CN1614401B - 由nmr波谱估计分子物质中预定同位素的核数量的方法 - Google Patents

Abstract

一种从含有分子物质作为主要成分的样品的NMR谱出发，估算所述分子物质中预定同位素的核数量的方法，所述NMR谱包含多个对应于所述核的信号峰。通过应用包含和排序标准得到一组有序信号峰，对其积分产生一组有序积分。进行嵌套的外部和内部迭代循环，其中对于每个循环，将一个尝试性的核数分配给所述有序积分中的一个，同时其它的有序积分相应地重新校正，并四舍五入得到下一个整数值，以产生候选的总核数。从具有最高出现次数的多个候选总核数中选择最小的一个，即得估计的总核数。

Description

由NMR波谱估计分子物质中预定同位素的核数量的方法

技术领域

本发明涉及从NMR波谱估算分子物质中预定同位素的核数的方法、所述方法的用途以及实现所述方法的计算机程序产品。

背景技术

核磁共振波谱法是广泛用于定性和定量分析各种样品的熟知技术。该技术一般涉及在选择具有非零核自旋角动量的预定核同位素，如¹H，¹³C或其它核素的条件下，记录核磁共振波谱，此后称作NMR谱。一般地，由含分子物质的样品得到的NMR谱包含许多由预定同位素核产生的信号峰。每个信号峰对应一个特定的共振频率，其可归因于一个或多个核处于由特定分子环境所导致的特定局部磁场。因此，在共振频率处可记录到NMR信号峰，通常用相对于参照信号的百万分之几(ppm)计的术语化学位移来表示，它是引起信号峰的核或多个核的分子定位的指标。

同其它分析技术相比较，NMR波谱法的一个重要优势在于：在一定的已知条件下，信号峰的积分值与共振核数成正比【如见R.R.Ernst，G.Bodenhausen和A.wokaun，“在一维和二维中核磁共振的原理”，牛津科学出版社，1988，91-157】。因此，在一个NMR谱中，各信号峰的积分值反映贡献于每个信号峰的原子核的数量。这一事实通常用来指导对未知分子物质的NMR谱进行人工的，即非自动的解读，也就是定性分析。

然而，NMR波谱法也可应用于定量分析。因为上述的信号峰的积分值与共振核的数量成比例关系，NMR信号峰的绝对积分值与存在于NMR波谱仪检测容积中含共振核的分子数量直接相关。不过，NMR信号峰的绝对积分值一般取决于许多实验条件。通过NMR波谱法作定量分析时，需将测量得到的信号积分同由标准信号得到的积分进行比较。

本领域中已知一些产生合适的标准信号的方法，如法国专利申请FR2735865A1所述。FR2735865A1特别公开了一种通过具有由电子设备生成的合成NMR标准信号的NMR波谱法进行定量分析的装置和方法。该技术由于采用首字缩略词“ERETIC”(表示“Electronic REference To access In vivo Concentrations”---获取体内浓度的电子参照)而知名，如报道于L.Barantiin，A.Le page.和S.Akoka“关于MRS代谢物质绝对定量的新方法”《磁学研究方法》38卷(1997)179-182页。

应用NMR波谱法进行定性和定量分析的一个基本问题是任何实际得到的NMR谱都同理论期望有某种程度的偏差。这种偏差主要由于不可避免的噪声干扰以及其它的实验影响例如磁场的不均一性、偏场及其它影响。而溶剂效应和交换反应，如氢离子交换，在进行¹H-NMR波谱分析时会导致对积分值确定不准确。因此，相比于相同分子物质中其它的信号峰的积分值，受干扰的信号峰的积分值一般会与理论值有所差异。更进一步的问题由所谓的化学位移简并所引起，指的是在分子物质中处于不同位置的核具有基本相同的化学位移从而造成NMR信号峰重叠的情况。这些因素为用NMR波谱法作定性和定量分析造成了以下困难。

在定性分析时，一个分子物质的特定NMR谱中所有信号峰的相对积分值应该重新校正，即每个信号峰的积分要被乘以一个通用换算系数，以使每个重新校正的积分值都是一个整数。该通用换算系数说明了该仪器的测量敏感度和样品中该分子物质的浓度。得到的一组整数对应于分子物质中引起不同信号峰的原子核数量。在波谱简单、不密集且小噪声的有利情况下，程序会以直接的方式运行。然而，在不利的条件下，重新校正一组整数的计算强度会导致出现与事实不符的核数解。例如在一个分子中的一个特定的核产生的两个信号峰应该具有相同的信号积分值，然而得出的实验积分比为0.97/1.03，提示在该分子中第一种核有97个，第二种有103个，因此导致对NMR谱无法接受的解释。

