CN1663962A - 重组人粒细胞集落刺激因子及其化学修饰物的一步纯化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种简单高效的纯化重组人粒细胞集落刺激因子(rhG－CSF)及其化学修饰产物的一步纯化工艺。该工艺主要采用阳离子交换层析的方法，通过一步层析而有效地得到高活性、高纯度和高回收率的rhG－CSF和聚乙二醇化学修饰的rhG－CSF，特别适合于产业化生产。
Description
一、技术领域
本发明涉及蛋白质及其修饰物纯化领域，具体而言就是简单高效地制备高纯度、高活性的药用蛋白质溶液的领域。本发明涉及用相当简单的方法，通过一个步骤纯化出高纯度的rhG-CSF或其聚乙二醇(PEG)修饰物溶液的方法，特别适合于该蛋白及其聚乙二醇修饰物在医药工业中的的大规模生产工艺。
二、背景技术
随着基因工程技术的发展，基因工程重组蛋白技术在医药工业中的应用越来越多，很多在人类疾病的预防和治疗中有明显作用的蛋白质都通过基因工程重组的手段被制备出来，并有效地应用于许多人类疾病的预防和治疗上。例如干扰素(α-IFN，β-IFN，γ-IFN)、白细胞介素(IL-2，IL-11)、肿瘤坏死因子、造血生长因子(G-CSF，GM-CSF和EPO)、各类溶栓药物(SK，tPA，hirudin)以及各种激素(insulin，PTH)等。
在基因工程重组蛋白技术应用于医药工业的近20年的发展过程中，既适合于规模化生产，其所得产品又符合药品的质量标准的重组蛋白生产工艺路线的研究逐渐被人们重视起来。例如早期用于重组蛋白质纯化的亲和层析方法，已越来越不适合规模化生产的需要；有的重组蛋白纯化工艺方法复杂，步骤繁多，虽然纯度达到了所需要求，但回收率及蛋白的生物活性都很受影响。G-CSF于1991年被美国FDA批准投放市场，用于治疗放疗后中性粒细胞减少症，国内目前有厂家在生产销售。其聚乙二醇修饰的长效制剂PEG-G-CSF(商品名为Neulasta)也已于2002年被美国FDA批准投放市场。根据文献及相关专利的报道，现行rhG-CSF的纯化工艺路线大多采用包涵体复性-疏水层析-离子交换层析等；PEG-G-CSF的纯化工艺路线大多采用凝胶过滤配合离子交换层析等。
三、发明内容
本发明是一种简单高效的生产rhG-CSF及其PEG修饰物的工艺方法，通过一次柱层析得到高纯度的rhG-CSF或PEG修饰物。
本发明是在研究国内外较为成熟的rhG-CSF及其PEG修饰物的一些纯化方法的基础上，通过试验研究目的蛋白(rhG-CSF及其PEG修饰物)的一些特性及其与阳离子层析介质的一些特殊作用关系，总结并发明该方法。
G-CSF是用于治疗造血障碍引起的白细胞减少症(如化疗)的治疗用蛋白质。本发明所述G-CSF可以是从哺乳动物有机体分离纯化而来，也可是化学合成产品，或者是通过原核生物或真核生物宿主表达的外源性DNA序列而得到的产品。其中DNA可以从基因组或cDNA合成而得。合适的原核生物宿主包括各种细菌(如大肠杆菌)；合适的真核生物宿主包括酵母及哺乳动物细胞(如，CHO)。因宿主不同，所得G-CSF可能会被糖基化或非糖基化。G-CSF也可包括一个起始的甲硫氨酸残基(第一位)。同时，G-CSF类似物可包括具有氨基酸添加、缺失、替代及融合方式等。上述G-CSF及其类似物适合本发明。
其中采用大肠杆菌表达的rhG-CSF多为包涵体形式，本发明对rhG-CSF包涵体的制备、洗涤、溶解和复性方法是：加溶菌酶辅以高压匀浆破菌，破菌缓冲带5mM EDTA和1.0％ Triton X-100；离心得包涵体后直接用含4M尿素的缓冲液洗涤包涵体，同法洗涤两次后包涵体蛋白纯度可达80％；离心得包涵体沉淀，用含8M尿素的缓冲液直接溶解包涵体，溶解后采用逐步稀释辅以超滤对包涵体进行复性和浓缩，所得样品进行阳离子交换。层析上样及平衡缓冲液pH为4.0，rhG-CSF能很好地结合在介质上，用100mM，pH为7.0的磷酸钠缓冲液(PB)洗脱，所得rhG-CSF纯度大于95％，回收率大于80％。
本发明所述PEG修饰是制备PEG与蛋白质连接物的方法，主要采用了烷化法和酰化法。在还原型烷基化反应条件下，将含多余一个氨基的蛋白质分子与PEG反应，反应液的pH值应适合于选择激活所说蛋白质分子氨基酸末端的a-氨基酸，所以PEG附着于所述a-氨基酸残基上。酰化法是PEG与蛋白氨基酸残基中的Lys发生酰化缩合反应而结合。烷化法和酰化法是目前较为成熟的两种PEG修饰方法。
