CN1634031A - 治疗艾滋病的药物及其应用 - Google Patents

Abstract

提供含有治疗艾滋病有效量的式(I)化合物联苯环辛二烯类木脂素及可药用载体和/或赋形剂的治疗艾滋病的药物，以及它们在制备抗艾滋病的药物中的应用。结构式中：R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，R₇，R₈，R₉，R₁₀＝－H，－OCH₃，－OH，－OCOR(R为烷基或芳基)；R₁R₂，R₂R₃，R₄R₅，R₅R₆为右（a）式；R₇，R₁₀＝氧桥。

Description

治疗艾滋病的药物及其应用

技术领域：本发明属于药物技术领域，具体地说，涉及一种治疗艾滋病的药物及其在制备逆转录酶抑制剂和治疗艾滋病药物中的应用。

技术背景：自从1981年首例艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)报告以来，其流行迅速蔓延至世界各国，目前已有6000多万人被感染，2000多万人死亡，造成的经济及社会损失不可估量。中国已成为艾滋病大流行的第二浪潮国家，如不采取有效的预防和控制措施，预计2010年中国的艾滋病病毒感染人数将达1000万，成为世界上艾滋病感染人数最多的国家。因此，艾滋病的防治无可争议地成为当代科学的前沿之一。目前有十余种HIV疫苗正在临床试验，但尚无有确切疗效的HIV疫苗面市。因而，抗艾滋病药物的研究就显得特别重要，药物治疗成为目前防治艾滋病的焦点。高效抗逆转录病毒疗法(HAART，即鸡尾酒疗法)延长了HIV感染者寿命，取得了很好的效果，但仍然不能清除体内病毒，治愈病人。目前临床使用的24种抗HIV药物都是基于病毒本身的蛋白为靶标，包括HIV逆转录酶(如AZT，DDC，DDI，D4T，3TC)和蛋白水解酶抑制剂(如Sequanavir，Ritonavir，Indinavir，Nelfinavir)，这些药物存在治疗价格昂贵、有毒副作用、服药繁琐、不能清除体内病毒和耐药病毒株的产生等缺陷。从传统中药、植物和真菌资源中寻找新的抗HIV药物或先导化合物的研究，是国内外新药研制中非常活跃的领域。至今已发现100多种天然化合物具有很好的抗HIV活性，其中活性较强的有：甘草甜素，金丝桃素，姜黄素，大豆皂甙，喜树碱，栗精胺，香菇多糖和天花粉蛋白等。

迄今，现有技术中没有含有本发明式I的化合物作为有效成分在治疗艾滋病方面的报道，也没有该化合物具有抗HIV-1活性的报道。

发明内容：本发明的目的在于提供一类治疗艾滋病的药物，该药物含有治疗艾滋病有效量的式(I)化合物联苯环辛二烯类木脂素及可药用载体和/或赋形剂。

本发明的另一目的是提供上述化合物和组合物在药物中特别是在制备治疗艾滋病药物中的应用。

本发明的目的可以通过下述的技术方案得以实现：

一种治疗艾滋病的药物，其中含有治疗艾滋病有效量的式(I)化合物联苯环辛二烯类木脂素及可药用载体和/或赋形剂

其中：

R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，R₇，R₈，R₉，R₁₀＝-H，-OCH₃，-OH，-OCOR(R为烷基或芳基)；

R₁R₂，R₂R₃，R₄R₅，

R₇，R₁₀＝氧桥；

优选的本发明的化合物是gomisin M₂(1)，是其中R₁＝R₂＝R₄＝-OCH₃，R₃＝-OH，R₇＝R₁₀＝H，

R₈＝R₉＝β-H时的化合物；micrantherin A(2)，是其中R₁＝R₃＝R₄＝R₅＝R₆＝-OCH₃，R₂＝-OH，R₇＝R₁₀＝H，R₈＝β-OAng，R₉＝β-H时的化合物；以及gomisin G(3)，即R₁＝R₂＝R₃＝R₄＝-OCH₃， R₇＝β-OCOPh，R₈＝α-OH，R₉＝β-H，R₁₀＝H时的化合物。其中micrantherin A(2)为新化合物。