在定量分析中，确定分子中特定的NMR信号峰积分值需对比适当的标准峰的积分值，例如这种标准峰可以是按ERETIC方法合成的NMR信号，也可以由加到被测样品中的已知浓度的标准物质得到。显然，这种比较必须适时计算贡献于特定信号峰的具有相同化学位移的核数量。如同在定性分析中一样，任何实验引起的与理论信号积分值的偏差都将导致定量估算的相应误差。在上述简单的例子中，取决于是第一还是第二积分值与标准积分值进行对比，结果将是真实结果的0.97或1.03倍。

概括地说，定性和定量分析中NMR波谱法的使用是受限制的，这些限制因素一是由于不可避免的实验误差，二是由于化学位移简并使得分子物质中预定同位素的核数量一般不能由含该分子物质样品的NMR谱直接得到。在上述领域中，阻碍NMR波谱法应用的是在本领域中未知的自动测定样品浓度和纯度的方法。如果基于NMR的定量和定性分析需要高处理能力，那么对原子核数量的自动样品分析就是先决条件。

发明内容

本发明的主要目的是克服上述NMR波谱法对定性和定量分析的困难和限制。

本发明的另一个目的是提供一种由含有分子物质的样品的NMR谱估算该分子物质中预定同位素核数量的方法及其用途。

本发明的另一个目的是为由含有分子物质的样品的NMR谱估算该分子物质中预定同位素核数量提供一个计算机程序产品。

上述和其它目的通过权利要求1限定的方法、权利要求9限定的用途和权利要求10限定的计算机程序产品来实现。

根据权利要求1，提供了从含有分子物质作为主要成分的样品的NMR谱出发，估算所述分子物质中预定同位素的核数量的方法。预定同位素可以是适于NMR波谱分析的任何同位素的原子核，包括，但不限于¹H，¹³C和³¹P。此方法可用于包含在不同类型样品中的广泛的分子物质。该方法要求待测分子物质产生具有多个信号峰、合理的信噪比且不存在过强的溶剂信号的可分辨NMR谱。该方法包括的连续步骤概述于下文的斜体字中，并提供了解释性说明。

a)从所述多个信号峰中选择一组内含信号峰，该峰能满足内含标准：这种内含标准(inclusion criterion)通常指一个波谱范围，例如化学移位的范围，在此范围内选择信号峰。该范围可有一个或多个排除区域，例如含有来自溶剂或已知杂质的信号峰的波谱区域，它们不在分析之列。

b)根据预定的信号排序标准排列该组内含信号峰，得到一组对应的有序信号峰：通常，信号峰将按照其峰位置(如：共振时的化学位移)以升序或降序排列，但任何其它的任意排序方式也能应用。

c)确定每一个所述有序信号峰的积分以得到一组对应的有序积分：NMR信号峰的积分方法在本领域中已众所周知，也可以用其它方法进行。应该指出的是操作步骤b)和c)的顺序也可以交换。

d)定义不超过预定最大整数的一组互不相同的正整数并按照预定的数字排序标准排列该组正整数，得到一组有序整数：此操作产生一组介于1至预定最大整数K_max的有序整数。例如，可能是有序集合{1、2、3、4、5，……K_max}。然而，集合元素的任何其它排列都可以采用，而且，该有序集合不需要包括1和K_max之间的所有整数，例如，有序集合{3，27，4，…，6，89，2}其中K_max＝89。

e)选择所述有序积分中的第一个来启动一个外部迭代循环，得到一个选定积分：外部迭代循环对所述有序积分的每一个都要进行，从第一个开始直至所有所述的有序积分都被处理(见下文步骤m)。对于一个给定的外部迭代循环，正好存在一个当前的选定积分。

f)给所述有序整数的第一个的值分配一个顺序号(running number)来启动一个内部迭代循环：内部迭代循环对所述有序整数中的每一个都进行(见下文步骤1)；在给定的内部迭代循环中，设置一个顺序号等于所述有序整数中当前的那个数。该顺序号的含义是暂时分配给当前选定积分的假设核数。