对所得rhG-CSF进行PEG修饰，所得样品中含有未修饰的rhG-CSF，修饰N末端的rhG-CSF和非N端(Lys位点)修饰的rhG-CSF。使用同样的层析介质和缓冲条件，反应产物能很好地结合在介质上，游离PEG直接透过。充分平衡后，改变缓冲液的pH至5.6，仅修饰N末端的rhG-CSF被洗脱下来；改变缓冲液的pH至6.2，非N端(Lys位点)修饰的rhG-CSF被洗脱下来；再改变缓冲液的pH至7.0，未修饰的rhG-CSF被洗脱下来。其中，所得PEG-G-CSF纯度大于95％，回收率大于80％。
四、附图说明
附图1：SP Sepharose F.F.纯化rhG-CSF示意图
附图2：SP Sepharose F.F.纯化N端PEG修饰的rhG-CSF示意图
附图3：SP Sepharose F.F.纯化Lys PEG修饰的rhG-CSF示意图
附图4：纯化的rhG-CSF和PEG-G-CSF的SDS-PAGE电泳分析
五、具体实施实例
实例一rhG-CSF构建、表达及复性
人G-CSF氨基酸序列如下：
NH2-Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu LysCys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu CysAla Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly IlePro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu SerGln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile SerPro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Vla Ala Asp Phe Ala Thr ThrIle Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly AlaMet Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser HisLeu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro-COOH
全基因合成人G-CSF cDNA基因片段，应用递归PCR方法获得3’端含NdeI和5’端含BamHI的插入片段，该序列重组到质粒pET-3a，转化宿主菌BL21(DE3)pLysS进行表达，表达温度37℃，IPTG终浓度0.2mmol/L，所得目的蛋白为包涵体形式。配制破菌缓冲液如下：
50mmol/L Tris.CL，pH10.0
5mmol/L EDTA
0.1mg/ml溶菌酶
1.0％ Triton
以100g湿菌：1L缓冲液比例悬浮菌体，高压匀浆破菌(30-40MP/2-3次)，10,000rpm/15min离心收集包涵体沉淀。配制包涵体洗涤液如下：
50mmol/L Tris.CL，pH9.0
5mmol/L EDTA
4mmol/L Urea以10g包涵体：100ml缓冲液比例悬浮包涵体，搅拌洗涤30min，10,000rpm/15min离心弃上清，配制溶解缓冲液：
50mmol/L Tris.CL，pH9.0
5mmol/L EDTA
8mmol/L Urea
0.05％(v/v)β-ME以10g包涵体：100ml缓冲液比例悬浮包涵体，搅拌溶解1hr，10,000rpm/15min离心收集上清。配制复性缓冲液：
20mmol/L Tris.CL，pH9.0
20umol/L CuSO4取包涵体溶液，加入1倍体积复性缓冲液，尿素终浓度为4mmol/L，室温搅拌30min；再加入1倍体积复性缓冲液，尿素终浓度为2.7mmol/L，室温搅拌30min；再加入1倍体积复性缓冲液，尿素终浓度为2mmol/L，室温搅拌30min；再加入1倍体积复性缓冲液，尿素终浓度为1.6mmol/L，室温搅拌30min；再加入1倍体积复性缓冲液，尿素终浓度为0.8mmol/L，室温搅拌过夜(约12hr)。用分子截流量为3KD的中空超滤柱超滤浓缩至1/10体积。配制稀释液：
