CN1668751A

CN1668751A - 用于疫苗和基因治疗的改进的腺病毒载体

Info

Publication number: CN1668751A
Application number: CNA028296230A
Authority: CN
Inventors: 斯特凡·科斯滕斯; 奥尔佳·约翰娜·阿伯丁娜·埃莉萨·奥霍斯特; 曼佐·扬斯·埃姆柯·哈文加
Original assignee: Crucell Holand BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 2002-09-20
Filing date: 2002-09-20
Publication date: 2005-09-14
Also published as: JP2006500029A; WO2004027073A1; AU2002326213A1; CA2499385A1; EP1539973A1; US20050201985A1

Abstract

本发明提供了用于影响经病毒感染的抗原呈递细胞例如树突状细胞对CTL的敏感性的新的方法和元件。本发明提供了可用于不同治疗方案例如免疫接种和/或基因治疗的新的基因运载工具。

Description

用于疫苗和基因治疗的改进的腺病毒载体

技术领域

本发明涉及医学领域，特别是涉及使用改良的腺病毒载体进行免疫接种的领域。本发明还涉及基因治疗领域以及在用携带转基因的病毒载体(如腺病毒)治疗的患者中改变免疫应答的方法和元件(means)。

背景技术

现有的疫苗的实例包括减毒活疫苗、完整的灭活疫苗、亚单位疫苗(无论是否基于重组蛋白)、肽疫苗、(裸)DNA疫苗、以及免疫原载体，例如改进的痘苗病毒(MVA)、重组腺病毒、痘病毒或α病毒。由于对于许多疾病来说并不知道究竟是免疫系统的哪一种成分(抗体和/或T细胞)在起到保护作用，因此理想的疫苗应该能够引发细胞和体液两种有效的应答。腺病毒在本领域很受重视，这是因为其能够以高滴度进行制备，已经证明，对于多种病原体来说，其始终是一种高度有效的疫苗运载工具(vaccine vehicle)(Bruna-Romero等，2001；Sullivan等，2000)，且在与例如MVA进行的直接比较研究中，腺病毒被证实在非人灵长类动物HIV模型中能够出色地诱导免疫和针对攻击试验的保护作用(Shiver等，2002)。此外，腺病毒似乎能够诱导针对由所包含的核酸所编码的插入性抗原或蛋白质的体液(抗体)和细胞(细胞毒T淋巴细胞)两种免疫应答(Bruna-Romero等，2001；Shi等，2001；Shiver等，2002；Sullivan等，2000)。因此，在重组腺病毒中插入编码来自各种不同病原体(病毒、细菌等等)的抗原性蛋白质或通过在重组腺病毒中使用肿瘤特异性蛋白(肿瘤免疫接种)，原则上应该能够使宿主免疫系统被抗原激发，从而产生针对所述病原体的感染的保护作用(预防性免疫接种)或清除患病的和/或感染的细胞(治疗性免疫接种)。

除了在疫苗中具有潜在应用，腺病毒还广泛用于基因治疗方案中。用于两种治疗用途的其他的病毒载体系统的例子是α病毒(例如塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)和委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitis virus))、人免疫缺陷病毒(HIV)、痘病毒和流感病毒。使用腺病毒所遇到的一个问题是，人群中的大部分均曾经数次遭遇腺病毒感染，因此会产生抗多种不同血清型的中和抗体(高)滴度。本领域面临的一个主要任务是克服这一问题并提供与常规使用的腺病毒(例如Ad2、Ad3、Ad5、Ad7和Ad12)相比明显较少被中和且仍然能够感染目的靶细胞的(重组)腺病毒。尽管已经提出了多种针对这些问题的解决方案(例如通过使用嵌合腺病毒或难于中和的血清型(WO 00/03029、WO 02/24730和WO 00/70071)，但现在已经清楚的是，由于细胞过程可能并不限于所使用的血清型或存在因早期感染而产生的中和抗体，在感染水平，重组病毒仍然只能分选出有限的效应。

一些研究指出，直接应用腺病毒可产生针对插入抗原的有效的免疫应答。就此而言，采用何种施用途径似乎并不重要。但重要的是，仅有少数研究探讨了各种不同的细胞类型在引发B细胞或T细胞介导的免疫应答中的作用(Shi等，2001；Xiang等，2002)。肌肉注射是本领域最常采用的免疫接种途径。骨骼肌中的细胞类型主要是肌纤维或肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞，以及很少的成肌细胞、树突状细胞和巨噬细胞。

在一个研究中，通过体外培养并转导内皮细胞、树突状细胞或骨骼肌细胞，并随后将固定数量的转导的细胞移植入同基因型小鼠，来研究各种不同的细胞类型在引发免疫应答中的作用(Mercier等，2002)。通过观察这些小鼠针对插入性抗原(在该研究中为β-Gal)的免疫应答，发现所有细胞类型均能够诱导针对β-Gal的抗体应答，但只有移植了树突状细胞的小鼠能够同时引发针对β-Gal的CD8⁺-T细胞应答。这些研究清楚说明，树突状细胞在诱导B细胞和T细胞介导的免疫中起了重要的作用。

致力于诱导免疫系统的两种机制的疫苗应该由能够将抗原输送至位于施用了疫苗的组织中的树突状细胞的生物制剂组成。对于腺病毒血清型5(Ad5，经常用于基因治疗和免疫接种)，已知需要高病毒负荷才能转导灵长类动物和啮齿动物的树突状细胞，以便使得插入性抗原在这些细胞中以某种程度的表达(Rea等，2001)。树突状细胞对Ad5所具有的这种低易感性被认为是由于Ad5受体(柯萨奇腺病毒受体(CoxsackieAdenovirus Receptor，CAR))表达的缺乏或过低引起的。本领域中现在已知一些这样的腺病毒载体，即这些腺病毒载体具有不同的向性，以便使得载体能够有效地转导树突状细胞，即那些由于外壳蛋白交换(coat-protein swaps)(例如纤维(fiber)、六邻体(hexon)、五邻体(penton)和/或纤维部分)而获得了新的向性的嵌合腺病毒载体，以及那些具有不同于Ad5向性的一种天然向性(例如Ad11、Ad35以及来自其他不同于亚群C的subgroup的其他血清型)的腺病毒血清型(Farina等，2001；Havenga等，2002；Mastrangeli等，1996；Rea等，2001)。

本领域普遍接受这一认识，即树突状细胞对于引起有效的抗外来抗原的免疫反应来说是至关重要的(Guermonprez等，2002；Lanzavecchia等，2001)。树突状细胞在体内可分为不同的阶段(成熟的和未成熟的)，可通过将细胞培养于组织培养皿中且在存在一组确定的生长因子(例如IL-4和GM-CSF)的情况下在体外模拟这些阶段。现有的免疫学方面的知识认为，未成熟的树突状细胞是“抗原清道夫(antigen scavengers)”且因此可有效地捕获并加工抗原。捕获抗原后即可诱导成熟过程。在这一过程中，可观察到表面的肽-MHC复合体的数量发生上调，共刺激分子(co-stimululatory molecule)的表达增加，且细胞向淋巴器官迁移。经过CD4+ T细胞充分激活后，原初

CD8⁺ T细胞被树突状细胞刺激，产生细胞毒T淋巴细胞(CTL)群，后者被激发以杀死体内所有含有该抗原的细胞(Lanzavecchia 1998)。这些已经获得了“杀伤状态”的CTL至少通过两种机制诱导其靶细胞发生凋亡：一种是通过摄取由CTL产生的名为粒酶B(GranzymeB)的蛋白而导致DNA片段化，而另一种涉及死亡受体的交联。两种机制均非常迅速，在树突状细胞介导的原初T细胞的活化过程中，两种机制均被明显诱导(Liu等，1989)。这后一种现象导致产生这样一个疑问，即在树突状细胞激活CTL后，树突状细胞自身是否也被杀死呢？如果确是如此，那么这将是一种极其不适当的情况，其有可能导致针对抗原的T细胞应答严重受限。重要的是，实际上在体外研究中的确发现，在发生病毒感染后数天，感染病毒的树突状细胞显示出对CTL的杀伤作用是敏感的(Knight等，1997)。