g)由所述顺序号与所述当前选定积分的比率来计算换算系数：该换算系数是基于暂时分配给当前选定积分的假设核数。

h)将所述有序积分逐个乘以所述换算系数，产生一组校正积分：利用这一操作，根据暂时分配给当前选定积分的假设核数，对所有的积分值进行重新校正。

i)将所述校正积分逐个四舍五入至最接近的整数值，以产生一组整数化的校正积分：由于不可避免的测量误差以及因为暂时分配给当前选定积分的假设核数在大多数情况下都是错的，因此校正积分值通常具有非整数值。舍入操作产生了一组具有整数值的积分。

i)计算该组整数化校正积分的总和，产生候选总核数：对于暂时分配给当前选定积分的假设核数，所有整数化校正积分的总和得到分子物质中候选总核数。在程序的这一点上，还不能确定候选总核数是否是一个可接受的对真实总核数的估计。

k)可检索地存储对应于即时内部迭代循环的结果集合，所述存储的结果集合至少含有所述候选总核数：该存储的结果集合可以暂时或永久存储，优选存储在某些合适的计算机存储介质上，如核心存储器。对应于特定内部迭代循环的结果集合的检索由适当的存储数据编码来保证，如在关联数据库的架构下。

1)将顺序号设定为等于所述有序整数的下一个值来启动下一个内部迭代循环，然后将该顺序号赋值给所述选定积分并且重复步骤g)到步骤l)直至所有的有序整数都被处理：见上文f)步。

m)选择下一个所述有序积分，启动下一个外部迭代循环并重复步骤f)到步骤m)直至所有有序积分都经过处理:见上文步骤e)。

n)从多个所述存储的结果集合中确定每个所述候选总核数的出现次数:在完成所有的内部和外部迭代循环后，该操作产生一个总核数的分布，它可以绘成直方图，图中可以显示每个候选总核数的出现频率。

o)在所述总核数分布中确定最高出现次数。

p)形成一个包括所有出现的次数等于所述最高出现次数的候选总核数的集合：该集合中始终包含至少一个候选总核数。

q)从所述候选总核数集合中取最低值，得到估计的总核数：这一步确保该方法产生一个唯一解。特别地，要删除对应于最简单解的无意义倍数的解。

以上定义的方法提供了一种简单、可靠、易于操作的规定方法，以从基本任意的样品NMR谱中得到总核数的估计，该样品含有作为主要物质的相关分子物质。

根据权利要求9，本发明提供了该方法用于定量测定所述样品的所述分子物质的用途。

根据权利要求10，提供了一个计算机程序产品，包括存储于计算机可读介质上的程序编码方式，当该计算机程序产品在计算机系统中运行时该程序执行以上定义的方法。例如，该计算机程序产品包含一个存储在软盘或其它合适介质上的可执行程序以装入个人计算机中。

本发明的优选实施方案公开在从属权利要求中。

本发明方法的主要应用之一是针对具有未知总核数的分子，但也可以用于具有已知总核素的分子，下文称之为“标称总核数”。在理想条件下，所估计的总核数应与标称总核数相同。然而，在某些特殊环境下，标称总核数可能是估计总核数的整倍数，例如有两倍大。估计总核数或它的整倍数与标称总核数的差异，如果可得到后者的话，表示有某些非理想的影响，如存在对NMR信号有实质贡献的杂质或对NMR信号峰的表观积分有影响的交换反应。一般情况下，这类非理想的影响的存在需要操作者的介入。因此，在根据权利要求2的优选实施方案中，该方法还包括以下步骤：

a)检查所述估计的总核数或其直到预定最大整乘数的任何整倍数与所述分子物质的标称总核数是否相等；和

b)如果所有所述同一性检查结果是否定的，则发出警告通知。

根据权利要求3的优选实施方案中，每一个所述存储的结果集合还包括多个整数化校正积分和多个在即时内部迭代循环中得到的校正积分之间的总偏差量，该方法还包括下述步骤：

a)取出对应于所述估计总核数的全部结果集合；

b)选择具有最小总偏差量的结果集合；

c)为每一个所述的有序信号峰分配一个相应的部分核数，该部分核数通过从所述选定的结果集合中取对应于所述有序信号峰的整数化校正积分而得到。

在本方法中不仅得到相关分子物质的估计总核数，还可以得到NMR谱中对应于每个信号峰的部分核数的估计。这些信息对于推导相关分子物质的结构式是特别有用的。如果有一个以上的结果集合对应于估计总核数，则通过选择具有最小总偏差量的结果集合来选择部分核数的唯一解，其中后者可以是整数化校正积分和校正积分间绝对偏差的总和，或是均方根差或任何其它合适的统计方法。