本发明还提供了式(I)化合物联苯环辛二烯类木脂素在制备抗艾滋病药物中的应用。

本发明式(I)化合物的制备方法是用合适的有机溶剂浸提小花五味子和滇翼梗五味子茎和叶粗粉得到总浸膏，总浸膏用水分散后用有机溶剂萃取后得到萃取物，萃取物经反复柱层析分离后得到。其中的提取溶剂可采用60％-100％的丙酮、乙醇、甲醇中的任意一种；浸提可采用冷浸或热回流；萃取的有机溶剂可采用乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、苯中的任意一种。

本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1-99％，优选为0.5-90％的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物有单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经口服和注射(静注、肌注)两种形式给药。

具体实施方式：

附图说明：

图1为化合物2重要的HMBC相关信号图；

图2为小花五味子化学成分提取分离流程图。

下面结合附图用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质，但实施例不以任何方式限制本发明。

实施例1：

gomisin M₂(1)(以下简称化合物1)的制备：

干燥小花五味子(Schisandra micrantha A.C.Smith)茎和叶6.8kg，粉碎后用丙酮水溶液室温浸泡3次(每次25升左右)，提取液合并，减压蒸馏除去丙酮后，静置过夜，滤除沉积的色素，滤液先用石油醚萃取2次，再用乙酸乙酯萃取3次，回收溶剂后，得乙酸乙酯部分(170g)。乙酸乙酯部分用300g粗硅胶(80-100目)拌样，1.4kg硅胶(100-200目)以粗短型硅胶柱进行粗分离，氯仿∶丙酮(1∶0→0∶1)梯度洗脱，每1000ml为一个馏分，共300份。TLC监测合并相同的部分，得到8个主要部分。其中第6-8份(3g，部位2)以石油醚-丙酮(20∶1)为洗脱剂进行硅胶柱层析，每100ml为一个馏分，共48份，其中第33-45份经硅胶柱层析，重结晶后得化合物1(740mg)。

实施例2：

Micrantherin A(2)(以下简称化合物2)的制备

干燥小花五味子茎和叶6.8kg，粉碎后用丙酮水溶液室温浸泡3次(每次25升左右)，提取液合并，减压蒸馏至无丙酮味后，水部分静置过夜，滤除沉积的色素，滤液先用石油醚萃取2次，然后用乙酸乙酯萃取3次，回收溶剂后，得乙酸乙酯部分170g。将沉积下的色素部分和石油醚萃取部分合并，浓缩，得石油醚部分150g。石油醚部分用300g粗硅胶拌样后，1.5kg硅胶进行硅胶柱层析，石油醚∶丙酮(1∶0→7∶3)梯度洗脱，TLC监测合并相同部分，得到5个部分：部位a-e(图-4)。部位b(19g)为石油醚∶丙酮(10∶1)冲下部分，经石油醚∶乙酸乙酯10∶1冲柱，反复纯化后得到化合物2(185mg)