与这一现象不同的是，本领域普遍认为，病毒可运用多种不同的方法来躲避免疫系统并规避针对被感染的宿主细胞的免疫应答。已经鉴别出病毒基因组的许多区域，其编码的蛋白在此类过程中具有作用。例如，腺病毒含有一个早期表达区域，即E3，通过它一些蛋白可例如下调细胞的MHC分子的表达，以降低宿主免疫应答的作用。本领域普遍认为，病毒，例如腺病毒，已经经过了相当的进化过程，可在一定程度上逃避宿主免疫应答。

Borrow等(1995)进行了一个有趣的病毒诱导免疫抑制的研究，其中将Choriomeningitis病毒(LCMV)用于作为该病毒的天然宿主的小鼠中。该研究证实，给成年小鼠接种LCMV的“Armstrong”毒株后病毒颗粒被快速清除，由此小鼠仍然具有免疫活性。与此不同的是，给小鼠接种一种称为“克隆3”的变异LCMV毒株(其与亲代毒株具有2个氨基酸的差异)后导致持续的感染，且产生明显的免疫抑制。随后对这两种LCMV毒株的生物学研究发现，LCMV克隆3与Armstrong毒株不同，其能够非常有效地感染树突状细胞，结果导致树突状细胞被清除。导致病毒感染持续存在的原因是感染LCMV克隆3的树突状细胞被过多清除，而这与CD8⁺ T细胞介导的杀伤作用明显相关。显然，与Armstrong毒株相比，LCMV克隆3对树突状细胞具有不同的向性，这可以说明向性在病毒的致病性中具有关键的作用。显然，一些病毒能够通过杀死树突状细胞而建立持续的感染。根据在此所做的描述，与对树突状细胞具有向性的腺病毒血清型相似，LCMV克隆3很可能影响了CD8+细胞的有效杀伤树突状细胞的能力，且因此建立了一种与靶向非树突状细胞的病毒不同的免疫逃避机制。

附图说明

图1：以6种不同的抗人mAb染色的CD14⁺细胞(单核细胞)、未成熟DC(粗灰线)和成熟DC(细黑线)、和感染了腺病毒的未成熟的和成熟的DC。单核细胞仅表达CD14。通过CD14减少并表达CD86、HLAABC(I类MHC)和HLA DR(II类MHC)可证明单核细胞分化为未成熟的DC。通过诱导CD83表达以及CD86、HLA ABC和HLA DR表达的增强可证明DC的成熟。感染腺病毒并未产生表达水平的明显不同。

图2：CTL杀伤成熟的(空心符号)和未成熟的(实心符号)树突状细胞。(A)携带肽的成熟树突状细胞仅被中等程度杀伤，而未成熟树突状细胞对CTL介导的杀伤作用易感。(B)感染了腺病毒载体的成熟的和未成熟树突状细胞对杀伤作用均高度易感。

发明内容

本发明人发现，树突状细胞受到病毒感染可导致该树突状细胞对细胞毒T淋巴细胞(CTL)的敏感性增加。因此，如果用树突状细胞特异性重组腺病毒(例如Ad35或嵌合病毒例如Ad5.fib35)感染树突状细胞，那么即使该细胞最初对CTL杀伤作用相对具有抗性，但感染的树突状细胞很可能会因腺病毒感染所诱导的效应而被CTL快速清除。这显然为在(肿瘤)免疫接种方面探索有效的可靠的药物组合物提出了一个新的潜在的问题。也许人们会需要免疫原性转基因在树突状细胞中能够长期表达，由此产生更有效的疫苗。有趣的是，在另一方面，从基因治疗的目的出发，显然希望对用作药物组合物中的基因运载工具(gene deliveryvehicle)的病毒载体仅产生非常有限的免疫应答。实际上是希望延长转基因在目的靶组织中而非树突状细胞中的表达时间。为此，应该产生树突状细胞-CTL级联的短暂应答，以确保仅对所使用的病毒载体产生低的免疫应答。因此，尽管疫苗要求产生高CTL应答并需要长期存在感染的树突状细胞的抗原呈递，但有益的是，基因治疗药物应该对呈递病毒抗原的树突状细胞具有短暂的CTL应答，以降低针对运载工具的蛋白的免疫应答，并因此延长由感染了目的组织的该运载工具所提供的转基因的存在和活性。另一种用途是使用携带治疗基因的病毒载体导向不需要的细胞。这可在携带治疗性核酸序列的载体中引入一种异源性核酸序列，当其表达后，可在所述细胞中下调PI-9，以便使得细胞对CTL相关性杀伤作用敏感。

为了克服至少一部分在此所面临的问题，本发明提供了新的基因运载工具，例如病毒载体，其能够将异源性核酸输送至可接受该基因运载工具的细胞中，其中所述基因运载工具包含一种(异源性)核酸，所述核酸当在细胞中表达后可引起细胞中的蛋白酶抑制剂-9(PI-9)的水平升高或保持在基本上稳定的水平。本发明还提供了新的基因运载工具，例如病毒载体，其能够将异源性核酸输送至可接受该基因运载工具的细胞中，其中所述基因运载工具包含一种核酸，所述核酸当在细胞中表达后可引起细胞中的PI-9的功能升高或保持在基本上稳定的水平。

在另一个实施方案中，本发明提供了新的基因运载工具，例如病毒载体，其能够将异源性核酸输送至可接受该基因运载工具的细胞中，其中所述基因运载工具包含一种(异源性)核酸，所述核酸当在细胞中表达后可引起细胞中的PI-9的水平和/或功能降低。本发明的基因运载工具可用于多种治疗方案中，例如基因治疗和/或免疫接种。

此外，本发明提供了调节细胞对CTL的敏感性的方法，其包含以下步骤：用本发明的基因输送载体感染所述细胞。

具体实施方案

本发明的目的之一在于为至少一部分以上提及的问题提供一种解决方案，并在免疫接种过程中预防感染了病毒载体的树突状细胞对CTL的敏感性升高，并降低针对在基因治疗用途中用作基因运载工具的病毒载体的免疫应答。为此，本发明提供了一种病毒载体，其能够将外来DNA输送至能够接受该外来DNA的细胞中，所述病毒载体包含一种核酸序列，所述核酸序列当在细胞中表达后，可引起PI-9的水平升高或使之保持在稳定的水平。在另一个实施方案中，本发明提供了一种病毒载体，其能够将外来DNA输送至能够接受该外来DNA的细胞中，所述病毒载体包含一种核酸序列，当所述核酸序列在该细胞中表达时，可引起PI-9的水平降低。

本发明提供了一种基因运载工具，例如一种病毒载体，其能够将异源性核酸输送至能够接受该病毒载体的细胞中，其中所述病毒载体包含一种异源性核酸序列，当所述异源性核酸序列在该细胞中表达时，可引起该细胞中的蛋白酶抑制剂-9(PI-9)的水平和/或活性升高或保持在基本上稳定的水平。在一个优选的实施方案中，本发明的病毒载体选自：腺病毒、α病毒、痘病毒、痘苗病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)和流感病毒。在一个更加优选的实施方案中，所述病毒载体是一种(重组)腺病毒，或其功能性衍生物。更为优选的的是一种来自亚群B的腺病毒血清型其中所述来自亚群B的腺病毒血清型选自：Ad11、Ad26、Ad35和Ad50。特别优选的是重组腺病毒载体，其遇到的因曾经感染该特定血清型的野生型或重组腺病毒而产生的中和抗体的水平较低。此类腺病毒的实例见于WO 00/70071，其中Ad35的功能性等价物为类似于Ad35的腺病毒血清型，不足大约10％的首次施用该腺病毒血清型的宿主中对其已经存在免疫力，或者其能够在超过大约90％的施用该腺病毒血清型的宿主中避免或减弱免疫应答。