根据权利要求4的优选实施方案中，该方法还包括下述步骤：

a)提供一个不满足所述内含标准且对应于标准物质的特定核数的标准信号峰；

b)积分所述标准信号峰并将结果除以所述特定的核数来得到标准积分；

c)选择一个包含至少一个所述的有序信号峰的定量集合；

d)对所述定量集合的有序信号峰所对应的有序积分求和；

e)对所述定量集合的有序信号峰的估计部分核数求和；

f)得到标称样品积分，定义为所述有序积分的总和与所述部分核数的总和的比率：

g)将所述标称样品积分除以标准积分，得到样品中分子物质的相对浓度。

要强调的是，标准信号峰不需要与样品的NMR谱同时获得。换言之，该标准信号可由完全表征的参照样品的其它NMR谱中提取。在任何情况下，该标准信号峰都不应该满足内含标准，以确保在内部、外部迭代循环进行时，该标准信号峰不会被纳入计算。

以上定义的实施方案是基于这样的事实，即在一定的已知条件下(如见R、R、Ernst，GBodenhausen和A.wokaun，载于引文)，NMR信号峰的积分与共振核的数量成正比。有必要提供一个与相关分子物质的信号峰不相重叠的标准信号峰。还应该理解的是，标准信号峰应该是已知对应于标准物质的特定核数。通过将标准峰的积分除以所述特定核数来得到一个标准积分，它可以作为所述分子物质定量测定的参照。

定量集合可以包含任一个所述有序积分。特别地，它可以包括全部有序积分，在此情况下，步骤e)所计算的结果对应于所述分子物质中所述预定同位素的估计总核数。步骤g)得到样品中分子物质的浓度结果，该浓度被表示为相对于与标准信号峰相对应的浓度。

得到标称样品信号的便利方法定义在权利要求5中，按其要求，所述的定量集合包含与选定的结果集合相关的选定积分相对应的有序信号峰。换言之，定量测定是通过与最小总偏差量相关联的信号峰来进行。

在定义于权利要求6的特别优选的实施方案中，所述标准信号峰由ERETIC法产生，因此允许利用合成NMR标准峰的已知优势。

根据权利要求7的方法还包括从有序信号峰集合和对应的估计部分核数中得到关于所述分子物质的物质集合和关于含在样品中的杂质物质的杂质集合的步骤，该物质集合包括其估计部分核数大于0的有序信号峰，并且杂质集合包括其估计部分核数等于0的有序信号峰。因此杂质集合所包含的信号峰不会来自于相关分子物质。这些信息可以用来改进内含标准，即可以利用改进的内含信号峰集合反复运行上述程序来估计核数以得到改进的结果。

根据权利要求8，该方法还包括下述步骤：

a)采用对应于所述物质集合的信号峰的一个积分或多个积分的和，得到有关物质的积分；

b)采用对应于所述杂质集合的信号峰的一个积分或多个积分的和，得到有关杂质的积分；和

c)比较有关杂质的积分和有关物质的积分，得到包含在样品中的杂质的相对核数量。

上述实施方案可以简单用于得到均含相同分子物质的一系列样品中杂质的相对量和具有不同含量的给定类型的杂质物质。

附图说明

通过参考以下对本发明不同实施方案的描述连同附图的说明，本发明的上述及其它特点、目的和实现的方法将更为显而易见，并且该发明本身将会被更好地理解，其中：

图1显示含分子物质A(C₂₁H₂₂FN₃O₃S)并加入标准化合物四甲基硅烷(TMS)的第一样品的¹H-NMR谱，以信号强度I(任意单位)对化学位移δ(ppm)(注：ppm为百万分率)作图。

图2显示分子物质A的化学结构式，包括氢原子的化学位移(ppm)；

图3显示由图1的谱测定的¹H核候选总数的直方图，以出现次数f(M)对候选总核数M作图；

图4显示含分子物质A、加入标准化合物TMS和加入分子物质B(C₁₃H₁₄CIN₃O₃)的第二样品的¹H-NMR谱，以信号强度I(任意单位)对化学位移δ(ppm)作图；

