CN1680382A

CN1680382A - 二步树脂法制备河豚毒素的方法及河豚毒素制剂

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Publication number: CN1680382A
Application number: CNA2005100131155A
Authority: CN
Inventors: 陈家童; 苏同芳; 梁同春; 孙存祯; 林平生; 贺秉军; 王同顺
Original assignee: RIYUE BIOTECH CO Ltd NANKAI UNIV TIANJIN; Nankai University
Current assignee: RIYUE BIOTECH CO Ltd NANKAI UNIV TIANJIN; Nankai University
Priority date: 2005-01-19
Filing date: 2005-01-19
Publication date: 2005-10-12
Anticipated expiration: 2025-01-19
Also published as: CN1323081C

Abstract

本发明公开了一种工厂规模化生产河豚毒素的制备方法。原料为河豚鱼内脏，采用一种提取罐提取、二步树脂法纯化和二次结晶生产工艺，得以使河豚毒素产品达到工厂规模化生产。生产过程中操作安全、简便，获得的产品质量高，产品收率高，产品纯度达到96％－99％。符合作为医学临床应用和生物试剂应用所需的品质质量。二步树脂法生产河豚毒素的制备方法，适用河豚毒素产品的批量生产。其产品可作为临床戒断生物碱类成瘾性依赖药物综合症(戒毒)用药，以及可作为镇痛用药替代吗啡、度冷丁等。还可作为解痉、镇静、局部麻醉、抗瘙痒、及心动过速和降血压等临床用药。同时也可作为离子通道阻断作用研究的生物试剂。

Description

二步树脂法制备河豚毒素的方法及河豚毒素制剂

【技术领域】：本发明涉及一种以河豚鱼内脏为原料规模化生产河豚毒素的制备方法。其产品可作为临床用于戒毒和镇痛之药剂。作为离子通道阻断作用研究的生物试剂。

【背景技术】：河豚毒素(简称TTX)是一种由河豚鱼内脏提取的低分子量生物碱类物质。由于其独特的化学结构使其成为细胞钠离子通道专一阻断剂。因此其在生物学研究领域作为生物试剂有着不可替代的位置。河豚毒素在医学临床上所显示的药理学作用，早在上世纪30年代就已有用于临床戒断生物碱类成瘾性病症的报道。在镇痛治疗方面也不断有报道推出。因此，其无论在生物学研究领域还是在医学临床应用方面，都显示了十分重要的地位。

河豚毒素虽然在生物学研究领域和医学临床应用有着重要的作用，但其自身是一个具有极强毒性的剧毒物质。同时，由于河豚毒素在河豚鱼内脏的单位含量极低，给提取纯化带来相当大的困难。所以选择一种安全、操作简便、有较高收率的规模化生产制备河豚毒素的方法，就显示出极为重要的作用。

目前提取河豚毒素的方法有许多种，但这些方法都在不同程度上存在着某些缺点。如高效液相法：使用设备昂贵(高压液相仪)，且产品一次产出率低，难于满足规模化生产；膜过滤法：众所周知膜过滤原理是在某一分子量区间范围内，截留分子量大致相同的物质。而对分子量大致相同而结构、性质不同的物质则无法分离，因此很难将河豚毒素纯化；活性炭法：活性炭是一种非选择性吸附剂，其对物质吸附能力强，而物质被洗脱下来效果差，对产品的收率有直接的影响；这些都制约了河豚毒素的规模化生产。

【发明内容】：本发明的目的之一是解决现有提取河豚毒素的方法使用设备昂贵、产品一次产出率低、难以规模化生产的问题，提供一种能够大规模提取制备河豚毒素的方法，该方法不仅提取工艺简单，产率高，而且产品质量优良，纯度高达96-99％，直接符合生物学研究和临床应用的要求。

本发明方法提取的产品可以直接制备为各种制剂，因此，本发明要解决的另一技术问题是提供一类戒除药物依赖性的制剂。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备河豚毒素的方法，该方法包括下述步骤：

