CN1653335A - 免疫球蛋白通用文库 - Google Patents

Abstract

本发明描述了所感兴趣免疫球蛋白的文库，所述文库含有突变的所感兴趣免疫球蛋白，其中单个的预定氨基酸在所感兴趣免疫球蛋白的一个或多个互补决定区的一个或多个位点上被取代。所述文库含有一系列子文库，其中预定的氨基酸在所感兴趣免疫球蛋白的六个互补决定区(CDR)中的每一个上以及CDR的每一个可能的组合变体上“步移”，得到包含突变免疫球蛋白的子文库，其中所述突变免疫球蛋白在每个CDR的一个或多个位点上具有预定的氨基酸，总体来说在每一个CDR的每一个位点上都具有预定的氨基酸。本发明进一步包括通用文库，所述通用文库中对于作为单个的预定氨基酸的每一个天然存在的氨基酸都含有一个这样的文库，一共是二十个文库；而且还包括编码所述文库的核苷酸文库。

Description

免疫球蛋白通用文库

相关申请

本申请要求保护2002年4月17日申请的美国临时申请No.60/373,558的权利。在此引入上述申请的全文作为参考。

发明背景

在蛋白质和功能研究中诱发突变是一种强有力的工具。可以在编码所感兴趣蛋白质的克隆基因的核苷酸序列中进行突变，所修饰的基因可以进行表达以产生蛋白质突变体。将野生型蛋白和所产生的突变体蛋白的性质进行比较，就有可能识别出对于蛋白的结构完整性和/或生化功能，例如其结合和/或催化活性所必须的单个氨基酸或氨基酸域。可以用一个蛋白产生多个突变体，但是要选择能提供信息的或具有所希望性质的突变体是很困难的，即使所选择的突变体包含的突变完全是在推定的蛋白的重要区域(例如在蛋白活性位点或其周围的区域)。例如，特定氨基酸的取代，缺失或插入都可以对蛋白质造成局部的或整体的影响。目前仍然需要能够系统评价蛋白突变效果的方法。

发明简述

本发明涉及所感兴趣免疫球蛋白的文库。所述的文库建立在所感兴趣的原型球蛋白的基础上，可以通过对原型球蛋白进行步移法突变获得。在一个实施方案中，本发明的单个预定氨基酸文库包括突变的所感兴趣免疫球蛋白，其中单个预定氨基酸在所感兴趣免疫球蛋白的一个或多个互补决定区的一个或多个位点处被取代；所述文库包含一系列子文库，包括：a)一个含有所感兴趣原型免疫球蛋白的子文库；b)六个含有突变免疫球蛋白的子文库(所感兴趣免疫球蛋白的六个互补决定区中的每一个都有一个子文库)，其中预定氨基酸只在该免疫球蛋白的六个互补决定区其中一个的一个或多个位点被取代；c)15个含有突变免疫球蛋白的子文库(每种可能的六个互补决定区之中的两个的组合都有一个子文库)，其中预定氨基酸在六个互补决定区其中两个的一个或多个位点被取代；d)20个含有突变免疫球蛋白的子文库(每种可能的六个互补决定区之中的三个的组合都有一个子文库)，其中预定氨基酸在六个互补决定区其中三个的一个或多个位点被取代；e)15个含有突变免疫球蛋白的子文库(每种可能的六个互补决定区之中的四个的组合都有一个子文库)，其中预定氨基酸在六个互补决定区其中的四个的一个或多个位点被取代；f)六个含有突变免疫球蛋白的子文库(每种可能的六个互补决定区之中的五个的组合都有一个子文库)，其中预定氨基酸在六个互补决定区其中五个的一个或多个位点被取代；以及g)一个含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在全部六个互补决定区中的一个或多个位点被取代。每个含有突变免疫球蛋白的子文库都含有其中预定氨基酸在所述预定氨基酸被引入的互补决定区的每个位点上出现至少一次的突变免疫球蛋白。

预定氨基酸选自于20个天然存在的氨基酸。所感兴趣免疫球蛋白可以是整个免疫球蛋白，或者是免疫球蛋白的一个Fab片断，或者是免疫球蛋白的一条链。所感兴趣免疫球蛋白可以是免疫球蛋白的五种类型(IgG，IgM，IgA，IgD或IgE)中的任何一种。在一个实施方案中，所感兴趣的免疫球蛋白是催化性抗体。

本发明进一步涉及所感兴趣原型免疫球蛋白的通用文库，其中该通用文库包括20个上述的“单个预定氨基酸”文库，20个天然存在的核苷酸中每一个都具有一个文库。本发明还涉及编码此单个预定氨基酸文库的核苷酸文库，以及编码通用文库的核苷酸文库。