化合物2，浅黄色胶状物；[α]_D ¹⁷.9：+16.2(c＝0.43，CHCl₃)。EI MS谱显示分子离子峰为基峰(m/z 500)，结合NMR谱，确定分子式为C₂₈H₃₆O₈，并经高分辨EI MS谱([M+Na]⁺，m/z 523.2306)证实。不饱和度为11。UV在241(4.24)nm具有联苯环辛烯木脂素的特征吸收。IR光谱显示存在羟基(3448cm^-1)，酯羰基(1735cm^-1)，芳环(1647，1598，1494cm^-1)和双键(1579cm^-1)。¹H和¹³C NMR谱(表-1)表明分子中有5个甲氧基，1个羟基，1个当归酸酯，1个仲甲基、1个与氧同碳的叔甲基和两个苄基质子。¹³C NMR谱中2个甲氧基的化学位移与其它甲氧基相比在高场(δ_C56.4，56.6)，说明它们处在芳香质子的邻位，即C-3和C-12位。比较NMR谱数据，化合物2与已知化合物gomisin K₃在C₁～C₃结构片段的化学位移值非常相似，提示化合物2在C-1、C-2、C-3位均有甲氧基取代。由于当归酸酯基不受芳香环屏蔽的影响，表明该基团位于联苯的7位或8位。C-4(δ_C112.2)移向高场，而C-5(δ_C135.7)移向低场，表明当归酸酯基连在C-7位较合理。ROESY谱中(图-2)，当归酸酯基的烯质子与H-8的NOE相关，进一步证实了上述判断。HMBC谱中5个甲氧基与C-1、C-2、C-3、C-12和C-14的相关点，说明剩下的1个羟基应连在13位上。

在化合物2的ROESY谱中，H-4与H-6α，H-8β与Me-17，H-11与H-9β，H-11与Me-17之间的NOE明显相关，可以推定化合物2的八元环为扭曲的船椅式构象。据此，化合物2的结构如图-1所示，命名为小花五味子酯A。

实施例3：

gomisin G(3)(以下简称化合物3)的制备：

干燥滇翼梗五味子(Schisandra henryi var.yunnanensis A.C.Smith)茎和叶2.4kg，粉碎后用80％丙酮水溶液室温冷浸3次(每次12升)，提取液合并，减压蒸馏至无丙酮味，静置过夜，滤除沉积物，滤液用乙酸乙酯萃取，回收溶剂后得乙酸乙酯部分105g。乙酸乙酯部分粗硅胶(150g)拌样后，CHCl₃-Me₂CO1∶0→0∶1梯度洗脱，分为5个部分。部位1(20g)，适量硅胶拌样后，以石油醚-丙酮9∶1和石油醚-乙酸乙酯4∶1为洗脱剂，反复纯化后得化合物3(850mg)。

                    表-1化合物2的NMR数据(CD₃OD中测定)^a

编号 δH(mult，J，Hz)    δC	编号   δH(mult，J，Hz)   δC
		1                         152.9s2                         141.1s3                         153.5s4    6.73(s)              112.2d5                         135.7s6α      2.66(d，13.7)        42.6t6β      2.38(d，13.7)7                         73.5s8    1.86(t，6.9)         42.1d9α      2.95(dd，8.4，14.4)  36.2t9β      2.48(dd，2.2，14.4)10                        136.0s11   6.88(s)              113.9d12                        152.3s13                        140.5s	14                          143.3s15                          124.5s16                          123.3s17       1.25(s)            29.7q18       0.89(d，7.1)       16.4q1′                         166.9s2′                         128.7s3′      5.97(m)            138.6d2′-Me   1.77(s)            20.6q3′-Me   1.76(br s)         15.7q1-OCH3  3.87(s)            61.2q2-OCH3  3.82(s)            61.0q3-OCH3  3.48(s)            56.4q12-OCH3 3.92(s)            56.6q14-OCH3 3.88(s)            61.3q

^aBruker DRX-400MHz核磁共振仪测定，化学位移值(δ)用ppm表示，偶合常数(J)用Hz表示

                             化合物1-3的结构

实施例4：

体外抗艾滋病HIV-1活性试验：

化合物1对C8166细胞的毒性较大，CC₅₀为15.22μg/ml。对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体抑制的EC₅₀为0.70μg/ml，选择指数(S.I.值)为21.74；对HIV-1感染MT-4细胞死亡的保护作用较明显，选择指数(S.I.值)为12.02。实验结果显示，化合物1的细胞毒性较大，但具有显著的体外抗HIV-1活性，因此可作为治疗艾滋病药物的活性先导化合物。