在本发明的一个具体方面，本发明的重组腺病毒包含一种嵌合壳体，其包含来自至少两种不同腺病毒血清型的蛋白和/或蛋白片段。本领域已知，为了将重组病毒载体例如腺病毒靶向特定的靶细胞，可以使用来自不同腺病毒血清型的片段，其中主链血清型携带例如一种异源性核酸(如一种治疗性基因)，而壳体由来自两种或更多腺病毒血清型的片段组成。此类“嵌合”载体的实例为来自腺病毒血清型5(Ad5)的腺病毒，携带来自例如Ad11、Ad16或Ad35的纤维的全长或片段。此类载体也称为Ad5.fib11、Ad5.fib16或Ad5.fib35，可用于将例如腺病毒载体导向抗原呈递细胞(APC)，例如树突状细胞。本领域已知可产生众多交换(swaps)，并将其用于靶向大量不同的靶组织和细胞，包括肿瘤细胞、APC、平滑肌细胞、肺细胞、某些血细胞和上皮细胞。因此，在一种实施方案中，本发明提供了一种本发明的病毒载体，其中所述细胞是APC。在一个优选的实施方案中，所述细胞是树突状细胞或B细胞，其中所述树突状细胞是未成熟的或成熟的。可作为靶的树突状细胞的其他实例为动脉周围并指状树突状细胞(peri-arterial inter-digitating DC)。

本发明还提供了本发明的病毒载体，其中所述异源性核酸包含编码PI-9的核酸或其功能性等价物。功能性等价物可以是衍生物、片段、部分、突变体等等，它们在正常表达PI-9或所述等价物的细胞中均仍然具有控制和/或调节该细胞对CTL的敏感性的功能。应该理解的是，如果存在以类似方式调节CTL敏感性的同源性PI-9，那么这些功能物(和/或序列同源物)可用于类似的基因运载工具中，以达到在此所讨论的目的。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种病毒载体，其能够将异源性核酸输送至能够接受该病毒载体的细胞中，其中所述病毒载体包含一种异源性核酸序列，当所述异源性核酸序列在该细胞中表达时，可引起该细胞中PI-9的水平和/或功能降低。优选地，该病毒载体包含一种编码反义PI-9 RNA的核酸或其功能性等价物。任何降低靶细胞的PI-9水平和/或功能的核酸均为一种功能性等价物。应该理解的是，如果基因存在抑制PI-9的功能和/或降低PI-9蛋白水平的编码因子，那么此类基因也可用于本发明的病毒载体中，以达到在此讨论的目的。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含：一种本发明的病毒载体；和一种药物可接受的载体。此外，本发明提供了一种接触和/或感染了本发明的基因运载工具的树突状细胞。

在本发明的另一个方面中，提供了一种调节细胞对CTL的敏感性的方法，所述方法包含以下步骤：用包含一种异源性核酸序列的病毒载体感染该细胞，当所述异源性核酸序列在该细胞中表达时，可引起该细胞中PI-9的水平和/或活性升高或保持在基本上稳定的水平，同时，在另一方面提供了一种调节细胞对CTL的敏感性的方法，所述方法包含以下步骤：用包含一种异源性核酸序列的病毒载体感染该细胞，当所述异源性核酸序列在该细胞中表达时，可引起该细胞中PI-9的水平和/或活性降低。

可以预见一些升高或降低对CTL的杀伤作用敏感的细胞内的PI-9和/或其等价物的水平和/或功能的方法。一种优选的方法是采用基因输送载体。基因输送载体的实例是包含待输送的核酸的病毒载体和微颗粒。病毒载体的实例是DNA病毒以及RNA病毒。因此，输送至目的细胞的本发明的核酸可以是RNA以及DNA。

“异源性”在此指的是所有对于掺入其中的基因输送载体来说是外来的核酸。例如，如果一种“异源性”核酸被克隆入一种腺病毒基因组，这意味着该异源性核酸不存在于该特定的腺病毒的野生型中。异源性核酸的实例是治疗性基因，例如那些编码肿瘤抗原、来自病原体例如细菌和病毒的免疫原性抗原、诱导凋亡蛋白、激素和细胞因子。异源性核酸还可以来自与掺入其中的血清型不同的一种血清型。

人蛋白酶抑制剂-9(PI-9)及其许多序列同源物、分布同源物、和功能同源物是本领域已知的，例如小鼠丝氨酸蛋白酶抑制剂-6(SPI-6)(Sprecher等，1995；Sun等，1997)。SPI-6是丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白家族(serpin protein family)的成员。该蛋白最有可能特异性灭活粒酶B(见下文)，由此预防CTL诱导的凋亡。最近的研究显示，来自小鼠和人的未成熟树突状细胞对CTL的杀伤作用具有易感性，但当其成熟后，CTL变不能再破坏树突状细胞(Medema等，2001)。一种假设认为，存在一种能够保护树突状细胞免于CTL介导的杀伤作用的细胞机制。这种对CTL敏感性的降低已经在实验上被证明是由小鼠树突状细胞内的SPI-6表达升高所致。尽管认为保护原初成熟树突状细胞免于CTL的细胞杀伤作用的原因是SPI-6/PI-9的上调，但一个有趣的问题涉及伴随SPI-6/PI-9上调和下调的生物学途径。如上所述，可以是来自病毒的蛋白质直接影响细胞表达SPI-6/PI-9，或者可以是来自树突状细胞的应激应答导致蛋白酶抑制剂的上调和下调。

CTL对树突状细胞的杀伤作用至少由两种机制引起：第一种机制包括释放成孔分子、穿孔素和细胞毒蛋白质粒酶B(Heusel等，1994；Kagi等，1994)。自CTL分泌后，粒酶B结合6-磷酸甘露糖受体并经由受体介导的胞吞作用被靶细胞摄取(Motyka等，2000)。通过穿孔素，粒酶B自内体释放至靶细胞的细胞质(Shi等，1997)。一旦粒酶B出现在胞浆中，其可通过裂解细胞底物例如caspase-3、caspase-7、caspase-8和Bid(caspase活化的DNAase的抑制剂)而诱导凋亡，导致DNA片段化(Trapani等，2000)。CTL杀死其靶细胞所采用的第二种机制是通过死亡受体的交联。这一过程涉及Fas-Fas配体相互作用，该相互作用诱导caspase途径，导致杀死靶细胞(Berke 1995)。

如上所述，已经开发了一些基因运载工具，例如重组腺病毒，以用于基因治疗以及免疫接种。在免疫接种方面，希望能够激发针对插入性抗原的免疫应答，以获得针对该抗原的有效的T细胞反应。对于这种策略，针对载体的T细胞应答受损可同样引起针对该抗原的受损的或非最佳的T细胞应答。除了这种直接的体内免疫接种措施，可使用腺病毒载体将抗原离体(ex vivo)加载到来自患者的树突状细胞上，所述患者的免疫应答不足以控制肿瘤细胞或感染(Dhodapkar等，1999；Steinman等，2001；Zhong等，2000)。将目的抗原加载至树突状细胞之后，细胞被重新输注到患者体内，用于激发肿瘤或病毒特异性免疫。一个最近才认识到的问题是，所输注的加载了抗原的树突状细胞成了CTL攻击的靶(Hermans等，2000)，且再次输注的效果降低，原因可能在于CTL介导的对输注的树突状细胞的杀伤作用，这使得无法重新激活并激发记忆T细胞应答(Ludewig等，2001；Ribas等，2000；Ronchese等，2001)。显然，树突状细胞对CTL的激活可持续数天之久，这与激活时间仅持续数小时相比，可产生针对该抗原的更多的T细胞和更广泛的T细胞库。对于由重复(第二次或更多次)施用而引起的CTL活化来说很可能也是这种情况。因此，在此所提及的实验结果同样可用来获得那些能够更有效地引发针对插入性抗原的T细胞应答的、基于腺病毒的疫苗运载工具。例如，可产生在其基因组中携带编码SPI-6或其人同源物PI-9的基因的重组腺病毒载体，该核酸被置于一种强真核细胞启动子的控制下。在腺病毒感染未成熟树突状细胞后数小时内，可获得高水平的PI-9(或SPI-6)蛋白。这种升高的表达随后可用于两种目的：(i)其通降低(例如)粒酶B的活性而保护成熟树突状细胞免于被CTL杀伤，以及(ii)其使得含有该病毒的未成熟树突状细胞得以存活，否则，由于未成熟树突状细胞未受到保护，其将被有效杀伤。两种机制均保证了可有更多的树突状细胞来激发原初T细胞，并保证成熟树突状细胞具有更长的存活时间，这两种机制最终使得T细胞数量增加。确保PI-9水平在病毒感染后不会降低的另一种途径是确定病毒所采用的降低该水平的机制。这些机制可以是直接的或间接的，但关闭该机制的一种合理的途径是应用一种缺乏参与PI-9转录/翻译调控的功能性区域或结构域的重组病毒。因此，本发明公开了至少两种途径来确保PI-9蛋白的水平达到足够高，并由此保护感染的树突状细胞免于通过CTL杀伤作用而被清除：其一是将一种置于强启动子控制下的编码PI-9的核酸或其同源物(例如SPI-6)引入病毒主链，而第二种是使得病毒主链中参与下调感染细胞内的PI-9表达的区域缺失或削弱其功能。这两种不同机制的组合也属于本发明的一部分。