这里所说的文库含有容易识别的突变免疫球蛋白，使得可以对所感兴趣原型免疫球蛋白的结合区域，以及每个特定的预定氨基酸在结合区域活性中所起的作用进行系统分析。所述文库可以为能改变所感兴趣免疫球蛋白与其抗原的相互作用的特定突变提供特定的信息，其中所述的相互作用包括在不同的互补决定区的氨基酸之间的多种相互作用，同时所述文库可避免与分析任意突变所产生的突变体相关的问题。

附图简述

图1A-1B显示了GP-120单链FV的全序列，包括核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图2显示了图1A-1B所示的GP-120 scFV基因的总体装配示意图。

图3总结了通过本发明的方法得到的scFV基因文库，以及每个单独的文库产生的基因变体数目。

图4是图2所示的装配示意图中所使用的寡核苷酸集合。

图5A-5B是以多种不同的组合在Fv的单个CDR中引入三个

(3)靶核苷酸，Ser，His和Asp所用的寡核苷酸集合。集合序列用IUPAC混合碱基命名法给出，以大写字母表示，R＝A或者G，Y＝C或者T，M＝A或者C，K＝G或者T，S＝C或者G，W＝A或者T；H＝A或者C或者T，B＝C或者G或者T，V＝A或者C或者G，D＝A或者G或者T。

图6是生成GP-120 scFV文库所进行的VL和VH基因装配策略，其中六个CDR区域中的三个(3)同时进行突变以以多种(8)不同的组合(L1到L8)生成选定的氨基酸(Ser，His和Asp)。

图7A-7B是第一个VL区域(6个CDR区域中的第一个)的20个单个寡核苷酸库，每一个库都相应于20个天然氨基酸中的一个。

图8A-8B是第二个VL区域(6个CDR区域中的第二个)的20个单个寡核苷酸库，每一个库都相应于20个天然氨基酸中的一个。

图9A-9B是第三个VL区域(6个CDR区域中的第三个)的20个单个寡核苷酸库，每一个库都相应于20个天然氨基酸中的一个。

图10A-10B是第一个VH区域(6个CDR区域中的第四个)的20个单个寡核苷酸库，每一个库都相应于20个天然氨基酸中的一个。

图11A-11B是第二个VH区域(6个CDR区域中的第五个)的20个单个寡核苷酸库，每一个库都相应于20个天然氨基酸中的一个。

图12A-12B是第三个VH区域(6个CDR区域中的第六个)的20个单个寡核苷酸库，每一个库都相应于20个天然氨基酸中的一个。

图13A-13D是单个氨基酸的CDR库的分组。

发明详述

本发明涉及所感兴趣免疫球蛋白的文库，包括含有编码免疫球蛋白的核苷酸的文库，以及含有免疫球蛋白自身的文库。这里所说的“免疫球蛋白”是一种抗体蛋白，可以应答并结合特定的抗原。已知有五种，或者五类免疫球蛋白：IgG，IgM，IgA，IgD和IgE(参见，例如，Dictionary of Cell and Molecular Biology，ThirdEdition)。免疫球蛋白的基本形式是IgG形式：它包括两个相同的重链(H)和两个相同的轻链(L)，通过二硫键以“Y”的形状连接起来。重链包含四个区，包括三个恒定区(C_H)和一个可变区(V_H)。轻链具有一个恒定区(C_L)和一个可变区(V_L)。

每个重链可变区和每个轻链可变区都含有三个高度可变的环，也叫作互补决定区(CDR)。抗原结合位点(Fv)区(也称为“结合袋(binding pocket)”)包括这样的六个高度可变(CDR)环(三个在免疫球蛋白重链可变区(V_H)，三个在轻链可变区(V_L))。每个免疫球蛋白分子的CDR的残基与其它免疫球蛋白分子都不同，这使的抗原对于每个抗体都是特异的。

下面对每种免疫球蛋白进行简单描述。

                免疫球蛋白G(IgG)

IgG是一类经典的免疫球蛋白；IgG的分子量大约是150kD。如上所述，IgG由两个相同的轻链和两个相同的重链组成。IgG分子可以被蛋白水解为两个Fab片段和一个Fc片段。Fab包括抗原结合位点(轻链和重链的可变区)，轻链的恒定区，重链的三个恒定区中的一个。Fc区域由其余的重链的固定区组成；它含有细胞结合位点和补体结合位点。

               免疫球蛋白M(IgM)