25mmol/L Tris.CL，pH9.0
1mmol/L EDTA
10umol/L CuSO4用稀释液稀释浓缩液4倍，再超滤浓缩至1/4体积，得rhG-CSF蛋白复性液。
实例二rhG-CSF一步纯化
样品处理，即用乙酸调节复性液至pH4.0，离心去沉淀。取阳离子层析介质SP Sepharose F.F.，装柱后平衡缓冲液(10mmol/L乙酸-乙酸钠，pH4.0)平衡至基线后上样样品，再用平衡缓冲液平衡至基线。取洗脱缓冲液(100mmol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液，pH7.0)洗脱下rhG-CSF目的蛋白峰。按介质说明书方法再生层析介质，去除其他杂质蛋白。用SDS-PAGE电泳法和RP-HPLC法测定所得目的蛋白纯度。
实例三rhG-CSF的PEG修饰
1.烷化法N-末端修饰
取纯化所得rhG-CSF，稀释至2.0mg/ml，对0.1M NaH2PO4，pH5.0于4℃透析过夜，调节pH至5.0。取分子量为20KD的mPEG-ButyrALD(NEKTARTM)，按mPEG-ButyrALD∶rhG-CSF摩尔比5∶1比例加入mPEG-ButyrALD，充分搅拌溶解。再取1M NaCNBH3加入反应液，终浓度为20mM。充分搅拌混匀后置4℃反应过夜。
2.酰化法N-末端修饰
取纯化所得rhG-CSF，稀释至2.0mg/ml，对0.1M NaH2PO4，pH6.5于4℃透析过夜，调节pH至6.5。取分子量为20KD的mPEG-NH2(NEKTARTM)，按mPEG-NH2∶rhG-CSF摩尔比5∶1比例加入，充分搅拌溶解。再置25℃搅拌1hr，加入羟胺至终浓度2M，充分搅拌混匀后反应1hr。
实例四烷化法PEG-G-CSF的一步纯化
样品处理，取修饰后样品，用蒸馏水稀释两倍体积后，再用乙酸调节至pH4.0，离心去沉淀。取阳离子层析介质SP Sepharose F.F.，装柱后取平衡缓冲液I(10mmol/L乙酸-乙酸钠，pH4.0)平衡至基线后上样样品，再用平衡缓冲液II(10mmol/L乙酸-乙酸钠，pH5.0)平衡至基线。取洗脱缓冲液I(10mmol/L乙酸-乙酸钠，pH5.6)洗脱下PEG-G-CSF目的蛋白峰。取洗脱缓冲液II(10mmol/L乙酸-乙酸钠，pH7.0)洗脱下未修饰的rhG-CSF蛋白峰。
实例五酰化法PEG-G-CSF的一步纯化
样品处理，取修饰后样品，用蒸馏水稀释两倍体积后，再用乙酸调节至pH4.0，离心去沉淀。取阳离子层析介质SP Sepharose F.F.，装柱后取平衡缓冲液I(10mmol/L乙酸-乙酸钠，pH4.0)平衡至基线后上样样品，再用平衡缓冲液II(10mmol/L乙酸-乙酸钠，pH5.0)平衡至基线。取洗脱缓冲液I(10mmol/L乙酸-乙酸钠，pH6.2)洗脱下PEG-G-CSF目的蛋白峰。取洗脱缓冲液II(10mmol/L乙酸-乙酸钠，pH7.0)洗脱下未修饰的rhG-CSF蛋白峰。
实例六产物纯度分析及体外生物活性测定
取未修饰的rhG-CSF、烷化法修饰的PEG-G-CSF和酰化法修饰的PEG-G-CSF做为供试品。分别用非还原性SDS-PAGE法和RP-HPLC法对产物进行纯度分析。同时参照《中国生物制品规程(2000年版)》附录“rhG-CSF效价测定(NFS-60依赖株/MTT比色法)”所述方法，对产物进行体外生物活性测定。
1.非还原性SDS-PAGE法测定纯度
参照《中国生物制品规程》(2000版)“SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳”所述方法，分离胶浓度为15％，然后取rhG-CSF、烷化法修饰的PEG-G-CSF和酰化法修饰的PEG-G-CSF测定。每孔上样10ug。凝胶扫描后用蛋白凝胶分析系统分析目的蛋白纯度。
2.RP-HPLC法测定纯度
色谱条件如下：
高效液相系统为waters(600E)
色谱柱：Hypersil C18(300A，5u，4.6×250mm)
流速：1.0ml/min
上样量：20ul.