在基因治疗领域，正在研究多种不同的载体系统以用于治疗各种不同的致命性人类疾病，包括遗传学贮积病(genetic storage disorders)(高雪氏病(Gaucher)、II型糖原贮积病(Pompe)、粘多糖病I型(Hurler)、Scheie、Hunter、粘多糖病III型(Sanfilippo’s)、Moquio’s、神经酰胺代谢溶酶体贮积病(Farber)、Niemann-Pick、半乳糖脑苷类脂沉积病(Krabbe)、异染性白质营养不良(metachromatic leucodystrophy)、海洋性贫血(thallassemias)等)、心血管疾病及相关应用(狭窄、再狭窄、血管移植)、以及关节炎，仅举数例。为了有效治疗此类种种疾病，希望能够长期表达转基因。而这将需要一种不同于免疫接种措施的机制，也就是说，对于免疫接种来说需要的是针对抗原的更强的和长期的免疫应答。对于基因治疗则不希望对所使用的基因运载工具产生强烈反应；为此，希望产生一种微弱的应答且以基因运载工具感染的树突状细胞能够快速消失。如果使用一种感染树突状细胞(因其天然具有的向性)和目的靶细胞的基因运载工具，则希望通过树突状细胞-CTL途径的应答能够尽可能弱些。可例如通过使用PI-9来获得这种微弱CTL应答的效果。一种措施是在重组腺病毒中插入一种可在树突状细胞中有效对抗例如SPI-6或人同源物PI-9表达的基因、核酶、反义核酸和/或其他核酸。该策略大体上可在腺病毒感染未成熟树突状细胞数小时后降解SPI-6或PI-9和/或降低其表达，导致成熟树突状细胞内的SPI-6或PI-9基因产物的水平较低。不然，这会导致直接的由CTL介导的杀伤作用，最终可严重妨碍针对治疗性载体的T细胞应答，例如对用来输送转基因的重组腺病毒载体的T细胞应答。可将一种PI-9抑制物，例如反义核酸，置于树突状细胞特异性启动子的控制下，例如CD83启动子。或者，使PI-9或其同源物过表达，例如通过共表达与插入基因运载工具中的治疗性转基因邻近的PI-9基因，可保护被感染的细胞免于CTL介导的杀伤作用，并延长治疗性(免疫原性)基因的表达，这可能会对免疫接种非常有益。

对于另一个本领域熟知的方面，即“肿瘤免疫接种”，则希望针对由病毒主链中的核酸编码的抗原产生强烈的反应。因此，受损的CTL应答将是有益的，且因此应该优选过表达PI-9蛋白或其功能性同源物，而非快速的CTL应答。因此本发明的措施与其说是基因治疗用途，还不如说是为了免疫接种的目的。如在此所述的，已经研究过如果细胞感染了腺病毒载体是否会损害抗CTL杀伤作用的保护作用。发现感染了腺病毒的成熟树突状细胞不能免于被CTL杀伤，且与未感染的加载了肽的树突状细胞相比，感染的加载了肽的成熟的和未成熟的树突状细胞均对CTL介导的杀伤作用高度敏感。这些实验显示，一旦腺病毒进入成熟树突状细胞即可改变细胞的正常的生物学行为，使其变得对快速CTL介导的杀伤作用敏感。抗原呈递细胞被清除可削弱针对腺病毒的T细胞应答，因此其是腺病毒用来逃避宿主免疫系统的一种新方法。或者，免疫系统可用这种机制来预防病毒在树突状细胞内进行不受控制的复制，否则这种复制将逃脱由CTL介导的清除作用。

如上所述，在此揭示了一种新的免疫学现象，该现象导致被病毒感染的成熟树突状细胞对CTL介导的杀伤作用变得敏感。此外，根据具体的用途，在此揭示了适合用于下调宿主T细胞免疫应答的新的腺病毒载体以及更适合用于增强宿主T细胞应答的新的腺病毒载体。

可通过若干途径在使用小鼠的实验中造成SPI-6过表达以及造成人PI-9过表达。一种途径是将该特定的核酸置于强启动子控制下并克隆入腺病毒主链的E3区域，而将目的转基因克隆入E1区域。可采用的强启动子的实例为SV40启动子、PGK-启动子和RSV启动子。转基因的实例是多种多样的，可包括细胞因子、治疗性基因、肿瘤抗原、抗体或其部分，或任何编码一种以肿瘤免疫接种、抗病原体免疫接种和/或基因治疗为目的的蛋白或治疗性物质的核酸。

如上所述，可自患者分离树突状细胞，经过离体导向、培养并重新导入分离出该树突状细胞的个体，以引发抗原特异性免疫应答(Dhodapkar等，1999；Steinman和Dhodapkar 2001；Zhong等，2000)。延长加载的树突状细胞的寿命有可能增强免疫接种的效力。根据本领域技术人员熟知的方案自骨髓中分离鼠树突状细胞前体细胞并培养。通过对标记物(例如CD11c和/或CD86，仅举数例)进行染色并进行FACS分析来确定树突状细胞的分化。使用载体引入用于抗原呈递目的的转基因和用于树突状细胞存活目的的SPI-6基因(或PI-9)。要实现这一目的，可采用同时以两种载体进行感染，一种携带抗原(转基因)，而另一种在E1区域(或E3区域)携带SPI-6(PI-9)，或反之亦然，或者采用以一种载体进行单次感染，该载体在E1结构域携带抗原(转基因)而在例如E3区域携带PI-9(SPI-6)，或反之亦然，但也可使用其他区域来携带各种转基因如抗原或PI-9基因。总之，使用小鼠的实验需要的是编码SPI-6的重组载体，但应该理解的是，本发明也涵盖用于治疗人类疾病的重组载体，其需要的是编码PI-9的核酸。如上所述，需要下调PI-9或SPI-6的方案当然应该包括特异性靶向物种特异性基因表达的方案。

在另一方面，本发明提供了一种用于在能够引发由树突状细胞介导的针对一种抗原的CD8+ T细胞应答的系统中调节针对该抗原的免疫应答的方法，所述方法包含给所述系统提供所述抗原和一种用于调节由抗原特异性CD8+ T细胞介导的对所述树突状细胞的杀伤作用的元件。

能够引发树突状细胞介导的针对一种抗原的CD8+ T细胞应答的系统可以是一种体外系统。可将树突状细胞和原初T细胞在存在所述抗原的情况下在体外进行共培养，由此可产生对所述抗原具有特异性的CD8⁺ T细胞。可对这种体外培养进行各种方式的补充以提高产生所述CD8⁺ T细胞的效力。此类补充可包含(部分)淋巴结、胸腺、或其他支持。在一个优选的实施方案中，所述系统包含一个个体。在这种实施方案中，本发明可用来调节该个体的免疫应答，特别是在该个体中产生抗原特异性CD8+ T细胞。

可通过不同的途径将所述抗原提供给所述系统。在一个优选的实施方案中，通过病毒载体提供所述抗原。病毒载体特别适合用于将抗原和/或核酸输送至靶细胞。如上所述，本发明的方法可采用多种类型的病毒载体。在一个特别优选的实施方案中，所述病毒载体包含一种腺病毒载体。