体外抗HIV-1活性实验方法：

1、病毒感染性的滴定

HIV-1按Johnson&Byington(1990)所述方法改良进行滴定，简述如下：将HIV-1贮存液在96孔板上作4倍稀释，10个梯度，每梯度6个重复孔，每孔加入C8166细胞50μl(3×10⁵/ml)，每孔终体积200μl，37℃，5％CO₂培养。第三天补加新鲜RPMI-1640培养基100μl。第七天在倒置显微镜下观察每孔中HIV-1致细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)，以每孔是否有合胞体的形成进行判断；按Reed & Muench方法计算病毒的TCID₅₀(50％Tissue CultureInfection Dose)，即引起细胞出现CPE的病毒上清稀释度。

2、细胞毒性检测

4×10⁵/ml C8166细胞悬液100ul与不同浓度的药物溶液混合，同时设置阳性药物AZT对照孔、不含药物的对照孔和空白对照孔，37℃，5％CO₂培养3天，采用MTT法(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)检测细胞存活率。ELx800 ELISA Reader测定OD_595/630nm值。计算CC₅₀值(50％Cytotoxic Concentration)，即50％细胞存活时的药物浓度。

3、对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体的抑制试验

4×10⁵/ml C8166细胞悬液50ul与不同浓度的药物溶液混合，加入50μlHIV-1稀释上清50μl，M.O.I.为0.025，同时设置不含药物的对照孔及阴性对照孔，设置阳性药物AZT对照.37℃，5％CO₂培养三天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体个数。计算EC50值(50％Effective Concentration)即抑制合胞体形成50％时的药物浓度。

4、化合物对HIV-1感染MT-4细胞死亡的保护作用试验

8×10⁵/ml MT-4细胞悬液50μl与100μl不同浓度的药物溶液混合，培养板的一半孔加入50μl培养基，另一半孔加入50μl HIV-1稀释上清，M.O.I.为0.5，同时设置不含药物的未感染或感染HIV-1的细胞对照孔及空白对照孔，设置阳性药物AZT对照，37℃，5％CO₂培养5天，采用MTT法检测细胞存活率。ELx800ELISA Reader测定OD_595/630nm值。计算药物对正常细胞的存活率和HIV-1感染细胞的保护率。

              表-2化合物1-3体外抗HIV-1活性实验结果

                                            1        2        3

               毒性实验CC50(μg/ml)         15.22    99.02    56.09

毒性与

               合胞体抑制EC50(μg/ml)       0.70     24.54    5.74

合胞体实验

               选择指数(SI)(CC50/EC50)      21.74    4.04     9.77

               CC50(μg/ml)                 13.2     111.34   1.45

MTT保护试验    EC50(μg/ml)                 0.81     ＞200    ＞200

               选择指数(SI)                 16.30

实施例5：

按实施例1的方法先制得化合物1，按其与赋形剂重量比为5∶1的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例6：

按实施例2的方法先制得化合物2，按其与赋形剂重量比为5∶1的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例7：

按实施例3的方法先制得化合物3，按其与赋形剂重量比为5∶1的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例8：

按实施例1的方法先制得化合物1，按常规注射液制法加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例9：

按实施例2的方法先制得化合物2，按常规注射液制法加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例10：

按实施例3的方法先制得化合物3，按常规注射液制法加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

Claims (2)

1、一种治疗艾滋病的药物，其中含有治疗艾滋病有效量的式(I)化合物联苯环辛二烯类木脂素及可药用载体和/或赋形剂

结构式中：

R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，R₇，R₈，R₉，R₁₀＝-H，-OCH₃，-OH，-OCOR(R为烷基或芳基)；

R₁R₂，R₂R₃，R₄R₅，

R₇，R₁₀＝氧桥；

2、式(I)化合物联苯环辛二烯类木脂素在制备抗艾滋病药物中的应用。

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