图5显示包括氢原子化学位移(ppm)的分子物质B的化学结构式；

图6显示由图4的谱测定的¹H核候选总数的直方图，以出现次数f(M)对候选总核数M作图；

具体实施方式

这里举出的实例不会以任何方式来限制本公开或本发明的范围。

显示的波谱是用ACD/HNMR软件包模拟的。所有模拟在标称磁场强度14.1Tesla(特斯拉)下制作，对非交换质子用缺省线宽1Hz(赫兹)，对交换质子用5Hz。每个具有化学位移范围为12.3ppm的波谱由16000个谱图数据点计算得到。

实施例1

此例说明了对含有未知核数的基本纯净样品的应用。图1显示含C₂₁H₂₂FN₃O₃S(见图2)样品的¹H-NMR谱，后文注明为“分子物质A”，并加入四甲基硅烷(TMS)，一种已知的用于NMR分析的标准物质。已知分子A含22个质子，这些信息将不用于即将使用的程序。该波谱含有化学移位δ范围为约0到11的多个信号峰。这些峰都有一些多重结构，可以很容易看到总波谱是由10个清晰的信号峰组成。在此情况下，只有在1到11ppm之间的信号峰被包括在下一步的分析中，并且定义包括的信号峰P的集合含有元素{P₁，P₂，……，P₉}。Oppm处的信号已知来源于TMS，并且将在实施例3中用于标定的目的，但它不是本实施例中包括的信号峰的集合的一部分。按照峰的位置，P集合通过对每个包括的信号峰分配一个峰号来排序，于是形成了具有元素{∏₁，∏₂，……，∏₉}的有序信号峰∏的集合。每个有序信号峰的积分通过标准数值积分方法确定，产生了具有元素{S₁，S₂，……，S₉}的有序积分S的集合。如表1所列，归纳了准备一组原始数据的初始过程。

表1实施例1的有序积分集合S

峰值号∏<sub>j</sub>	化学移位δ[ppm]	序列积分S<sub>j</sub>[a.u.]
			1	10270	4.335
2	7.860	9.122

3	7.255	9.368
			4	6.157	9.054
5	4.054	13.667
			6	3.615	9.228
7	3.357	27.7
			8	1.908	8.710
9	1.204	8.746

现在解释在分子物质A中估计¹H-核(后文以“质子”表示)数量的过程。应该强调的是没有将关于质子数的信息用于该过程(在本例已知为22个)。

开始定义预定最大整数K_max，它应被选作未知的质子数的上限。K_max的一个合理的数值通常得自于有关相关分子物质的额外化学信息，例如从关于该分子怎样由已知的反应物合成的知识中得到。另外，K_max可以由燃烧分析或其他常规分析方法得到。为了简化，在此可假设K_max＝50，但实际上也可选择更高的数值。然后，定义一个由互不相同的不超过K_max的正整数组成的有序集合K，例如具有元素{K₁，K₂，……，K₅₀}的有序集合K＝{1，2，3，4，5，……，50}。

通过选择关于峰Π₁的第一有序积分S₁来启动外部迭代循环。此外，内部迭代循环通过将以上定义的正整数集合K的第一元素K₁的值分配给顺序号来启动。接着，即时外部和内部迭代循环的换算系数S(S₁，K₁)被计算为所述选定的正整数K₁与即时选定的积分S₁的比率。相应地，得到S(S₁，K₁)＝1/4.335≈0.23。S中的每个有序积分S_j再乘以该即时换算系数，于是导出具有元素{C₁，C₂，……，C₉}的校正信号集合C。利用此操作，按照有序积分S₁相关于质子数K₁的即时假设对有序积分S₁进行重新校正。因此，每一个所述的校正积分C_j四舍五入为最接近的整数值，产生了具有元素{I₁，I₂，……，I₉}的整数化校正积分集合I。整数化校正积分的总和即产生对于即时内部、外部迭代循环的质子候选总数M。至少含有所述的候选质子总数的结果集合R(S₁，K₁)被存储以进行进一步的处理。前述步骤的结果列于表2。