在一种实施方案中，通过提供一种用于降低由抗原特异性CD8+ T细胞介导的对所述树突状细胞的杀伤作用的元件而增强免疫应答。通过降低由抗原特异性CD8⁺T细胞介导的对所述树突状细胞的杀伤作用，可提高所述树突状细胞的存活机会，且由此提高所述树突状细胞参与进一步活化免疫系统的倾向。其结果是扩大了所述系统中的特异于所述抗原的CD8⁺T细胞库。本发明的这一方面特别适用于免疫接种的用途，在这种用途中需要有效的抗原特异性免疫应答。

在另一个实施方案中，通过提供一种用于增强由抗原特异性CD8+T细胞介导的对所述树突状细胞的杀伤作用的元件而降低所述免疫应答。通过增强由抗原特异性CD8+ T细胞介导的对所述树突状细胞的杀伤作用，可降低所述树突状细胞的存活机会，且由此降低所述树突状细胞参与进一步活化免疫系统的倾向。其结果是减小了所述系统中的CD8⁺T细胞库。本发明的这一方面特别适用于所谓的功能获得性用途(gain of function applications)。这些功能获得性用途是通常(但并非绝对)以病毒载体产生，例如典型的基因治疗用途。通常通过提供一种具有目的基因的细胞而实现功能获得，其中所述基因给该细胞提供了额外的功能。目的基因的产物以及与病毒载体相关的产物可作为本发明的系统的抗原，由此刺激特异于所述抗原的免疫应答。在功能获得性用途中，本发明可优选地用于至少部分预防不希望出现的针对目的基因产物或病毒载体相关性产物的免疫应答。

可通过若干途径实现CD8⁺T细胞介导的对树突状细胞的杀伤作用。在前言部分已经给出了一些非限制性的实例且包括至少两种在树突状细胞中诱导DNA片段化的机制。至少一种机制包含摄取一种由CTL产生的被称为粒酶B的蛋白质，而至少一种其他机制包含一或多种类型的死亡受体的交联。在本发明中，由CD8⁺T细胞介导的对树突状细胞的杀伤作用的至少一种途径的活性受本发明的一种元件的调节。在一个优选的实施方案中，调节了粒酶B介导的DNA片段化途径的活性。该途径特别易于进行操控。在一种实施方案中，调节了在树突状细胞中起破坏作用的可利用的粒酶B蛋白。在一个优选的实施方案中，用于调节由抗原特异性CD8+ T细胞介导的对所述树突状细胞的杀伤作用的所述元件包含PI-9蛋白或其功能性等价物。上面已经详细描述了这种优选实施方案的优点。在另一个优选实施方案中，通过给所述树突状细胞提供一种包含至少部分PI-9基因的核酸或其衍生物和/或类似物，而将所述元件提供给所述树突状细胞。所述核酸可包含PI-9基因的转录区域的任何部分。所述部分典型地包含该区域的至少20个碱基，优选地为连续的碱基。不过，根据具体的设计要求可以有中断，以便例如提供或干扰mRNA的剪切。在这种实施方案中，通过提供PI-9反义核酸，典型地为至少20个核苷酸，或通过提供在所述细胞中的条件下能够与PI-9(m)RNA杂交的所述反义的同源物，得以例如下调细胞内的PI-9的表达。

在一个优选的实施方案中，所述元件包含一种编码PI-9蛋白或其具有蛋白酶活性的部分、衍生物和/或类似物的核酸。在这种实施方案中，粒酶B途径的活性至少部分地被降低。

在一个优选的实施方案中，通过病毒载体提供用于调节由抗原特异性CD8+ T细胞介导的对所述树突状细胞的杀伤作用的所述元件。在一个特别优选的实施方案中，所述抗原和用于调节由抗原特异性CD8+ T细胞介导的对所述树突状细胞的杀伤作用的所述元件均由同一种病毒载体提供。这样可将所述抗原和所述元件同时提供给树突状细胞，由此提高总体功效，并简化本发明的方法的工作。在这种实施方案中，所述病毒载体优选地包含允许对树突状细胞进行有效转导的向性。

在另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗原和用于调节由抗原特异性CD8+ T细胞介导的对树突状细胞的杀伤作用的元件。本发明进一步提供了一种试剂盒(a kit of parts)，其包含抗原和用于调节由抗原特异性CD8+ T细胞介导的对树突状细胞的杀伤作用的元件。

在一种实施方案中，所述组合物或试剂盒包含一种病毒载体，其中所述载体优选地包含所述抗原和/或编码所述抗原的核酸。

本发明进一步提供了一种病毒载体，其包含一种用于特异性调节由抗原特异性CD8+ T细胞介导的对树突状细胞的杀伤作用的元件。在一种实施方案中，本发明提供了本发明的病毒载体在制备用于在个体中调节抗原特异性CD8⁺T细胞应答的药物中的用途。优选地，在所述用途中，所述调节对由所述病毒载体提供的抗原具有特异性。

实施例

实施例1.保护成熟树突状细胞免于CTL介导的裂解作用

首先，进行实验以期重复其他人的研究结果：未成熟树突状细胞对CTL介导的杀伤作用敏感而成熟树突状细胞可得到保护。为此，自一个健康成人个体分离血液并随后用于通过ficoll步骤分离周围血单个核细胞。本领域技术人员已知的Variomacs技术和CD14特异性抗体(Miltenyi Biotec GmbH)自细胞群体中分离单核细胞。将这些单核细胞在存在100ng/ml IL-4(Bioscource International，Inc.)和800IU/ml GM-CSF(Leucomax；Novartis)的情况下培养6天以获得未成熟树突状细胞。通过FACScalibur以抗体(来自BD Pharmingen)测定细胞表面的表达来监测单核细胞向未成熟树突状细胞的正确分化。如普通免疫学领域的技术人员所知，与未分化的CD14+单核细胞相比，未成熟树突状细胞的标记物CD1a、CD86、HLA ABC和HLA DR发生上调；可通过CD83的表达来辨别成熟树突状细胞。图1显示了采用这种分离/分化策略所得到的结果，此外还给出了确定继续处理所依据的质量标准。显然，通过采用这种技术自人的血液中得到了基本上纯的未成熟树突状细胞群。

为使得树突状细胞在体外人工化成熟，可将多种不同的刺激物添加到未成熟树突状细胞的培养基中，以获得这些完全成熟的树突状细胞。这些刺激物可单独应用，包括200ng/ml脂多糖(LPS)，50μg/ml Poly：IC(均来自Sigma)，30％(终体积)单核细胞条件化培养基(MCM)，CD40L，或100ng/ml TNF-α(PreproTech，Inc.)。使用FACScalibur和特异性抗体(CD1a，CD14，CD83，CD86，HLA-A，-B，-C和/或-DR)来监测成熟过程。结果显示于图1。

培养6天后，将成熟和未成熟树突状细胞在10mM铕，25mMDTPA和硫酸葡聚糖(Sigma)的混合物中在冰上标记30分钟。以100mM CaCl₂(Sigma)在冰上孵育5分钟以回收细胞。该孵育步骤后，将细胞洗涤并置于室温(RT)30-60分钟，然后再洗涤一次以去除绝大部分自发性铕泄漏。

下一步给细胞加载被CTL克隆所识别的抗原。为此，将熟知的gp100黑色素瘤抗原与gp100特异性CTL克隆8J联合使用，后者在小鼠K^b单元型以及人HLA-A2单元型的情况下均可识别gp100蛋白(Dr R.Offringa，Dept.Immunohematology，LUMC，The Netherlands惠赠)。将成熟或未成熟树突状细胞以2000细胞/孔的浓度接种在96孔培养板中，使用的是RPMI培养基。随后将8J CTL作为效应细胞添加到成熟或未成熟树突状细胞中，各种效应细胞∶靶细胞比为25∶1，12.5∶1和6.25∶1。

