+|-|F-|)2异常差异Patternson图鉴别重原子位点。
步骤7.重复上述步骤以改进小分子开关控制调制剂
评价发现用来调节蛋白质活性的各个小分子的亲和性并在蛋白质超家族内(例如，其它激酶，如果候选蛋白质是激酶)或蛋白质家族之间(例如，其它蛋白质家族，如磷酸酶和转录因子，如果候选蛋白质是激酶)对其它蛋白质的功能性调制。在这个筛选范例中还评价了小分子筛选文库。评估结构活性关系(SARs)，并随后将小分子设计成对候选蛋白质更有效和/或对于候选蛋白质的调制更有选择性，以便使与反靶countertarget)蛋白的相互作用最小化。
对激酶蛋白质的分析揭示了4种类型的开关控制口袋，可根据它们与互补的开关控制配体的结合模式进行分类，即：(1)稳定并结合带电荷的配体的口袋，通常由互补的开关控制配体(带电荷的配体)中的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的磷酸化形成，或由甲硫氨酸或半胱氨酸的硫原子氧化形成；(2)通过氢键或疏水相互作用(氢键/疏水配体)机制与配体结合的口袋；(3)结合具有酰化残基(酰化配体)的配体的口袋；和(4)不与配体内源性结合的口袋，但可结合非天然产生的开关控制调制剂化合物(未鉴别的配体)。此外，这四种类型的口袋可以是图1-4示意性描述的简单类型、图6的复合类型、或图7的组合类型。最后，可根据它们的开关控制功能来定义这些口袋，即所述口袋可以是开类型，它在开关控制配体相互作用时诱导生物上调的蛋白质构象，可以是关类型，它在开关控制配体相互作用时诱导生物下调的蛋白质构象，或者称为“双功能”口袋，这意味着同一个口袋在与不同的互补的开关控制配体相互作用时可作为开-口袋和关-口袋。在所有感兴趣的蛋白质(即那些通过开关控制配体序列和互补的开关控制口袋的相互作用经历构象变化的蛋白质)中都可发现这种同样的口袋光谱。
下表15还按照口袋分类和类型鉴别了步骤2和3中描述的口袋
                       表15
  蛋白质   鉴别表   开关控制口袋类型
  abl激酶   1   带电荷的配体；简单的；-开
  abl激酶   2   酰化配体；简单的；-关
  p38-α激酶   3   带电荷的配体；简单的；-开
  Gsk-3β激酶   4   带电荷的配体；简单的；-双功能
  胰岛素受体激酶-1   5   带电荷的配体；简单的；-开
  蛋白激酶B/Akt   6   带电荷的配体；简单的；-开
  转化生长因子B-1受体激酶   7   氢键/疏水的；简单的；-关
  转化生长因子B-1受体激酶   8   未鉴别的配体
  转化生长因子B-1受体激酶   9   未鉴别的配体
  abl激酶   10   带电荷的配体；复合的；-开
  abl激酶   11   带电荷的配体；组合的；-开
  p38α激酶   12   带电荷的配体；复合的；-开
  Gsk-3β激酶   13   带电荷的配体；复合的；-双功能
本发明的原则性目的是碱化设计和开发非天然产生的小分子调制剂化合物，它将在所选蛋白质一个或多个开关控制口袋区域与其结合以调节蛋白质活性。根据开关控制口袋(-开、-关或-双功能)的类型、所选调制剂化合物的性质以及调制剂化合物和蛋白质之间相互结合的类型，可用几种不同方法实现这种功能目的。
例如，所选调制剂化合物可在所选开关控制口袋区域作为开关控制配体激动剂，即所述调制剂化合物引起由天然产生的、互补开关控制配体诱导的相同类型的构象变化。因此，如果开关控制配体激动剂与开-口袋结合，结果将上调蛋白质活性，如果与关-口袋结合则发生下调。
相反，一种给定的调制剂可结合作为开关控制配体拮抗剂，即所述调制剂化合物引起由天然产生的、互补开关控制配体诱导的相反类型的构象变化。因此，如果开关控制配体拮抗剂与开-口袋结合，结果将下调蛋白质活性，如果与关-口袋结合则发生上调。
在双功能和未鉴别的配体口袋的情况下，调制剂化合物作为功能激动剂或功能拮抗剂，这取决于所得到的反应类型。
实施例2
潜在开关控制小分子的合成
以下实施例列举了尤其可用作被设计与激酶蛋白质相互作用的开关控制分子候选物的化合物的合成。在这些实施例中，用字母表示的实施例指中间体的合成，而用数字表示的实施例指最终化合物的合成。
[Boc-磺酰胺]氨基酯(试剂AA)、1，5，7，-三甲基-2，4-二氧代-3-氮杂二环[3.3.1]壬烷-7-羧酸(试剂BB)和Kemp酸酐(试剂CC)按照文献中所述的方法制备。为了解更多细节可参见Askew等；J.Am.Chem.Soc.1989，111，1082。
                             实施例A
Figure A20038011004900381
0℃下，在溶于浓盐酸(200mL)的间-氨基苯甲酸(200g，1.46mol)溶液中加入NaNO2(102g，1.46mol)水(250mL)溶液。将反应混合物搅拌1小时，然后在0℃加入溶于浓盐酸(2L)的SnCl2·2H2O(662g，2.92mol)溶液，并将反应物在室温下再搅拌2小时。将沉淀滤出并用乙醇和乙醚洗涤，得到白色固体状的3-肼基-苯甲酸盐酸盐。
将溶于乙醇(2L)的上述反应的粗物质(200g，1.06mol)和4，4-二甲基-3-氧代-戊腈(146g，1.167mol)加热回流过夜。反应溶液在真空下蒸发并通过柱层析纯化残余物，得到白色固体3-(3-叔-丁基-5-氨基-1H-吡唑-1-基)苯甲酸乙酯(实施例A，116g，40％)和3-(5-氨基-3-叔-丁基-1H-吡唑-1-基)苯甲酸(93g，36％)。1HNMR(DMSO-d6)：δ8.09(s，1H)，8.05(brd，J＝8.0Hz，1H)，7.87(brd，J＝8.0Hz，1H)，7.71(t，J＝8.0Hz，1H)，5.64(s，1H)，4.35(q，J＝7.2Hz，2H)，1.34(t，J＝7.2Hz，3H)，1.28(s，9H)。
                             实施例B
Figure A20038011004900391
0℃下，在溶于THF(100mL)的1-萘基异氰酸酯(9.42g，55.7mmol)和吡啶(44mL)溶液中加入溶于THF(200mL)的实施例A(8.0g，27.9mmol)的溶液。混合物在室温下搅拌1小时，加热至所有固体溶解，再在室温下搅拌3小时，并用水(200mL)淬灭。将沉淀滤出，用稀盐水和水洗涤，并在真空下干燥，得到白色粉末3-[3-叔-丁基-5-(3-萘-1-基)脲基]-1H-吡唑-1-基]苯甲酸乙酯(12.0g，95％)。1H NMR(DMSO-d6)：δ9.00(s，1H)，8.83(s，1H)，8.257.42(m，11H)，6.42(s，1H)，4.30(q，J＝7.2Hz，2H)，1.26(s，9H)，1.06(t，J＝7.2 Hz，3H)；MS(ESI)m/z：457.10(M+H+)。
                             实施例C
Figure A20038011004900392
0℃下，在吡啶(56mL)和THF(30mL)混合物中的实施例A(10.7g，70.0mmol)的溶液中加入4-硝基苯基4-氯苯基氨基甲酸酯(10g，34.8mmol)的THF(150mL)溶液。混合物在室温下搅拌1小时并加热直到所有固体溶解，再在室温下搅拌3小时。加入H2O(200mL)和CH2Cl2(200mL)，将水相分离并用CH2Cl2(2×100mL)提取。合并的有机层用1N NaOH、0.1N HCl和饱和盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥。在真空下除去溶剂得到3-{3-叔-丁基-5-[3-(4-氯苯基)脲基]-1H-吡唑-1-基}苯甲酸乙酯(8.0g，52％)。1H NMR(DMSO-d6：δ9.11(s，1H)，8.47(s，1H)，8.06(m，1H)，7.93(d，J＝7.6Hz，1H)，7.81(d，J＝8.0Hz，1H)，7.65(dd，J＝8.0，7.6Hz，1H)，7.43(d，J＝8.8Hz，2H)，7.30(d，J＝8.8Hz，2H)，6.34(s，1H)，4.30(q，J＝6.8Hz，2H)，1.27(s，9H)，1.25(t，J＝6.8Hz，3H)；MS(ESI)m/z：441(M++H)。
                             实施例D
Figure A20038011004900401
在-10℃氮气下，在实施例B(8.20g，18.0mmol)的THF(500mL)溶液中边搅拌边加入LiAlH4粉末(2.66g，70.0mmol)。混合物在室温下搅拌2小时，然后通过缓慢加入冰来破坏过量的LiAlH4。用稀盐酸将反应混合物酸化至pH＝7，在真空下浓缩并用EtOAc提取残余物。合并的有机层在真空下浓缩，得到白色粉末1-{3-叔-丁基-1-[3-(羟基甲基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(萘-1-基)脲(7.40g，99％)。1HNMR(DMSO-d6)：9.19(s，1H)，9.04(s，1H)，8.80(s，1H)，8.26-7.35(m，11H)，6.41(s，1H)，4.60(s，2H)，1.28(s，9H)；MS(ESI)m/z：415(M+H+)。
                             实施例E
Figure A20038011004900402
将实施例C(1.66g，4.0mmol)和SOCl2(0.60mL，8.0mmol)的CH3Cl(100mL)溶液回流3小时并在真空下浓缩，得到白色粉末1-{3-叔-丁基-1-[3-氯甲基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(萘-1-基)脲(1.68g，97％)。1H NMR(DMSO-d6)：δ9.26(s，1H)，9.15(s，1H)，8.42-7.41(m，11H)，6.40(s，1H)，4.85(s，2H)，1.28(s，9H)。MS(ESI)m/z：433(M+H+)。
                             实施例F
Figure A20038011004900411
在-10℃氮气下，在实施例C(1.60g，3.63mmol)的THF(200mL)溶液中边搅拌边加入LiAlH4粉末(413mg，10.9mmol)。将混合物搅拌2小时，过量的LiAlH4通过加冰淬灭。溶液用稀盐酸酸化至pH＝7。缓慢除去溶剂，将固体滤出并用EtOAc(200+100mL)洗涤。将滤液浓缩得到1-{3-叔-丁基-1-[3-羟基甲基]苯基}-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲(1.40g，97％)。1H NMR(DMSO-d6)：δ9.11(s，1H)，8.47(s，1H)，7.47-7.27(m，8H)，6.35(s，1H)，5.30(t，J＝5.6Hz，1H)，4.55(d，J＝5.6Hz，2H)，1.26(s，9H)；MS(ESI)m/z：399(M+H+)。
                             实施例G
将实施例F(800mg，2.0mmol)和SOCl2(0.30mL，4mmol)的CHCl3(30mL)溶液温和回流3小时。溶剂在真空下蒸发并将残余物取出置于CH2Cl2(2×20mL)中。除去溶剂后，得到白色粉末状的1-{3-叔-丁基-1-[3-(氯甲基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲(812mg，97％)。1H NMR(DMSO-d6)：δ9.57(s，1H)，8.75(s，1H)，7.63(s，1H)，7.50-7.26(m，7H)，6.35(s，1H)，4.83(s，2H)，1.27(s，9H)；MS(ESI)m/z：417(M+H+)。
                             实施例H
在0℃氮气下，在LiAlH4(5.28g，139.2mmol)的THF(1000mL)悬液中分批加入实施例A(20.0g，69.6mmol)。将反应混合物搅拌5小时，在0℃用1N HCl淬灭并将沉淀滤出，用EtOAc洗涤并将滤液蒸发得到[3-(5-氨基-3-叔-丁基-1H-吡唑-1-基)苯基]甲醇(15.2g，89％)。1H NMR(DMSO-d6)：7.49(s，1H)，7.37(m，2H)，7.19(d，J＝7.2Hz，1H)，5.35(s，1H)，5.25(t，J＝5.6Hz，1H)，5.14(s，2H)，4.53(d，J＝5.6Hz，2H)，1.19(s，9H)；MS(ESI)m/z：246.19(M+H+)。
以上反应的粗物质(5.0g，20.4mmol)被溶于无水THF(50mL)和SOCl2(4.85g，40.8mmol)，在室温下搅拌2小时，在真空下浓缩得到3-叔-丁基-1-(3-氯甲基苯基)-1H-吡唑-5-胺(5.4g)，将其加入DMF(50mL)中的N3(3.93g，60.5mmol)。将反应混合物在30℃加热2小时，倒入H2O(50mL)，并用CH2Cl2提取。将有机层合并，用硫酸镁干燥，并在真空下浓缩得到粗制的3-叔-丁基-1-[3-(叠氮基甲基)苯基]-1H-吡唑-5-胺(1.50g，5.55mmol)。
                             实施例I
Figure A20038011004900422
室温下，将实施例H溶于无水THF(10mL)并加入1-异氰基萘(1.13g，6.66mmol)和吡啶(5.27g，66.6mmol)的THF(10mL)溶液。将反应混合物搅拌3小时，用水(30mL)淬灭，滤出所得沉淀，并用1N HCl和乙醚洗涤，得到白色固体1-[2-(3-叠氮基甲基-苯基)-5-叔-丁基-2H-吡唑-3-基]-3-萘-1-基-脲(2.4g，98％)。
将THF(30mL)中的以上反应的粗物质和Pd/C(0.4g)在室温1atm下氢化2小时。过滤除去催化剂并将滤液在真空下浓缩，得到黄色固体1-{3-叔-丁基-1-[3-(氨基甲基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(萘-1-基)脲(2.2g，96％)。1H NMR(DMSO-d6)：9.02(s，1H)，7.91(d，J＝7.2Hz，1H)，7.89(d，J＝7.6Hz，2H)，7.67-7.33(m，9H)，6.40(s，1H)，3.81(s，2H)，1.27(s，9H)；MS(ESI)m/z：414(M+H+)。
                             实施例J
室温下，在实施例H(1.50g，5.55mmol)的无水THF(10mL)溶液中加入4-氯苯基异氰酸酯(1.02g，6.66mmol)和吡啶(5.27g，66.6mmol)的THF(10mL)溶液。将反应混合物搅拌3小时然后加入H2O(30mL)。将沉淀滤出并用1N HCl和乙醚洗涤，得到白色固体1-{3-叔-丁基-1-[3-(氨基甲基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲(2.28g，97％)，其无需进一步纯化即可用于下面的步骤。MS(ESI)m/z：424(M+H+)。
                             实施例K
Figure A20038011004900432
在苄胺(16.5g，154mmol)和溴乙酸乙酯(51.5g，308mmol)的乙醇(500mL)溶液中加入K2CO3(127.5g，924mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时，过滤，用EtOH洗涤，在真空下浓缩并层析得到N-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-N-(苯基甲基)-甘氨酸乙酯(29g，67％)。1H NMR(CDCl3)：δ7.39-7.23(m，5H)，4.16(q，J＝7.2Hz，4H)，3.91(s，2H)，3.54(s，4H)，1.26(t，J＝7.2Hz，6H)；MS(ESI)：m/e：280(M++H)。
将N-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-N-(苯基甲基)-甘氨酸乙酯(7.70g，27.6mmol)的甲胺醇溶液(25-30％，50mL)在封管中在加热至50℃3小时，冷却至室温并在真空下浓缩，得到一定产量的N-(2-甲基氨基-2-氧代乙基)-N-(苯基甲基)-甘氨酸甲基酰胺(7.63g)。1H NMR(CDCl3)：δ7.35-7.28(m，5H)，6.75(br s，2H)，3.71(s，2H)，3.20(s，4H)，2.81(d，J＝5.6Hz，6H)；MS(ESI)m/e 250(M+H+)。
在N-(2-甲基氨基-2-氧代乙基)-N-(苯基甲基)-甘氨酸甲基酰胺(3.09g，11.2mmol)的MeOH(30mL)混合物中加入10％Pd/C(0.15g)。搅拌混合物并在40psi氢气下加热至40℃10小时，过滤并在真空下浓缩以得到一定产量的N-(2-甲基氨基-2-氧代乙基)-甘氨酸甲基酰胺(1.76g)。1H NMR(CDCl3)：δ6.95(br s，2H)，3.23(s，4H)，2.79(d，J＝6.0，4.8Hz)，2.25(br s 1H)；MS(ESI)m/e 160(M+H+)
                             实施例1
将1-甲基-[1，2，4]三唑烷-3，5-二酮(188mg，16.4mmol)和氢化钠(20mg，0.52mmol)的DMSO(1mL)溶液加入实施例E(86mg，0.2mmol)。使反应物在室温下搅拌过夜，用H2O(10mL)淬灭，用CH2Cl2提取，并分离有机层，用盐水洗涤，Na2SO4干燥并在真空下浓缩。残余物通过制备型HPLC纯化以得到1-(3-叔-丁基-1-{3-[(1-甲基-3，5-二氧代-1，2，4-三唑烷-4-基)甲基]苯基}-1H-吡唑-5-基)-3-(萘-1-基)脲(实施例1，14mg)。1H NMR(CD3OD)：δ7.88-7.86(m，2H)，7.71-7.68(m，2H)，7.58(m，2H)，7.60-7.42(m，5H)，6.49(s，1H)，4.85(s，1H)，1.34(s，9H)，1.27(s，6H)；MS(ESI)m/z：525(M+H+)。
                             实施例2
Figure A20038011004900442
标题化合物是用与实施例1类似的方法用实施例G合成的，得到1-(3-叔-丁基-1-{3-[(1-甲基-3，5-二氧代-1，2，4-三唑烷-4-基)甲基]苯基}-1H-吡唑-5-基)-3-(4-氯苯基)脲。1H NMR(CD3OD)：δ7.2-7.5(m，7H)，6.40(s 1H)，4.70(s，2H)，2.60(d，J＝14Hz，2H)，1.90(m，1H)，1.50(m，1H)，1.45(s，9H)，1.30(m，2H)，1.21(s，3H)，1.18(s，6H)；MS(ESI)m/z：620(M+H+)。
                             实施例3
在-10℃氮气下，将THF(2mL)中化合物1，1-二氧代-[1，2，5]噻二唑烷-3-酮(94mg，0.69mmol)和NaH(5.5mg，0.23mmol)的混合物搅拌1小时直到所有的NaH溶解。加入实施例E(100mg，0.23mmol)并将反应物在室温下搅拌过夜，用H2O淬灭，并用CH2Cl2提取。合并的有机层在真空下浓缩，残余物通过制备型HPLC纯化以得到白色粉末状的1-(3-叔-丁基-1-{[3-(1，1，3-三氧代-[1，2，5]噻二唑烷-2-基)甲基]苯基}-1H-吡唑-5-基)-3-(萘-1-基)脲(18mg)。1H NMR(CD3OD)：δ7.71-7.44(m，11H)，6.45(s，1H)，4.83(s，2H)，4.00(s，2H)，1.30(s，9H)。MS(ESI)m/z：533.40(M+H+)。
                             实施例4
标题化合物是用类似于实施例3的方法用实施例G获得的，得到1-(3-叔-丁基-1-{[3-(1，1，3-三氧代-[1，2，5]噻二唑烷-2-基)甲基]苯基}-1H吡唑-5-基)-3-(4-氯苯基)脲。1H NMR(CD3OD)：δ7.38-7.24(m，8H)，6.42(s，1H)，4.83(s，2H)，4.02(s，2H)，1.34(s，9H)；MS(ESI)m/z：517(M+H+)。
                             实施例5
0℃下，在氯磺酰异氰酸酯(19.8μL，0.227mmol)的CH2Cl2(0.5mL)溶液中边搅拌边加入吡咯烷(18.8μL，0.227mmol)，加入速度为反应溶液的温度不超过5℃。搅拌1.5小时后，加入实施例J(97.3mg，0.25mmol)和Et3N(95μL，0.678mmol)的CH2Cl2(1.5mL)溶液，加入速度为反应温度不超过5℃。当加入完成时使反应溶液加热到室温并将其搅拌过夜。将反应混合物倒入10％HCl，用CH2Cl2提取，有机层用饱和NaCl洗涤，硫酸镁干燥，并过滤。除去溶剂后，粗制产物通过制备型HPLC纯化以得到1-(3-叔-丁基-1-[[3-N-[[(1-吡咯烷基羰基)氨基]磺酰]氨基甲基]苯基]-1H-吡唑-5-基)-3-(4-氯苯基)脲。1H NMR(CD3OD)：δ7.61(s，1H)，7.43-7.47(m，3H)，7.23-7.25(dd，J＝6.8Hz，2H)，7.44(dd，J＝6.8Hz，2H)，6.52(s，1H)，4.05(s，2H)，3.02(m，4H)，1.75(m，4H)，1.34(s，9H)；MS(ESI)m/z：574.00 M+H+)。
                             实施例6
Figure A20038011004900462
标题化合物是用与实施例5类似的方法用实施例I制成的，得到1-(3-叔-丁基-1-[[3-N-[[1-吡咯烷基羰基]氨基]磺酰]氨基甲基]-苯基)-1H-吡唑-5-基)-3-(萘-1-基)脲。1H NMR(CDCl3)：δ7.88(m，2H)，7.02-7.39(m，2H)，7.43-7.50(m，7H)，6.48(s，1H)，4.45(s，1H)，3.32-3.36(m，4H)，1.77-1.81(m，4H)，1.34(s，9H)；MS(ESI)m/z：590.03(M+H+)。
                             实施例7
Figure A20038011004900471
在0℃下，在氯磺酰异氰酸酯(19.8μΛ，0.227μμoλ)的vXH1Xλ1(0.5μΛ)溶液中边搅拌边加入实施例J(97.3mg，0.25mmol)，加入速度为反应溶液的温度不超过5℃。搅拌1.5小时后，加入吡咯烷(18.8μL，0.227mmol)和Et3N(95μL，0.678mmol)的CH2Cl2(1.5mL)溶液，加入速度为反应温度不超过5℃。当加入完成后使反应溶液回复室温并将其搅拌过夜。将反应混合物倒入10％HCl，用CH2Cl2提取，有机层用饱和NaCl洗涤，通过硫酸镁干燥，并过滤。除去溶剂后，粗制产物通过制备型HPLC纯化以得到1-(3-叔-丁基-1-[[3-N-[[(1-吡咯烷基磺酰)氨基]羰基]氨基甲基]苯基]-1H-吡唑-5-基)-3-(4-氯苯基)脲。1H NMR(CDCl3)：δ7.38(m，1H)，7.36-7.42(m，3H)，7.23(d，J＝8.8Hz，2H)，7.40(d，J＝8.8Hz，2H)，6.43(s，1H)，4.59(s，1H)，4.43(s，2H)，1.81(s，2H)，1.33(s，9H)；MS(ESI)m/z：574.10(M+H+)。
                             实施例8
标题化合物是用与实施例7类似的方法用实施例I制成的，得到1-(3-叔-丁基-1-[[3-N-[[(1-吡咯烷基磺酰)氨基]羰基]氨基甲基]-苯基]-1H-吡唑-5-基)-3-(萘-1-基)脲。1HNMR(CDCl3)：δ7.88(m，2H)，7.02-7.39(m，2H)，7.43-7.50(m，7H)，6.48(s，1H)，4.45(s，1H)，3.32-3.36(m，4H)，1.77-1.81(m，4H)，1.34(s，9H)；MS(ESI)m/z：590.03(M+H+)。
                             实施例9
Figure A20038011004900481
在试剂BB(36mg，0.15mmol)、实施例I(62mg，0.15mmol)、HOBt(40mg，0.4mmol)和NMM(0.1mL，0.9mmol)的DMF(10mL)溶液中加入EDCI(58mg，0.3mmol)。搅拌过夜后，将混合物倒入水(15mL)中并用EtOAc(35mL)提取。将有机层合并，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，并在真空下浓缩。残余物通过制备型TLC纯化以得到1，5，7-三甲基-2，4-二氧代-3-氮杂二环[3.3.1]壬烷-7-羧酸3-[3-叔-丁基-5-(3-萘-1-基-脲基)-吡唑-1-基]苯甲酰胺(22mg)。1HNMR(CDCl3)：δ8.40(s，1H)，8.14(d，J＝8.0Hz，2H)，7.91(s，1H)，7.87(s，1H)，7.86(d，J＝7.2Hz，1H)，7.78(d，J＝7.6Hz，1H)，7.73(d，J＝8.4Hz，1H)，7.69(d，J＝8.4Hz，1H)，7.57-7.40(m，4H)，7.34(d，J＝7.6Hz，1H)，6.69(s，1H)，6.32(t，J＝5.6Hz，1H)，5.92(brs，1H)，4.31(d，J＝5.6Hz，2H)，2.37(d，J＝14.8Hz，2H)，1.80(d，J＝13.2Hz，1H)，1.35(s，9H)，1.21(d，J＝13.2Hz，1H)，1.15(s，3H)，1.12(d，J＝12.8Hz，2H)，1.04(s，6H)；MS(ESI)m/z：635(M+H+)。
                             实施例10
Figure A20038011004900482
标题化合物是用与实施例9类似的方法用实施例J合成的，得到1，5，7-三甲基-2，4-二氧代-3-氮杂-二环[3.3.1]壬烷-7-羧酸3-{3-叔-丁基-5-[3-(4-氯-苯基)-脲基]-吡唑-1-基}苯甲酰胺。1HNMR(CDCl3)：δ8.48(s，1H)，7.78(s，1H)，7.75(d，J＝8.0Hz，1H)，7.69(s，1H)，7.53(t，J＝8.0Hz，1H)，7.48(d，J＝8.8Hz，2H)，7.26(m，3H)，6.62(s，1H)，6.35(t，J＝6.0Hz，1H)，5.69(brs，1H)，4.26(d，J＝6.0Hz，2H)，2.48(d，J＝14.0Hz，2H)，1.87(d，J＝13.6Hz，1H)，1.35(s，9H)，1.25(m，6H)，1.15(s，6H)；MS(ESI)m/z：619(M+H+)。