IgM分子(分子量是大约970kD)是由五个IgG类型的单体连接起来，在J链的辅助下，形成一个环形的五聚体。IgM可结合补体；与细胞表面相结合的单个IgM分子可以溶解该细胞。IgM在免疫反应中通常先于IgG并且第一个产生。

               免疫球蛋白A(IgA)

IgA是一类在哺乳动物的血清和细胞外分泌物中发现的免疫球蛋白。在分泌物中，IgA以IgG类型的单体的二聚体的形式存在(二聚体的分子量大约为400kD)，通过短的J链连接起来，并且连接到分泌肽或转运肽上；在血清中，它们以单体的形式存在(分子量大约为170kD)。IgA是对消化道和呼吸道感染提供局部免疫的主要方式。

               免疫球蛋白D(IgD)

IgD(分子量大约为184kD)在血清中的量很少，但是它是B-淋巴细胞表面的主要免疫球蛋白，其中它起着抗原识别的作用。它的结构与IgG类似，但是重链是类型的。

               免疫球蛋白E(IgE)

IgE(分子量大约为188kD)与即时的超敏感反应和寄生虫感染相关。它们在血清中的量很少，大部分是与具有IgE特异性的Fc受体(Fc  R)的肥大细胞和嗜碱细胞结合。IgE中碳水化合物含量很高，也存在于细胞外分泌物中。其重链是  类型的。

在优选的实施方案中，所感兴趣免疫球蛋白是IgG类免疫球蛋白。这里所说的“所感兴趣免疫球蛋白”指完整的免疫球蛋白(即含有两个完整的重链和两个完整的轻链的免疫球蛋白)。可选择地，所感兴趣免疫球蛋白也可以指免疫球蛋白的一部分(即含有少于两个完整重链和两个完整轻链的免疫球蛋白)，其中所述部分含有免疫球蛋白的可变区(例如Fab片段，或者Fv片段)。在另一个实施方案中，所感兴趣免疫球蛋白也可以是含有，例如，由连接子区域连接起来的一个重链和一个轻链，或者一个单链Fv片断的“单链的”或是“单链”免疫球蛋白。在一个实施方案中，例如，所感兴趣免疫球蛋白可以将三个轻链可变区和三个重链可变区连接起来(例如用连接子区域)，形成一个单链Fv免疫球蛋白。如果需要，所感兴趣免疫球蛋白可以与大分子偶联。在一个实施方案中，它可以与一个蛋白，例如一种酶，毒素或细胞因子偶联。例如，蛋白水解酶可以与免疫球蛋白分子偶联，这样可以直接对特异的蛋白进行酶催化作用，例如用于溶解血栓的纤维蛋白，或者用于抗病毒治疗的病毒胞衣蛋白和RNA。与免疫球蛋白偶联的毒素可以直接针对癌细胞(参见，例如，AntibodyEngineering.R.Konterman，S.Dubel(Eds.).Springer Lab manual.Spriger-Verlag.Berlin，Heidelberg(2001)，Chapter 41.″StabilizationStrategies and Application of recombinant Fvs and Fv Fusionproteins″.By U.Brinkmann，pp.593-615.等)，细胞因子(IL2等等)可以用于抗炎症用途。

所感兴趣免疫球蛋白可以来自于任何能产生抗体的物种，优选是哺乳动物，，特别是人；可选择地，所感兴趣免疫球蛋白可以是来自于抗体氨基酸数据库的嵌合抗体或“共有区”结构或规范结构(参见，例如Kabat等，Jlmniuiiol 1991 Sep 1；147(5)：1709-19)。所感兴趣免疫球蛋白可以是野生型的免疫球蛋白(例如，从组织中分离出来的或者可以从组织中分离出来的免疫球蛋白，例如在哺乳动物，特别是人的合适的生理学样品(例如血，血清等)中存在的免疫球蛋白)。可选择地，所感兴趣免疫球蛋白可以是修饰的免疫球蛋白(例如向已知的野生型免疫球蛋白的一个或多个可变区和/或恒定区中引入突变)。在另一个实施方案中，所感兴趣免疫球蛋白可以是合成的免疫球蛋白(例如用重组DNA方法制备的，而不是从组织中分离出来的)。在优选的实施方案中，所感兴趣免疫球蛋白是人免疫球蛋白。