1)将河豚鱼内脏(鱼肝、鱼卵巢等)破碎，加无离子水低温搅拌下提取，获得提取液，将提取液加热，凝固蛋白；吊滤去除固形物；获得微黄色初毒液；

2)初毒液低温条件下，用非极性吸附树脂R1树脂低速搅拌吸附后，滤出树脂；获无杂质粗毒液；

3)将粗毒液进行离子交换型树脂R2树脂上柱交换吸附；粗毒液被离子交换型树脂R2树脂吸附完毕，经水洗后；用洗脱液醋酸：水pH＝3.5进行洗脱，收集浓馏份，以生物检测法示踪监测，获得的浓馏份液体，即河豚毒素粗品；

4)将所得液体河豚毒素粗品置减压浓缩装置，进行低温减压浓缩，浓缩至小体积，得高浓度河豚毒素液；其中低温减压浓缩，是在温度小于50℃，减压真空度0.8-1.1Pa条件下进行；

5)调节所得的高浓度河豚毒素液pH＝7.5-9.0使达到等电点，置4-8℃条件下静置获得河豚毒素结晶；

6)将河豚毒素结晶用无机或有机酸性试剂溶解，并再用碱性试剂调pH达到等电点，使产品二次结晶纯化。获得的结晶产品经干燥后，既为河豚毒素产品。

上述方法的提取是在双层提取罐中，以冷却水进行冷却提取。一次可以提取500公斤以上原料(河豚鱼内脏)。本发明的方法采用低温提取。以减少河豚毒素因温度过高，造成产品脱氢而品质下降和产率降低。上述的“低温”优选是指大约2-8℃。

上述方法中的“非极性吸附树脂”可以是各种规格的进口或国产非极性吸附树脂。优选NKA-9树脂(天津南开大学化工厂生产)，但不局限于同类型的其它型号树脂是指各种规格的进口或国产非极性吸附树脂。

例如：X-5、3520等(天津产)

上述的“离子交换型树脂”可以是各种规格的进口或国产离子交换型树脂。优选D₁₅₁树脂，但不局限于同类型的其它型号树脂，例如：D₁₅₂、D₁₁₁、(天津产)Amberlyst XN1004(美国产)。

上述方法中非极性吸附树脂在吸附杂质完毕后，采用过滤或离心的方法，分离无杂质毒素液。树脂用乙醇洗脱去除杂质后，重复使用；离子交换型树脂的洗脱剂同样也可以是任何常规洗脱该类树脂的洗脱剂，优选但是不限于醋酸：水体系、盐酸：水体系等。

上述方法中二次纯化结晶可以使用的各种有机酸和无机酸化学试剂作为纯化结晶试剂。这些有机酸或无机酸包括不局限于：例如盐酸、醋酸、苦味酸等。

另一方面，本发明也提供了含有本法制备的河豚毒素产品的各种制剂，包括口服胶囊、口服片剂、含片、肌肉注射、静脉注射、静脉滴注等剂型。以及各类型透皮吸收制剂(包括但不局限于透皮贴片、喷雾剂、涂摸剂等)。各剂型中河豚毒素产品含量为：口服剂型；每片(或每一胶囊)含10-50ng。注射针剂；每毫升含10-50ng，透皮吸收制剂；每一使用单体含1-50ng。

本发明的优点和积极效果：本发明通过“二步树脂法”，即通过选用特定的树脂联用；以非极性吸附树脂吸附除去全部的非河豚毒素杂质。以离子交换型树脂进行纯化和浓缩无杂质粗毒液。使得提取工艺简化，效率提高，所得的产品纯度高，可以实现大规模生产。而且该提取过程可以在半封闭条件下；既以封闭双层提取罐—封闭加热釜—封闭吊滤槽—封闭搅拌吸附罐—纯化树脂柱等。在各工序之间以管道联结，以液体泵进行液体输送，使每一工作步骤尽量避免了操作人员与毒液的直接接触。这样一方面有利于实现规模化生产，另一方面减少污染，有利于环境保护。