                             实施例11
将无水CH2Cl2(2mL)中实施例I(41mg，0.1mmol)、Kemp酸酐(24mg，0.1mmol)和Et3N(100mg，1mmol)的混合物在室温下搅拌过夜并在真空下浓缩。在残余物中加入无水苯(20mL)，将混合物回流3小时，在真空下浓缩并通过制备型HPLC纯化以得到3-{3-[3-叔-丁基-5-(3-萘-1-基-脲基)-吡唑-1-基]-苄基}-1，5-二甲基-2，4-二氧代-3-氮杂二环[3.3.1]壬烷-7-羧酸(8.8mg，14％)。1H NMR(CD3OD)：δ7.3-7.4(m，2H)，7.20(m，2H)，7.4-7.6(m，7H)，6.50(m，1H)，4.80(s，2H)，2.60(d，J＝14Hz，2H)，1.90(m，1H)，1.40(m，1H)，1.30(m，2H)，1.20(s，3H)，1.15(s，6H)；MS(ESI)m/z：636(M+H+)。
                             实施例12
Figure A20038011004900492
标题化合物是用与实施例11类似的方法用实施例J合成的，得到3-{3-[3-叔-丁基-5-(3-萘-1-基-脲基)-吡唑-1-基]-苄基}-1，5-二甲基-2，4-二氧代-3-氮杂-二环[3.3.1]壬烷-7-羧酸。1H NMR(CD3OD)：δ7.2-7.5(m，7H)，6.40(s 1H)，4.70(s，2H)，2.60(d，J＝14Hz，2H)，1.90(m，1H)，1.50(m，1H)，1.45(s，9H)，1.30(m，2H)，1.21(s，3H)，1.18(s，6H)；MS(ES1)m/z：620(M+H+)。
                             实施例13
Figure A20038011004900501
标题化合物是用与实施例1类似的方法用实施例E和4，4-二甲基-3，5-二氧代-吡唑烷合成的，得到1-(3-叔-丁基-1-{3-[(4，4-二甲基-3，5-二氧代吡唑烷-1-基)甲基]苯基}-1H-吡唑-5-基)-3-(萘-1-基)脲。1HNMR(CD3OD)：δ7.88-7.86(m，2H)，7.71-7.68(m，2H)，7.58(m，2H)，7.60-7.42(m，5H)，6.49(s，1H)，4.85(s，1H)，1.34(s，9H)，1.27(s，6H)；MS(ESI)m/z：525(M+H+)。
                             实施例14
Figure A20038011004900502
标题化合物是用与实施例1类似的方法用实施例G和4，4-二甲基-3，5-二氧代-吡唑烷合成的，得到1-(3-叔-丁基-1-{3-[(4，4二甲基-3，5-二氧代吡唑烷-1基)甲基]苯基}-1H-吡唑-5-基)-3-(4-氯苯基)脲。1H NMR(CD3OD)：δ7.60-7.20(m，8H)，6.43(s，1H)，4.70(s，1H)，1.34(s，9H)，1.26(s，6H)；MS(ESI)m/z：509，511(M+H+)。
                             实施例15
Figure A20038011004900511
在MeOH中用2N LiOH皂化实施例B，并在所得酸(64.2mg，0.15mmol)中加入HOBt(30mg，0.225mmol)、实施例K(24mg，0.15mmol)和4-甲基吗啉(60mg，0.60mmol 4.0当量)、DMF(3mL)以及EDCI(43mg，0.225mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜并倒入H2O(3mL)中，收集白色沉淀并通过制备型HPLC进一步纯化得到1-[1-(3-{二[(甲基氨基甲酰基)甲基]氨基甲酰基}苯基)-3-叔-丁基-1H-吡唑-5-基]-3-(萘-1-基)脲(40mg)。1H NMR(CDCl3)：δ8.45(brs，1H)，8.10(d，J＝7.6Hz，1H)，7.86-7.80(m，2H)，7.63-7.56(m，2H)，7.52(s，1H)，7.47-7.38(m，3H)，7.36-7.34(m，1H)，7.26(s，1H)，7.19-7.17(m，2H)，6.60(s，1H)，3.98(s，2H)，3.81(s，3H)，2.87(s，3H)，2.63(s，3H)，1.34(s，9H)；MS(ESI)m/z：570(M+H+)。
                             实施例16
Figure A20038011004900512
标题化合物是用与实施例15类似的方法用实施例C(37mg)和实施例K合成的，得到1-[1-(3-{二[(甲基氨基甲酰基)甲基]氨基甲酰基}苯基)-3-叔-丁基-1H-吡唑-5-基]-3-(4-氯苯基)脲。1H NMR(CD3OD)：δ8.58(brs，1H)，8.39(brs，1H)，7.64-7.62(m，3H)，7.53-7.51(m，1H)，7.38(d，J＝9.2Hz，2H)，7.25(d，J＝8.8Hz，2H)，6.44(s，1H)，4.17(s，2H)，4.11(s，2H)，2.79(s，3H)，2.69(s，3H)，1.34-1.28(m，12H)；MS(ESI)m/z：554(M+H+)。
                             实施例17
Figure A20038011004900521
在MeOH中用2N LiOH皂化实施例B，在无水THF(25mL)中的所得酸(0.642g，1.5mmol)中边剧烈搅拌边加入新鲜蒸馏的三乙胺(0.202g，2.0mmol)和新戊酰氯(0.216g，1.80mmol)。在-78℃搅拌15分钟并在0℃搅拌45分钟后再将混合物冷却至-78℃，然后转移到D-4-苯基-噁唑烷-2-酮的锂盐的THF溶液中[*：噁唑烷酮试剂的锂盐预先制得，方法是在-78℃下将n-BuLi(2.50M溶于己烷，1.20mL，3.0mmol)缓慢加入D-4-苯基-噁唑烷-2-酮的THF溶液]。反应溶液在-78C下搅拌2小时并在室温下过夜，然后用氯化铵水溶液淬灭并用二氯甲烷(100mL)提取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并在真空下浓缩。残余物通过制备型HPLC纯化以得到D-1-{5-叔-丁基-2-[3-(2-氧代-4-苯基-噁唑烷基-3-羰基)苯基]-2H-吡唑-3-基}-3-(萘-1-基)脲(207mg，24％)。1H NMR(CDCl3)：δ8.14-8.09(m，2H)，8.06(s，1H)，7.86-7.81(m，4H)，7.79(s，1H)，7.68-7.61(m，2H)，7.51-7.40(m，9H)，6.75(s，1H)，5.80(t，J＝9.2，7.6Hz，1H)，4.89(t，J＝9.2Hz，1H)，4.42(dd，J＝9.2，7.6Hz，1H)，1.37(s，9H)；MS(ESI)m/z：574(M+H+)。
                             实施例18
标题化合物是用与实施例17类似的方法用实施例B和L-4-苯基-噁唑烷-2-酮合成的，得到L-1-{5-叔-丁基-2-[3-(2-氧代-4-苯基-噁唑烷基-3-羰基)苯基]-2H-吡唑-3-基}-3-(萘-1-基)脲。1H NMR(CD3)：δ8.14-8.09(m，2H)，8.06(s，1H)，7.86-7.81(m，4H)，7.79(s，1H)，7.68-7.61(m，2H)，7.51-7.40(m，9H)，6.75(s，1H)，5.80(t，J＝9.2，7.6Hz，1H)，4.89(t，J＝9.2Hz，1H)，4.42(dd，J＝9.2，7.6Hz，1H)，1.37(s，9H)；MS(ESI)m/z：574(M+H+)
                             实施例19
标题化合物是用与实施例17类似的方法用实施例C和D-4-苯基-噁唑烷-2-酮合成的，得到D-1-{5-叔-丁基-2-[3-(2-氧代-4-苯基噁唑烷基-3-羰基)苯基]-2H-吡唑-3-基}-3-(4-氯苯基)脲。1H NMR(CDCl3)：δ7.91(s，1H)，7.85(d，J＝8.0Hz，1H)，7.79(d，J＝7.6Hz，1H)，7.71(m，1H)，7.65(m，1H)，7.49-7.40(m，8H)，7.26-7.24(m，2H)，6.68(s，1H)，5.77(dd，J＝8.8，8.0Hz，1H)，4.96(t，8.8Hz，1H)，4.44(dd，J＝8.8，8.0Hz，1H)，1.36(s，9H)；MS(ESI)m/z：558(M+H+)
                             实施例20
Figure A20038011004900532
标题化合物是用与实施例17类似的方法用实施例C和L-4-苯基-噁唑烷-2-酮合成的，得到L-1-{5-叔-丁基-2-[3-(2-氧代-4-苯基-噁唑烷基-3-羰基)苯基]-2H-吡唑-3-基}-3-(4-氯苯基)脲。1H NMR(CDCl3)：δ7.91(s，1H)，7.85(d，J＝8.0Hz，1H)，7.79(d，J＝7.6Hz，1H)，7.71(m，1H)，7.65(m，1H)，7.49-7.40(m，8H)，7.26-7.24(m，2H)，6.68(s，1H)，5.77(dd，J＝8.8，8.0Hz，1H)，4.96(t，8.8Hz，1H)，4.44(dd，J＝8.8，8.0Hz，1H)，1.36(s，9H)；MS(ESI)m/z：558(M+H+)
                             实施例L
Figure A20038011004900541
在0℃氮气下，在(3-硝基-苯基)-乙酸(2g)的CH2Cl2(40ml，含有催化量的DMF)悬液中边搅拌边逐滴加入草酰氯(1.1ml)。将反应混合物搅拌40分钟，加入吗啉(2.5g)。搅拌20分钟后过滤反应混合物。滤液在真空下浓缩以得到固体状的1-吗啉-4-基-2-(3-硝基-苯基)-乙酮(2g)。将在乙醇(30ml)中的1-吗啉-4-基-2-(3-硝基-苯基)-乙酮(2g)和10％碳载钯(0.2g)在30psi下氢化3小时并通过硅藻土过滤。在真空下除去挥发性物质得到2-(3-氨基-苯基)-1-吗啉-4-基-乙酮(1.7g)。将2-(3-氨基-苯基)-1-吗啉-4-基-乙酮(1.7g，7.7mmol)溶于6N HCl(15ml)，冷却至0℃，并剧烈搅拌。加入硝酸钠(0.54g)的水(8ml)溶液。30分钟后，加入氯化锡(II)二水合物(10g)的6N HCl(30ml)溶液。将反应混合物在0℃搅拌3小时。用固体氢氧化钾调节pH至pH 14并用EtOAc提取。合并的有机提取物在真空下浓缩得到2-(3-肼-苯基)-1-吗啉-4-基-乙酮(1.5g)。将2-(3-肼基苯基)-1-吗啉-4-基-乙酮(3g)和4，4-二甲基-3-氧代戊腈(1.9g，15mmol)的乙醇(60ml)溶液和6N HCl(1ml)回流1小时，并冷却至室温。加入固体碳酸氢钠总和反应混合物。浆液过滤并在真空下除去挥发性物质，得到的残余物用乙酸乙酯提取。在真空下除去挥发性物质以得到2-[3-(3-叔-丁基-5-氨基-1H-吡唑-1-基)苯基]-1-吗啉代乙酮(4g)，其无需进一步纯化即可使用。
                             实施例21
Figure A20038011004900542
将无水CH2Cl2(4ml)中实施例L(0.2g，0.58mmol)和1-萘基异氰酸酯(0.10g，0.6mmol)的混合物在室温下搅拌18小时。在真空下除去溶剂，粗制产物通过柱层析纯化，用乙酸乙酯/己烷/CH2Cl2(3/1/0.7)作为洗脱液(0.11g，灰白色固体)，得到1-{3-叔-丁基-1-[3-(2-吗啉代-2-氧代乙基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(萘-1-基)脲。mp：194-196；1H NMR(200MHz，DMSO-d6)：δ9.07(1H，s)，8.45(s，1H)，8.06-7.93(m，3H)，7.69-7.44(m，7H)，7.33-7.29(d，6.9Hz，1H)，6.44(s，1H)，3.85(m，2H)，3.54-3.45(m，8H)，1.31(s，9H)；MS：
                             实施例22
Figure A20038011004900551
标题化合物是用与实施例21类似的方法用实施例L(0.2g，0.58mmol)和4-氯苯基异氰酸酯(0.09g，0.6mmol)合成的，得到1-{3-叔-丁基-1-[3-(2-吗啉代-2-氧代乙基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲。mp：100-104；1H NMR(200MHz，DMSO-d6)：δ9.16(s，1H)，8.45(s，1H)，7.52-7.30(m，8H)，6.38(s，1H)，3.83(m，1H)，3.53-3.46(m，8H)，1.30(s，9H)；MS：
                             实施例23
Figure A20038011004900552
标题化合物是用与实施例21类似的方法用实施例L(0.2g，0.58mmol)和苯基异氰酸酯(0.09g，0.6mmol)合成的，得到1-{3-叔-丁基-1-[3-(2-吗啉代-2-氧代乙基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-苯基脲。
                             实施例24
Figure A20038011004900561
标题化合物是用与实施例21类似的方法用实施例L(0.2g，0.58mmol)和1-异氰酸根-4-甲氧基-萘合成的，得到1-{3-叔-丁基-1-[3-(2-吗啉代-2-氧代乙基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(1-甲氧基萘-4-基)脲。
                             实施例M
Figure A20038011004900562
标题化合物是用与实施例C类似的方法用实施例A和苯基异氰酸酯合成的，得到3-(3-叔-丁基-5-(3-苯基脲基)-1H-吡唑-1-基)苯甲酸乙酯。
                             实施例N
将(3-硝基苯基)乙酸(23g，127mmol)的甲醇(250ml)溶液和催化量的浓硫酸加热回流18小时。反应混合物在真空下浓缩得到黄色油状物。将其溶于甲醇(250ml)并在冰浴中搅拌18小时，在溶液上面充入缓慢流动的氨。在真空下除去挥发性物质。残余物用二乙醚洗涤并干燥以得到2-(3-硝基苯基)乙酰胺(14g，灰白色固体)。1HNMR(CDCl3)：δ 8.1(s，1H)，8.0(d，1H)，7.7(d，1H)，7.5(m，1H)，7.1(bd s，1H)，6.2(brs，1H)，3.6(s，2H)。
将上述反应的粗物质(8g)和10％碳载钯(1g)在乙醇(100ml)中于30psi下氢化18小时并通过硅藻土过滤。在真空下除去挥发性物质得到2-(3-氨基苯基)乙酰胺(5.7g)。将该物质(7g，46.7mmol)的溶液溶于6N HCl(100ml)，冷却至0℃，并剧烈搅拌。加入硝酸钠(3.22g，46.7mmol)水(50ml)溶液。30分钟后加入溶于6NHCl(100ml)的氯化锡(II)二水合物(26g)。反应混合物在0℃搅拌3小时。用50％NaOH水溶液将pH调至pH14并用乙酸乙酯提取。合并的有机提取物在真空下浓缩得到2-(3-肼基苯基)乙酰胺。
将乙醇(60ml)和6N HCl(1.5ml)中的上述反应的粗物质(约15mmol)和4，4-二甲基-3-氧代戊腈(1.85g，15mmol)回流1小时并冷却至室温。加入固体碳酸氢钠中和反应混合物。浆液过滤并在真空下除去挥发性物质得到残余物，该残余物用乙酸乙酯提取。在真空下除去溶剂以得到白色固体状的2-[3-(3-叔-丁基-5-氨基-1H-吡唑-1-基)苯基]乙酰胺(3.2g)，其无需进一步纯化即可使用。
                             实施例25
Figure A20038011004900571
将无水CH2Cl2(4ml)中的实施例N(2g，0.73mmol)和1-萘基异氰酸酯(0.124g，0.73mmol)的混合物在室温氮气下搅拌18小时。在真空下除去溶剂，粗制产物用乙酸乙酯(8ml)洗涤并在真空下干燥得到白色固体状的1-{3-叔-丁基-1-[3-(氨基甲酰基甲基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(萘-1-基)脲(0.22g)。mp：230(dec.)；1HNMR(200MHz，DMSO-d6)：δ9.12(s，1H)，8.92(s，1H)，8.32-8.08(m，3H)，7.94-7.44(m，8H)，6.44(s，1H)，3.51(s，2H)，1.31(s，9H)；MS：
                             实施例26
Figure A20038011004900581
标题化合物是用与实施例23类似的方法用实施例N(0.2g，0.73mmol)和4-氯苯基异氰酸酯(0.112g，0.73mmol)合成的，得到白色固体状的1-{3-叔-丁基-1-[3-(氨基甲酰基甲基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲(0.28g)。mp：222224.(dec.)；1H NMR(200MHz，DMSO-d6)：δ9.15(s，1H)，8.46(s，1H)，7.55-7.31(m，8H)，6.39(s，1H)，3.48(s，2H)，1.30(s，9H)；MS：
                             实施例O
标题化合物是用与实施例C类似的方法用实施例A和1-异氰酸根-4-甲氧基-萘合成的，得到3-(3-叔-丁基-5-(3-(1-甲氧基萘-4-基)脲基)-1H-吡唑-1-基)苯甲酸乙酯。
                             实施例27
Figure A20038011004900583
标题化合物是用与实施例17类似的方法用实施例M和D-4-苯基-噁唑烷-2-酮合成的，得到D-1-{5-叔-丁基-2-[3-(2-氧代-4-苯基-噁唑烷基-3-羰基)苯基]-2H-吡唑-3-基}-3-苯基脲。
                             实施例28
Figure A20038011004900591
标题化合物是用与实施例17类似的方法用实施例M和L-4-苯基-噁唑烷-2-酮合成的，得到L-1-{5-叔-丁基-2-[3-(2-氧代-4-苯基-噁唑烷基-3-羰基)苯基]-2H-吡唑-3-基}-3-苯基脲。
                             实施例P
Figure A20038011004900592
将3-(3-氨基-苯基)-丙烯酸甲酯(6g)和10％碳载钯(1g)的混合物在乙醇(50ml)中于30psi下氢化18小时并通过硅藻土过滤。在真空下除去挥发性物质得到3-(3-氨基-苯基)丙酸甲酯(6g)。
边剧烈搅拌边将上述反应的粗物质(5.7g，31.8mmol)溶液溶于6N HCl(35ml)，并冷却至0℃，加入硝酸钠(2.2g)水(20ml)溶液。1小时后加入溶于6N HCl(35ml)的氯化锡(II)二水合物(18g)。混合物在0℃搅拌3小时。用KOH固体将pH调至pH14并用EtOAc提取。合并的有机提取物在真空下浓缩得到3-(3-肼基-苯基)丙酸甲酯(1.7g)。
将乙醇(30ml)和6N HCl(2ml)中的上述反应的粗物质(1.7g，8.8mmol)和4，4-二甲基-3-氧代戊腈(1.2g，9.7mmol)的溶液边搅拌边回流18小时，并冷却至室温。在真空下除去挥发性物质，将残余物溶于EtOAc并用1N NaOH水溶液洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，在真空下浓缩并通过柱层析纯化残余物，用30％乙酸乙酯的己烷溶液作为洗脱液，得到3-[3-(3-叔-丁基-5-氨基-1H-吡唑-1-基)苯基]丙酸甲酯(3.2g)，其无需进一步纯化即可使用
                             实施例29
Figure A20038011004900601
在氮气下将无水CH2Cl2(5ml)中的实施例P(0.35g，1.1mmol)和1-萘基异氰酸酯(0.19g，1.05mmol)的混合物在室温下搅拌20小时。在真空下除去溶剂并将残余物在含有氢氧化锂(0.1g)的THF(3ml)/MeOH(2ml)/水(1.5ml)溶液中在室温下搅拌3小时，随后用EtOAc和稀柠檬酸溶液稀释。将有机层干燥(Na2SO4)，并在真空下除去挥发性物质。残余物通过柱层析纯化，用3％的甲醇的CH2Cl2溶液作为洗脱液，得到3-(3-{3-叔-丁基-5-[3-(萘-1-基)脲基]-1H-吡唑-1-基}苯基丙酸(0.22g，褐色固体)。mp：105-107；1H NMR(200MHz，CDCl3)：δ7.87-7.36(m，10H)，7.18-7.16(m，1H)，6.52(s，1H)，2.93(t，J＝6.9Hz，2H)，2.65(t，J＝7.1Hz，2H)，1.37(s，9H)；MS
                             实施例30
Figure A20038011004900602
标题化合物是用与实施例29类似的方法用实施例P(0.30g，0.95mmol)和4-氯苯基异氰酸酯(0.146g，0.95mmol)合成的，得到3-(3-{3-叔-丁基-5-[3-(4-氯苯基)脲基]-1H-吡唑-1-基)苯基)丙酸(0.05g，白色固体)。mp：8587；1H NMR(200MHz，CDCl3)：δ8.21(s，1H)，7.44-7.14(m，7H)，6.98(s，1H)，6.55(s，1H)，2.98(t，J＝5.2Hz，2H)，2.66(t，J＝5.6Hz，2H)，1.40(s，9H)；MS
                             实施例Q
Figure A20038011004900611
将3-(4-氨基苯基)丙烯酸乙酯(1.5g)和10％碳载钯(0.3g)的混合物在乙醇(20ml)中于30psi下氢化18小时，并通过硅藻土过滤。在真空下除去挥发性物质得到3-(4-氨基苯基)丙酸乙酯(1.5g)。
将上述反应的粗物质(1.5g，8.4mmol)的溶液溶于6N HCl(9ml)，冷却至0℃，并剧烈搅拌。加入硝酸钠(0.58g)的水(7ml)溶液。1小时后加入溶于6N HCl(10ml)的氯化锡(II)二水合物(5g)。将反应混合物在0℃搅拌3小时。用KOH固体将pH调至pH14并用EtOAc提取。合并的有机提取物在真空下浓缩得到3-(4-肼基-苯基)-丙酸乙酯(1g)。
将溶于乙醇(8ml)和6N HCl(1ml)的上述反应的粗物质(1g，8.8mmol)和4，4-二甲基-3-氧代戊腈(0.7g)回流18小时，并冷却至室温。在真空下除去挥发性物质。残余物溶于乙酸乙酯并用1N氢氧化钠水溶液洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)并在真空下浓缩。残余物通过柱层析纯化，用0.7％的甲醇的CH2Cl2溶液作为洗脱液，得到3-{4-[3-叔-丁基-5-(3-(萘-1-基)脲基)-1H-吡唑-1-基]苯基}丙酸乙酯(0.57g)。
                             实施例31
Figure A20038011004900621
将无水CH2Cl2(5ml)中的实施例Q(0.25g，0.8mmol)和1-萘基异氰酸酯(0.13g，0.8mmol)的混合物在氮气下室温搅拌20小时。在真空下除去溶剂，将残余物在含有氢氧化锂(0.1g)的THF(3ml)/MeOH(2ml)/水(1.5ml)溶液中室温下搅拌3小时，并用EtOAc和稀柠檬酸溶液稀释。将有机层干燥(Na2SO4)，并在真空下除去挥发性物质。残余物通过柱层析纯化，用4％的甲醇的CH2Cl2溶液作为洗脱液，得到3-{4-[3-叔-丁基-5-(3-(萘-1-基)脲基]-1H-吡唑-1-基3苯基)丙酸(0.18g，灰白色固体)。mp：120122；1H NMR(200MHz，CDCl3)：δ7.89-7.06(m，11H)，6.5(s，1H)，2.89(m，2H)，2.61(m，2H)，1.37(s，9H)；MS
                             实施例32
Figure A20038011004900622
标题化合物是用与实施例31类似的方法用实施例Q(0.16g，0.5mmol)和4-氯苯基异氰酸酯(0.077g，0.5mmol)合成的，得到3-{4-[3-叔-丁基-5-(3-(4-氯苯基)脲基]-1H-吡唑-1-基}苯基)丙酸(0.16g，灰白色固体)。mp：112-114；1H NMR(200MHz，CDCl3)：δ8.16(s，1H)，7.56(s，1H)，7.21(s，2H)，7.09(s，2H)，6.42(s，1H)，2.80(m，2H)，2.56(m，2H)，1.32(s，9H)；MS
                             实施例R
Figure A20038011004900631
在250mL压力容器(ACE Glass Teflon螺帽)中装入溶于THF(约100mL)的3-硝基二苯基(20g，0.10mol)和10％Pd/C(3g)。在反应容器中充入氢气(g)并吹扫3次。在反应容器中充入40psi H2(g)并将其置于Parr振动式氢化装置上在室温下振荡过夜。HPLC显示反应完成，通过硅藻土床过滤反应混合物并蒸发以得到胺：16.7g(产率98％)
在放入磁性搅拌棒的250mL锥形烧瓶中，将上述反应的粗物质(4.40g，0.026mol)加入6N HCl(40mL)，并用冰浴冷却至约0℃。逐滴加入NaNO2(2.11g，0.0306mol，1.18eq.)的水(5mL)溶液。30分钟后加入SnCl2·2H2O(52.0g，0.23mol，8.86eq.)的6N HCl(100mL)溶液并将反应混合物搅拌3小时，然后将其转移到500mL圆底烧瓶中。在其中加入4，4-二甲基-3-氧代戊腈(3.25g，0.026mol)和EtOH(100ml)并将混合物回流4h，在真空下浓缩，残余物用EtOAc(2×100mL)提取。残余物用己烷/EtOAc/Et3N(8∶2∶0.2)通过柱层析纯化，得到0.53g实施例R。1H NMR(CD3)：δ7.5(m，18H)，5.8(s，1H)，1.3(s，9H)。
                             实施例33
Figure A20038011004900632