最后，将10μg/ml的合成的肽(gp100肽，氨基酸154-162)添加到细胞中，并将细胞在37℃孵育4小时。收集20μl上清液并转移至平底微滴定板中(Maxisorp F-96，Nunc)，每孔含有200μl的Enhancement溶液(Wallac/Perkin Elmer Life Science)。铕释放可代表CTL介导的对成熟或未成熟DC的裂解作用，使用时间分辩荧光剂(Wallac/Perkin ElmerLife Science)对铕释放进行测定。这些实验的结果显示于图2A，其说明，正如文献(Medema等，2001)所述，未成熟树突状细胞对CTL介导的裂解作用敏感，而成熟树突状细胞受到保护而免于被裂解。因此，这些结果验证了所采用的目的在于研究基于致敏抗原呈递细胞的病毒免疫逃脱机制的检测方法的有效性。

实施例2.腺病毒介导致敏成熟树突状细胞

如上所述，已经大致描述了自人外周血单个核细胞获得成熟和未成熟树突状细胞、给细胞加载铕、以及加载gp100肽的过程。将树突状细胞与复制缺陷型腺病毒载体一起孵育48小时(每个细胞1000该病毒颗粒(vp/cell))。对照组不与腺病毒载体孵育。所用的腺病毒载体基于腺病毒血清型5(Ad5)，但缺失整个腺病毒E1区域。此外，所用的载体经遗传工程化而携带了来自腺病毒血清型35的纤维分子，为其提供更佳的对的树突状细胞向性。WO 00/03029和WO 02/24730详细描述了如何产生携带来自各种(其他)血清型的纤维的Ad5病毒。该载体在E1区域含有一个真核细胞表达盒，该表达盒由位于一个3’端具有来自乙型肝炎病毒的聚腺苷酸化信号的多接头上游的CMV启动子组成。如文献(WO00/03029；WO 00/31285)所述，将编码萤火虫萤光素酶蛋白的cDNA克隆入该多接头。

图2B显示了在感染的、加载了铕且加载了gp100肽的细胞中进行铕检测的结果。暴露于腺病毒的成熟和未成熟树突状细胞均对CTL介导的杀伤作用非常敏感。这些结果说明，缺失E1的腺病毒(也称为第一代基因转移载体)可致敏树突状细胞，导致CTL介导的杀伤作用。

为了进一步探讨其中涉及了哪些腺病毒蛋白，使用如下腺病毒载体重复进行了上述实验，所述腺病毒载体为E1，E2A，E3，E4阳性或阴性，或者为例如E4表达是减弱的。还测试了携带各种缺失/突变的组合的病毒，例如E1和E2A缺失的病毒。可采用本领域技术人员已知的技术产生此类病毒，并自病毒主链中引入此类区域的缺失以及将缺失的区域的反式互补(trans-complementation)引入腺病毒包装细胞系中(WO01/05945、WO 01/07571、WO 01/20014)。通过这些实验可鉴别早期腺病毒蛋白是否参与了对成熟树突状细胞的致敏。

实施例3.调节重组腺病毒对成熟树突状细胞的致敏作用

据文献记载，上调小鼠的SPI-6或人的PI-9或者保持其水平稳定至少部分地参与了成熟树突状细胞对抗CTL介导的杀伤作用的生物学途径。为了研究腺病毒是否通过PI-9途径致敏树突状细胞，进行了两种不同的实验策略：(i)以Western印迹分析和/或反转录PCR来确定暴露于或未暴露于腺病毒载体的人树突状细胞中PI-9蛋白和/或RNA的表达水平。(ii)产生携带PI-9 cDNA的腺病毒载体，随后感染成熟的和未成熟树突状细胞，继而确定PI-9过表达对CTL介导的杀伤作用的影响。

为了确定PI-9的表达水平，如上所述获取来自人单核细胞的成熟和未成熟树突状细胞。将细胞以每孔2.5×10⁶个细胞的浓度接种于3个6孔板中。然后加入1000vp/细胞的Ad5.萤光素酶(阴性对照)或Ad5.PI-9病毒或者不加入病毒，进行感染24小时(同时使用了成熟和未成熟的人树突状细胞，每个参数一式三份)。24小时后，收集每个孔的细胞用于铕细胞裂解分析(1个孔)，产生蛋白裂解物(1个孔)，以及自细胞群(1个孔)中分离RNA用于逆转录酶PCR。如上所述进行铕细胞裂解分析。根据制造商的说明，将10μg总蛋白加载到蛋白分离胶(Invitrogen，NP0321，Nupage4-12％Bis-Tris胶，或Biorad，标准胶)上，进行Western印迹分析以确定PI-9蛋白表达水平。将蛋白转移至Immunobilon-P PVDF膜(孔径：0.45μm)。将膜在封闭缓冲液(5％奶粉和0.1％Tween-20，溶于PBS)中封闭1小时。使用抗血清MoAb17和/或PI9-K来观察PI-9蛋白：小鼠单克隆抗体MoAb17(亚型IgG1)特异于人PI-9蛋白并可与小鼠SPI-6蛋白发生有效的交叉反应(Bladergroen等，2001)。为了测定PI-9蛋白，将MoAb17稀释于PBS(3.6μg/ml)，加至Western印迹膜上，并在室温孵育3小时。然后以10ml的PBS将膜洗涤2次以去除抗体溶液。为了观察MoAb17与膜的结合，使用了辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG1的二抗以及ECL检测系统，根据制造商的说明(Amersham)和本领域人员已知的常规方法进行。

为了以反转录PCR确定PI-9的表达水平，根据制造商的说明，用TRIzol(Life Technologies)自每群10⁶个细胞中分离总RNA。将得到的RNA溶解于无RNAse的水中，并根据制造商的说明与DNAse(Lifetechnologies)一起孵育。然后，在存在1μg oligo dT引物和100ng随机六聚体引物的情况下，将RNA溶液在70℃孵育10分钟，总体积为15μl。将RNA置于冰上，并加入dNTP、DTT、5μl第一链缓冲液和1单位RNAseH-superscript II逆转录酶(所有试剂均来自Invitrogen)，然后在42℃孵育50分钟。在70℃孵育10分钟以终止反应。

对于PI-9特异性PCR，在PCR反应中使用1μl的cDNA溶液。加入定位于一个外显子中的正向引物(PI-9F：5’-GGC ATT TGG GAA TTG TTGATG-3’)和反向引物(PI-9R：5’-TGG CGA TGA GAA CCT GCC AC-3’)，浓度为每种引物每个反应10pmol。此外，在每个反应中加入：2mmoldNTP、1x MgCl₂、2.5U Taq聚合酶、1x Taq缓冲液(均来自Invitrogen)，并加入H₂O以使体积达到50μl。PCR一般采用以下基本程序进行：94℃，5分钟；继以35个循环，每个循环为94℃，1分钟，60℃，30秒，72℃，1分钟。20个循环后，每3个循环自反应管中取出5μl的PCR产物样品，并进行琼脂糖凝胶电泳分析，以对PI9 PCR产物进行半定量分析。