在本发明的一个实施方案中，所感兴趣免疫球蛋白是一种催化性抗体。免疫球蛋白可以是催化性的，或者可以通过本文所述的方法向免疫球蛋白的可变区域(Fv区域)的结合位点引入合适的氨基酸使其催化活性得到提高。例如，可以在抗体的Fv区域的高度可变区段生成模仿丝氨酸蛋白酶的催化三联体，并对其蛋白水解活性进行筛选。具有代表性的催化性抗体包括氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶和连接酶；这一类别包括蛋白酶，糖酶，脂肪酶，加双氧酶和过氧化物酶，以及其它酶。这些酶和其它酶可以用于卫生保健，化妆品，食品，酿造，洗涤剂，环境(例如废水处理)，农业，制革，纺织品以及其它化学过程，例如诊断和治疗，脂肪、碳水化合物和蛋白的转化，有机污染物的降解和化学物质的合成领域中的酶催化的转化。例如，可以制备具有溶解血纤维蛋白活性的，或者具有抵抗感染所必需的病毒结构，例如病毒胞衣蛋白的活性的治疗有效的蛋白酶。这样的蛋白酶可用于抗血栓形成试剂或者可抵抗病毒例如AIDS，鼻病毒，流感病毒或肝炎病毒的抗病毒试剂。可选择地，在另一个实施例中，加氧酶(例如双加氧酶)，一类在进行芳香环或其它双键的氧化时需要辅因子的酶，在工业上可用于生物制浆过程，将生物物质转化为燃料或其它化学物质，废水污染物的转化，煤的生物处理，和危险有机化合物的解毒。

本发明的文库涉及所感兴趣的单个原型免疫球蛋白。所述的“原型”免疫球蛋白是所有下述突变免疫球蛋白的基础免疫球蛋白(或者上述的Fab片段)。

                 步移法突变

要制备本发明的文库，可以对原型免疫球蛋白进行“步移法突变”。步移法突变在美国专利5,830,650和5,798,208中有详细描述，在此引入其全文作为参考。虽然在除免疫球蛋白之外的其它蛋白和多肽中同样也可以使用步移法突变，但本文中所述的是所感兴趣免疫球蛋白的突变。

在步移法突变中，在免疫球蛋白的感兴趣的预定区域(或者几个预定区域)的每个位点引入单个预定氨基酸至少一次(即向免疫球蛋白的一个或多个高度可变环(CDR)中引入)，从而产生一组(文库)免疫球蛋白。得到的免疫球蛋白(这里称为“突变免疫球蛋白”)与原型不同，它们是将单个预定氨基酸引入免疫球蛋白的一个或多个CDR中的一个或多个位点，而在“天然”或是“野生型”中氨基酸与原型免疫球蛋白中相同位点的氨基酸相同。突变的免疫球蛋白组包括单个突变免疫球蛋白，其中所感兴趣的预定区域的每个位点上都有单个突变免疫球蛋白；因此，每个突变免疫球蛋白在所感兴趣的预定区域(例如CDR)的每个位点都具有原型免疫球蛋白中具有的氨基酸，或者是预定氨基酸，所有突变免疫球蛋白的混合物包含所有可能的变体。

预定氨基酸可以是天然存在的氨基酸。二十个天然存在的氨基酸彼此的差别仅在于它们的侧链不同。每条侧链对化学性质都有影响，使得每个氨基酸的性质都是唯一的(参见，例如，Principles of Protein Structure，1988，by G.E.Schulz和R.M.Schirner，Springer-Verlag)。典型的极性和中性侧链是Cys，Ser，Thr，Asn，Gln和Tyr的侧链。Gly也可以看作是这一组中的边界成员。Ser和Thr对氢键的形成起着重要作用。Thr在碳原子处具有不对称性，因此只有一种立体异构体可以使用。氨基酸G1n和Asn也可以形成氢键，氨基基团作为氢供体，羰基基团作为受体。Gln比Asn多一个CH2基团，这使得其极性基团更具柔性，并且减少了和主链之间的相互作用。Tyr具有一个极性很强的羟基(酚的OH)，因此在高pH值的时候可以解离。Tyr有点类似带有电荷的侧链；其氢键非常稳固。

在蛋白质分子的表面和内部都具有中性极性酸。内部残基常常在彼此之间或者与多肽骨架之间形成氢键。Cys可以形成二硫桥键。组氨酸(His)具有一个杂环的芳香环侧链，其pK值为6.0。在生理pH范围内，在从溶液中摄取了一个氢离子以后，它的咪唑环可以是不带电荷的或者是带电荷的。由于这两种状态都是稳定可存在的，His对于催化性化学反应非常有用，存在于许多酶的活性中心处。