在放入磁性搅拌棒的干燥小瓶中将实施例R(0.145g；0.50mmol)溶于2mLCH2Cl2(无水)，然后加入苯基异氰酸酯(0.0544mL；0.50mmol；1eq.)。将反应物在氩气下搅拌17小时。蒸发溶剂后得到一种晶体物质，将其与己烷/EtOAc(4∶1)一起研磨并过滤以得到1-(3-叔-丁基-1-(3-苯基苯基)-1H-吡唑-5-基)-3-苯基脲(0.185g，90％)。HPLC纯度：96％；mp：8084；1H NMR(CDCl3)：δ7.3(m，16H)，6.3(s，1H)，1.4(s，9H)。
                             实施例34
Figure A20038011004900641
标题化合物是用与实施例33类似的方法用实施例R(0.145g；0.50mmol)和对-氯苯基异氰酸酯(0.0768g，0.50mmol，leq.)合成的，得到1-(3-叔-丁基-1-(3-苯基苯基)-1H-吡唑-5-基)-3-(4-氯苯基)脲(0.205g，92％)。HPLC纯度：96.5％；mp：134136；1H NMR(CDCl3)：δ7.5(m，14H)，7.0(s，1H)，6.6(s，1H)，6.4(s，1H)，1.4(s，9H)。
                             实施例S
标题化合物是用与实施例C类似的方法用实施例A和4-氟苯基异氰酸酯合成的，得到3-(3-叔-丁基-5-(3-(4-氟苯基)脲基)-1H-吡唑-1-基)苯甲酸乙酯。
                             实施例35
Figure A20038011004900643
标题化合物是用与实施例17类似的方法用实施例M和D-4-苯基-噁唑烷-2-酮合成的，得到D-1-{5-叔-丁基-2-[3-(2-氧代-4-苯基-噁唑烷基-3-羰基)苯基]-2H-吡唑-3-基}-3--(萘-1-基)脲。
                             实施例36
Figure A20038011004900651
标题化合物是用与实施例29类似的方法用实施例P(0.30g，0.95mmol)和4-氟苯基异氰酸酯(0.146g，0.95mmol)合成的，得到3-(3-(3-叔-丁基-5-(3-(4-氟苯基)脲基)-1H-吡唑-1-基)苯基)丙酸。
                             实施例T
在实施例N(2g，7.35mmol)的THF(6ml)溶液中边搅拌边加入硼烷-甲基硫化物(18mmol)。将混合物加热回流90分钟并冷却至室温，之后加入6N HCl并加热回流10分钟。用NaOH将混合物碱化并用EtOAc提取。将有机层干燥(Na2SO4)，过滤，并在真空下浓缩以得到3-叔-丁基-1-[3-(2-氨基乙基)苯基]-1H-吡唑-5胺(0.9g)。
将无水CH2Cl2(5ml)中的上述反应的粗物质(0.8g，3.1mmol)和二-叔-丁基碳酸酯(0.7g，3.5mmol)以及催化量的DMAP在氮气下室温搅拌18小时。反应混合物在真空下浓缩，残余物通过柱层析纯化，用1％的甲醇的CH2Cl2溶液作为洗脱液，得到3-(3-叔-丁基-5-氨基-1H-吡唑-1-基)苯基氨基甲酸叔丁酯(0.5g)。
                             实施例37
Figure A20038011004900661
将无水CH2Cl2(5ml)中的实施例T(0.26g，0.73mmol)和1-萘基异氰酸酯(0.123g，0.73mmol)的混合物在氮气下室温搅拌48小时。在真空下除去溶剂，残余物通过柱层析纯化，用1％的甲醇的CH2Cl2溶液作为洗脱液(0.15g，灰白色固体)。该固体用TFA(0.2ml)处理5分钟并用EtOAc稀释。有机层用饱和NaHCO3溶液和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，并在真空下浓缩以得到固体状的1-{3-叔-丁基-1-[3-(2-氨基乙基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(萘-1-基)脲(80mg)。mp：110-112；1H NMR(200MHz，DMSO-d6)：δ9.09(s，1H)，8.90(s，1H)，8.01-7.34(m，11H)，6.43(s，1H)，3.11(m，2H)，2.96(m，2H)，1.29(s，9H)；MS
                             实施例38
Figure A20038011004900662
标题化合物是用与实施37例类似的方法用实施例T(0.15g，0.42mmol)和4-氯苯基异氰酸酯(0.065g，0.42mmol)合成的，得到灰白色固体的1-{3-叔-丁基-1-[3-(2-氨基乙基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲(20mg)。mp：125-127；1H NMR(200MHz，CDCl3)：δ8.81(s，1H)，8.66(s，1H)，7.36-7.13(m，8H)，6.54(s，1H)，3.15(brs，2H)，2.97(brs，2H)，1.32(s，9H)；MS
                             实施例U
在放入磁性搅拌棒的250mL锥形瓶中将间-甲氧基苯胺(9.84g，0.052mol)加入6N HCl(80mL)并用冰浴冷却至0℃。逐滴加入NaNO2(4.22g，0.0612mol，1.18eq.)的水(10mL)溶液。30分钟后加入SnCl2·2H2O(104.0g，0.46mol，8.86eq.)的6N HCl(200mL)溶液并将反应混合物搅拌3小时，随后转移到1000mL圆底烧瓶。在其中加入4，4-二甲基-3-氧代戊腈(8.00g，0.064mol)和EtOH(200mL)，并将混合物回流4小时，在真空下浓缩，残余物从CH2Cl2中重结晶以得到3-叔-丁基-1-(3-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-胺，其为盐酸盐(13.9g)。
将上述反应的粗物质(4.65g，0.165mol)溶于30mL CH2Cl2，其中含有Et3N(2.30mL，0.0165mol，1eq.)，并搅拌30分钟。用水提取，然后用硫酸钠干燥有机相并在真空下浓缩以得到棕色浆液，其为游离碱3-叔-丁基-1-(3-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-胺(3.82g，94.5％)，其无需进一步纯化即可使用。
                             实施例39
Figure A20038011004900672
在放入磁性搅拌棒的干燥小瓶中将实施例U(2.62g，0.0107mol)溶于CH2Cl2(5mL，无水)，随后加入1-萘基异氰酸酯(1.53mL，0.0107mol，1eq.)。将反应物置于氩气下并搅拌18小时。蒸发溶剂，然后进行柱层析，用EtOAc/己烷/Et3N(7∶2∶0.5)作为洗脱液，得到1-[3-叔-丁基-1-(3-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-(萘-1-基)脲(3.4g，77％)。HPLC：97％；mp：78-80；1HNMR(CDCl3)：δ7.9-6.8(m，15H)，6.4(s，1H)，3.7(s，3H)，1.4(s，9H)。
                             实施例40
Figure A20038011004900681
标题化合物是用与实施例39类似的方法用实施例U(3.82g；0.0156mol)和对-氯苯基异氰酸酯(2.39g，0.0156mol，1eq.)合成的，通过与己烷/EtOAc(4∶1)一起研磨来纯化，并过滤以得到1-[3-叔-丁基-1-(3-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-(4-氯苯基)脲(6.1g，98％)。HPLC纯度：95％；mp：158-160；1H NMR(CDCl3)：δ7.7(s，1H)；87.26.8(m，8H)，6.4(s，1H)，3.7(s，3H)，1.3(s，9H)。
                             实施例41
Figure A20038011004900682
在放入磁性搅拌棒的100ml圆底烧瓶中将实施例39(2.07g)溶于CH2Cl2(20mL)并用冰浴冷却至0℃。慢慢加入BBr3(1M，溶于CH2Cl2；7.5mL)。使反应混合物回复室温并过夜。再加入BBr3(1M，溶于CH2Cl2，2×1mL，总共加入9.5mmol)，并通过加入MeOH淬灭反应。将溶剂蒸发得到一种晶体物质，在硅胶(30g)上层析，用CH2Cl2/MeOH(9.6∶0.4)作为洗脱液，得到1-[3-叔-丁基-1-(3-羟基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-(萘-1-基)脲(0.40g，20％)。1H NMR(DMSO-d6)：δ9.0(s，1H)，8.8(s，1H)，8.1-6.8(m，11H)，6.4(s，1H)，1.3(s，9H)。MS(ESI)m/z：401(M+H+)。
                             实施例42
Figure A20038011004900683
标题化合物是用与实施例41类似的方法用实施例40(2.00g，5mmol)合成的，得到一种晶体物质，将该物质过滤并用MeOH洗涤以得到1-[3-叔-丁基-1-(3-羟基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-(4-氯苯基)脲(1.14g，60％)。HPLC纯度：96％；mp：214-216；IH NMR(CDCl3)：δ8.4(s，1H)，7.7(s，1H)，7.4-6.6(m，9H)，1.3(s，9H)。
                             实施例V
起始物质1-[4-(氨基甲基)苯基]-3-叔-丁基-N-亚硝基-1H-吡唑-5-胺是用与实施例A类似的方法用4-氨基苯甲酰胺和4，4-二甲基-3-氧代戊腈合成的。
一个1L的四颈圆底烧瓶上装有搅拌棒、干燥氩气源、加热套和回流冷凝器。在该烧瓶中充入氩气并装入上述反应的粗物质(12g，46.5mmol；258.1g/mol)和无水THF(500ml)。用LiAlH4(2.65g，69.8mmol)小心处理该溶液并将反应物搅拌过夜。将反应物加热回流并加入其余的LiAlH4(总共加入8.35g)。将反应物冷却至0℃并依次加入水(8.4ml)、15％NaOH(8.4ml)和水(24ml)。将混合物搅拌2小时，通过硅藻土过滤固体物质，用THF充分洗涤，溶液在真空下浓缩以得到油状的1-(4-(氨基甲基-3-甲氧基)苯基)-3-叔-丁基-1H-吡唑-5-胺(6.8g)。
在一个40mL小瓶上装置搅拌棒、隔片和氩气源。在该小瓶中装入上述反应的粗物质(2g，8.2mmol，244.17g/mol)和CHCl3(15mL)，在氩气下冷却至0℃，并用2分钟时间逐滴加入溶于CHCl3(5mL)的二-叔-丁基碳酸酯(1.9g，9.0mmol)。混合物用1N KOH(2mL)处理，在2小时内加入。加入饱和的NaCl溶液破碎所得乳液，将各层分离，水相用CH2Cl2(2×1.5ml)提取。合并的有机相用硫酸钠干燥，过滤，在真空下浓缩以得到淡黄色固体状的[4-(3-叔-丁基-5-氨基-1H-吡唑-1-基)-2-甲氧基苄基氨基甲酸叔丁酯(2.23g，79％)。1H NMR(CDCl3)：δ7.4(m，5H)，5.6(s，1H)，4.4(d，2H)，1.5(s，9H)，1.3(s，9H)。
                             实施例43
Figure A20038011004900701
在一个40mL小瓶上装置隔片、搅拌棒和氩气源，并装入实施例V(2g，5.81mmol)，用氩气吹扫，并溶于CHCl3(20mL)。溶液用溶于CHCl3(5mL)的2-萘基异氰酸酯(984mg，5.81mmol)处理，在1分钟内加入。将反应物搅拌8h，再加入1-萘基异氰酸酯(81mg)并将反应物搅拌过夜。将固体过滤并用CH2Cl2洗涤以得到4-[3-叔-丁基-5-(3-萘-1-基)脲基]-1H-吡唑-1-基]苄基氨基甲酸叔丁酯(1.2g)。HPLC纯度：94.4％；1H NMR(DMSO-d6)：δ9.1(s，1H)，8.8(s，1H)，8.0(m，3H)，7.6(m，9H)，6.4(s，1H)，4.2(d，2H)，1.4(s，9H)，1.3(s，9H)。
                             实施例44
Figure A20038011004900702
标题化合物是用与实施例43类似的方法用实施例V(2.0g，5.81mmol)和对-氯苯基异氰酸酯(892mg)合成的，得到叔-丁基4-[3-叔-丁基-5-(3-(4-氯苯基)脲基)-1H-吡唑-1-基]苄基氨基甲酸酯(1.5g)。HPLC纯度：97％；1H NMR(DMSO-d6)：δ9.2(s，1H)，8.4(s，1H)，7.4(m，8H)，6.4(s，1H)，4.2(d，2H)，1.4(s，9H)，1.3(s，9H)。
                             实施例45
用氩气吹扫一个放入搅拌棒的10mL烧瓶，并在其中装入实施例43(770mg，1.5mmol)和CH2Cl2(1ml)和1∶1的CH2Cl2∶TFA(2.5mL)。1.5小时后，在真空下浓缩反应混合物，将残余物溶于EtOAc(15mL)，用饱和的NaHCO3(10mL)和饱和的NaCl(10mL)洗涤。将有机层干燥，过滤，并在真空下浓缩，得到1-{3-叔-丁基-1-[4-(氨基甲基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(萘-1-基)脲(710mg)。1H NMR(DMSO-d6)：δ7.4(m，11H)，6.4(s，1H)，3.7(s，2H)，1.3(s，9H)。
                             实施例46
Figure A20038011004900712
标题化合物是用与实施例45类似的方法用实施例44(1.5g，1.5mmol)合成的，得到1-{3-叔-丁基-1-[4-(氨基甲基)苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲(1.0g)。HPLC纯度：93.6％；mp：100-102；1H NMR(CDCl3)：δ8.6(s，1H)，7.3(m，8H)，6.3(s，1H)，3.7(brs，2H)，1.3(s，9H)。
                             实施例47
Figure A20038011004900721
在氩气下，在10ml的小瓶中装入实施例45(260mg，63mmol)和无水EtOH(3mL)。用3分钟逐滴加入二乙烯砜(63uL，74mg，.63mmol)并将反应物在室温下搅拌1.5小时。在真空下浓缩以得到黄色固体，通过制备型TLC进行纯化，用5％MeOH∶CH2Cl2展开。切下主要的条带，并用1∶1 EtOAc∶MeOH洗脱去硅，过滤，并在真空下浓缩以得到1-{3-叔-丁基-1-[4-(1，1-二氧代硫代吗啉-4-基)甲基苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(萘-1-基)脲(150mg)。HPLC纯度：96％；1H NMR(DMSO-d6)：δ9.1(s，1H)，9.0(s，1H)，7.9(m，3H)，7.5(m，8H)，6.4(s，1H)，3.1(brs，4H)，2.9(brs，4H)，1.3(s，9H)。
                             实施例48
Figure A20038011004900722
标题化合物是用与实施例47类似的方法用实施例46(260mg，0.66mmol)合成的，得到1-{3-叔-丁基-1-[4-(1，1-二氧代硫代吗啉-4-基)甲基苯基]-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲(180mg)。HPLC纯度：93％；mp：136-138；1H NMR(DMSO-d6)：δ9.2(s，1H)，8.5(s，1H)，7.4(m，9H)，6.4(s，1H)，3.1(brs，4H)，3.0(brs，4H)，1.3(s，9H)。
                             实施例49
Figure A20038011004900731
0℃下，在氯磺酰异氰酸酯(0.35g，5mmol)的CH2Cl2(20mL)溶液中边搅拌边加入吡咯烷(0.18g，5mmol)，加入速度为不使反应物的温度超过5℃。搅拌2小时后加入实施例41(1.10g，6.5mmol)和三乙胺(0.46g，9mmol)的CH2Cl2(20mL)溶液。当加入结束时，使混合物回复室温并搅拌过夜。将反应混合物倒入用NaCl饱和的10％HCl(10mL)，将有机层分离并用乙醚(20mL)提取水层。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并在真空下浓缩，通过制备型HPLC纯化以得到(吡咯烷-1-羰基)氨基磺酸3-[3-叔-丁基-5-(3-萘-1-基-脲基)-吡唑-1-基]苯酯(40mg)。1H NMR(CD3)：δ9.12(brs，1H)，8.61(brs，1H)，7.85-7.80(m，3H)，7.65(d，J＝8.0Hz，2H)，7.53-7.51(m，1H)，7.45-7.25(m，5H)，6.89(s，4H)，3.36-3.34(brs，1H)，3.14-3.13(brs，2H)，1.69(brs，2H)，1.62(brs，2H)，1.39(s，9H)；MS(ESI)m/z：577(M+H+)。
                             实施例50
标题化合物是用与实施例49类似的方法用实施例42合成的，得到(吡咯烷-1-羰基)氨基磺酸3-[3-叔-丁基-5-(4-氯苯基-1基-脲基)吡唑-1基]苯酯。MS(ESI)m/z：561(M+H+)。
                             实施例W
Figure A20038011004900741
将固体4-甲氧基苯基肼盐酸(25.3g)悬浮于甲苯(100mL)并用三乙胺(20.2g)处理。混合物在室温下搅拌30分钟并用新戊酰乙腈(18g)处理。将反应物加热回流并搅拌过夜。过滤热的混合物，固体用己烷洗涤并在真空下干燥以得到3-叔-丁基-1-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-胺(25g，70％)。1H NMR(DMSO-d6)：δ7.5(d，2H)，7.0(d，1H)，6.4(s，1H)，6.1(s，2H)，3.9(s，3H)，1.3(s，9H)。
                             实施例51
Figure A20038011004900742
在1-异氰酸根-4-甲氧基-萘(996mg)的无水CH2Cl2(20mL)溶液中加入实施例W(1.23g)。将反应溶液搅拌3小时，将所得白色沉淀过滤，用10％HCl处理并从MeOH中重结晶，在真空下干燥以得到白色晶体状的1[3-叔-丁基-1(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-(1-甲氧基萘-4-基-脲(900mg，40％)。HPLC纯度：96％；mp：143-144；1H NMR(DMSO-d6)：δ8.8(s，1H)，8.5(s，1H)，8.2(d，1H)，8.0(d，1H)，7.6(m，5H)，7.1(d，2H)，7.0(d，1H)，6.3(s，1H)，4.0(s，3H)，3.9(s，3H)；1.3(s，9H)。
                             实施例52
标题化合物是用与实施例51类似的方法用实施例W和对-溴苯基异氰酸酯(990mg)合成的，得到灰白色晶体状的1-{3-叔-丁基-1-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-基}-3-(4-溴苯基)脲(1.5g，68％)。HPLC纯度：98％；mp：200-201；1HNMR(DMSO-d6)：δ9.3(s，1H)，8.3(s，1H)，7.4(m，6H)，7.0(d，2H)，6.3(s，1H)，3.8(s，3H)，1.3(s，9H)。
                             实施例53
Figure A20038011004900752
标题化合物是用与实施例51类似的方法用实施例W和对-氯苯基异氰酸酯(768mg)合成的，得到白色晶体状的1-{3-叔-丁基-1-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲(1.3g，65％)。HPLC纯度：98％；mp：209-210；1H NMR(DMSO-d6)：δ9.1(s，1H)，8.3(s，1H)，7.4(m，4H)，7.3(d，2H)，7.1(d，2H)，6.3(s，1H)，3.8(s，3H)，1.3(s，9H)。
                             实施例54
Figure A20038011004900753
标题化合物是用与实施例41类似的方法用实施例53(500mg)合成的，得到白色晶体状的1-{3-叔-丁基-1-(4-羟基苯基)-1H-吡唑-5-基}-3-(4-氯苯基)脲(300mg，62％)。HPLC纯度：94％；mp：144-145；1H NMR(DMSO-d6)：δ9.7(s，1H)，9.1(s，1H)，8.3(s，1H)，7.4(d，2H)，7.3(m，4H)；6.9(d，2H)，6.3(s，1H)，1.3(s，9H)
                             实施例55
标题化合物是用与实施例41类似的方法用实施例52(550mg)合成的，得到白色结晶固体状的1-{3-叔-丁基-1-(4-羟基苯基)-1H-吡唑-5-基}-3-(4-溴苯基)脲(400mg，70％)。HPLC纯度：93％；mp：198-200；1H NMR(DMSO-d6)：δ9.7(s，1H)，9.2(s，1H)，8.3(s，1H)，7.4(d，4H)，7.2(m，2H)，6.9(d，2H)，6.3(s，1H)，1.3(s，9H)。
                             实施例X
Figure A20038011004900762
甲基4-(3-叔-丁基-5-氨基-1H-吡唑-1-基)苯甲酸酯(3.67mmol)是按照Regan等的方法(J.Med.Chem.，45，2994(2002))从甲基4-肼基苯甲酸酯和新戊酰乙腈制备的。
                             实施例56
在一个500mL的圆底烧瓶中放入磁力搅拌棒并置于冰浴中。在该烧瓶中装入实施例X(1g)并将其溶于CH2Cl2(100mL)。加入饱和碳酸氢钠(100mL)并迅速搅拌混合物，用冰浴冷却并用双光气(1.45g)处理，并将不均一的混合物搅拌1小时。将各层分离，CH2Cl2层用叔丁醇(1.07g)处理，溶液在室温下搅拌过夜。该溶液用水(2×150mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，在真空下浓缩，并通过急骤层析纯化，用1∶2乙酸乙酯∶己烷作为洗脱液，得到灰白色固体状的1-(4-(甲氧基羰基)苯基)-3-叔-丁基-1H-吡唑-5-基氨基甲酸叔丁酯(100mg)。1HNMR(DMSO-D6)：δ9.2(s，1H)，8.1(d，2H)，7.7(d，2H)，6.3(s，1H)，3.3(s，3H)，1.3(s，18H)。
                             实施例57
Figure A20038011004900772
标题化合物是用与实施例41类似的方法用实施例X(1.37g)和对-氯苯基异氰酸酯(768mg)合成的，得到白色晶体状的4-{3-叔-丁基-5-[3-(4-氯苯基)脲基]-1H-吡唑-1-基}苯甲酸甲酯(1.4g 66％)。HPLC纯度：98％；mp：160-161；1H NMR(DMSO-d6)：δ9.2(s，1H)，8.6(s，1H)，8.1(d，2H)，7.8(d，2H)，7.5(d，2H)，7.3(d，2H)，6.4(s，1H)，3.9(s，3H)，1.3(s，9H)。
                             实施例58
标题化合物是用与实施例41类似的方法用实施例X(1.27g)和1-异氰酸根-4-甲氧基-萘(996mg)合成的，得到白色晶体状的4-{3-叔-丁基-5-[3-(1-甲氧基萘-4-基)脲基]-1H-吡唑-1-基}苯甲酸甲酯(845mg，36％)。HPLC纯度：98％；mp：278-280；1H NMR(DMSO-d6)：δ8.76(s，1H)，8.73(s，1H)，8.1(m，3H)，7.9(d，1H)，7.7(d，2H)，7.6(m，3H)，7.0(d，1H)，7.0(d，1H)，6.3(s，1H)，4.0(s，3H)，3.9(s，3H)，1.3(s，9H)。
                             实施例59
Figure A20038011004900782
标题化合物是用与实施例41类似的方法用实施例X(1.37g)和对-溴苯基异氰酸酯(990mg)合成的，得到白色晶体状的4-3-叔-丁基-5-[3-(4-溴苯基)脲基]-1H-吡唑-1-基}苯甲酸甲酯(1.4g，59％)。HPLC纯度：94％；mp：270272；1H NMR(DMSO-d6)：δ9.2(s，1H)，8.6(s，1H)，8.1(d，2H)，7.7(d，2H)，7.4(d，4H)，6.4(s，1H)，3.9(s，3H)，1.3(s，9H)。
                             实施例60
-78℃下，在溶于30mL甲苯的实施例59(700mg)的溶液中用10分钟逐滴加入二异丁基氢化铝的甲苯溶液(1M，溶于甲苯，7.5mL)。反应混合物在-78℃搅拌30分钟，然后在0℃搅拌30分钟。反应混合物在真空下浓缩至干并用水处理。将固体过滤并用乙腈处理。将溶液蒸发至干，并将残余物溶于乙酸乙酯，用己烷沉淀以得到黄色固体，将其在真空下干燥以得到1-[3-叔-丁基-1-(4-羟基甲基)苯基]-1H-吡唑-5-基)脲(400mg，61％)。HPLC纯度：95％；1H NMR(DMSO-d6)：δ9.2(s，1H)，8.4(s，1H)，7.5(m，8H)，6.4(s，1H)，5.3(t，1H)，4.6(d，2H)，1.3(s，9H)。
上面提到的所有参考资料纳入本文作为参考。此外，还将两个同时提交的申请，即抗炎药物(Anti-Inflammatory Medicaments)，S/N＿＿，＿＿提交和抗癌药物(Anti-Cancer Medicaments)，S/N＿＿，＿＿提交，并入本文作为参考。
                                                序列表
<110>迪赛孚尔药品研制有限公司(Deciphera Pharmaceuticals，Inc.)