为了确定在成熟和未成熟树突状细胞中过表达PI-9蛋白是否导致产生对抗CTL杀伤作用的保护作用，可用携带人PI-9 cDNA的腺病毒感染此类未成熟和成熟树突状细胞。首先需要克隆PI-9 cDNA。为此，根据制造商的说明，用TRIzol试剂(Life Technologies)自大约5×10⁵个来自成熟的人单核细胞的树突状细胞中分离总RNA。根据制造商的说明，使用随机六聚体RT-PCR试剂盒(Applied Biosystems，N808-0234)通过反转录PCR自这种细胞中产生cDNA。接下来，将cDNA用作模板通过PCR扩增人PI-9的完整编码区。为此，合成了寡核苷酸PI-9Forw(5’-GGG GTACCG CCA CCA TGG AAA CTC TTT CTA AGT GG-3’)和PI-9Rev(5’-CGG GAT CCT TAT GGC GAT GAG AAC CTG C-3’)(InvitroGen)。PI-9Forw含有KpnI限制性位点，而PI-9Rev含有BamHI限制性位点。采用以下PCR程序：94℃，5分钟；继以30个循环，每个循环为94℃，1分钟，59℃，30秒，72℃，1分钟。通过在72℃孵育10分钟而终止PCR反应。取5μl PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳分析。PCR扩增产物是一个1153碱基对的片段。随后，以限制性酶KpnI和BamHI消化20μl PCR产物，同样方式消化质粒pAdapt(WO 00/63403)。简言之，pAdapt含有Ad5基因组的大约5000碱基对的左翼。在该腺病毒区域内，编码E1蛋白的区域被整个去除，并替换为一种真核细胞表达盒，其包含CMV启动子和BGH poly(A)。随后采用分子生物学领域技术人员熟知的方法将KpnI/BamHI消化的PI-9核酸克隆入KpnI/BamHI消化的pAdapt质粒中。通过限制性消化图谱和/或测序确定了人PI-9编码序列在pAdapt中的正确插入和正确扩增。为获得携带PI-9核酸的重组腺病毒(其中该病毒对人树突状细胞具有向性)，首先以PacI消化携带PI-9序列的pAdapt质粒，以便自质粒中释放出病毒序列，随后将其与PacI消化的粘粒(cosmid)一同转染入包装细胞，例如PER.C6^TM细胞，所述PacI消化的粘粒含有Ad5基因组其余的31,000碱基对的右翼(这些过程详见WO 99/55132)。通过将Ad5主链的纤维部分替换为来自另一种携带树突状细胞特异性向性的血清型的纤维部分，或者通过使用对细胞例如树突状细胞具有天然关联的腺病毒血清型，来提供对树突状细胞的向性。对例如树突状细胞具有向性的腺病毒的实例为腺病毒血清型11和35(Ad11和Ad35)。本实施例仅使用了Ad5fib35.PI-9嵌合病毒，但其他实验中使用了Ad11和/或Ad35主链，其中这些腺病毒载体携带编码PI-9蛋白的核酸。在这些情况下，没有必要交换纤维或纤维部分、或病毒外壳的其他部分。将Ad11、Ad35和其他非C群腺病毒用于此类导向目的已有报导(WO 00/70071和WO02/40665)。经转染后形成了一种功能性的腺病毒基因组，借助于包装细胞提供的辅助功能其得以复制，并被包装成子代病毒，后者在宿主细胞裂解后释放入培养基。病毒制备、纯化、以及滴定均采用腺病毒制备领域的技术人员熟知的技术和方案进行。该嵌合病毒的代码为Ad5.Fib35.PI-9。

如上所述产生成熟和未成熟树突状细胞。将成熟的和未成熟的DC均以每孔1×10⁶个细胞的浓度接种于6孔板中，并暴露于1000vp/细胞的Ad5.Fib35(缺少转基因)或Ad5.Fib35.PI-9，以非感染细胞作为对照。48小时后，收集细胞并如上所述制备细胞裂解物。使用MoAb17和Western印迹分析来确定成熟和未成熟树突状细胞中的PI-9蛋白水平。为进一步确定PI-9蛋白表达的上调和下调是否与CTL介导的杀伤作用相关且因此是否可保护成熟和未成熟树突状细胞抵抗CTL介导的杀伤作用，平行进行了上述实验，但将细胞用于铕细胞毒性分析。感染Ad.luc病毒的成熟和未成熟树突状细胞均大部分被CTL应答杀伤，但感染携带PI-9基因的病毒则明显存活。

实施例4.以编码SPI-6的病毒在体内测定抗腺病毒的体液和细胞应答的效力

为了研究在未成熟和成熟抗原呈递细胞中过表达PI-9对抗腺病毒体液和细胞应答的体内影响。还产生了携带编码人PI-9在小鼠中的同源物，即丝氨酸蛋白酶抑制剂-6(SPI-6)的cDNA的腺病毒载体。为此，首先产生了SPI-6 cDNA。为PCR扩增SPI-6 cDNA，自小鼠树突状细胞或SPI-6 RNA高表达组织中分离总细胞RNA，SPI-6 RNA高表达组织例如为肺、脾脏、肾脏或心脏，随后如上所述将其转换为cDNA。通过PCR扩增完整的编码序列，引物为SPI-6 F(5’-GGG GTA CCG CCA CCATGA ATA CTC TGT CTG AAG G-3’)和SPI-6 R(5’-CGG GAT CCT TATGGA GAT GAG AAC CTG CC-3’)，产生了一种1147碱基对的PCR产物。如上所述以KpnI和BamHI进行消化后，将该产物克隆入pAdApt。该嵌合载体命名为Ad5.Fib35.SPI-6，随后将其用于产生在宿主细胞例如PER.C6TM中不复制的重组病毒。然后，采用本领域技术人员已知的方法如上所述纯化病毒并滴定。

给单独的各只小鼠肌肉注射对照病毒Ad5.Fib35以及Ad5.Fib35.SPI-6病毒，剂量为10¹⁰病毒颗粒。注射后2周，将来自这些小鼠的脾脏用于分析抗该载体的T细胞应答，而血清用于分析抗该载体的抗体应答。采用免疫学领域的技术人员熟知的技术和方案进行这些分析，如中和分析、IFN-γ的产生和细胞内染色。通过这些实验可鉴别SPI-6在体内引起抗腺病毒载体的体液和细胞免疫应答中的作用。

实施例5.SPI-6在针对病毒载体的免疫中的作用

给单独的各只小鼠肌肉注射Ad5.Fib35和Ad5.Fib35.SPI-6，剂量为10¹⁰病毒颗粒。2周后，给每只小鼠肌肉注射10¹⁰病毒颗粒的Ad5.Fib35.luc，随后在第1，2，4，8和12天将小鼠处死，并分离肌肉组织。在600μl冷PO₄缓冲液中，pH 7.8，进行组织匀浆，随后加入400μl裂解缓冲液(PO₄缓冲液，pH 7.8，1mM DTT+0.1％Triton X-100)。将裂解的肌肉样品进行冻融，然后取20μl转移至白色酶标板(ThermoLifescience)中。将板置于酶标仪(Thermo Lifescience)中，加入20μl萤光素酶底物(Luciferase-assay systems，Promega)并测定萤光素酶活性10秒钟。萤光素酶活性的量代表表达该转基因的肌肉细胞的数量。由于以Ad5.Fib35.SPI-6激发的小鼠的抗病毒载体的免疫得到增强，因此该活性会降低，与以Ad5.Fib35(无转基因)激发的小鼠的延长的表达相比也是如此。以空载体进行预注射的小鼠产生明显的抗载体T细胞应答。在注射组的肌肉中萤光素酶活性很快升高，但由于腺病毒感染的肌肉细胞被T细胞清除，因此数日后降低。与此不同，预注射Ad5.fib35.SPI-6的小鼠预期引起一种与对照小鼠相比更弱的载体特异性T细胞免疫，且预期在肌肉细胞中出现延长的萤光素酶表达。

总之，使用携带编码靶抗原的异源性核酸的病毒载体并与置于强启动子(例如CMV启动子)控制下的编码PI-9的核酸相结合以导向一种抗原呈递细胞，可导致在这种通常会对CTL杀伤作用变得敏感的细胞中，在表达该靶抗原的过程中可发生PI-9过表达。这种过表达将防止细胞被CTL应答清除，并因此产生针对该靶抗原的更持久的(且可能是更强的)免疫应答。这在免疫接种用途中是非常有益的。

与此不同，将病毒载体用于基因治疗用途中(例如用于导向肿瘤细胞)，其中这些病毒载体携带编码一种治疗性蛋白的目的基因并与一种下调PI-9表达的核酸或物质相结合，可降低针对所使用的病毒载体的免疫应答，这是由于表达来自病毒的抗原的抗原呈递细胞会被快速清除。这些病毒抗原呈递细胞的快速清除可能会导致产生针对所导向的肿瘤细胞的更强的也是更持久的效应。

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Claims

1.一种病毒载体，其能够将异源性核酸输送至能够接受该病毒载体的细胞，其中所述病毒载体包含一种异源性核酸序列，当所述异源性核酸序列在该细胞中表达时，引起该细胞中的蛋白酶抑制剂-9(PI-9)的水平和/或活性升高或保持在基本上稳定的水平。

2.权利要求1的病毒载体，其中所述病毒载体选自：腺病毒、α病毒、痘病毒、痘苗病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)和流感病毒。