本发明的上述制剂与现有技术类似的含河豚毒素的药剂相比的改进之处在于特定的剂量范围的选择。如专利(CN 1227102A) 其使用剂量过低仅为0.001-0.45ug，此剂量根本无法达到治疗效果。同时过低的河豚毒素给药量，会使机体产生耐药性和免疫学反应。如使用低剂量的河豚毒素偶连物免疫动物，可制备单克隆抗体。(专利CN 1465403A)因此本发明所选用的剂量，是在药代动力学研究的基础上，提出的一个既安全、有具有很好的戒毒效果的使用剂量。在此剂量范围下，能保证较好的量效关系。同时该剂量的使用也减少了病人的用药次数，避免了给病人带来不必要的痛苦和负担。

本河豚毒素产品可作为用于临床戒断生物碱类成瘾性依赖药物综合症(戒毒)用药，还可作为镇痛用药替代吗啡、度冷丁等。以及解痉、镇静、局部麻醉、抗瘙痒、及心动过速和降血压等临床用药。

【具体实施方式】：

实例1：河豚毒素的提取

1、取河豚鱼内脏(鱼肝、鱼卵巢)100公斤，破碎后投入提取罐，加入2倍去离子水，低温条件下(2-8℃)搅拌提取30小时。

2、提取完毕后，自提取罐下出液口连接管道，将提取混合液泵入加热槽罐，将混合液10-15分钟加热至沸腾后，立即迅速降温至30℃以下。

3、从下口管道将蛋白凝固后得混合液吊滤槽进行(吊滤布为200目)吊滤，获得微黄色透明清液，为河豚毒素初毒液。

4、将上述清液通过连接管道泵入高位R1树脂(A-8)吸附罐，进行吸附除杂质，搅拌吸附5小时，滤出树脂，获得无色透明清液。

5、透明清液通过管道与R2交换离子树脂床(柱)连接，进行R2树脂(D₁₅₁)吸附。(树脂柱高1.5米，直径0.2米)待全部液体吸附完毕后，改用洗脱液洗脱。(洗脱液pH＝4.0)收集含河豚毒素浓馏部分洗脱液(约为总提取量的1/60)为粗品河豚毒素液。

6、将粗品河豚毒素液进行减压浓缩，低温减压浓缩温度为45℃。减压真空度为1.0Pa。将粗品河豚毒素液浓缩至原体积1/50。

7、收集浓缩液至离心管内，调节pH＝7.5-9.5后，在低温条件下静置5-10小时，获得结晶河豚毒素(约为总提取量的0.7克/十万)。

结晶河豚毒素二次纯化，以1.5倍1N醋酸溶液，完全溶解结晶河豚毒素。用碱性溶液调节pH＝8.5。低温静置10小时。离心收集结晶河豚毒素，干燥后获得纯品河豚毒素(约为总提取量的0.6克/十万)。

上述方法制备的河豚毒素产品，其质量、纯度以下表所列指标进行检测、确定产品纯度：

产品质量、纯度检测

检测名称	结论
检测名称	结论	外观	目测为白色结晶粉末，显微镜下呈白色短针状结晶粉末。
融点	产品无融点，220℃炭化。	外观	目测为白色结晶粉末，显微镜下呈白色短针状结晶粉末。
融点	产品无融点，220℃炭化。	元素分析	C：40.24±0.3 H：5.53±0.4 N：12.83±0.3
可见光谱	经可见光区530-700nm全波段扫描，无任何杂质峰出现。	元素分析	C：40.24±0.3 H：5.53±0.4 N：12.83±0.3
可见光谱	经可见光区530-700nm全波段扫描，无任何杂质峰出现。	紫外光谱	经紫外光区190-300nm全波段扫描，证实产品在195-210nm处有一特异吸收峰外，其它区域无任何杂质吸收峰。
红外光谱	经KCl压片法红外扫描测定，证实在3300、3230、1667、1611处有特异吸收峰。	紫外光谱	经紫外光区190-300nm全波段扫描，证实产品在195-210nm处有一特异吸收峰外，其它区域无任何杂质吸收峰。
红外光谱	经KCl压片法红外扫描测定，证实在3300、3230、1667、1611处有特异吸收峰。	核磁谱图	经核磁谱仪测定，证实产品在2.34，3.94，4.03，4.25，5.46处有特异吸收峰。
高压液相分析	采用20RBAX C₁₈柱，检测波长200-210nm，依据扫描的绘图结果，通过保留时间和峰值比较以峰面积归一法，计算认定产品纯度达到99％。	核磁谱图	经核磁谱仪测定，证实产品在2.34，3.94，4.03，4.25，5.46处有特异吸收峰。
高压液相分析		LD₅₀急性毒性试验	采用简化几率法测定，认定产品的LD₅₀为10.97ug/kg±0.72
活细胞膜片钳技术，检测	使用体外培养的活细胞，依据产品对细胞Na⁺通道发生阻塞作用的最低浓度和最短时间结果，确定产品纯度和生物活性。	LD₅₀急性毒性试验	采用简化几率法测定，认定产品的LD₅₀为10.97ug/kg±0.72