     D.L.费林(Flynn，Daniel L)
     P.A.彼得里洛(Petillo，Peter A)
<120>蛋白质功能性的调控
<130>34475
<150>US 60/437,487
<151>2002-12-31
<160>38
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
Asp Phe Gly Leu Ser Arg Leu Met Thr Gly Asp Thr Tyr Thr Ala His
1               5                   10                  15
<210>2
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>X是肉豆蔻酰(myristolyl)
<400>2
Xaa Gly Gln Gln Pro Gly Lys Val Leu Gly Asp Gln Arg Arg Pro Ser
1               5                   10                  15
Leu
<210>3
<211>360
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
Met Ser Gln Glu Arg Pro Thr Phe Tyr Arg Gln Glu Leu Asn Lys Thr
1               5                   10                  15
Ile Trp Glu Val Pro Glu Arg Tyr Gln Asn Leu Ser Pro Val Gly Ser
            20                  25                  30
Gly Ala Tyr Gly Ser Val Cys Ala Ala Phe Asp Thr Lys Thr Gly Leu
        35                  40                  45
Arg Val Ala Val Lys Lys Leu Ser Arg Pro Phe Gln Ser Ile Ile His
    50                  55                  60
Ala Lys Arg Thr Tyr Arg Glu Leu Arg Leu Leu Lys His Met Lys His
65                  70              75                      80
Glu Asn Val Ile Gly Leu Leu Asp Val Phe Thr Pro Ala Arg Ser Leu
                85                  90                  95
Glu Glu Phe Ash Asp Val Tyr Leu Val Thr His Leu Met Gly Ala Asp
    100                         105                 110
Leu Asn Asn Ile Val Lys Cys Gln Lys Leu Thr Asp Asp His Val Gln
        115                 120                 125
Phe Leu Ile Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala
    130                 135                 140
Asp Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Ala Val Asn Glu
145                 150                 155                 160
Asp Cys Glu Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg His Thr Asp
                165                 170                 175
Asp Glu Met Thr Gly Tyr Val Ala Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu
            180                 185                 190
Ile Met Leu Asn Trp Met His Tyr Asn Gln Thr Val Asp Ile Trp Ser
        195                 200                 205
Val Gly Cys Ile Met Ala Glu Leu Leu Thr Gly Arg Thr Leu Phe Pro
    210                 215                 220
Gly Thr Asp His Ile Asp Gln Leu Lys Leu Ile Leu Arg Leu Val Gly
225                 230                 235                 240
Thr Pro Gly Ala Glu Leu Leu Lys Lys Ile Ser Ser Glu Ser Ala Arg
                245                 250                 255
Asn Tyr Ile Gln Ser Leu Thr Gln Met Pro Lys Met Asn Phe Ala Asn
            260                 265                 270
Val Phe Ile Gly Ala Asn Pro Leu Ala Val Asp Leu Leu Glu Lys Met
        275                 280                 285
Leu Val Leu Asp Ser Asp Lys Arg Ile Thr Ala Ala Gln Ala Leu Ala
    290                 295                 300
His Ala Tyr Phe Ala Gln Tyr His Asp Pro Asp Asp Glu Pro Val Ala
305                 310                 315                 320
Asp Pro Tyr Asp Gln Ser Phe Glu Ser Arg Asp Leu Leu Ile Asp Glu
                325                 330                 335
Trp Lys Ser Leu Thr Tyr Asp Glu Val Ile Ser Phe Val Pro Pro Pro
            340                 345                 350
Leu Asp Gln Glu Glu Met Glu Ser
        355                 360
<210>4
<211>24
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
Asp Phe Gly Leu Ala Arg His Thr Asp Asp Glu Met Thr Gly Tyr Val
1               5                   10                  15
Ala Thr Arg Trp Tyr Arg Thr Tyr
            20
<210>5
<211>21
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>5
Asp Phe Gly Ser Ala Lys Gln Leu Val Lys Gly Glu Pro Asn Val Ser
1               5                   10                  15
Tyr Ile Cys Ser Lys
            20
<210>6
<211>10
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>6
Gly Arg Pro Arg Thr Thr Ser Phe Ala Glu
1               5                   10
<210>7
<211>21
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>7
Asp Phe Gly Met Thr Arg Asp Ile Tyr Glu Thr Asp Tyr Tyr Arg Lys
1               5                   10                  15
Gly Gly Lys Gly Leu
            20
<210>8
<211>11
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>8
Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser
1               5                   10
<210>9
<211>12
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>9
Thr Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Pro Leu Leu
1               5                   10
<210>10
<211>1123
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>10
Met Leu Glu Ile Cys Leu Lys Leu Val Gly Cys Lys Ser Lys Lys Gly
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Ser Ser Ser Cys Tyr Leu Glu Glu Ala Leu Gln Arg Pro
            20                  25                  30
Val Ala Ser Asp Phe Glu Pro Gln Gly Leu Ser Glu Ala Ala Arg Trp
        35                  40                  45
Asn Ser Lys Glu Asn Leu Leu Ala Gly Pro Ser Glu Asn Asp Pro Asn
    50                  55                  60
Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Phe Val Ala Ser Gly Asp Asn Thr Leu
65                  70                  75                  80
Ser Ile Thr Lys Gly Glu Lys Leu Arg Val Leu Gly Tyr Asn His Asn
                85                  90                  95
Gly Glu Trp Cys Glu Ala Gln Thr Lys Asn Gly Gln Gly Trp Val Pro
            100                 105                 110
Ser Asn Tyr Ile Thr Pro Val Asn Ser Leu Glu Lys His Ser Trp Tyr
        115                 120                 125
His Gly Pro Val Ser Arg Asn Ala Ala Glu Tyr Leu Leu Ser Ser Gly
    130                 135                 140
Ile Asn Gly Ser Phe Leu Val Arg Glu Ser Glu Ser Ser Pro Gly Gln
145                 150                 155                 160
Arg Ser Ile Ser Leu Arg Tyr Glu Gly Arg Val Tyr His Tyr Arg Ile
            165                 170                     175
Asn Thr Ala Ser Asp Gly Lys Leu Tyr Val Ser Ser Glu Ser Arg Phe
            180                 185                 190
Asn Thr Leu Ala Glu Leu Val His His His Ser Thr Val Ala Asp Gly
        195                 200                 205
Leu Ile Thr Thr Leu His Tyr Pro Ala Pro Lys Arg Asn Lys Pro Thr
    210                 215                 220
Ile Tyr Gly Val Ser Pro Asn Tyr Asp Lys Trp Glu Met Glu Arg Thr
225                 230                 235                 240
Asp Ile Thr Met Lys His Lys Leu Gly Gly Gly Gln Tyr Gly Glu Val
                245                 250                 255
Tyr Glu Gly Val Trp Lys Lys Tyr Ser Leu Thr Val Ala Val Lys Thr
            260                 265                 270
Leu Lys Glu Asp Thr Met Glu Val Glu Glu Phe Leu Lys Glu Ala Ala
        275                 280                 285
Val Met Lys Glu Ile Lys His Pro Asn Leu Val Gln Leu Leu Gly Val
    290                 295                 300
Cys Thr Arg Glu Pro Pro Phe Tyr Ile Ile Thr Glu Phe Met Thr Tyr
305                 310                 315                 320
Gly Asn Leu Leu Asp Tyr Leu Arg Glu Cys Asn Arg Gln Glu Val Ser
                325                 330                 335
Ala Val Val Leu Leu Tyr Met Ala Thr Gln Ile Ser Ser Ala Met Glu
            340                 345                 350
Tyr Leu Glu Lys Lys Asn Phe Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn
        355                 360                 365
Cys Leu Val Gly Glu Asn His Leu Val Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu
    370                 375                 380
Ser Arg Leu Met Thr Gly Asp Thr Tyr Thr Ala His Ala Gly Ala Lys
385                 390                 395                 400
Phe Pro Ile Lys Trp Thr Ala Pro Glu Ser Leu Ala Tyr Asn Lys Phe
                405                 410                 415
Ser Ile Lys Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile
            420                 425                 430
Ala Thr Tyr Gly Met Ser Pro Tyr Pro Gly Ile Asp Leu Ser Gln Val
        435                 440                 445
Tyr Glu Leu Leu Glu Lys Asp Tyr Arg Met Glu Arg Pro Glu Gly Cys
    450                 455                 460
Pro Glu Lys Val Tyr Glu Leu Met Arg Ala Cys Trp Gln Trp Asn Pro
465                 470                 475                 480
Ser Asp Arg Pro Ser Phe Ala Glu Ile His Gln Ala Phe Glu Thr Met
                485                 490                 495
Phe Gln Glu Ser Ser Ile Ser Asp Glu Val Glu Lys Glu Leu Gly Lys
            500                 505                 510
Arg Gly Thr Arg Gly Gly Ala Gly Ser Met Leu Gln Ala Pro Glu Leu
        515                 520                 525
Pro Thr Lys Thr Arg Thr Cys Arg Arg Ala Ala Glu Gln Lys Asp Ala
    530                 535                 540
Pro Asp Thr Pro Glu Leu Leu His Thr Lys Gly Leu Gly Glu Ser Asp
545                 550                 555                 560
Ala Leu Asp Ser Glu Pro Ala Val Ser Pro Leu Leu Pro Arg Lys Glu
                565                 570                 575
Arg Gly Pro Pro Asp Gly Ser Leu Asn Glu Asp Glu Arg Leu Leu Pro
            580                 585                 590
Arg Asp Arg Lys Thr Asn Leu Phe Ser Ala Leu Ile Lys Lys Lys Lys
        595                 600                 605
Lys Met Ala Pro Thr Pro Pro Lys Arg Ser Ser Ser Phe Arg Glu Met
    610                 615                 620
Asp Gly Gln Pro Asp Arg Arg Gly Ala Ser Glu Asp Asp Ser Arg Glu
625                 630                 635                 640
Leu Cys Asn Gly Pro Pro Ala Leu Thr Ser Asp Ala Ala Glu Pro Thr
                645                 650                 655
Lys Ser Pro Lys Ala Ser Asn Gly Ala Gly Val Pro Asn Gly Ala Phe
            660                 665                 670
Arg Glu Pro Gly Asn Ser Gly Phe Arg Ser Pro His Met Trp Lys Lys
        675                 680                 685
Ser Ser Thr Leu Thr Gly Ser Arg Leu Ala Ala Ala Glu Glu Glu Ser
    690                 695                 700
Gly Met Ser Ser Ser Lys Arg Phe Leu Arg Ser Cys Ser Ala Ser Cys
705                 710                 715                 720
Met Pro His Gly Ala Arg Asp Thr Glu Trp Arg Ser Val Thr Leu Pro
                725                 730                 735
Arg Asp Leu Pro Ser Ala Gly Lys Gln Phe Asp Ser Ser Thr Phe Gly
            740                 745                 750
Gly His Lys Ser Glu Lys Pro Ala Leu Pro Arg Lys Arg Thr Ser Glu
        755                 760                 765
Ser Arg Ser Glu Gln Val Ala Lys Ser Thr Ala Met Pro Leu Pro Gly
    770                 775                 780
Trp Leu Lys Lys Asn Glu Glu Ala Ala Glu Glu Gly Phe Lys Asp Thr
785                 790                 795                 800
Glu Ser Ser Pro Gly Ser Ser Pro Pro Ser Leu Thr Pro Lys Leu Leu
                805                 810                 815
Arg Arg Gln Val Thr Ala Ser Pro Ser Ser Gly Leu Ser His Lys Glu
            820                 825                 830
Glu Ala Thr Lys Gly Ser Ala Ser Gly Met Gly Thr Pro Ala Thr Ala
        835                 840                 845
Glu Pro Ala Pro Pro Ser Asn Lys Val Gly Leu Ser Lys Ala Ser Ser
    850                 855                 860
Glu Glu Met Arg Val Arg Arg His Lys His Ser Ser Glu Ser Pro Gly
865                 870                 875                 880
Arg Asp Lys Gly Arg Leu Ala Lys Leu Lys Pro Ala Pro Pro Pro Pro
                885                 890                 895
Pro Ala Cys Thr Gly Lys Ala Gly Lys Pro Ala Gln Ser Pro Ser Gln
            900                 905                 910
Glu Ala Gly Glu Ala Gly Gly Pro Thr Lys Thr Lys Cys Thr Ser Leu
        915                 920                 925
Ala Met Asp Ala Val Asn Thr Asp Pro Thr Lys Ala Gly Pro Pro Gly
    930                 935                 940
Glu Gly Leu Arg Lys Pro Val Pro Pro Ser Val Pro Lys Pro Gln Ser
945                 950                 955                 960
Thr Ala Lys Pro Pro Gly Thr Pro Thr Ser Pro Val Ser Thr Pro Ser
                965                 970                 975
Thr Ala Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ala Gly Asp Gln Gln Pro Ser Ser
            980                 985                 990
Ala Ala Phe Ile Pro Leu Ile Ser Thr Arg Val Ser Leu Arg Lys Thr
        995                 1000                1005
Arg Gln Pro Pro Glu Arg Ile Ala Ser Gly Thr Ile Thr Lys Gly
    1010                1015                1020
Val Val Leu Asp Ser Thr Glu Ala Leu Cys Leu Ala Ile Ser Arg
    1025                1030                1035
Asn Ser Glu Gln Met Ala Ser His Ser Ala Val Leu Glu Ala Gly
    1040                1045                1050
Lys Asn Leu Tyr Thr Phe Cys Val Ser Tyr Val Asp Ser Ile Gln
    1055                1060                1065
Gln Met Arg Asn Lys Phe Ala Phe Arg Glu Ala Ile Asn Lys Leu
    1070                1075                1080
Glu Ser Asn Leu Arg Glu Leu Gln Ile Cys Pro Ala Thr Ala Ser
    1085                1090                1095
Ser Gly Pro Ala Ala Thr Gln Asp Phe Ser Lys Leu Leu Ser Ser
    1100                1105                1110
Val Lys Glu Ile Ser Asp Ile Val Arg Arg
    1115                1120
<210>11
<211>1123
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>11
Met Leu Glu Ile Cys Leu Lys Leu Val Gly Cys Lys Ser Lys Lys Gly
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Ser Ser Ser Cys Tyr Leu Glu Glu Ala Leu Gln Arg Pro
        20                      25                  30
Val Ala Ser Asp Phe Glu Pro Gln Gly Leu Ser Glu Ala Ala Arg Trp
        35                  40                  45
Asn Ser Lys Glu Asn Leu Leu Ala Gly Pro Ser Glu Asn Asp Pro Asn
    50                  55                  60
Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Phe Val Ala Ser Gly Asp Asn Thr Leu
65                  70                  75                  80
Ser Ile Thr Lys Gly Glu Lys Leu Arg Val Leu Gly Tyr Asn His Asn
                85                  90                  95
Gly Glu Trp Cys Glu Ala Gln Thr Lys Asn Gly Gln Gly Trp Val Pro
            100                 105                 110
Ser Asn Tyr Ile Thr Pro Val Asn Ser Leu Glu Lys His Ser Trp Tyr
        115                 120                 125
His Gly Pro Val Ser Arg Asn Ala Ala Glu Tyr Leu Leu Ser Ser Gly
    130                 135                 140
Ile Asn Gly Ser Phe Leu Val Arg Glu Ser Glu Ser Ser Pro Gly Gln
145                 150                 155                 160
Arg Ser Ile Ser Leu Arg Tyr Glu Gly Arg Val Tyr His Tyr Arg Ile
                165                 170                 175
Asn Thr Ala Ser Asp Gly Lys Leu Tyr Val Ser Ser Glu Ser Arg Phe
            180                 185                 190
Asn Thr Leu Ala Glu Leu Val His His His Ser Thr Val Ala Asp Gly
        195                 200                 205
Leu Ile Thr Thr Leu His Tyr Pro Ala Pro Lys Arg Asn Lys Pro Thr
    210                 215                 220
Ile Tyr Gly Val Ser Pro Asn Tyr Asp Lys Trp Glu Met Glu Arg Thr
225                 230                 235                 240
Asp Ile Thr Met Lys His Lys Leu Gly Gly Gly Gln Tyr Gly Glu Val
                245                 250                 255
Tyr Glu Gly Val Trp Lys Lys Tyr Ser Leu Thr Val Ala Val Lys Thr
            260                 265                 270
Leu Lys Glu Asp Thr Met Glu Val Glu Glu Phe Leu Lys Glu Ala Ala
        275                 280                 285
Val Met Lys Glu Ile Lys His Pro Asn Leu Val Gln Leu Leu Gly Val
    290                 295                 300
Cys Thr Arg Glu Pro Pro Phe Tyr Ile Ile Thr Glu Phe Met Thr Tyr
305                 310                 315                 320
Gly Asn Leu Leu Asp Tyr Leu Arg Glu Cys Asn Arg Gln Glu Val Ser
                325                 330                 335
Ala Val Val Leu Leu Tyr Met Ala Thr Gln Ile Ser Ser Ala Met Glu
            340                 345                 350
Tyr Leu Glu Lys Lys Asn Phe Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn
        355                 360                 365
Cys Leu Val Gly Glu Asn His Leu Val Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu
    370                 375                 380
Ser Arg Leu Met Thr Gly Asp Thr Tyr Thr Ala His Ala Gly Ala Lys
385                 390                 395                 400
Phe Pro Ile Lys Trp Thr Ala Pro Glu Ser Leu Ala Tyr Asn Lys Phe
                405                 410                 415
Ser Ile Lys Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile
            420                 425                 430
Ala Thr Tyr Gly Met Ser Pro Tyr Pro Gly Ile Asp Leu Ser Gln Val
        435                 440                 445
Tyr Glu Leu Leu Glu Lys Asp Tyr Arg Met Glu Arg Pro Glu Gly Cys
    450                 455                 460
Pro Glu Lys Val Tyr Glu Leu Met Arg Ala Cys Trp Gln Trp Asn Pro
465                 470                 475                 480
Ser Asp Arg Pro Ser Phe Ala Glu Ile His Gln Ala Phe Glu Thr Met
                485                 490                 495
Phe Gln Glu Ser Ser Ile Ser Asp Glu Val Glu Lys Glu Leu Gly Lys
            500                 505                 510
Arg Gly Thr Arg Gly Gly Ala Gly Ser Met Leu Gln Ala Pro Glu Leu
        515                 520                 525
Pro Thr Lys Thr Arg Thr Cys Arg Arg Ala Ala Glu Gln Lys Asp Ala
    530                 535                 540
Pro Asp Thr Pro Glu Leu Leu His Thr Lys Gly Leu Gly Glu Ser Asp
545                 550                 555                 560
Ala Leu Asp Ser Glu Pro Ala Val Ser Pro Leu Leu Pro Arg Lys Glu
                565                 570                 575
Arg Gly Pro Pro Asp Gly Ser Leu Asn Glu Asp Glu Arg Leu Leu Pro
            580                 585                 590
Arg Asp Arg Lys Thr Asn Leu Phe Ser Ala Leu Ile Lys Lys Lys Lys
        595                 600                 605
Lys Met Ala Pro Thr Pro Pro Lys Arg Ser Ser Ser Phe Arg Glu Met
    610                 615                 620
Asp Gly Gln Pro Asp Arg Arg Gly Ala Ser Glu Asp Asp Ser Arg Glu
625                 630                 635                 640
Leu Cys Asn Gly Pro Pro Ala Leu Thr Ser Asp Ala Ala Glu Pro Thr
                645                 650                 655
Lys Ser Pro Lys Ala Ser Asn Gly Ala Gly Val Pro Asn Gly Ala Phe
            660                 665                 670
Arg Glu Pro Gly Asn Ser Gly Phe Arg Ser Pro His Met Trp Lys Lys
        675                 680                 685
Ser Ser Thr Leu Thr Gly Ser Arg Leu Ala Ala Ala Glu Glu Glu Ser
    690                 695                 700
Gly Met Ser Ser Ser Lys Arg Phe Leu Arg Ser Cys Ser Ala Ser Cys
705                 710                 715                 720
Met Pro His Gly Ala Arg Asp Thr Glu Trp Arg Ser Val Thr Leu Pro
                725                 730                 735
Arg Asp Leu Pro Ser Ala Gly Lys Gln Phe Asp Ser Ser Thr Phe Gly
            740                 745                 750
Gly His Lys Ser Glu Lys Pro Ala Leu Pro Arg Lys Arg Thr Ser Glu
        755                 760                 765
Ser Arg Ser Glu Gln Val Ala Lys Ser Thr Ala Met Pro Leu Pro Gly
    770                 775                 780
Trp Leu Lys Lys Asn Glu Glu Ala Ala Glu Glu Gly Phe Lys Asp Thr
785                 790                 795                 800
Glu Ser Ser Pro Gly Ser Ser Pro Pro Ser Leu Thr Pro Lys Leu Leu
                805                 810                 815
Arg Arg Gln Val Thr Ala Ser Pro Ser Ser Gly Leu Ser His Lys Glu
            820                 825                 830
Glu Ala Thr Lys Gly Ser Ala Ser Gly Met Gly Thr Pro Ala Thr Ala
        835                 840                 845
Glu Pro Ala Pro Pro Ser Asn Lys Val Gly Leu Ser Lys Ala Ser Ser
    850                 855                 860
Glu Glu Met Arg Val Arg Arg His Lys His Ser Ser Glu Ser Pro Gly
865                 870                 875                 880
Arg Asp Lys Gly Arg Leu Ala Lys Leu Lys Pro Ala Pro Pro Pro Pro
                885                 890                 895
Pro Ala Cys Thr Gly Lys Ala Gly Lys Pro Ala Gln Ser Pro Ser Gln
            900                 905                 910
Glu Ala Gly Glu Ala Gly Gly Pro Thr Lys Thr Lys Cys Thr Ser Leu
        915                 920                 925
Ala Met Asp Ala Val Asn Thr Asp Pro Thr Lys Ala Gly Pro Pro Gly
    930                 935                 940
Glu Gly Leu Arg Lys Pro Val Pro Pro Ser Val Pro Lys Pro Gln Ser
945                 950                 955                 960
Thr Ala Lys Pro Pro Gly Thr Pro Thr Ser Pro Val Ser Thr Pro Ser
                965                 970                 975
Thr Ala Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ala Gly Asp Gln Gln Pro Ser Ser
            980                 985                 990
Ala Ala Phe Ile Pro Leu Ile Ser Thr Arg Val Ser Leu Arg Lys Thr
        995                 1000                1005
Arg Gln Pro Pro Glu Arg Ile Ala Ser Gly Thr Ile Thr Lys Gly
    1010                1015                1020
Val Val Leu Asp Ser Thr Glu Ala Leu Cys Leu Ala Ile Ser Arg
    1025                1030                1035
Asn Ser Glu Gln Met Ala Ser His Ser Ala Val Leu Glu Ala Gly
    1040                1045                1050
Lys Asn Leu Tyr Thr Phe Cys Val Ser Tyr Val Asp Ser Ile Gln
    1055                1060                1065
Gln Met Arg Asn Lys Phe Ala Phe Arg Glu Ala Ile Asn Lys Leu
    1070                1075                1080
Glu Ser Asn Leu Arg Glu Leu Gln Ile Cys Pro Ala Thr Ala Ser
    1085                1090                1095
Ser Gly Pro Ala Ala Thr Gln Asp Phe Ser Lys Leu Leu Ser Ser
    1100                1105                1110
Val Lys Glu Ile Ser Asp Ile Val Arg Arg
    1115                1120
<210>12
<211>537
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>链
<222>(1)..(537)
<223>10PL的A链
<400>12
Met Gly Gln Gln Pro Gly Lys Val Leu Gly Asp Gln Arg Arg Pro Ser
1               5                   10                  15
Leu Pro Ala Leu His Phe Ile Lys Gly Ala Gly Lys Arg Asp Ser Ser
            20                  25                  30
Arg His Gly Gly Pro His Cys Asn Val Phe Val Glu His Glu Ala Leu
        35                  40                  45
Gln Arg Pro Val Ala Ser Asp Phe Glu Pro Gln Gly Leu Ser Glu Ala
    50                  55                  60
Ala Arg Trp Asn Ser Lys Glu Asn Leu Leu Ala Gly Pro Ser Glu Asn
65                  70                  75                  80
Asp Pro Asn Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Phe Val Ala Ser Gly Asp
                85                  90                  95
Asn Thr Leu Ser Ile Thr Lys Gly Glu Lys Leu Arg Val Leu Gly Tyr
    100                         105                 110
Asn His Asn Gly Glu Trp Cys Glu Ala Gln Thr Lys Asn Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Trp Val Pro Ser Asn Tyr Ile Thr Pro Val Asn Ser Leu Glu Lys His
    130                 135                 140
Ser Trp Tyr His Gly Pro Val Ser Arg Asn Ala Ala Glu Tyr Leu Leu
145                 150                 155                 160
Ser Ser Gly Ile Asn Gly Ser Phe Leu Val Arg Glu Ser Glu Ser Ser
                165                 170                 175
Pro Gly Gln Arg Ser Ile Ser Leu Arg Tyr Glu Gly Arg Val Tyr His
            180                 185                 190
Tyr Arg Ile Asn Thr Ala Ser Asp Gly Lys Leu Tyr Val Ser Ser Glu
        195                 200                 205
Ser Arg Phe Asn Thr Leu Ala Glu Leu Val His His His Ser Thr Val
    210                 215                 220
Ala Asp Gly Leu Ile Thr Thr Leu His Tyr Pro Ala Pro Lys Arg Asn
225                 230                 235                 240
Lys Pro Thr Val Tyr Gly Val Ser Pro Asn Tyr Asp Lys Trp Glu Met
            245                     250                 255
Glu Arg Thr Asp Ile Thr Met Lys His Lys Leu Gly Gly Gly Gln Tyr
            260                 265                 270
Gly Glu Val Tyr Glu Gly Val Trp Lys Lys Tyr Ser Leu Thr Val Ala
        275                 280                 285
Val Lys Thr Leu Lys Glu Asp Thr Met Glu Val Glu Glu Phe Leu Lys
    290                 295                 300