表2：第一次内部、外部迭代循环的结果

峰值号∏<sub>j</sub>	化学移位δ[ppm]	序列积分[a.u.]	校正积分[a.u.]	整数化校正积分
					1	10.279	4.335	1.000	1

2	7.860	9.122	2.104	2
					3	7.255	9.368	2.161	2
4	6.157	9.054	2.089	2
					5	4.054	13.66	3.153	3
6	3.615	9.228	2.129	2
					7	3.357	27.77	6.406	6
8	1.908	8.710	2.009	2
					9	1.204	8.746	2.018	2

偶然的是，整数化校正积分I_i的总和产生的候选质子总数M为22，它恰好是A分子正确的质子数。然而，这与本实施例并无联系，因为假设质子数是未知的。

该程序接着继续进行第一个外部迭代循环的第二内部迭代循环。随着顺序号设为K₂，重复上述所有步骤。基本上，这意味着分配两个质子给有序积分S₁。最终导致候选总质子数为45并存储于R(S₁，K₂)中。下一个内部迭代循环进行直到K₅₀，产生甚至更大的候选总质子数。

其后，选择有序积分集合S中的S₂，则下一个外部迭代循环被启动，从K₁开始，即分配一个质子到积分S₂并且继续所有的步骤直至K₅₀。执行下一个外部和内部迭代循环，直至所有集合S的积分都被处理。对于9个积分和50个集合K的元素，这需要总数达4500次的迭代。

由大量存储的结果集合R，确定所述的候选质子数M中每一个出现的次数(由给定内部迭代循环中的所有整数化校正积分I_i的总和得到，见上文)。为此目的，适当地对结果集合分类并按候选质子总数M的值的升序进行排序，如表3所示，直至该数值达到23。

由表3可见，例如仅有一个解产生候选质子总数等于1，而有四个解的结果为10个质子。出现次数最高的候选质子总数为22(表3中用黑体字示出)，这里的f(22)等于9。必须注意在此情况下当9个有序积分值都被用来分析时，9次是可能的最高出现次数。这意味着在分子A的总共22个质子中，对于集合S中的每个积分都能找到一个质子数。

表3：以候选质子总数的升序排列的结果

以出现次数f(M)对范围为1到50的候选质子总数M绘制的图示于图3。观察该全部结果集合，显示M＝22确实是出现次数最高的解。因此，在本实施例中估计的质子总数就等于M_est＝22，它完全符合分子物质A中的标称质子总数。

回到表3，最右侧一列显示了每个结果集合所对应的总偏差量ΔM(∏_k)，在此定义为具有给定候选质子总数M的结果集合的整数值和给定的选定峰Π_k之间的绝对偏差之和。换言之，对给定的结果集合，对于集合S中每个有序积分计算校正积分和整数化校正积分之间的绝对偏差，然后得到对于给定结果集合的这些绝对偏差的总和。作为选择，其他的统计方法例如C_j(校正积分)与I_j(整数化校正积分)之间的均方根偏差之和也能得到。结果集合中，对应于所述估计的总核数，即具有M＝22的结果集合，发现与选定峰j＝2有关的结果集合具有最小的总偏差值，即Δ22(∏₂)＝0.407。该结果集合对应于分配两个质子数给2号峰，其结果示于表4。表4中用黑体印刷的该行数字反映了一个直接假设，即2号峰与2个质子有关；示于表4最右列的整数化校正积分代表了贡献于每个峰的部分核数量。很明显，部分核数的总和是22而且与估计的总核数相对应。

表4：对于选定峰∏₂的迭代循环，假设K＝2个质子。

峰值号∏<sub>j</sub>	化学移位δ[ppm]	序列积分[a.u.]	校正积分[a.u.]	整数化校正积分
					1	10.279	4.335	0.950	1
2	7.860	9.122	2.000	2
					3	7.255	9.368	2.054	2
4	6.157	9.054	1.985	2
					5	4.054	13.66	2.996	3
6	3.615	9.228	2.023	2
					7	3.357	27.77	6.089	6
8	1.908	8.710	1.910	2
					9	1.204	8.746	1.918	2

实施例2

此实例说明了对主要含分子物质A但杂质有实质贡献的受污染样品的应用。图4显示第二样品的¹H-NMR谱，该样品含分子物质A，标准化合物TMS并加入10％的C₁₃H₁₄C₁N₃O₃，后文称为“分子物质B”。出于本实施例的目的，分子物质B被认为是样品中的不明杂质。