3.权利要求2的病毒载体，其中所述病毒载体是腺病毒或其功能性衍生物。

4.权利要求3的病毒载体，其中所述腺病毒是来自亚群B的腺病毒血清型。

5.权利要求4的病毒载体，其中所述来自亚群B的腺病毒血清型选自：Ad11、Ad26、Ad35和Ad50。

6.权利要求3的病毒载体，其中所述腺病毒包含一种嵌合壳体，所述嵌合壳体包含来自至少两种不同腺病毒血清型的蛋白和/或蛋白片段。

7.权利要求1-6中任一项的病毒载体，其中所述细胞是抗原呈递细胞(APC)。

8.权利要求1-7中任一项的病毒载体，其中所述细胞是树突状细胞或B细胞。

9.权利要求8的病毒载体，其中所述树突状细胞是未成熟的。

10.权利要求8的病毒载体，其中所述树突状细胞是成熟的。

11.权利要求8-10中任一项的病毒载体，其中所述树突状细胞是动脉周围并指状树突状细胞。

12.权利要求1-11中任一项的病毒载体，其中所述异源性核酸包含编码PI-9的核酸或其功能性等价物。

13.一种病毒载体，其能够将异源性核酸输送至能够接受该病毒载体的细胞，其中所述病毒载体包含一种异源性核酸序列，当所述异源性核酸序列在该细胞中表达时，引起该细胞中PI-9的水平和/或功能降低。

14.权利要求13的病毒载体，其中所述病毒载体选自：腺病毒、α病毒、痘病毒、痘苗病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)和流感病毒。

15.权利要求14的病毒载体，其中所述病毒载体是腺病毒或其功能性衍生物。

16.权利要求15的病毒载体，其中所述腺病毒是来自亚群B的腺病毒血清型。

17.权利要求16的病毒载体，其中所述来自亚群B的腺病毒血清型选自：Ad11、Ad26、Ad35和Ad50。

18.权利要求15的病毒载体，其中所述腺病毒包含一种嵌合壳体，所述嵌合壳体包含来自至少两种不同腺病毒血清型的蛋白和/或蛋白片段。

19.权利要求13-18中任一项的病毒载体，其中所述细胞是抗原呈递细胞(APC)。

20.权利要求13-19中任一项的病毒载体，其中所述细胞是树突状细胞或B细胞。

21.权利要求20的病毒载体，其中所述树突状细胞是未成熟的。

22.权利要求20的病毒载体，其中所述树突状细胞是成熟的。

23.权利要求20-22中任一项的病毒载体，其中所述树突状细胞是动脉周围并指状树突状细胞。

24.权利要求13-23中任一项的病毒载体，其中所述核酸包含编码反义PI-9 RNA的核酸或其功能性等价物。

25.一种药物组合物，其包含：权利要求1-24中任一项的病毒载体；和一种药物可接受的载体。

26.一种接触和/或感染了权利要求1-24中任一项的病毒载体的树突状细胞。

27.一种调节细胞对CTL的敏感性的方法，其包含以下步骤：用包含一种异源性核酸序列的病毒载体感染该细胞，当所述异源性核酸序列在该细胞中表达时，引起该细胞中PI-9的水平和/或活性升高或保持在基本上稳定的水平。

28.权利要求27的方法，其中所述病毒载体选自：腺病毒、α病毒、痘病毒、痘苗病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)和流感病毒。

29.权利要求28的方法，其中所述病毒载体是腺病毒或其功能性衍生物。

30.权利要求29的方法，其中所述腺病毒是来自亚群B的腺病毒血清型。

31.权利要求30的方法，其中所述来自亚群B的腺病毒血清型选自：Ad11、Ad26、Ad35和Ad50。

32.权利要求29的方法，其中所述腺病毒包含一种嵌合壳体，所述嵌合壳体包含来自至少两种不同腺病毒血清型的蛋白和/或蛋白片段。

33.权利要求27-32中任一项的方法，其中所述细胞是抗原呈递细胞(APC)。

34.权利要求27-33中任一项的方法，其中所述细胞是树突状细胞或B细胞。

35.权利要求34的方法，其中所述树突状细胞是未成熟的。

36.权利要求34的方法，其中所述树突状细胞是成熟的。

37.权利要求34-36中任一项的方法，其中所述树突状细胞是动脉周围并指状树突状细胞。

38.权利要求27-37中任一项的方法，其中所述核酸包含编码PI-9的核酸或其功能性等价物。

39.一种调节细胞对CTL的敏感性的方法，其包含以下步骤：用包含一种异源性核酸序列的病毒载体感染该细胞，当所述异源性核酸序列在该细胞中表达时，引起该细胞中PI-9的水平和/或活性降低。

40.权利要求39的方法，其中所述病毒载体选自：腺病毒、α病毒、痘病毒、痘苗病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)和流感病毒。

41.权利要求40的方法，其中所述病毒载体是腺病毒或其功能性衍生物。

42.权利要求41的方法，其中所述腺病毒是来自亚群B的腺病毒血清型。

43.权利要求42的方法，其中所述来自亚群B的腺病毒血清型选自：Ad11、Ad26、Ad35和Ad50。

44.权利要求41的方法，其中所述腺病毒包含一种嵌合壳体，所述嵌合壳体包含来自至少两种不同腺病毒血清型的蛋白和/或蛋白片段。

45.权利要求39-44中任一项的方法，其中所述细胞是抗原呈递细胞(APC)。

46.权利要求39-45中任一项的方法，其中所述细胞是树突状细胞或B细胞。

47.权利要求46的方法，其中所述树突状细胞是未成熟的。

48.权利要求46的方法，其中所述树突状细胞是成熟的。

49.权利要求46-48中任一项的方法，其中所述树突状细胞是动脉周围并指状树突状细胞。

50.权利要求39-49中任一项的方法，其中所述核酸包含编码反义PI-9 RNA的核酸或其功能性等价物。

51.一种用于在能够引发由树突状细胞介导的针对一种抗原的CD8+T细胞应答的系统中调节针对该抗原的免疫应答的方法，所述方法包含给所述系统提供所述抗原和一种用于调节由抗原特异性CD8+T细胞介导的对所述树突状细胞的杀伤作用的元件。

52.权利要求51的方法，其中所述抗原由一种病毒载体提供。

53.权利要求51或权利要求52的方法，其中所述病毒载体包含腺病毒载体。

54.权利要求51-53中任一项的方法，其中通过提供一种用于降低由抗原特异性CD8+T细胞介导的对所述树突状细胞的杀伤作用的元件而增强所述免疫应答。

55.权利要求51-53中任一项的方法，其中通过提供一种用于增强由抗原特异性CD8+T细胞介导的对所述树突状细胞的杀伤作用的元件而降低所述免疫应答。

56.权利要求54或权利要求55的方法，其中所述元件可调节粒酶B介导的DNA片段化途径。

57.权利要求56的方法，其中所述元件包含PI-9蛋白或其功能性等价物。

58.权利要求56的方法，其中通过给所述树突状细胞提供一种包含至少部分PI-9基因的核酸或其衍生物和/或类似物而将所述元件提供给所述树突状细胞。

59.权利要求57或权利要求58的方法，其中所述元件包含一种编码PI-9蛋白或其具有蛋白酶活性的部分、衍生物和/或类似物的核酸。

60.权利要求51-59中任一项的方法，其中由病毒载体提供用于调节由抗原特异性CD8+T细胞介导的对所述树突状细胞的杀伤作用的所述元件。

61.一种组合物，其包含一种抗原和一种用于调节由抗原特异性CD8+T细胞介导的对树突状细胞的杀伤作用的元件。

62.一种试剂盒，其包含一种抗原和一种用于调节由抗原特异性CD8+T细胞介导的对树突状细胞的杀伤作用的元件。

63.权利要求61的组合物或权利要求62的试剂盒，包含一种病毒载体。

64.一种病毒载体，其包含一种用于特异性调节由抗原特异性CD8+T细胞介导的对树突状细胞的杀伤作用的元件。

65.权利要求1-24或64中任一项的病毒载体在制备用于调节个体的抗原特异性CD8+T细胞应答的药物中的用途。

66.权利要求65的用途，其中所述调节特异于由所述病毒载体提供的抗原。