Glu Ala Ala Val Met Lys Glu Ile Lys His Pro Asn Leu Val Gln Leu
305                 310                 315                 320
Leu Gly Val Cys Thr Arg Glu Pro Pro Phe Tyr Ile Ile Thr Glu Phe
                325                 330                 335
Met Thr Tyr Gly Asn Leu Leu Asp Tyr Leu Arg Glu Cys Asn Arg Gln
            340                 345                 350
Glu Val Asn Ala Val Val Leu Leu Tyr Met Ala Thr Gln Ile Ser Ser
        355                 360                 365
Ala Met Glu Tyr Leu Glu Lys Lys Asn Phe Ile His Arg Asn Leu Ala
    370                 375                 380
Ala Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn His Leu Val Lys Val Ala Asp
385                 390                 395                 400
Phe Gly Leu Ser Arg Leu Met Thr Gly Asp Thr Tyr Thr Ala His Ala
                405                 410                 415
Gly Ala Lys Phe Pro Ile Lys Trp Thr Ala Pro Glu Ser Leu Ala Tyr
            420                 425                 430
Asn Lys Phe Ser Ile Lys Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val Leu Leu
        435                 440                 445
Trp Glu Ile Ala Thr Tyr Gly Met Ser Pro Tyr Pro Gly Ile Asp Leu
    450                 455                 460
Ser Gln Val Tyr Glu Leu Leu Glu Lys Asp Tyr Arg Met Glu Arg Pro
465                 470                 475                 480
Glu Gly Cys Pro Glu Lys Val Tyr Glu Leu Met Arg Ala Cys Trp Gln
                485                 490                 495
Trp Asn Pro Ser Asp Arg Pro Ser Phe Ala Glu Ile His Gln Ala Phe
            500                 505                 510
Glu Thr Met Phe Gln Glu Ser Ser Ile Ser Asp Glu Val Glu Lys Glu
        515                 520                 525
Leu Gly Lys Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
    530                 535
<210>13
<211>537
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>链
<222>(1)..(537)
<223>10PL的B链
<400>13
Met Gly Gln Gln Pro Gly Lys Val Leu Gly Asp Gln Arg Arg Pro Ser
1               5                   10                  15
Leu Pro Ala Leu His Phe Ile Lys Gly Ala Gly Lys Arg Asp Ser Ser
            20                  25                  30
Arg His Gly Gly Pro His Cys Asn Val Phe Val Glu His Glu Ala Leu
        35                  40                  45
Gln Arg Pro Val Ala Ser Asp Phe Glu Pro Gln Gly Leu Ser Glu Ala
    50                  55                  60
Ala Arg Trp Asn Ser Lys Glu Asn Leu Leu Ala Gly Pro Ser Glu Asn
65                  70                  75                  80
Asp Pro Asn Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Phe Val Ala Ser Gly Asp
                85                  90                  95
Asn Thr Leu Ser Ile Thr Lys Gly Glu Lys Leu Arg Val Leu Gly Tyr
            100                 105                 110
Asn His Asn Gly Glu Trp Cys Glu Ala Gln Thr Lys Asn Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Trp Val Pro Ser Asn Tyr Ile Thr Pro Val Asn Ser Leu Glu Lys His
    130                 135                 140
Ser Trp Tyr His Gly Pro Val Ser Arg Asn Ala Ala Glu Tyr Leu Leu
145                 150                 155                 160
Ser Ser Gly Ile Asn Gly Ser Phe Leu Val Arg Glu Ser Glu Ser Ser
                165                 170                 175
Pro Gly Gln Arg Ser Ile Ser Leu Arg Tyr Glu Gly Arg Val Tyr His
           180                  185                 190
Tyr Arg Ile Asn Thr Ala Ser Asp Gly Lys Leu Tyr Val Ser Ser Glu
        195                 200                 205
Ser Arg Phe Asn Thr Leu Ala Glu Leu Val His His His Ser Thr Val
    210                 215                 220
Ala Asp Gly Leu Ile Thr Thr Leu His Tyr Pro Ala Pro Lys Arg Asn
225                 230                 235                 240
Lys Pro Thr Val Tyr Gly Val Ser Pro Asn Tyr Asp Lys Trp Glu Met
                245                 250                 255
Glu Arg Thr Asp Ile Thr Met Lys His Lys Leu Gly Gly Gly Gln Tyr
            260                 265                 270
Gly Glu Val Tyr Glu Gly Val Trp Lys Lys Tyr Ser Leu Thr Val Ala
        275                 280                 285
Val Lys Thr Leu Lys Glu Asp Thr Met Glu Val Glu Glu Phe Leu Lys
    290                 295                 300
Glu Ala Ala Val Met Lys Glu Ile Lys His Pro Asn Leu Val Gln Leu
305                 310                 315                 320
Leu Gly Val Cys Thr Arg Glu Pro Pro Phe Tyr Ile Ile Thr Glu Phe
                325                 330                 335
Met Thr Tyr Gly Asn Leu Leu Asp Tyr Leu Arg Glu Cys Asn Arg Gln
            340                 345                 350
Glu Val Asn Ala Val Val Leu Leu Tyr Met Ala Thr Gln Ile Ser Ser
        355                 360                 365
Ala Met Glu Tyr Leu Glu Lys Lys Asn Phe Ile His Arg Asn Leu Ala
    370                 375                 380
Ala Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn His Leu Val Lys Val Ala Asp
385                 390                 395                 400
Phe Gly Leu Ser Arg Leu Met Thr Gly Asp Thr Tyr Thr Ala His Ala
                405                 410                 415
Gly Ala Lys Phe Pro Ile Lys Trp Thr Ala Pro Glu Ser Leu Ala Tyr
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Asn Lys Phe Ser Ile Lys Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val Leu Leu
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Trp Glu Ile Ala Thr Tyr Gly Met Ser Pro Tyr Pro Gly Ile Asp Leu
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Ser Gln Val Tyr Glu Leu Leu Glu Lys Asp Tyr Arg Met Glu Arg Pro
465                 470                 475                 480
Glu Gly Cys Pro Glu Lys Val Tyr Glu Leu Met Arg Ala Cys Trp Gln
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Trp Asn Pro Ser Asp Arg Pro Ser Phe Ala Glu Ile His Gln Ala Phe
            500                 505                 510
Glu Thr Met Phe Gln Glu Ser Ser Ile Ser Asp Glu Val Glu Lys Glu
        515                 520                 525
Leu Gly Lys Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
    530                 535
<210>14
<211>537
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>14
Met Gly Gln Gln Pro Gly Lys Val Leu Gly Asp Gln Arg Arg Pro Ser
1               5                   10                  15
Leu Pro Ala Leu His Phe Ile Lys Gly Ala Gly Lys Arg Asp Ser Ser
            20                  25                  30
Arg His Gly Gly Pro His Cys Asn Val Phe Val Glu His Glu Ala Leu
        35                  40                  45
Gln Arg Pro Val Ala Ser Asp Phe Glu Pro Gln Gly Leu Ser Glu Ala
    50                  55                  60
Ala Arg Trp Asn Ser Lys Glu Asn Leu Leu Ala Gly Pro Ser Glu Asn
65                  70                  75                  80
Asp Pro Asn Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Phe Val Ala Ser Gly Asp
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Asn Thr Leu Ser Ile Thr Lys Gly Glu Lys Leu Arg Val Leu Gly Tyr
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Ser Trp Tyr His Gly Pro Val Ser Arg Asn Ala Ala Glu Tyr Leu Leu
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Ser Ser Gly Ile Asn Gly Ser Phe Leu Val Arg Glu Ser Glu Ser Ser
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Ala Asp Gly Leu Ile Thr Thr Leu His Tyr PTo Ala Pro Lys Arg Asn
225                 230                 235                 240
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Val Lys Thr Leu Lys Glu Asp Thr Met Glu Val Glu Glu Phe Leu Lys
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Glu Ala Ala Val Met Lys Glu Ile Lys His Pro Asn Leu Val Gln Leu
305                 310                 315                 320
Leu Gly Val Cys Thr Arg Glu Pro Pro Phe Tyr Ile Ile Thr Glu Phe
                325                 330                 335
Met Thr Tyr Gly Asn Leu Leu Asp Tyr Leu Arg Glu Cys Asn Arg Gln
            340                 345                 350
Glu Val Asn Ala Val Val Leu Leu Tyr Met Ala Thr Gln Ile Ser Ser
        355             360                     365
Ala Met Glu Tyr Leu Glu Lys Lys Asn Phe Ile His Arg Asn Leu Ala
    370                 375                 380
Ala Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn His Leu Val Lys Val Ala Asp
385                 390                 395                 400
Phe Gly Leu Ser Arg Leu Met Thr Gly Asp Thr Tyr Thr Ala His Ala
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Gly Ala Lys Phe Pro Ile Lys Trp Thr Ala Pro Glu Ser Leu Ala Tyr
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Trp Glu Ile Ala Thr Tyr Gly Met Ser Pro Tyr Pro Gly Ile Asp Leu
    450                 455                 460
Ser Gln Val Tyr Glu Leu Leu Glu Lys Asp Tyr Arg Met Glu Arg Pro
465                 470                 475                 480
Glu Gly Cys Pro Glu Lys Val Tyr Glu Leu Met Arg Ala Cys Trp Gln
                485                 490                 495
Trp Asn Pro Ser Asp Arg Pro Ser Phe Ala Glu Ile His Gln Ala Phe
            500                 505                 510
Glu Thr Met Phe Gln Glu Ser Ser Ile Ser Asp Glu Val Glu Lys Glu
        515                 520                 525
Leu Gly Lys Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
    530                 535
<210>15
<211>420
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>15
Met Ser Gly Arg Pro Arg Thr Thr Ser Phe Ala Glu Ser Cys Lys Pro
1               5                   10                  15
Val Gln Gln Pro Ser Ala Phe Gly Ser Met Lys Val Ser Arg Asp Lys
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Asp Gly Ser Lys Val Thr Thr Val Val Ala Thr Pro Gly Gln Gly Pro
        35                  40                  45
Asp Arg Pro Gln Glu Val Ser Tyr Thr Asp Thr Lys Val Ile Gly Asn
    50                  55                  60
Gly Ser Phe Gly Val Val Tyr Gln Ala Lys Leu Cys Asp Ser Gly Glu
65                  70                  75                  80
Leu Val Ala Ile Lys Lys Val Leu Gln Asp Lys Arg Phe Lys Asn Arg
                85                  90                  95
Glu Leu Gln Ile Met Arg Lys Leu Asp His Cys Asn Ile Val Arg Leu
            100                 105                 110
Arg Tyr Phe Phe Tyr Ser Ser Gly Glu Lys Lys Asp Glu Val Tyr Leu
        115                 120                 125
Asn Leu Val Leu Asp Tyr Val Pro Glu Thr Val Tyr Arg Val Ala Arg
    130                 135                 140
His Tyr Ser Arg Ala Lys Gln Thr Leu Pro Val Ile Tyr Val Lys Leu
145                 150                 155                 160
Tyr Met Tyr Gln Leu Phe Arg Ser Leu Ala Tyr Ile His Ser Phe Gly
                165                 170                 175
Ile Cys His Arg Asp Ile Lys Pro Gln Ash Leu Leu Leu Asp Pro Asp
            180                 185                 190
Thr Ala Val Leu Lys Leu Cys Asp Phe Gly Ser Ala Lys Gln Leu Val
        195                 200                 205
Arg Gly Glu Pro Asn Val Ser Tyr Ile Cys Ser Arg Tyr Tyr Arg Ala
    210                 215                 220
Pro Glu Leu Ile Phe Gly Ala Thr Asp Tyr Thr Ser Ser Ile Asp Val
225                 230                 235                 240
Trp Ser Ala Gly Cys Val Leu Ala Glu Leu Leu Leu Gly Gln Pro Ile
                245                 250                 255
Phe Pro Gly Asp Ser Gly Val Asp Gln Leu Val Glu Ile Ile Lys Val
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Leu Gly Thr Pro Thr Arg Glu Gln Ile Arg Glu Met Asn Pro Asn Tyr
        275                 280                 285
Thr Glu Phe Lys Phe Pro Gln Ile Lys Ala His Pro Trp Thr Lys Val
    290                 295                 300
Phe Arg Pro Arg Thr Pro Pro Glu Ala Ile Ala Leu Cys Ser Arg Leu
305                 310                 315                 320
Leu Glu Tyr Thr Pro Thr Ala Arg Leu Thr Pro Leu Glu Ala Cys Ala
                325                 330                 335
His Ser Phe Phe Asp Glu Leu Arg Asp Pro Asn Val Lys Leu Pro Asn
            340                 345                 350
Gly Arg Asp Thr Pro Ala Leu Phe Asn Phe Thr Thr Gln Glu Leu Ser
        355                 360                 365
Ser Asn Pro Pro Leu Ala Thr Ile Leu Ile Pro Pro His Ala Arg Ile
    370                 375                 380
Gln Ala Ala Ala Ser Thr Pro Thr Asn Ala Thr Ala Ala Ser Asp Ala
385                 390                 395                 400
Asn Thr Gly Asp Arg Gly Gln Thr Asn Asn Ala Ala Ser Ala Ser Ala
                405                 410                 415
Ser Asn Ser Thr
            420
<210>16
<211>352
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>链
<222>(1)..(352)
<223>1H8F的A链
<400>16
Ser Lys Val Thr Thr Val Val Ala Thr Pro Gly Gln Gly Pro Asp Arg
1               5                   10                  15
Pro Gln Glu Val Ser Tyr Thr Asp Thr Lys Val Ile Gly Asn Gly Ser
            20                  25                  30
Phe Gly Val Val Tyr Gln Ala Lys Leu Cys Asp Ser Gly Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ile Lys Lys Val Leu Gln Gly Lys Ala Phe Lys Asn Arg Glu Leu
    50                  55                  60
Gln Ile Met Arg Lys Leu Asp His Cys Asn Ile Val Arg Leu Arg Tyr
65                  70                  75                  80
Phe Phe Tyr Ser Ser Gly Glu Lys Lys Asp Glu Val Tyr Leu Asn Leu
                85                  90                  95
Val Leu Asp Tyr Val Pro Glu Thr Val Tyr Arg Val Ala Arg His Tyr
            100                 105                 110
Ser Arg Ala Lys Gln Thr Leu Pro Val Ile Tyr Val Lys Leu Tyr Met
        115                 120                 125
Tyr Gln Leu Phe Arg Ser Leu Ala Tyr Ile His Ser Phe Gly Ile Cys
    130                 135                 140
His Arg Asp Ile Lys Pro Gln Asn Leu Leu Leu Asp Pro Asp Thr Ala
145                 150                 155                 160
Val Leu Lys Leu Cys Asp Phe Gly Ser Ala Lys Gln Leu Val Arg Gly
                165                 170                 175
Glu Pro Asn Val Ser Tyr Ile Cys Ser Arg Tyr Tyr Arg Ala Pro Glu
            180                 185                 190
Leu Ile Phe Gly Ala Thr Asp Tyr Thr Ser Ser Ile Asp Val Trp Ser
        195                 200                 205
Ala Gly Cys Val Leu Ala Glu Leu Leu Leu Gly Gln Pro Ile Phe Pro
    210                 215                 220
Gly Asp Ser Gly Val Asp Gln Leu Val Glu Ile Ile Lys Val Leu Gly
225                 230                 235                 240
Thr Pro Thr Arg Glu Gln Ile Arg Glu Met Asn Pro Asn Tyr Thr Glu
                245                 250                 255
Phe Ala Phe Pro Gln Ile Lys Ala His Pro Trp Thr Lys Val Phe Arg
            260                 265                 270
Pro Arg Thr Pro Pro Glu Ala Ile Ala Leu Cys Ser Arg Leu Leu Glu
        275                 280                 285
Tyr Thr Pro Thr Ala Arg Leu Thr Pro Leu Glu Ala Cys Ala His Ser
    290                 295                 300
Phe Phe Asp Glu Leu Arg Asp Pro Asn Val Lys Leu Pro Asn Gly Arg
305                 310                 315                 320
Asp Thr Pro Ala Leu Phe Asn Phe Thr Thr Gln Glu Leu Ser Ser Asn
                325                 330                 335
Pro Pro Leu Ala Thr Ile Leu Ile Pro Pro His Ala Arg Ile Gln Ala
            340                 345                 350
<210>17
<211>352
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>链
<222>(1)..(352)
<223>1H8F的B链
<400>17
Ser Lys Val Thr Thr Val Val Ala Thr Pro Gly Gln Gly Pro Asp Arg
1               5                   10                  15
Pro Gln Glu Val Ser Tyr Thr Asp Thr Lys Val Ile Gly Asn Gly Ser
            20                  25                  30
Phe Gly Val Val Tyr Gln Ala Lys Leu Cys Asp Ser Gly Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ile Lys Lys Val Leu Gln Gly Lys Ala Phe Lys Asn Arg Glu Leu
    50                  55                  60
Gln Ile Met Arg Lys Leu Asp His Cys Asn Ile Val Arg Leu Arg Tyr
65                  70                  75                  80
Phe Phe Tyr Ser Ser Gly Glu Lys Lys Asp Glu Val Tyr Leu Asn Leu
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Val Leu Asp Tyr Val Pro Glu Thr Val Tyr Arg Val Ala Arg His Tyr
            100                 105                 110
Ser Arg Ala Lys Gln Thr Leu Pro Val Ile Tyr Val Lys Leu Tyr Met
        115                 120                 125
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    130                 135                 140
His Arg Asp Ile Lys Pro Gln Asn Leu Leu Leu Asp Pro Asp Thr Ala
145                 150                 155                 160
Val Leu Lys Leu Cys Asp Phe Gly Ser Ala Lys Gln Leu Val Arg Gly
                165                 170                 175
Glu Pro Asn Val Ser Tyr Ile Cys Ser Arg Tyr Tyr Arg Ala Pro Glu
            180                 185                 190
Leu Ile Phe Gly Ala Thr Asp Tyr Thr Ser Ser Ile Asp Val Trp Ser
        195                 200                 205
Ala Gly Cys Val Leu Ala Glu Leu Leu Leu Gly Gln Pro Ile Phe Pro
    2l0                 215                 220
Gly Asp Ser Gly Val Asp Gln Leu Val Glu Ile Ile Lys Val Leu Gly
225                 230                 235                 240
Thr Pro Thr Arg Glu Gln Ile Arg Glu Met Asn Pro Asn Tyr Thr Glu
                245                 250                 255
Phe Ala Phe Pro Gln Ile Lys Ala His Pro Trp Thr Lys Val Phe Arg
            260                 265                 270
Pro Arg Thr Pro Pro Glu Ala Ile Ala Leu Cys Ser Arg Leu Leu Glu
        275                 280                 285
Tyr Thr Pro Thr Ala Arg Leu Thr Pro Leu Glu Ala Cys Ala His Ser
    290                 295                 300
Phe Phe Asp Glu Leu Arg Asp Pro Asn Val Lys Leu Pro Asn Gly Arg
305                 310                 315                 320
Asp Thr Pro Ala Leu Phe Asn Phe Thr Thr Gln Glu Leu Ser Ser Asn
                325                 330                 335
Pro Pro Leu Ala Thr Ile Leu Ile Pro Pro His Ala Arg Ile Gln Ala
            340                 345                 350
<210>18
<211>420
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>18
Met Ser Gly Arg Pro Arg Thr Thr Ser Phe Ala Glu Ser Cys Lys Pro
1               5                   10                  15
Val Gln Gln Pro Ser Ala Phe Gly Ser Met Lys Val Ser Arg Asp Lys
            20                  25                  30
Asp Gly Ser Lys Val Thr Thr Val Val Ala Thr Pro Gly Gln Gly Pro
        35                  40                  45
Asp Arg Pro Gln Glu Val Ser Tyr Thr Asp Thr Lys Val Ile Gly Asn
    50                  55                  60
Gly Ser Phe Gly Val Val Tyr Gln Ala Lys Leu Cys Asp Ser Gly Glu
65                  70                  75                  80
Leu Val Ala Ile Lys Lys Val Leu Gln Asp Lys Arg Phe Lys Asn Arg
                85                  90                  95
Glu Leu Gln Ile Met Arg Lys Leu Asp His Cys Asn Ile Val Arg Leu
            100                 105                 110
Arg Tyr Phe Phe Tyr Ser Ser Gly Glu Lys Lys Asp Glu Val Tyr Leu
        115                 120                 125
Asn Leu Val Leu Asp Tyr Val Pro Glu Thr Val Tyr Arg Val  Ala Arg
    130                 135                 140
His Tyr Ser Arg Ala Lys Gln Thr Leu Pro Val Ile Tyr Val Lys Leu
145                 150                 155                 160
Tyr Met Tyr Gln Leu Phe Arg Ser Leu Ala Tyr Ile His Ser Phe Gly
                165                 170                 175
Ile Cys His Arg Asp Ile Lys Pro Gln Asn Leu Leu Leu Asp Pro Asp
            180                 185                 190
Thr Ala Val Leu Lys Leu Cys Asp Phe Gly Ser Ala Lys Gln Leu Val
        195                 200                 205
Arg Gly Glu Pro Asn Val Ser Tyr Ile Cys Ser Arg Tyr Tyr Arg Ala
    210                 215                 220
Pro Glu Leu Ile Phe Gly Ala Thr Asp Tyr Thr Ser Ser Ile Asp Val
225                 230                 235                 240
Trp Ser Ala Gly Cys Val Leu Ala Glu Leu Leu Leu Gly Gln Pro Ile
                245                 250                 255
Phe Pro Gly Asp Ser Gly Val Asp Gln Leu Val Glu Ile Ile Lys Val
            260                 265                 270
Leu Gly Thr Pro Thr Arg Glu Gln Ile Arg Glu Met Asn Pro Asn Tyr
        275                 280                 285
Thr Glu Phe Lys Phe Pro Gln Ile Lys Ala His Pro Trp Thr Lys Val
    290                 295                 300
Phe Arg Pro Arg Thr Pro Pro Glu Ala Ile Ala Leu Cys Ser Arg Leu
305                 310                 315                 320
Leu Glu Tyr Thr Pro Thr Ala Arg Leu Thr Pro Leu Glu Ala Cys Ala
                325                 330                 335
His Ser Phe Phe Asp Glu Leu Arg Asp Pro Asn Val Lys Leu Pro Asn
            340                 345                 350
Gly Arg Asp Thr Pro Ala Leu Phe Asn Phe Thr Thr Gln Glu Leu Ser
        355                 360                 365
Ser Asn Pro Pro Leu Ala Thr Ile Leu Ile Pro Pro His Ala Arg Ile
    370                 375                 380
Gln Ala Ala Ala Ser Thr Pro Thr Asn Ala Thr Ala Ala Ser Asp Ala
385                 390                 395                 400
Asn Thr Gly Asp Arg Gly Gln Thr Asn Asn Ala Ala Ser Ala Ser Ala
                405                 410                 415
Ser Asn Ser Thr
            420
<210>19
<211>306
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>链
<222>(1)..(306)
<223>1GAG的A链
<220>
<221>misc_feature
<222>(181)..(181)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(185)..(186)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<400>19
Val Phe Pro Ser Ser Val Phe Val Pro Asp Glu Trp Glu Val Ser Arg
1               5                   10                  15
Glu Lys Ile Thr Leu Leu Arg Glu Leu Gly Gln Gly Ser Phe Gly Met
            20                  25                  30
Val Tyr Glu Gly Asn Ala Arg Asp Ile Ile Lys Gly Glu Ala Glu Thr
        35                  40                  45
Arg Val Ala Val Lys Thr Val Asn Glu Ser Ala Ser Leu Arg Glu Arg
    50                  55                  60
Ile Glu Phe Leu Asn Glu Ala Ser Val Met Lys Gly Phe Thr Cys His
65                  70                  75                  80
His Val Val Arg Leu Leu Gly Val Val Ser Lys Gly Gln Pro Thr Leu
                85                  90                  95
Val Val Met Glu Leu Met Ala His Gly Asp Leu Lys Ser Tyr Leu Arg
            100                 105                 110
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Glu Asn Asn Pro Gly Arg Pro Pro Pro Thr
        115                 120                 125
Leu Gln Glu Met Ile Gln Met Ala Ala Glu Ile Ala Asp Gly Met Ala
    130                 135                 140
Tyr Leu Asn Ala Lys Lys Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn
145                 150                 155                 160
Cys Met Val Ala His Asp Phe Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met
                165                 170                 175
Thr Arg Asp Ile Xaa Glu Thr Asp Xaa Xaa Arg Lys Gly Gly Lys Gly
            180                 185                 190
Leu Leu Pro Val Arg Trp Met Ala Pro Glu Ser Leu Lys Asp Gly Val
        195                 200                 205
Phe Thr Thr Ser Ser Asp Met Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu
    210                 215                 220
Ile Thr Ser Leu Ala Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu Ser Asn Glu Gln
225                 230                 235                 240
Val Leu Lys Phe Val Met Asp Gly Gly Tyr Leu Asp Gln Pro Asp Asn
                245                 250                 255
Cys Pro Glu Arg Val Thr Asp Leu Met Arg Met Cys Trp Gln Phe Asn
            260                 265                 270
Pro Lys Met Arg Pro Thr Phe Leu Glu Ile Val Asn Leu Leu Lys Asp
        275                 280                 285
Asp Leu His Pro Ser Phe Pro Glu Val Ser Phe Phe His Ser Glu Glu
    290                 295                 300
Asn Lys
305
<210>20
<211>13
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>链
<222>(1)..(13)
<223>1IRK的B链
<220>
<221>链
<222>(1)..(13)
<223>1GAG的B链
<400>20
Pro Ala Thr Gly Asp Phe Met Asn Met Ser Pro Val Gly
1               5                   10
<210>21
<211>307
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>21