检测波长：280nm
洗脱条件：100％ A液洗脱5分钟，0-100％B液梯度洗脱30分钟
A液：5％乙腈、0.1％TFA
B液：90％乙腈、0.1％TFA
3.体外生物活性测定
先配制基础培养液：
1640培养液
2.5％小牛血清(FBS，v/v)
12.5％马血清(v/v)
10ml/L丙酮酸钠
10ml/L谷氨酰氨
取对G-CSF依赖的细胞株NFS-60，用基础培养液洗涤3次，重新悬浮于基础培养基中配成2.0×105个细胞/ml的细胞悬液，置37℃备用。取rhG-CSF参照品(美国Amgen公司)和供试品，用基础培养基稀释至1.0ng/ml。取96孔细胞培养板，对参照品和供试品以2倍稀释度做梯度稀释，共做7个稀释度，每个梯度2个复孔。然后每孔加入50ul细胞悬液，于37℃，5％CO2培养48小时，每孔加入20ulMTT溶液，37℃，5％CO2培养5小时，每孔加入200ul裂解液(1％浓盐酸，10％TritonX-100的异丙醇)，混匀后在酶标仪上比色，测定波长570nm，参比波长630nm，记录测定结果，根据下列公式计算供试品比活性：
4.测定结果总结如下表：
SDS-PAGE纯度 RP-HPLC纯度 比活性
供试品
(％) (％) (IU/mg)
rhG-CSF 97.7 98.5 1.1×108
PEG-G-CSG(烷化法) 98.1 98.7 4.7×107
PEG-G-CSG(酰化法) 97.2 97.9 4.1×107
电子可读序列-peggcsf专利
重组人粒细胞集落刺激因子及其化学修饰物的一步纯化工艺序列表
Organization Applicant
Street：重庆市石桥铺科园四街70号
City：重庆市
State：重庆市
Country：中华人民共和国
PostalCode：400041
PhoneNumber：023-68888852
FaxNumber：023-68699676
EmailAddress：fankai1963@yahoo.com.cn
<110>OrganizationName：重庆富进生物医药有限公司
Application Project
<120>Title：重组入粒细胞集落刺激因子及其化学修饰物的一步纯化工艺
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<170>PatentIn version 3.2
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<213>OrganismName：天然序列
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Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu 15
Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala 30
Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro 45
Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala 60
Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys 75
Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly leu Leu 90
Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp 105
Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln 120
Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln 135
Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly 150
Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser 165
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<212>Type：PRT
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Feature
<221>FeatureKey：mat_peptide
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<222>LocationTo：10
Other Information：人G-CSF氨基酸序列
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Claims (10)
1.一种用阳离子交换层析纯化重组人粒细胞集落刺激因子及其聚乙二醇化学修饰产物的方法，其特征是一步纯化，纯度高，活性高及回收率高。
2.权利要求1所述一步阳离子交换层析方法适用于重组人粒细胞集落刺激因子的纯化。
3.权利要求1所述一步阳离子交换层析方法同样适用于经聚乙二醇化学修饰的重组人粒细胞集落刺激因子的纯化。
4.权利要求1所述的阳离子交换层析指弱离子型交换介质和强离子型交换介质。
5.权利要求4所述的阳离子交换层析介质聚合物包括Sephadex、Sepharose、Cellulose及Source等。
6.权利要求2所述重组人粒细胞集落刺激因子指应用基因工程手段制备的天然型或经缺失、突变以及嵌合的形式。
7.权利要求3所述重组人粒细胞集落刺激因子聚乙二醇化学修饰产物指重组人粒细胞集落刺激因子N末端和非N末端的聚乙二醇修饰产物。
8.权利要求1所述阳离子交换层析的条件为：
(1).平衡缓冲液离子强度为5-50mmol/L，酸碱度为2.0-5.0。
(2).洗脱缓冲液离子强度为10-200mmol/L，酸碱度为5.0-9.0。
(3).洗脱缓冲液盐离子梯度为0-500mmol/L氯化钠。
9.权利要求8所述缓冲液体系主要指乙酸钠，磷酸钠，碳酸钠，柠檬酸钠以及甘氨酸的缓冲。
10.权利要求8所述洗脱条件可以单独用pH或氯化钠梯度，也可两者同时使用。
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