实施例2：河豚毒素片剂的制备

精确称取河豚毒素20mg，加入含有30mg的柠檬酸盐溶液50ml，充分溶解后。再添加常规制片赋形剂(如淀粉、氢氧化铝、葡萄糖)100g，充分混均后，干燥蒸发水分制片。每片自身片重100mg，含河豚毒素20ng。

实施例3：河豚毒素针剂的制备

精确称取河豚毒素30mg，加入柠檬酸盐100mg，加注射用水1000ml，搅拌下充分溶解，无菌条件下分装1.0ml/支。每支含河豚毒素20ng。

实施例4：透皮吸收制剂的制备

精确称取河豚毒素10mg，加入柠檬酸盐20mg，加注射用水100ml，加入氮酮1.0g，海藻酸钠3.0g，搅拌下充分溶解。用氯化钙为造形剂，制成贴片1000片。每片含河豚毒素10ng。

Claims

1、一种二步树脂法制备河豚毒素的方法，其特征是该方法包括下述步骤：

1)将河豚鱼内脏破碎，加去离子水低温搅拌下提取，得提取混合液，将其加热以凝固蛋白、吊滤去除固形物，获得微黄色初毒液；

2)初毒液经非极性吸附树脂树脂搅拌吸附，搅拌速度10-30转/分钟，吸附5小时；吸附完毕后，滤出树脂，获无杂质粗毒液；

3)将粗毒液上树脂柱，经离子交换型树脂树脂吸附，吸附完毕经水洗后，以4％醋酸溶液pH＝3.5为洗脱液，进行洗脱；收集高浓馏份，获得的液体，即河豚毒素粗品；

4)将所得的液体河豚毒素粗品进行低温减压浓缩，浓缩至小体积，得高浓度河豚毒素液；

5)调节所得高浓度河豚毒素液pH＝7.5-9.0，使达到等电点，置低温条件下静置获得河豚毒素结晶；

6)将所得河豚毒素结晶用无机或有机酸性试剂溶解，并再用碱性试剂调pH＝7.5-9.0，达到等电点，将产品再次结晶纯化，获得的结晶产品经干燥后，即为所需的河豚毒素产品。

2、根据权利要求1的方法，其特征在于所述的无机或有机酸类试剂是盐酸、醋酸或者苦味酸。

3、根据权利要求1的方法，其特征在于所述方法的1)步中的提取是在2-8℃进行的。

4、根据权利要求1的方法，其特征在于低温减压浓缩，温度小于50℃，减压真空度0.8-1.1Pa条件下进行。

5、根据权利要求1的方法，其特征在于提取是在双层提取罐夹层以冷却水进行循环冷却，温度保持在2-8℃中进行的。

6、一种含有权利要求1所制备的河豚毒素的口服片剂，其特征在于每片河豚毒素的含量为10-50ng。

7、一种含有权利要求1所制备的河豚毒素的注射针剂，其特征在于每支中的河豚毒素含量为10-50ng。

8、一种含有权利要求1所制备的河豚毒素的透皮吸收制剂，其特征在于每一使用单体的河豚毒素含量为10-50ng。