Ile Val Phe Pro Ser Ser Val Phe Val Pro Asp Glu Trp Glu Val Ser
1                   5               10                  15
Arg Glu Lys Ile Thr Leu Leu Arg Glu Leu Gly Gln Gly Ser Phe Gly
            20                  25                  30
Met Val Tyr Glu Gly Asn Ala Arg Asp Ile Ile Lys Gly Glu Ala Glu
        35                  40                  45
Thr Arg Val Ala Val Lys Thr Val Asn Glu Ser Ala Ser Leu Arg Glu
    50                  55                  60
Arg Ile Glu Phe Leu Asn Glu Ala Ser Val Met Lys Gly Phe Thr Cys
65                  70                  75                  80
His His Val Val Arg Leu Leu Gly Val Val Ser Lys Gly Gln Pro Thr
                85                  90                  95
Leu Val Val Met Glu Leu Met Ala His Gly Asp Leu Lys Ser Tyr Leu
            100                 105                 110
Arg Ser Leu Arg Pro Glu Ala Glu Asn Asn Pro Gly Arg Pro Pro Pro
        115                 120                 125
Thr Leu Gln Glu Met Ile Gln Met Ala Ala Glu Ile Ala Asp Gly Met
    130                 135                 140
Ala Tyr Leu Asn Ala Lys Lys Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg
145                 150                 155                 160
Asn Cys Met Val Ala His Asp Phe Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly
                165                 170                 175
Met Thr Arg Asp Ile Tyr Glu Thr Asp Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Lys
            180                 185                 190
Gly Leu Leu Pro Val Arg Trp Met Ala Pro Glu Ser Leu Lys Asp Gly
        195                 200                 205
Val Phe Thr Thr Ser Ser Asp Met Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp
    210                 215                 220
Glu Ile Thr Ser Leu Ala Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu Ser Asn Glu
225                 230                 235                 240
Gln Val Leu Lys Phe Val Met Asp Gly Gly Tyr Leu Asp Gln Pro Asp
                245                 250                 255
Asn Cys Pro Glu Arg Val Thr Asp Leu Met Arg Met Cys Trp Gln Phe
            260                 265                 270
Asn Pro Lys Met Arg Pro Thr Phe Leu Glu Ile Val Asn Leu Leu Lys
        275                 280                 285
Asp Asp Leu His Pro Ser Phe Pro Glu Val Ser Phe Phe His Ser Glu
    290                 295                 300
Glu Asn Lys
305
<210>22
<211>315
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>链
<222>(1)..(315)
<223>1GZK的A链
<400>22
Lys Val Thr Met Asn Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly
1               5                   10                  15
Thr Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Arg Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ala Met Lys Ile Leu Arg Lys Glu Val Ile Ile Ala Lys Asp Glu
        35                  40                  45
Val Ala His Thr Val Thr Glu Ser Arg Val Leu Gln Asn Thr Arg His
    50                  55                  60
Pro Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ala Phe Gln Thr His Asp Arg Leu
65                  70                  75                  80
Cys Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu
                85                  90                  95
Ser Arg Glu Arg Val Phe Thr Glu Glu Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala
            100                 105                 110
Glu Ile Val Ser Ala Leu Glu Tyr Leu His Ser Arg Asp Val Val Tyr
        115                 120                 125
Arg Asp Ile Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile
    130                 135                 140
Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Ser Asp Gly Ala
145                 150                 155                 160
Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val
                165                 170                 175
Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly
            180                 185                 190
Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln
        195                 200                 205
Asp His Glu Arg Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg Phe
    210                 215                 220
Pro Arg Thr Leu Ser Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ala Gly Leu Leu
225                 230                 235                 240
Lys Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly Gly Pro Ser Asp Ala Lys
                245                 250                 255
Glu Val Met Glu His Arg Phe Phe Leu Ser Ile Asn Trp Gln Asp Val
            260                 265                 270
Val Gln Lys Lys Leu Leu Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu
        275                 280                 285
Val Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Asp Glu Phe Thr Ala Gln Ser Ile Thr
    290                 295                 300
Ile Thr Pro Pro Asp Arg Tyr Asp Ser Leu Gly
305                 310                 315
<210>23
<211>315
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>链
<222>(1)..(315)
<223>1GZO的A链
<400>23
Lys Val Thr Met Asn Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly
1               5                   10                  15
Thr Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Arg Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ala Met Lys Ile Leu Arg Lys Glu Val Ile Ile Ala Lys Asp Glu
        35                  40                  45
Val Ala His Thr Val Thr Glu Ser Arg Val Leu Gln Asn Thr Arg His
    50                  55                  60
Pro Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ala Phe Gln Thr His Asp Arg Leu
65                  70                  75                  80
Cys Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu
                85                  90                  95
Ser Arg Glu Arg Val Phe Thr Glu Glu Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala
            100                 105                 110
Glu Ile Val Ser Ala Leu Glu Tyr Leu His Ser Arg Asp Val Val Tyr
        115                 120                 125
Arg Asp Ile Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile
    130                 135                 140
Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Ser Asp Gly Ala
145                 150                 155                 160
Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val
                165                 170                 175
Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly
            180                 185                 190
Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln
        195                 200                 205
Asp His Glu Arg Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg Phe
    210                 215                 220
Pro Arg Thr Leu Ser Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ala Gly Leu Leu
225                 230                 235                 240
Lys Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly Gly Pro Ser Asp Ala Lys
                245                 250                 255
Glu Val Met Glu His Arg Phe Phe Leu Ser Ile Asn Trp Gln Asp Val
            260                 265                 270
Val Gln Lys Lys Leu Leu Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu
        275                 280                 285
Val Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Asp Glu Phe Thr Ala Gln Ser Ile Thr
    290                 295                 300
Ile Thr Pro Pro Asp Arg Tyr Asp Ser Leu Gly
305              310                 315
<210>24
<211>335
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>链
<222>(1)..(335)
<223>1GZN的A链
<400>24
Lys Val Thr Met Asn Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly
1               5                   10                  15
Thr Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Arg Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ala Met Lys Ile Leu Arg Lys Glu Val Ile Ile Ala Lys Asp Glu
        35                  40                  45
Val Ala His Thr Val Thr Glu Ser Arg Val Leu Gln Asn Thr Arg His
    50                  55                  60
Pro Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ala Phe Gln Thr His Asp Arg Leu
65                  70                  75                  80
Cys Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu
                85                  90                  95
Ser Arg Glu Arg Val Phe Thr Glu Glu Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala
            100                 105                 110
Glu Ile Val Ser Ala Leu Glu Tyr Leu His Ser Arg Asp Val Val Tyr
        115                 120                 125
Arg Asp Ile Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile
    130                 135                 140
Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Ser Asp Gly Ala
145                 150                 155                 160
Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val
                165                 170                 175
Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly
            180                 185                 190
Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln
        195                 200                 205
Asp His Glu Arg Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg Phe
    210                 215                 220
Pro Arg Thr Leu Ser Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ala Gly Leu Leu
225                 230                 235                 240
Lys Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly Gly Pro Ser Asp Ala Lys
                245                 250                 255
Glu Val Met Glu His Arg Phe Phe Leu Ser Ile Asn Trp Gln Asp Val
            260                 265                 270
Val Gln Lys Lys Leu Leu Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu
            275             280                 285
Val Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Asp Glu Phe Thr Ala Gln Ser Ile Thr
    290                 295                 300
Ile Thr Pro Pro Asp Arg Tyr Asp Ser Leu Gly Leu Leu Glu Leu Asp
305                 310                 315                 320
Gln Arg Thr His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Ile Arg
                325                 330                 335
<210>25
<211>503
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>25
Met Glu Ala Ala Val Ala Ala Pro Arg Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val
1               5                   10                  15
Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Pro Gly Ala Thr
        20                      25                  30
Ala Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys
        35                  40                  45
Val Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys
    50                  55                  60
Val Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg
65                  70                  75                  80
Asp Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr
                85                  90                  95
Thr Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro
            100                 105                 110
Thr Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu Ala Ala
        115                 120                 125
Val Ile Ala Gly Pro Val Cys Phe Val Cys Ile Ser Leu Met Leu Met
    130                 135                 140
Val Tyr Ile Cys His Asn Arg Thr Val Ile His His Arg Val Pro Asn
145                 150                 155                 160
Glu Glu Asp Pro Ser Leu Asp Arg Pro Phe Ile Ser Glu Gly Thr Thr
                165                 170                 175
Leu Lys Asp Leu Ile Tyr Asp Met Thr Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly
            180                 185                 190
Leu Pro Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Arg Thr Ile Val Leu Gln
        195                 200                 205
Glu Ser Ile Gly Lys Gly Arg Phe Gly Glu Val Trp Arg Gly Lys Trp
    210                 215                 220
Arg Gly Glu Glu Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg Glu Glu Arg
225                 230                 235                 240
Ser Trp Phe Arg Glu Ala Glu Ile Tyr Gln Thr Val Met Leu Arg His
                245                 250                 255
Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Asn Lys Asp Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Trp Thr Gln Leu Trp Leu Val Ser Asp Tyr His Glu His Gly Ser Leu
        275                 280                 285
Phe Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Thr Val Thr Val Glu Gly Met Ile Lys
    290                 295                 300
Leu Ala Leu Ser Thr Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His Met Glu Ile
305                 3l0                 315                 320
VaL Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser
                325                 330                 335
Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Thr Cys Cys Ile Ala Asp Leu
            340                 345                 350
Gly Leu Ala Val Arg His Asp Ser Ala Thr Asp Thr Ile Asp Ile Ala
        355                 360                 365
Pro Asn His Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu
    370                 375                 380
Asp Asp Ser Ile Asn Met Lys His Phe Glu Ser Phe Lys Arg Ala Asp
385                 390                 395                 400
Ile Tyr Ala Met Gly Leu Val Phe Trp Glu Ile Ala Arg Arg Cys Ser
                405                 410                 415
Ile Gly Gly Ile His Glu Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asp Leu Val
            420                 425                 430
Pro Ser Asp Pro Ser Val Glu Glu Met Arg Lys Val Val Cys Glu Gln
        435                 440                 445
Lys Leu Arg Pro Asn IIe Pro Asn Arg Trp Gln Ser Cys Glu Ala Leu
    450                 455                 460
Arg Val Met Ala Lys Ile Met Arg Glu Cys Trp Tyr Ala Asn Gly Ala
465                 470                 475                 480
Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ser Gln Leu Ser
                485                 490                 495
Gln Gln Glu Gly Ile Lys Met
            500
<210>26
<211>342
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>26
Glu Asp Pro Ser Leu Asp Arg Pro Phe Ile Ser Glu Gly Thr Thr Leu
1               5                   10                  15
Lys Asp Leu Ile Tyr Asp Met Thr Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu
            20                  25                  30
Pro Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Arg Thr Ile Val Leu Gln Glu
        35                  40                  45
Ser Ile Gly Lys Gly Arg Phe Gly Glu Val Trp Arg Gly Lys Trp Arg
    50                  55                  60
Gly Glu Glu Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg Glu Glu Arg Ser
65                  70                  75                  80
Trp Phe Arg Glu Ala Glu Ile Tyr Gln Thr Val Met Leu Arg His Glu
                85                  90                  95
Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Asn Lys Asp Asn Gly Thr Trp
            100                 105                 110
Thr Gln Leu Trp Leu Val Ser Asp Tyr His Glu His Gly Ser Leu Phe
        115                 120                 125
Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Thr Val Thr Val Glu Gly Met Ile Lys Leu
    130                 135                 140
Ala Leu Ser Thr Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His Met Glu Ile Val
145                 150                 155                 160
Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser Lys
                165                 170                 175
Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Thr Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly
            180                 185                 190
Leu Ala Val Arg His Asp Ser Ala Thr Asp Thr Ile Asp Ile Ala Pro
        195                 200                 205
Asn His Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Asp
    210                 215                 220
Asp Ser Ile Asn Met Lys His Phe Glu Ser Phe Lys Arg Ala Asp Ile
225                 230                 235                 240
Tyr Ala Met Gly Leu Val Phe Trp Glu Ile Ala Arg Arg Cys Ser Ile
                245                 250                 255
Gly Gly Ile His Glu Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asp Leu Val Pro
            260                 265                 270
Ser Asp Pro Ser Val Glu Glu Met Arg Lys Val Val Cys Glu Gln Lys
        275                 280                 285
Leu Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Gln Ser Cys Glu Ala Leu Arg
    290                 295                 300
Val Met Ala Lys Ile Met Arg Glu Cys Trp Tyr Ala Asn Gly Ala Ala
305                 310                 315                 320
Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ser Gln Leu Ser Gln
                325                 330                 335
Gln Glu Gly Ile Lys Met
            340
<210>27
<211>350
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>链
<222>(1)..(350)
<223>109U的A链
<220>
<221>misc feature
<222>(182)..(182)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<400>27
Ser Lys Val Thr Thr Val Val Ala Thr Pro Gly Gln Gly Pro Asp Arg
1               5                   10                  15
Pro Gln Glu Val Ser Tyr Thr Asp Thr Lys Val Ile Gly Asn Gly Ser
            20                  25                  30
Phe Gly Val Val Tyr Gln Ala Lys Leu Cys Asp Ser Gly Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ile Lys Lys Val Leu Gln Gly Lys Ala Phe Lys Asn Arg Glu Leu
    50                  55                  60
Gln Ile Met Arg Lys Leu Asp His Cys Asn Ile Val Arg Leu Arg Tyr
65                  70                  75                  80
Phe Phe Tyr Ser Ser Gly Glu Lys Lys Asp Glu Val Tyr Leu Asn Leu
                85                  90                  95
Val Leu Asp Tyr Val Pro Ala Thr Val Tyr Arg Val Ala Arg His Tyr
            100                 105                 110
Ser Arg Ala Lys Gln Thr Leu Pro Val Ile Tyr Val Lys Leu Tyr Met
        115                 120                 125
Tyr Gln Leu Phe Arg Ser Leu Ala Tyr Ile His Ser Phe Gly Ile Cys
    130                 135                 140
His Arg Asp Ile Lys Pro Gln Asn Leu Leu Leu Asp Pro Asp Thr Ala
145                 150                 155                 160
Val Leu Lys Leu Cys Asp Phe Gly Ser Ala Lys Gln Leu Val Arg Gly
                165                 170                 175
Glu Pro Asn Val Ser Xaa Ile Cys Ser Arg Tyr Tyr Arg Ala Pro Glu
            180                 185                 190
Leu Ile Phe Gly Ala Thr Asp Tyr Thr Ser Ser Ile Asp Val Trp Ser
        195                 200                 205
Ala Gly Cys Val Leu Ala Glu Leu Leu Leu Gly Gln Pro Ile Phe Pro
    210                 215                 220
Gly Asp Ser Gly Val Asp Gln Leu Val Glu Ile Ile Lys Val Leu Gly
225                 230                 235                 240
Thr Pro Thr Arg Glu Gln Ile Arg Glu Met Asn Pro Asn Tyr Thr Glu
                245                 250                 255
Phe Ala Phe Pro Gln Ile Lys Ala His Pro Trp Thr Lys Val Phe Arg
            260                 265                 270
Pro Arg Thr Pro Pro Glu Ala Ile Ala Leu Cys Ser Arg Leu Leu Glu
        275                 280                 285
Tyr Thr Pro Thr Ala Arg Leu Thr Pro Leu Glu Ala Cys Ala His Ser
    290                 295                 300
Phe Phe Asp Glu Leu Arg Asp Pro Asn Val Lys Leu Pro Asn Gly Arg
305                 310                 315                 320
Asp Thr Pro Ala Leu Phe Asn Phe Thr Thr Gln Glu Leu Ser Ser Asn
                325                 330                 335
Pro Pro Leu Ala Thr Ile Leu Ile Pro Pro His Ala Arg Ile
            340                 345                 350
<210>28
<211>18
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>链
<222>(1)..(18)
<223>109U的B链
<400>28
Val Glu Pro Gln Lys Phe Ala Glu Glu Leu Ile His Arg Leu Glu Ala
1               5                   10                  15
Val Gln
<210>29
<211>292
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>29
Gly Ala Met Asp Pro Ser Ser Pro Asn Tyr Asp Lys Trp Glu Met Glu
1               5                   10                  15
Arg Thr Asp Ile Thr Met Lys His Lys Leu Gly Gly Gly Gln Tyr Gly
            20                  25                  30
Glu Val Tyr Glu Gly Val Trp Lys Lys Tyr Ser Leu Thr Val Ala Val
        35                  40                  45
Lys Thr Leu Lys Glu Asp Thr Met Glu Val Glu Glu Phe Leu Lys Glu
    50                  55                  60
Ala Ala Val Met Lys Glu Ile Lys His Pro Asn Leu Val Gln Leu Leu
65                  70                  75                  80
Gly Val Cys Thr Arg Glu Pro Pro Phe Tyr Ile Ile Thr Glu Phe Met
                85                  90                  95
Thr Tyr Gly Asn Leu Leu Asp Tyr Leu Arg Glu Cys Asn Arg Gln Glu
            100                 105                 110
Val Asn Ala Val Val Leu Leu Tyr Met Ala Thr Gln Ile Ser Ser Ala
        115                 120                 125
Met Glu Tyr Leu Glu Lys Lys Asn Phe Ile His Arg Asp Leu Ala Ala
    130                 135                 140
Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn His Leu Val Lys Val Ala Asp Phe
145                 150                 155                 160
Gly Leu Ser Arg Leu Met Thr Gly Asp Thr Tyr Thr Ala His Ala Gly
                165                 170                 175
Ala Lys Phe Pro Ile Lys Trp Thr Ala Pro Glu Ser Leu Ala Tyr Asn
            180                 185                 190
Lys Phe Ser lle Lys Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val Leu Leu Trp
        195                 200                 205
Glu Ile Ala Thr Tyr Gly Met Ser Pro Tyr Pro Gly Ile Asp Leu Ser
    210                 215                 220
Gln Val Tyr Glu Leu Leu Glu Lys Asp Tyr Arg Met Glu Arg Pro Glu
225                 230                 235                 240
Gly Cys Pro Glu Lys Val Tyr Glu Leu Met Arg Ala Cys Trp Gln Trp
                245                 250                 255
Asn Pro Ser Asp Arg Pro Ser Phe Ala Glu Ile His Gln Ala Phe Glu
            260                 265                 270
Thr Met Phe Gln Glu Ser Ser Ile Ser Asp Glu Val Glu Lys Glu Leu
        275                 280                 285
Gly Lys Arg Gly
    290
<210>30
<211>360
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>30
Met Ser Gln Glu Arg Pro Thr Phe Tyr Arg Gln Glu Leu Asn Lys Thr
1               5                   10                  15
Ile Trp Glu Val Pro Glu Arg Tyr Gln Asn Leu Ser Pro Val Gly Ser
            20                  25                  30
Gly Ala Tyr Gly Ser Val Cys Ala Ala Phe Asp Thr Lys Thr Gly Leu
        35                  40                  45
Arg Val Ala Val Lys Lys Leu Ser Arg Pro Phe Gln Ser Ile Ile His
    50                  55                  60
Ala Lys Arg Thr Tyr Arg Glu Leu Arg Leu Leu Lys His Met Lys His
65                  70                  75                  80
Glu Asn Val Ile Gly Leu Leu Asp Val Phe Thr Pro Ala Arg Ser Leu
                85                  90                  95
Glu Glu Phe Asn Asp Val Tyr Leu Val Thr His Leu Met Gly Ala Asp
            100                 105                 110
Leu Asn Asn Ile Val Lys Cys Gln Lys Leu Thr Asp Asp His Val Gln
        115                 120                 125
Phe Leu Ile Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala
    130                 135                 140
 Asp Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Ala Val Asn Glu
 145                 150                 155                 160
Asp Cys Glu Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg His Thr Asp
                165                 170                 175
Asp Glu Met Thr Gly Tyr Val Ala Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu
            180                 185                 190
Ile Met Leu Asn Trp Met His Tyr Asn Gln Thr Val Asp Ile Trp Ser
        195                 200                 205
Val Gly Cys Ile Met Ala Glu Leu Leu Thr Gly Arg Thr Leu Phe Pro
    210                 215                 220
Gly Thr Asp His Ile Asp Gln Leu Lys Leu Ile Leu Arg Leu Val Gly
225                 230                 235                 240
Thr Pro Gly Ala Glu Leu Leu Lys Lys Ile Ser Ser Glu Ser Ala Arg
                245                 250                 255
Asn Tyr Ile Gln Ser Leu Thr Gln Met Pro Lys Met Asn Phe Ala Asn
            260                 265                 270
Val Phe Ile Gly Ala Asn Pro Leu Ala Val Asp Leu Leu Glu Lys Met
        275                 280                 285
Leu Val Leu Asp Ser Asp Lys Arg Ile Thr Ala Ala Gln Ala Leu Ala
    290                 295                 300
His Ala Tyr Phe Ala Gln Tyr His Asp Pro Asp Asp Glu Pro Val Ala
305                 310                 315                 320
Asp Pro Tyr Asp Gln Ser Phe Glu Ser Arg Asp Leu Leu Ile Asp Glu
                325                 330                 335
Trp Lys Ser Leu Thr Tyr Asp Glu Val Ile Ser Phe Val Pro Pro Pro
            340                 345                 350
Leu Asp Gln Glu Glu Met Glu Ser
        355                 360
<210>31
<211>414
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>31
Met Ser Gly Arg Pro Arg Thr Thr Ser Phe Ala Glu Ser Cys Lys Pro
1               5                   10                  15
Val Gln Gln Pro Ser Ala Phe Gly Ser Met Lys Val Ser Arg Asp Lys
            20                  25                  30
Asp Gly Ser Lys Val Thr Thr Val Val Ala Thr Pro Gly Gln Gly Pro
        35                  40                  45
Asp Arg Pro Gln Glu Val Ser Tyr Thr Asp Thr Lys Val Ile Gly Asn
    50                  55                  60
Gly Ser Phe Gly Val Val Tyr Gln Ala Lys Leu Cys Asp Ser Gly Glu
65                  70                  75                  80
Leu Val Ala Ile Lys Lys Val Leu Gln Asp Lys Arg Phe Lys Asn Arg
                85                  90                  95
Glu Leu Gln Ile Met Arg Lys Leu Asp His Cys Asn Ile Val Arg Leu
            100                 105                 110
Arg Tyr Phe Phe Tyr Ser Ser Gly Glu Lys Lys Asp Glu Val Tyr Leu
        115                 120                 125
Asn Leu Val Leu Asp Tyr Val Pro Glu Thr Val Tyr Arg Val Ala Arg
    130                 135                 140
His Tyr Ser Arg Ala Lys Gln Thr Leu Pro Val Ile Tyr Val Lys Leu
145                 150                 155                 160
Tyr Met Tyr Gln Leu Phe Arg Ser Leu Ala Tyr Ile His Ser Phe Gly
                165                 170                 175
Ile Cys His Arg Asp Ile Lys Pro Gln Asn Leu Leu Leu Asp Pro Asp
            180                 185                 190
Thr Ala Val Leu Lys Leu Cys Asp Phe Gly Ser Ala Lys Gln Leu Val
        195                 200                 205
Arg Gly Glu Pro Asn Val Ser Tyr Ile Cys Ser Arg Tyr Tyr Arg Ala
    210                 215                 220
Pro Glu Leu Ile Phe Gly Ala Thr Asp Tyr Thr Ser Ser Ile Asp Val
225                 230                 235                 240
Trp Ser Ala Gly Cys Val Leu Ala Glu Leu Leu Leu Gly Gln Pro Ile
                245                 250                 255
Phe Pro Gly Asp Ser Gly Val Asp Gln Leu Val Glu Ile Ile Lys Val
            260                 265                 270
Leu Gly Thr Pro Thr Arg Glu Gln Ile Arg Glu Met Asn Pro Asn Tyr
        275                 280                 285
Thr Glu Phe Lys Phe Pro Gln Ile Lys Ala His Pro Trp Thr Lys Val
    290                 295                 300
Phe Arg Pro Arg Thr Pro Pro Glu Ala Ile Ala Leu Cys Ser Arg Leu
305                 310                 315                 320
Leu Glu Tyr Thr Pro Thr Ala Arg Leu Thr Pro Leu Glu Ala Cys Ala
                325                 330                 335
His Ser Phe Phe Asp Glu Leu Arg Asp Pro Asn Val Lys Leu Pro Asn
            340                 345                 350
Gly Arg Asp Thr Pro Ala Leu Phe Asn Phe Thr Thr Gln Glu Leu Ser
        355                 360                 365
Ser Asn Pro Pro Leu Ala Thr Ile Leu Ile Pro Pro His Ala Arg Ile
    370                 375                 380
Gln Ala Ala Ala Ser Thr Pro Thr Asn Ala Thr Ala Ala Ser Asp Ala
385                 390                 395                 400
Asn Thr Gly Asp Arg Gly Gln Thr Asn Asn Ala Ala Ser Ala
                405                 410
<210>32
<211>367
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>32
Lys Val Ser Arg Asp Lys Asp Gly Ser Lys Val Thr Thr Val Val Ala
1                   5                   10                  15
Thr Pro Gly Gln Gly Pro Asp Arg Pro Gln Glu Val Ser Tyr Thr Asp
            20                  25                  30
Thr Lys Val Ile Gly Asn Gly Ser Phe Gly Val Val Tyr Gln Ala Lys
        35                  40                  45
Leu Cys Asp Ser Gly Glu Leu Val Ala Ile Lys Lys Val Leu Gln Asp
    50                  55                  60
Lys Arg Phe Lys Asn Arg Glu Leu Gln Ile Met Arg Lys Leu Asp His
65                  70                  75                  80
Cys Asn Ile Val Arg Leu Arg Tyr Phe Phe Tyr Ser Ser Gly Glu Lys
                85                  90                  95
Lys Asp Glu Val Tyr Leu Asn Leu Val Leu Asp Tyr Val Pro Glu Thr
            100                 105                 110
Val  Tyr Arg Val Ala Arg His Tyr Ser Arg Ala Lys Gln Thr Leu Pro
         115                 120                 125
Val Ile Tyr Val Lys Leu Tyr Met Tyr Gln Leu Phe Arg Ser Leu Ala
    130                 135                 140
Tyr Ile His Ser Phe Gly Ile Cys His Arg Asp Ile Lys Pro Gln Asn
145                 150                 155                 160
Leu Leu Leu Asp Pro Asp Thr Ala Val Leu Lys Leu Cys Asp Phe Gly
                165                 170                 175
Ser Ala Lys Gln Leu Val Arg Gly Glu Pro Asn Val Ser Tyr Ile Cys
            180                 185                 190
Ser Arg Tyr Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Ile Phe Gly Ala Thr Asp Tyr
        195                 200                 205
Thr Ser Ser Ile Asp Val Trp Ser Ala Gly Cys Val Leu Ala Glu Leu
    210                 215                 220
Leu Leu Gly Gln Pro Ile Phe Pro Gly Asp Ser Gly Val Asp Gln Leu
225                 230                 235                 240
Val Glu Ile Ile Lys Val Leu Gly Thr Pro Thr Arg Glu Gln Ile Arg
                245                 250                 255
Glu Met Asn Pro Asn Tyr Thr Glu Phe Lys Phe Pro Gln Ile Lys Ala
            260                 265                 270
His Pro Trp Thr Lys Val Phe Arg Pro Arg Thr Pro Pro Glu Ala Ile
        275                 280                 285
Ala Leu Cys Ser Arg Leu Leu Glu Tyr Thr Pro Thr Ala Arg Leu Thr
    290                 295                 300
Pro Leu Glu Ala Cys Ala His Ser Phe Phe Asp Glu Leu Arg Asp Pro
305                 310                 315                 320
Asn Val Lys Leu Pro Asn Gly Arg Asp Thr Pro Ala Leu Phe Asn Phe
                325                 330                 335
Thr Thr Gln Glu Leu Ser Ser Asn Pro Pro Leu Ala Thr lle Leu Ile
            340                 345                 350
Pro Pro His Ala Arg lle Gln Ala Ala Ala Ser Thr Pro Thr Asn
        355                 360                 365
<210>33
<211>2029
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>33
Met Val Asp Pro Val Gly Phe Ala Glu Ala Trp Lys Ala Gln Phe Pro
1               5                   10                  15
Asp Ser Glu Pro Pro Arg Met Glu Leu Arg Ser Val Gly Asp Ile Glu
            20                  25                  30
Gln Glu Leu Glu Arg Cys Lys Ala Ser Ile Arg Arg Leu Glu Gln Glu
        35                  40                  45
Val Asn Gln Glu Arg Phe Arg Met Ile Tyr Leu Gln Thr Leu Leu Ala
    50                  55                  60
Lys Glu Lys Lys Ser Tyr Asp Arg Gln Arg Trp Gly Phe Arg Arg Ala
65                  70                  75                  80
Ala Gln Ala Pro Asp Gly Ala Ser Glu Pro Arg Ala Ser Ala Ser Arg
                85                  90                  95
Pro Gln Pro Ala Pro Ala Asp Gly Ala Asp Pro Pro Pro Ala Glu Glu
            100                 105                 110
Pro Glu Ala Arg Pro Asp Gly Glu Gly Ser Pro Gly Lys Ala Arg Pro
        115                 120                 125
Gly Thr Ala Arg Arg Pro Gly Ala Ala Ala Ser Gly Glu Arg Asp Asp
    130                 135                 140
Arg Gly Pro Pro Ala Ser Val Ala Ala Leu Arg Ser Asn Phe Glu Arg
145                 150                 155                 160
Ile Arg Lys Gly His Gly Gln Pro Gly Ala Asp Ala Glu Lys Pro Phe
                165                 170                 175
Tyr Val Asn Val Glu Phe His His Glu Arg Gly Leu Val Lys Val Asn
            180                 185                 190
Asp Lys Glu Val Ser Asp Arg Ile Ser Ser Leu Gly Ser Gln Ala Met
        195                 200                 205
Gln Met Glu Arg Lys Lys Ser Gln His Gly Ala Gly Ser Ser Val Gly
    210                 215                 220
Asp Ala Ser Arg Pro Pro Tyr Arg Gly Arg Ser Ser Glu Ser Ser Cys
225                 230                 235                 240
Gly Val Asp Gly Asp Tyr Glu Asp Ala Glu Leu Asn Pro Arg Phe Leu
                245                 250                 255
Lys Asp Asn Leu Ile Asp Ala Asn Gly Gly Ser Arg Pro Pro Trp Pro
            260                 265                 270
Pro Leu Glu Tyr Gln Pro Tyr Gln Ser Ile Tyr Val Gly Gly Met Met
        275                 280                 285
Glu Gly Glu Gly Lys Gly Pro Leu Leu Arg Ser Gln Ser Thr Ser Glu
    290                 295                 300
Gln Glu Lys Arg Leu Thr Trp Pro Arg Arg Ser Tyr Ser Pro Arg Ser
305                 310                 315                 320
Phe Glu Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Thr Pro Asp Cys Ser Ser Asn Glu
                325                 330                 335
Asn Leu Thr Ser Ser Glu Glu Asp Phe Ser Ser Gly Gln Ser Ser Arg
            340                 345                 350
Val Ser Pro Ser Pro Thr Thr Tyr Arg Met Phe Arg Asp Lys Ser Arg
        355                 360                 365
Ser Pro Ser Gln Asn Ser Gln Gln Ser Phe Asp Ser Ser Ser Pro Pro
    370                 375                 380
Thr Pro Gln Cys His Lys Arg His Arg His Cys Pro Val Val Val Ser
385                 390                 395                 400
Glu Ala Thr Ile Val Gly Val Arg Lys Thr Gly Gln Ile Trp Pro Asn
                405                 410                 415
Asp Gly Glu Gly Ala Phe His Gly Asp Ala Asp Gly Ser Phe Gly Thr
            420                 425                 430
Pro Pro Gly Tyr Gly Cys Ala Ala Asp Arg Ala Glu Glu Gln Arg Arg
        435                 440                 445
His Gln Asp Gly Leu Pro Tyr Ile Asp Asp Ser Pro Ser Ser Ser Pro
    450                 455                 460
His Leu Ser Ser Lys Gly Arg Gly Ser Arg Asp Ala Leu Val Ser Gly
465                 470                 475                 480
Ala Leu Glu Ser Thr Lys Ala Ser Glu Leu Asp Leu Glu Lys Gly Leu
                485                 490                 495
Glu Met Arg Lys Trp Val Leu Ser Gly Ile Leu Ala Ser Glu Glu Thr
            500                 505                 510
Tyr Leu Ser His Leu Glu Ala Leu Leu Leu Pro Met Lys Pro Leu Lys
        515                 520                 525
Ala Ala Ala Thr Thr Ser Gln Pro Val Leu Thr Ser Gln Gln Ile Glu
    530                 535                 540
Thr Ile Phe Phe Lys Val Pro Glu Leu Tyr Glu Ile His Lys Glu Phe
545                 550                 555                 560
Tyr Asp Gly Leu Phe Pro Arg Val Gln Gln Trp Ser His Gln Gln Arg
                565                 570                 575
Val Gly Asp Leu Phe Gln Lys Leu Ala Ser Gln Leu Gly Val Tyr Arg
            580                 585                 590
Ala Phe Val Asp Asn Tyr Gly Val Ala Met Glu Met Ala Glu Lys Cys
        595                 600                 605
Cys Gln Ala Asn Ala Gln Phe Ala Glu Ile Ser Glu Asn Leu Arg Ala
    610                 615                 620
Arg Ser Asn Lys Asp Ala Lys Asp Pro Thr Thr Lys Asn Ser Leu Glu
625                 630                 635                 640
Thr Leu Leu Tyr Lys Pro Val Asp Arg Val Thr Arg Ser Thr Leu Val
                645                 650                 655
Leu His Asp Leu Leu Lys His Thr Pro Ala Ser His Pro Asp His Pro
            660                 665                 670
Leu Leu Gln Asp Ala Leu Arg Ile Ser Gln Asn Phe Leu Ser Ser Ile
        675                 680                 685
Asn Glu Glu Ile Thr Pro Arg Arg Gln Ser Met Thr Val Lys Lys Gly
    690                 695                 700
Glu His Arg Gln Leu Leu Lys Asp Ser Phe Met Val Glu Leu Val Glu
705                 710                 715                 720
Gly Ala Arg Lys Leu Arg His Val Phe Leu Phe Thr Glu Leu Leu Leu
                725                 730                 735
Cys ThT Lys Leu Lys Lys Gln Ser Gly Gly Lys Thr Gln Gln Tyr Asp
            740                 745                 750
Cys Lys Trp Tyr Ile Pro Leu Thr Asp Leu Ser Phe Gln Met Val Asp
        755                 760                 765
Glu Leu Glu Ala Val Pro Asn Ile Pro Leu Val Pro Asp Glu Glu Leu
    770                 775                 780
Asp Ala Leu Lys Ile Lys Ile Ser Gln Ile Lys Ser Asp Ile Gln Arg
785                 790                 795                 800
Glu Lys Arg Ala Asn Lys Gly Ser Lys Ala Thr Glu Arg Leu Lys Lys
                805                 810                 815
Lys Leu Ser Glu Gln Glu Ser Leu Leu Leu Leu Met Ser Pro Ser Met
            820                 825                 830
Ala Phe Arg Val His Ser Arg Asn Gly Lys Ser Tyr Thr Phe Leu Ile
        835                 840                 845
Ser Ser Asp Tyr Glu Arg Ala Glu Trp Arg Glu Asn Ile Arg Glu Gln
    850                 855                 860
Gln Lys Lys Cys Phe Arg Ser Phe Ser Leu Thr Ser Val Glu Leu Gln
865                 870                 875                 880
Met Leu Thr Asn Ser Cys Val Lys Leu Gln Thr Val His Ser Ile Pro
                885                 890                 895
Leu Thr Ile Asn Lys Glu Asp Asp Glu Ser Pro Gly Leu Tyr Gly Phe
            900                 905                 910
Leu Asn Val Ile Val His Ser Ala Thr Gly Phe Lys Gln Ser Ser Leu
        915                 920                 925
Gln Arg Pro Val Ala Ser Asp Phe Glu Pro Gln Gly Leu Ser Glu Ala
    930                 935                 940
Ala Arg Trp Asn Ser Lys Glu Asn Leu Leu Ala Gly Pro Ser Glu Asn
945                 950                 955                 960
Asp Pro Asn Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Phe Val Ala Ser Gly Asp
                965                 970                 975
Asn Thr Leu Ser Ile Thr Lys Gly Glu Lys Leu Arg Val Leu Gly Tyr
            980                 985                 990
Asn His Asn Gly Glu Trp Cys Glu Ala Gln Thr Lys Asn Gly Gln Gly
        995                 1000                1005
Trp Val Pro Ser Asn Tyr Ile Thr Pro Val Asn Ser Leu Glu Lys
    1010                1015                1020
His Ser Trp Tyr His Gly Pro Val Ser Arg Asn Ala Ala Glu Tyr
    1025                1030                1035
Leu Leu Ser Ser Gly Ile Asn Gly Ser Phe Leu Val Arg Glu Ser
    1040                1045                1050
Glu Ser Ser Pro Gly Gln Arg Ser Ile Ser Leu Arg Tyr Glu Gly
    1055                1060                1065
Arg Val Tyr His Tyr Arg Ile Asn Thr Ala Ser Asp Gly Lys Leu
    1070                1075                1080
Tyr Val Ser Ser Glu Ser Arg Phe Asn Thr Leu Ala Glu Leu Val
    1085                1090                1095
His His His Ser Thr Val Ala Asp Gly Leu Ile Thr Thr Leu His
    1100                1105                1110
Tyr Pro Ala Pro Lys Arg Asn Lys Pro Thr Val Tyr Gly Val Ser
    1115                1120                1125
Pro Asn Tyr Asp Lys Trp Glu Met Glu Arg Thr Asp Ile Thr Met
    1130                1135                1140
Lys His Lys Leu Gly Gly Gly Gln Tyr Gly Glu Val Tyr Glu Gly
    1145                1150                1155
Val Trp Lys Lys Tyr Ser Leu Thr Val Ala Val Lys Thr Leu Lys
    1160                1165                1170
Glu Asp Thr Met Glu Val Glu Glu Phe Leu Lys Glu Ala Ala Val
    1175                1180                1185
Met Lys Glu Ile Lys His Pro Asn Leu Val Gln Leu Leu Gly Val
    1190                1195                1200
Cys Thr Arg Glu Pro Pro Phe Tyr Ile Ile Thr Glu Phe Met Thr
    1205                1210                1215
Tyr Gly Asn Leu Leu Asp Tyr Leu Arg Glu Cys Asn Arg Gln Glu
    1220                1225                1230
Val Asn Ala Val Val Leu Leu Tyr Met Ala Thr Gln Ile Ser Ser
    1235                1240                1245
Ala Met Glu Tyr Leu Glu Lys Lys Asn Phe Ile His Arg Asp Leu
    1250                1255                1260
Ala Ala Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn His Leu Val Lys Val
    1265                1270                1275
Ala Asp Phe Gly Leu Ser Arg Leu Met Thr Gly Asp Thr Tyr Thr
    1280                1285                1290
Ala His Ala Gly Ala Lys Phe Pro Ile Lys Trp Thr Ala Pro Glu
    1295                1300                1305
Ser Leu Ala Tyr Asn Lys Phe Ser Ile Lys Ser Asp Val Trp Ala
    1310                1315                1320
Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Ala Thr Tyr Gly Met Ser Pro
    1325                1330                1335
Tyr Pro Gly Ile Asp Leu Ser Gln Val Tyr Glu Leu Leu Glu Lys
    1340                1345                1350
Asp Tyr Arg Met Glu Arg Pro Glu Gly Cys Pro Glu Lys Val Tyr
    1355                1360                1365
Glu Leu Met Arg Ala Cys Trp Gln Trp Asn Pro Ser Asp Arg Pro
    1370                1375                1380
Ser Phe Ala Glu Ile His Gln Ala Phe Glu Thr Met Phe Gln Glu
    1385                1390                1395
Ser Ser Ile Ser Asp Glu Val Glu Lys Glu Leu Gly Lys Gln Gly
    1400                1405                1410
Val Arg Gly Ala Val Ser Thr Leu Leu Gln Ala Pro Glu Leu Pro
    1415                1420                1425
Thr Lys Thr Arg Thr Ser Arg Arg Ala Ala Glu His Arg Asp Thr
    1430                1435                1440
Thr Asp Val Pro Glu Met Pro His Ser Lys Gly Gln Gly Glu Ser
    1445                1450                1455
Asp Pro Leu Asp His Glu Pro Ala Val Ser Pro Leu Leu Pro Arg
    1460                1465                1470
Lys Glu Arg Gly Pro Pro Glu Gly Gly Leu Asn Glu Asp Glu Arg
    1475                1480                1485
Leu Leu Pro Lys Asp Lys Lys Thr Asn Leu Phe Ser Ala Leu Ile
    1490                1495                1500
Lys Lys Lys Lys Lys Thr Ala Pro Thr Pro Pro Lys Arg Ser Ser
    1505                1510                1515
Ser Phe Arg Glu Met Asp Gly Gln Pro Glu Arg Arg Gly Ala Gly
    1520                1525                1530
Glu Glu Glu Gly Arg Asp Ile Ser Asn Gly Ala Leu Ala Phe Thr
    1535                1540                1545
Pro Leu Asp Thr Ala Asp Pro Ala Lys Ser Pro Lys Pro Ser Asn
    1550                1555                1560
Gly Ala Gly Val Pro Asn Gly Ala Leu Arg Glu Ser Gly Gly Ser
    1565                1570                1575
Gly Phe Arg Ser Pro His Leu Trp Lys Lys Ser Ser Thr Leu Thr
    1580                1585                1590
Ser Ser Arg Leu Ala Thr Gly Glu Glu Glu Gly Gly Gly Ser Ser
    1595                1600                1605
Ser Lys Arg Phe Leu Arg Ser Cys Ser Ala Ser Cys Val Pro His
    1610                1615                1620
Gly Ala Lys Asp Thr Glu Trp Arg Ser Val Thr Leu Pro Arg Asp
    1625                1630                1635
Leu Gln Ser Thr Gly Arg Gln Phe Asp Ser Ser Thr Phe Gly Gly
    1640                1645                1650
His Lys Ser Glu Lys Pro Ala Leu Pro Arg Lys Arg Ala Gly Glu
    1655                1660                1665
Asn Arg Ser Asp Gln Val Thr Arg Gly Thr Val Thr Pro Pro Pro
    1670                1675                1680
Arg Leu Val Lys Lys Asn Glu Glu Ala Ala Asp Glu Val Phe Lys
    1685                1690                1695
Asp Ile Met Glu Ser Ser Pro Gly Ser Ser Pro Pro Asn Leu Thr
    1700                1705                1710
Pro Lys Pro Leu Arg Arg Gln Val Thr Val Ala Pro Ala Ser Gly
    1715                1720                1725
Leu Pro His Lys Glu Glu Ala Gly Lys Gly Ser Ala Leu Gly Thr
    1730                1735                1740
Pro Ala Ala Ala Glu Pro Val Thr Pro Thr Ser Lys Ala Gly Ser
    1745                1750                1755
Gly Ala Pro Gly Gly Thr Ser Lys Gly Pro Ala Glu Glu Ser Arg
    1760                1765                1770
Val Arg Arg His Lys His Ser Ser Glu Ser Pro Gly Arg Asp Lys
    1775                1780                1785
Gly Lys Leu Ser Arg Leu Lys Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala
    1790                1795                1800
Ala Ser Ala Gly Lys Ala Gly Gly Lys Pro Ser Gln Ser Pro Ser
    1805                1810                1815
Gln Glu Ala Ala Gly Glu Ala Val Leu Gly Ala Lys Thr Lys Ala
    1820                1825                1830
Thr Ser Leu Val Asp Ala Val Asn Ser Asp Ala Ala Lys Pro Ser
    1835                1840                1845
Gln Pro Gly Glu Gly Leu Lys Lys Pro Val Leu Pro Ala Thr Pro
    1850                1855                1860
Lys Pro Gln Ser Ala Lys Pro Ser Gly Thr Pro Ile Ser Pro Ala
    1865                1870                1875
Pro Val Pro Ser Thr Leu Pro Ser Ala Ser Ser Ala Leu Ala Gly
    1880                1885                1890
Asp Gln Pro Ser Ser Thr Ala Phe Ile Pro Leu Ile Ser Thr Arg
    1895                1900                1905
Val Ser Leu Arg Lys Thr Arg Gln Pro Pro Glu Arg Ile Ala Ser
    1910                1915                1920
Gly Ala Ile Thr Lys Gly Val Val Leu Asp Ser Thr Glu Ala Leu
    1925                1930                1935
Cys Leu Ala Ile Ser Arg Asn Ser Glu Gln Met Ala Ser His Ser
    1940                1945                1950
Ala Val Leu Glu Ala Gly Lys Asn Leu Tyr Thr Phe Cys Val Ser
    1955                1960                1965
Tyr Val Asp Ser Ile Gln Gln Met Arg Asn Lys Phe Ala Phe Arg
    1970                1975                1980
Glu Ala Ile Asn Lys Leu Glu Asn Asn Leu Arg Glu Leu Gln Ile
    1985                1990                1995
Cys Pro Ala Thr Ala Gly Ser Gly Pro Ala Ala Thr Gln Asp Phe
    2000                2005                2010
Ser Lys Leu Leu Ser Ser Val Lys Glu Ile Ser Asp Ile Val Gln
    2015                2020                2025
Arg
<210>34
<211>1382
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>34
Met Gly Thr Gly Gly Arg Arg Gly Ala Ala Ala Ala Pro Leu Leu Val
1               5                   10                  15
Ala Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ala Gly His Leu Tyr Pro Gly
            20                  25                  30
Glu Val Cys Pro Gly Met Asp Ile Arg Asn Asn Leu Thr Arg Leu His
        35                  40                  45
Glu Leu Glu Asn Cys Ser Val Ile Glu Gly His Leu Gln Ile Leu Leu
    50                  55                  60
Met Phe Lys Thr Arg Pro Glu Asp Phe Arg Asp Leu Ser Phe Pro Lys
65                  70                  75                  80
Leu Ile Met Ile Thr Asp Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Tyr Gly Leu
                85                  90                  95
Glu Ser Leu Lys Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Ser
            100                 105                 110
Arg Leu Phe Phe Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Val His Leu
        115                 120                 125
Lys Glu Leu Gly Leu Tyr Asn Leu Met Asn Ile Thr Arg Gly Ser Val
    130                 135                 140
Arg Ile Glu Lys Asn Asn Glu Leu Cys Tyr Leu Ala Thr Ile Asp Trp
145                 150                 155                 160
Ser Arg Ile Leu Asp Ser Val Glu Asp Asn His Ile Val Leu Asn Lys
                165                 170                 175
Asp Asp Asn Glu Glu Cys Gly Asp Ile Cys Pro Gly Thr Ala Lys Gly