再来一次，仅取化学位移范围为1到11ppm中信号峰来建立包括的信号峰集合，该集合按峰的位置排序，由此形成有序信号峰集合∏。在每个有序信号峰积分后，得到列于表5的有序积分集合S＝{s1，s2，……，S₁₃}。同实施例1不同的是这里有13个有序积分而不是9个；14号峰来源于TMS，故不属于包括的信号峰集合。首先看到2，4，6和9号峰明显比其他峰的强度弱，这可能是由杂质造成的，但这些事实在本步骤中未能利用。

表5：实施例2的有序积分集合

峰值号∏<sub>j</sub>	化学移位δ[ppm]	序列积分S<sub>1</sub>[a.u.]
			1	10.300	3.992

2	8.470	0.421
			3	7.881	8.171
4	7.438	0.432
			5	7.243	8.504
6	6.849	0.328
			7	6.179	9.892
8	4.117	12.772
			9	3.902	1.488
10	3.666	10.179
			11	3.336	25.398
12	1.939	10.282
			13	1.225	8.137

在执行实施例1中所述的步骤且采用K_max＝50并以候选质子总数的数值升序排列结果后，得到对于直到M＝50的结果集合的数据，并作为直方图示于图6。在本实施例中，质子候选总数M＝22仅出现3次，而发现出现次数最高的是M＝48，f(48)＝7。换言之，估计的质子总数M_est＝48不同于标称质子总数M_nom＝22。此外，f(48)也不等于13，这使人期待对单一化合物的所有积分的一致解释是否是可能的。显然，这种差异是由来自杂质B的不可忽略的信号贡献所引起的。

有利之处是，只要发现了估计和标称质子总数的差异，就会发出警告通知。例如，这种警号通知可能包括显示出错信息，以警告操作者该样品可能被污染或被以其它方式破坏。在顺利的情况下，操作者有可能删除一定数量的信号峰，特别是最弱的峰，并且通过使用对应的限制包含标准，重复该程序来估计核数量。

实施例3

在此实施例中，参考了实施例1的结果，本实施例用来解决对样品中分子物质A的定量测定的不一致。该测定基于以下事实，即标准化合物质TMS的每个分子中含有12个质子。此外，本方法利用了测定的分子A的总核数和部分核数以及发现的A和TMS的NMR信号积分的相对大小。下文提及的积分以任意单位表示，不过，对于给定NMR谱的所有积分使用相同的任意单位。

通过积分来自TMS的14号峰得到标准积分Y_TMS，并除以已知的质子数12。在本实施例中，导出标准积分Y_TMS＝15.23/12＝1.27。

此外，定量集合被定义为包括至少一个物质A的有序信号峰。通过将定量集合的有序积分之和除以与之对应的估计部分核数来得到标称样品积分。为了简化，定量集合设为包括所有的选定峰，即从1号到9号峰。将表2第3行S_j(有序积分)值的总和除以估计的部分核数之和，为22，就得到了标称样品积分。导出标称样品积分为100/22＝4.55。

最后，将所述标称样品积分除以所述标准积分得到样品中分子物质的相对浓度。在本实施例中，相对标准化合物质TMS可得出分子物质A的相对浓度为4.55/1.27＝3.58。显然，这意味着如果标准化合物质TMS的浓度已知为C_TMS，则分子物质A的绝对浓度为C_A＝3.55C_TMS。

如果不将标准物质加入样品中来取得标准信号，可以采用按照ERETIC方法的电子标准信号。这样就必须建立一个初始标准程序，以确定多高的质子浓度等于给定的ERETIC信号。

符号参照表

f(M)     M出现的次数

K        正整数

K_max     预定的最大整数

M        候选质子总数

M_est     质子总数

P        峰号(对于包括的峰)

R        结果集合

S(P，n)  换算系数

S_j       积分信号

δ       化学位移

I_j       整数化校正积分

∏_j      有序信号峰

C_j       校正积分

Δ_M(∏_k) 总偏差量

Claims (9)