            180                 185                 190
Lys Thr Asn Cys Pro Ala Thr Val Ile Asn Gly Gln Phe Val Glu Arg
        195                 200                 205
Cys Trp Thr His Ser His Cys Gln Lys Val Cys Pro Thr Ile Cys Lys
    210                 215                 220
Ser His Gly Cys Thr Ala Glu Gly Leu Cys Cys His Ser Glu Cys Leu
225                 230                 235                 240
Gly Asn Cys Ser Gln Pro Asp Asp Pro Thr Lys Cys Val Ala Cys Arg
                245                 250                 255
Asn Phe Tyr Leu Asp Gly Arg Cys Val Glu Thr Cys Pro Pro Pro Tyr
            260                 265                 270
Tyr His Phe Gln Asp Trp Arg Cys Val Asn Phe Ser Phe Cys Gln Asp
        275                 280                 285
Leu His His Lys Cys Lys Asn Ser Arg Arg Gln Gly Cys His Gln Tyr
    290                 295                 300
Val Ile His Asn Asn Lys Cys Ile Pro Glu Cys Pro Ser Gly Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Met Asn Ser Ser Asn Leu Leu Cys Thr Pro Cys Leu Gly Pro Cys Pro
                325                 330                 335
Lys Val Cys His Leu Leu Glu Gly Glu Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr
            340                 345                 350
Ser Ala Gln Glu Leu Arg Gly Cys Thr Val Ile Asn Gly Ser Leu Ile
        355                 360                 365
Ile Asn Ile Arg Gly Gly Asn Asn Leu Ala Ala Glu Leu Glu Ala Asn
    370                 375                 380
Leu Gly Leu Ile Glu Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Lys Ile Arg Arg Ser
385                 390                 395                 400
Tyr Ala Leu Val Ser Leu Ser Phe Phe Arg Lys Leu Arg Leu Ile Arg
                405                 410                 415
Gly Glu Thr Leu Glu Ile Gly Asn Tyr Ser Phe Tyr Ala Leu Asp Asn
            420                 425                 430
Gln Asn Leu Arg Gln Leu Trp Asp Trp Ser Lys His Asn Leu Thr Thr
        435                 440                 445
Thr Gln Gly Lys Leu Phe Phe His Tyr Asn Pro Lys Leu Cys Leu Ser
    450                 455                 460
Glu Ile His Lys Met Glu Glu Val Ser Gly Thr Lys Gly Arg Gln Glu
465                 470                 475                 480
Arg Asn Asp Ile Ala Leu Lys Thr Asn Gly Asp Lys Ala Ser Cys Glu
                485                 490                 495
Asn Glu Leu Leu Lys Phe Ser Tyr Ile Arg Thr Ser Phe Asp Lys Ile
            500                 505                 510
Leu Leu Arg Trp Glu Pro Tyr Trp Pro Pro Asp Phe Arg Asp Leu Leu
        515                 520                 525
Gly Phe Met Leu Phe Tyr Lys Glu Ala Pro Tyr Gln Asn Val Thr Glu
    530                 535                 540
Phe Asp Gly Gln Asp Ala Cys Gly Ser Asn Ser Trp Thr Val Val Asp
545                 550                 555                 560
Ile Asp Pro Pro Leu Arg Ser Asn Asp Pro Lys Ser Gln Asn His Pro
                565                 570                 575
Gly Trp Leu Met Arg Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln Tyr Ala Ile Phe
            580                 585                 590
Val Lys Thr Leu Val Thr Phe Ser Asp Glu Arg Arg Thr Tyr Gly Ala
        595                 600                 605
Lys Ser Asp Ile Ile Tyr Val Gln Thr Asp Ala Thr Asn Pro Ser Val
    610                 615                 620
Pro Leu Asp Pro Ile Ser Val Ser Asn Ser Ser Ser Gln Ile Ile Leu
625                 630                 635                 640
Lys Trp Lys Pro Pro Ser Asp Pro Asn Gly Asn Ile Thr His Tyr Leu
                645                 650                 655
Val Phe Trp Glu Arg Gln Ala Glu Asp Ser Glu Leu Phe Glu Leu Asp
            660                 665                 670
Tyr Cys Leu Lys Gly Leu Lys Leu Pro Ser Arg Thr Trp Ser Pro Pro
        675                 680                 685
Phe Glu Ser Glu Asp Ser Gln Lys His Asn Gln Ser Glu Tyr Glu Asp
    690                 695                 700
Ser Ala Gly Glu Cys Cys Ser Cys Pro Lys Thr Asp Ser Gln Ile Leu
705                 710                 715                 720
Lys Glu Leu Glu Glu Ser Ser Phe Arg Lys Thr Phe Glu Asp Tyr Leu
                725                 730                 735
His Asn Val Val Phe Val Pro Arg Lys Thr Ser Ser Gly Thr Gly Ala
            740                 745                 750
Glu Asp Pro Arg Pro Ser Arg Lys Arg Arg Ser Leu Gly Asp Val Gly
        755                 760                 765
Asn Val Thr Val Ala Val Pro Thr Val Ala Ala Phe Pro Asn Thr Ser
    770                 775                 780
Ser Thr Ser Val Pro Thr Ser Pro Glu Glu His Arg Pro Phe GLu Lys
785                 790                 795                 800
Val Val Asn Lys Glu Ser Leu Val Ile Ser Gly Leu Arg His Phe Thr
                805                 810                 815
Gly Tyr Arg Ile Glu Leu Gln Ala Cys Asn Gln Asp Thr Pro Glu Glu
            820                 825                 830
Arg Cys Ser Val Ala Ala Tyr Val Ser Ala Arg Thr Met Pro Glu Ala
        835                 840                 845
Lys Ala Asp Asp Ile Val Gly Pro Val Thr His Glu Ile Phe Glu Asn
    850                 855                 860
Asn Val Val His Leu Met Trp Gln Glu Pro Lys Glu Pro Asn Gly Leu
865                 870                 875                 880
Ile Val Leu Tyr Glu Val Ser Tyr Arg Arg Tyr Gly Asp Glu Glu Leu
                885                 890                 895
His Leu Cys Val Ser Arg Lys His Phe Ala Leu Glu Arg Gly Cys Arg
            900                 905                 910
Leu Arg Gly Leu Ser Pro Gly Asn Tyr Ser Val Arg Ile Arg Ala Thr
        915                 920                 925
Ser Leu Ala Gly Asn Gly Ser Trp Thr Glu Pro Thr Tyr Phe Tyr Val
    930                 935                 940
Thr Asp Tyr Leu Asp Val Pro Ser Asn Ile Ala Lys Ile Ile Ile Gly
945                 950                 955                 960
Pro Leu Ile Phe Val Phe Leu Phe Ser Val Val Ile Gly Ser Ile Tyr
                965                 970                 975
Leu Phe Leu Arg Lys Arg Gln Pro Asp Gly Pro Leu Gly Pro Leu Tyr
            980                 985                 990
Ala Ser Ser Asn Pro Glu Tyr Leu Ser Ala Ser Asp Val Phe Pro Cys
        995                 1000                1005
Ser Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp Glu Val Ser Arg Glu Lys Ile
    1010                1015                1020
Thr Leu Leu Arg Glu Leu Gly Gln Gly Ser Phe Gly Met Val Tyr
    1025                1030                1035
Glu Gly Asn Ala Arg Asp Ile Ile Lys Gly Glu Ala Glu Thr Arg
    1040                1045                1050
Val Ala Val Lys Thr Val Asn Glu Ser Ala Ser Leu Arg Glu Arg
    1055                1060                1065
Ile Glu Phe Leu Asn Glu Ala Ser Val Met Lys Gly Phe Thr Cys
    1070                1075                1080
His His Val Val Arg Leu Leu Gly Val Val Ser Lys Gly Gln Pro
    1085                1090                1095
Thr Leu Val Val Met Glu Leu Met Ala His Gly Asp Leu Lys Ser
    1100                1105                1110
Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Pro Glu Ala Glu Asn Asn Pro Gly Arg
    1115                1120                1125
Pro Pro Pro Thr Leu Gln Glu Met Ile Gln Met Ala Ala Glu Ile
    1130                1135                1140
Ala Asp Gly Met Ala Tyr Leu Asn Ala Lys Lys Phe Val His Arg
    1145                1150                1155
Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Val Ala His Asp Phe Thr Val
    1160                1165                1170
Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Thr Arg Asp Ile Tyr Glu Thr Asp
    1175                1180                1185
Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Lys Gly Leu Leu Pro Val Arg Trp Met
    1190                1195                1200
Ala Pro Glu Ser Leu Lys Asp Gly Val Phe Thr Thr Ser Ser Asp
    1205                1210                1215
Met Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu lle Thr Ser Leu Ala
    1220                1225                1230
Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu Ser Asn Glu Gln Val Leu Lys Phe
    1235                1240                1245
Val Met Asp Gly Gly Tyr Leu Asp Gln Pro Asp Asn Cys Pro Glu
    1250                1255                1260
Arg Val Thr Asp Leu Met Arg Met Cys Trp Gln Phe Asn Pro Lys
    1265                1270                1275
Met Arg Pro Thr Phe Leu Glu Ile Val Asn Leu Leu Lys Asp Asp
    1280                1285                1290
Leu His Pro Ser Phe Pro Glu Val Ser Phe Phe His Ser Glu Glu
    1295                1300                1305
Asn Lys Ala Pro Glu Ser Glu Glu Leu Glu Met Glu Phe Glu Asp
    1310                1315                1320
Met Glu Asn Val Pro Leu Asp Arg Ser Ser His Cys Gln Arg Glu
    1325                1330                1335
Glu Ala Gly Gly Arg Asp Gly Gly Ser Ser Leu Gly Phe Lys Arg
    1340                1345                1350
Ser Tyr Glu Glu His Ile Pro Tyr Thr His Met Asn Gly Gly Lys
    1355                1360                1365
Lys Asn Gly Arg Ile Leu Thr Leu Pro Arg Ser Asn Pro Ser
    1370                1375                1380
<210>35
<211>290
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>35
Glu Lys Ile Thr Leu Leu Arg Glu Leu Gly Gln Gly Ser Phe Gly Met
1               5                   10                  15
Val Tyr Glu Gly Asn Ala Arg Asp Ile Ile Lys Gly Glu Ala Glu Thr
            20                  25                  30
Arg Val Ala Val Lys Thr Val Asn Glu Ser Ala Ser Leu Arg Glu Arg
        35                  40                  45
Ile Glu Phe Leu Asn Glu Ala Ser Val Met Lys Gly Phe Thr Cys His
    50                  55                  60
His Val Val Arg Leu Leu Gly Val Val Ser Lys Gly Gln Pro Thr Leu
65                  70                  75                  80
Val Val Met Glu Leu Met Ala His Gly Asp Leu Lys Ser Tyr Leu Arg
                85                  90                  95
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Glu Asn Asn Pro Gly Arg Pro Pro Pro Thr
            100                 105                 110
Leu Gln Glu Met Ile Gln Met Ala Ala Glu Ile Ala Asp Gly Met Ala
        115                 120                 125
Tyr Leu Asn Ala Lys Lys Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn
    130                 135                 140
Cys Met Val Ala His Asp Phe Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met
145                 150                 155                 160
Thr Arg Asp Ile Tyr Glu Thr Asp Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Lys Gly
                165                 170                 175
Leu Leu Pro Val Arg Trp Met Ala Pro Glu Ser Leu Lys Asp Gly Val
            180                 185                 190
Phe Thr Thr Ser Ser Asp Met Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu
        195                 200                 205
Ile Thr Ser Leu Ala Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu Ser Asn Glu Gln
    210                 215                 220
Val Leu Lys Phe Val Met Asp Gly Gly Tyr Leu Asp Gln Pro Asp Asn
225                 230                 235                 240
Cys Pro Glu Arg Val Thr Asp Leu Met Arg Met Cys Trp Gln Phe Asn
                245                 250                 255
Pro Lys Met Arg Pro Thr Phe Leu Glu Ile Val Asn Leu Leu Lys Asp
            260                 265                 270
Asp Leu His Pro Ser Phe Pro Glu Val Ser Phe Phe His Ser Glu Glu
        275                 280                 285
Asn Lys
    290
<210>36
<211>480
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>36
Met Ser Asp Val Ala Ile Val Lys Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly
1               5                   10                  15
Glu Tyr Ile Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Asn Asp
            20                  25                  30
Gly Thr Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Arg Pro Gln Asp Val Asp Gln Arg
        35                  40                  45
Glu Ala Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Gln Cys Gln Leu Met Lys
    50                  55                  60
Thr Glu Arg Pro Arg Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp
65                  70                  75                  80
Thr Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Glu Thr Pro Glu Glu Arg
                85                  90                  95
Glu Glu Trp Thr Thr Ala Ile Gln Thr Val Ala Asp Gly Leu Lys Lys
            100                 105                 110
Gln Glu Glu Glu Glu Met Asp Phe Arg Ser Gly Ser Pro Ser Asp Asn
        115                 120                 125
Ser Gly Ala Glu Glu Met Glu Val Ser Leu Ala Lys Pro Lys His Arg
    130                 135                 140
Val Thr Met Asn Glu Phe Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr
145                 150                 155                 160
Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr Tyr
                165                 170                 175
Ala Met Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Val Ala Lys Asp Glu Val
            180                 185                 190
Ala His Thr Leu Thr Glu Asn Arg Val Leu Gln Asn Ser Arg His Pro
        195                 200                 205
Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr His Asp Arg Leu Cys
    210                 215                 220
Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser
225                 230                 235                 240
Arg Glu Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala Glu
                245                 250                 255
Ile Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Glu Lys Asn Val Val Tyr
            260                 265                 270
Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile
        275                 280                 285
Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Lys Asp Gly Ala
    290                 295                 300
Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val
305                 310                 315                 320
Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly
                325                 330                 335
Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln
            340                 345                 350
Asp His Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg Phe
        355                 360                 365
Pro Arg Thr Leu Gly Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu
    370                 375                 380
Lys Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly Gly Ser Glu Asp Ala Lys
385                 390                 395                 400
Glu Ile Met Gln His Arg Phe Phe Ala Gly Ile Val Trp Gln His Val
                405                 410                 415
Tyr Glu Lys Lys Leu Ser Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu
            420                 425                 430
Thr Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Met Ile Thr
        435                 440                 445
Ile Thr Pro Pro Asp Gln Asp Asp Ser Met Glu Cys Val Asp Ser Glu
    450                 455                 450
Arg Arg Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Ser Thr Ala
465                 470                 475                 480
<210>37
<211>335
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>37
Lys Val Thr Met Asn Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly
1               5                   10                  15
Thr Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Arg Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ala Met Lys Ile Leu Arg Lys Glu Val Ile Ile Ala Lys Asp Glu
        35                  40                  45
Val Ala His Thr Val Thr Glu Ser Arg Val Leu Gln Asn Thr Arg His
    50                  55                  60
Pro Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ala Phe Gln Thr His Asp Arg Leu
65                  70                  75                  80
Cys Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu
                85                  90                  95
Ser Arg Glu Arg Val Phe Thr Glu Glu Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala
            100                 105                 110
Glu Ile Val Ser Ala Leu Glu Tyr Leu His Ser Arg Asp Val Val Tyr
        115                 120                 125
Arg Asp Ile Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile
    130                 135                 140
Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Ser Asp Gly Ala
145                 150                 155                 160
Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val
                165                 170                 175
Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly
            180                 185                 190
Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln
        195                 200                 205
Asp His Glu Arg Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg Phe
    210                 215                 220
Pro Arg Thr Leu Ser Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ala Gly Leu Leu
225                 230                 235                 240
Lys Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly Gly Pro Ser Asp Ala Lys
                245                 250                 255
Glu Val Met Glu His Arg Phe Phe Leu Ser Ile Ash Trp Gln Asp Val
            260                 265                 270
Val Gln Lys Lys Leu Leu Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu
        275                 280                 285
Val Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Asp Glu Phe Thr Ala Gln Ser Ile Thr
    290                 295                 300
Ile Thr Pro Pro Asp Arg Tyr Asp Ser Leu Gly Leu Leu Glu Leu Asp
305                 310                 315                 320
Gln Arg Thr His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Ile Arg
                325                 330                 335
<210>38
<211>390
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>38
Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1               5                   10                  15
Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr
            20                  25                  30
Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala
        35                  40                  45
Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser
    50                  55                  60
Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu
                85                  90                  95
Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu
            100                 105                 110
Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr
        115                 120                 125
His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val
    130                 135                 140
Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu
145                 150                 155                 160
Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn
                165                 170                 175
Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser
            180                 185                 190
Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu
        195                 200                 205
Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser
    210                 215                 220
Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Thr
225                 230                 235                 240
Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro
                245                 250                 255
Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln
            260                 265                 270
Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser
        275                 280                 285
Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys
    290                 295                 300
Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn
305                 310                 315                 320
Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr
                325                 330                 335
Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala
            340                 345                 350
Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr
        355                 360                 365
Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val
    370                 375                 380
Arg Ser Cys Lys Cys Ser
385                 390

Claims (35)

1.一种鉴别与天然产生的特定蛋白质相互作用以调节蛋白质活性的分子的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
鉴别形成所述蛋白质一部分的开关控制配体；
鉴别形成所述蛋白质一部分并与所述开关控制配体相互作用的开关控制口袋，
所述配体在体内与所述口袋相互作用以调节所述蛋白质的构象和生物活性，从而在所述配体-口袋相互作用时该蛋白质呈第一构象和第一生物活性，并在所述配体-口袋相互作用缺乏时呈第二种不同的构象和生物活性；
提供处于所述第一和第二构象的所述蛋白质的相应样品；以及
通过使分子与一种所述样品接触，并鉴别在所述口袋区域与这种蛋白质结合以调节蛋白质活性的小分子，用一个或多个候选分子来筛选至少一种所述样品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质选自酶、受体和信号蛋白。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述蛋白质选自激酶、磷酸酶、磺基转移酶、硫酸酯酶、转录因子、核激素受体、g蛋白质偶联受体、g-蛋白、gtp酶、激素、聚合酶和包含核苷酸调节位点的其它蛋白质。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质的分子量至少约15kDa。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述分子量大于约30kDa。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鉴别所述开关控制配体序列和所述开关控制口袋的步骤选自：生物信息学分析、X射线晶体学、核磁共振(NMR)、圆二色性(CD)和亲和碱基筛选。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提供蛋白质的步骤包括获得静态地限于与所述第一和第二构象相对应的各个状态的基本纯化的所述蛋白质样品的步骤。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接触步骤包括选自下组的技术：基于亲和性的筛选、毛细管区带电泳、荧光探针置换测定、核磁共振谱、圆二色性和X射线晶体学。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质是一种激酶蛋白质。
10.一种蛋白质-调制剂加合物，其包括具有开关控制口袋的天然产生的蛋白质以及在所述开关控制口袋区域与蛋白质结合的非天然产生的分子，所述分子通过诱导或限制所述蛋白质的构象至少用来部分调节所述蛋白质的生物活性。
11.如权利要求10所述的加合物，其特征在于，所述分子用来诱导所述蛋白质的构象变化。
12.如权利要求10所述的加合物，其特征在于，所述分子用来限制所述蛋白质的构象变化。
13.如权利要求10所述的加合物，其特征在于，所述蛋白质还具有一开关控制配体，所述配体在体内与所述口袋相互作用以调节所述蛋白质的构象和生物活性，从而在所述配体-口袋相互作用时该蛋白质呈第一构象和第一生物活性，并在所述配体-口袋相互作用缺乏时呈第二种不同的构象和生物活性。
14.如权利要求10所述的加合物，其特征在于，所述口袋是开-口袋，所述分子在所述开-口袋区域作为激动剂与所述蛋白质结合。
15.如权利要求10所述的加合物，其特征在于，所述口袋是开-口袋，所述分子在所述开-口袋区域作为拮抗剂与所述蛋白质结合。
16.如权利要求10所述的加合物，其特征在于，所述口袋是关-口袋，所述分子在所述关-口袋区域作为激动剂与所述蛋白质结合。
17.如权利要求10所述的加合物，其特征在于，所述口袋是关-口袋，所述分子在所述关-口袋区域作为拮抗剂与所述蛋白质结合。
18.如权利要求10所述的加合物，其特征在于，所述蛋白质选自酶、受体和信号蛋白。
19.如权利要求18所述的加合物，其特征在于，所述蛋白质选自激酶、磷酸酶、磺基转移酶、硫酸酯酶、转录因子、核激素受体、g蛋白质偶联受体、g-蛋白、gtp酶、激素、聚合酶和包含核苷酸调节位点的其它蛋白质。
20.如权利要求10所述的加合物，其特征在于，所述蛋白质的分子量至少约15kDa。
21.如权利要求20所述的加合物，其特征在于，所述分子量大于约30kDa。
22.如权利要求10所述的加合物，其特征在于，所述蛋白质是一种激酶蛋白质。
23.一种改变蛋白质生物活性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
提供具有开关控制口袋的天然产生的蛋白质；
使所述蛋白质与非-天然产生的分子调制剂接触；和
使所述调制剂在所述口袋区域与所述蛋白质结合，以通过诱导或限制所述蛋白质的构象至少部分调节所述蛋白质的生物活性。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述分子用来诱导所述蛋白质的构象变化。
25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述分子用来限制所述蛋白质的构象变化。
26.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述蛋白质还具有一开关控制配体，所述配体在体内与所述口袋相互作用以调节所述蛋白质的构象和生物活性，从而在所述配体-口袋相互作用时该蛋白质呈第一构象和第一生物活性，并在所述配体-口袋相互作用缺乏时呈第二种不同的构象和生物活性。
27.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述口袋是开-口袋，所述分子在所述开-口袋区域作为激动剂与所述蛋白质结合。
28.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述口袋是开-口袋，所述分子在所述开-口袋区域作为拮抗剂与所述蛋白质结合。
29.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述口袋是关-口袋，所述分子在所述关-口袋区域作为激动剂与所述蛋白质结合。
30.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述口袋是关-口袋，所述分子在所述关-口袋区域作为拮抗剂与所述蛋白质结合。
31.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述蛋白质选自酶、受体和信号蛋白。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述蛋白质选自激酶、磷酸酶、磺基转移酶、硫酸酯酶、转录因子、核激素受体、g蛋白质偶联受体、g-蛋白、gtp酶、激素、聚合酶和包含核苷酸调节位点的其它蛋白质。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述蛋白质的分子量至少约15kDa。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述分子量大于约30kDa。
35.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述蛋白质是一种激酶蛋白质。
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