1.一种从含有分子物质作为主要成分的样品的NMR谱出发，估算所述分子物质中预定同位素的核数量的方法，所述NMR谱包含多个对应于所述核的信号峰，所述方法包括下述步骤：

a)从所述多个信号峰中选择一组满足内含标准的内含信号峰，所述内含标准指一个波谱范围，在此范围内选择信号峰，所述范围可有一个或多个排除区域，所述区域不在分析之列；

b)根据预定的信号排序标准排列该组内含信号峰，得到一组对应的有序信号峰；

c)确定每一个所述有序信号峰的积分以得到一组对应的有序积分；

d)定义不超过预定最大整数的一组互不相同的正整数并按照预定的数字排序标准排列该组正整数，得到一组有序整数；

e)选择所述有序积分中的第一个来启动一个外部迭代循环，得到一个选定积分；

f)给所述有序整数的第一个的值分配一个顺序号来启动一个内部迭代循环；

g)由所述顺序号与所述当前选定积分的比率来计算换算系数；

h)将所述有序积分逐个乘以所述换算系数，产生一组校正积分；

i)将所述校正积分逐个四舍五入至最接近的整数值，以产生一组整数化的校正积分；

j)计算所述组整数化校正积分的总和，产生候选总核数；

k)可检索地存储对应于即时内部迭代循环的结果集合，所述存储的结果集合至少含有所述候选总核数；

l)将顺序号设定为等于所述有序整数的下一个值来启动下一个内部迭代循环，然后将该顺序号赋值给所述选定积分并且重复步骤g)到步骤l)直至所有的有序整数都被处理；

m)选择下一个所述有序积分，启动下一个外部迭代循环并重复步骤f)到步骤m)直至所有有序积分都经过处理；

n)从多个所述存储的结果集合中确定每个所述候选总核数的出现次数；

o)确定最高出现次数；

p)形成一个包括所有出现的次数等于最高出现次数的候选总核数的集合；

q)从所述候选总核数集合中取最低值，得到估计的总核数。

2.根据权利要求1的方法，还包括下述步骤：

a)在权利要求1中步骤q)之后，检查所述估计的总核数或其直到预定最大整乘数的任何整倍数与所述分子物质的标称总核数是否相等；和

b)如果所有所述同一性检查结果是否定的，则发出警告通知。

3.根据权利要求1的方法，其中每一个所述存储的结果集合还包括多个整数化校正积分和多个在即时内部迭代循环中得到的校正积分之间的总偏差量，该方法还包括下述步骤：

a)在权利要求1中步骤q)之后，取出对应于所述估计总核数的全部结果集合；

b)选择具有最小总偏差量的结果集合；

c)为每一个所述的有序信号峰分配一个相应的部分核数，该部分核数通过从所述选定的结果集合中取对应于所述有序信号峰的整数化校正积分而得到。

4.根据权利要求3的方法，还包括下述步骤：

a)在权利要求1中步骤b)之后，提供一个不满足所述内含标准且对应于标准物质的特定核数的标准信号峰；

b)积分所述标准信号峰并将结果除以所述特定的核数来得到标准积分；

c)选择一个包含至少一个所述的有序信号峰的定量集合；

d)对所述定量集合的有序信号峰所对应的有序积分求和；

e)对定量集合的有序信号峰的分配部分核数求和；

f)得到标称样品积分，定义为所述有序积分的总和与所述部分核数的总和的比率；

g)将所述标称样品积分除以标准积分，得到样品中分子物质的相对浓度。

5.根据权利要求4的方法，其中所述的定量集合包含与选定的结果集合相关的选定积分相对应的有序信号峰。

6.根据权利要求4的方法，其中所述的标准信号峰由ERETIC法产生。

7.根据权利要求3的方法，还包括，在权利要求3中步骤c)之后，从有序信号峰集合和相应的分配部分核数中得到关于所述分子物质的物质集合和关于含在样品中的杂质物质的杂质集合的步骤，该物质集合包括其分配部分核数大于0的有序信号峰，并且杂质集合包括其分配部分核数等于0的有序信号峰。

8.根据权利要求7的方法，还包括下述步骤：

a)在权利要求7中所述步骤之后，采用对应于所述物质集合的信号峰的一个积分或多个积分的和，得到有关物质的积分；

b)采用对应于所述杂质集合的信号峰的一个积分或多个积分的和，得到有关杂质的积分；和

c)比较有关杂质的积分和有关物质的积分，得到包含在样品中的杂质相对核数量。

9.权利要求4到6中任一项的方法用于定量测定所述样品的所述分子物质的用途。

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