Asp和Glu在生理pH下是带负电荷的。由于它们的侧链较短，Asp的羧基基团比其主链更具刚性；这可以解释为何许多催化位点的羧基基团都是由Asp而不是Glu提供的。带电荷的酸通常存在于蛋白表面。

Lys和Arg通常存在于表面。它们具有长的并且具柔性的侧链。在溶液中是不稳定的，它们促进了蛋白质球的溶解。在某些情况下，Lys和Arg参与形成内部盐桥，或者它们可帮助进行催化。由于它们暴露在蛋白质表面，Lys是一种较常受到酶攻击的残基，酶的作用可改变侧链或者切割Lys残基羰基末端处的肽链。

使用步移法突变，可以制备编码每个突变免疫球蛋白的一组核苷酸(例如cDNA)。在一个实施方案中，编码突变免疫球蛋白的核苷酸可以通过将编码非步移法突变靶定的免疫球蛋白区域(例如恒定区)的核苷酸序列和编码步移法靶定的免疫球蛋白区域(例如CDR)的核苷酸序列连接起来制备获得。例如，在一个实施方案中，编码突变免疫球蛋白的核苷酸可以通过将编码免疫球蛋白恒定区的核苷酸序列与编码可变区域的核苷酸序列连接起来制备获得。可选择地，在另一个实施例中，编码突变免疫球蛋白的核苷酸可以通过将编码恒定区的核苷酸序列，编码部分在步移法突变中不改变的可变区域的核苷酸序列(例如在CDR之外的寡核苷酸)，和编码CDR的核苷酸序列(例如含有编码预定氨基酸的核苷酸的寡核苷酸)连接起来制备获得。在另一个实施方案中，编码CDR的核苷酸序列(例如含有编码预定氨基酸的核苷酸的寡核苷酸)可以单独被插入到编码原型免疫球蛋白的核苷酸中，以取代编码高度可变环(CDR)氨基酸序列的核苷酸序列。如果需要的话，编码CDR的核苷酸序列可以含有侧翼的限制性酶识别位点(参见，例如美国专利No.4,888,286)，或者可以使用天然存在的限制酶识别位点。然后可以通过将其克隆至合适的限制性酶位点引入寡核苷酸混合物。

例如，可以制备寡核苷酸混合物，其中每一个寡核苷酸都编码原型免疫球蛋白的一个CDR(或者原型免疫球蛋白的一部分CDR)，或者用编码预定氨基酸的核苷酸代替CDR中的一个或多个天然氨基酸。寡核苷酸混合物可以通过合成产生，其中在寡核苷酸的每个位点引入合成原型球蛋白中存在的氨基酸所需的核苷酸或者(替换该核苷酸)预定氨基酸的密码子所需的合适的核苷酸。寡核苷酸混合物的合成可以通过自动DNA合成仪进行，其中DNA合成仪程序设定为将一种核苷酸送入到反应室中(例如在原型免疫球蛋白的编码CDR的核苷酸位点处的核苷酸)，或者将一种不同的核苷酸递送入反应室中(在原型球蛋白的该位点处不存在的核苷酸)，或者送入两种核苷酸的混合物以产生不仅含有编码原型免疫球蛋白CDR的寡核苷酸，而且含有编码突变免疫球蛋白CDR的寡核苷酸的寡核苷酸混合物。

例如，总共10种试剂容器，其中的四个含有单个碱基，剩余的6个含有所有可能的4个碱基中的两个碱基的混合物，可用于合成步移法突变过程的任何寡核苷酸混合物。例如DNA合成仪可以设计为含有下述十个室：

表1：自动DNA合成的合成子

室	合成子
		1	A
2	T
		3	C
4	G
		5	(A+T)
6	(A+C)
		7	(A+G)
8	(T+C)
		9	(T+G)
10	(C+G)

利用这样的排布，在序列任何位点的任何核苷酸都可以被任何一种两个核苷酸的组合所取代。可选择地，如果可以在寡核苷酸合成仪的管子中进行单个碱基的混合，该仪器就可以通过编制程序从两个或多个纯碱基库中产生所需要的核苷酸比例。

在一个实施方案中，两种核苷酸(即野生型核苷酸和非野生型核苷酸)在反应中的浓度几乎相同，使在所述位点处将每一个核苷酸引入序列的机会相同。可选择地，两种核苷酸浓度的比例可以改变，以增加一种或另一种核苷酸引入寡核苷酸的可能性。浓度比例的改变(这里称为“掺加(doping)”)在美国专利申请序列号No.60/373,686，Attorney Docket No.1551.2002-000，其名称为“’Doping′in Walk-through Mutagenesis”，以及美国专利申请序列号No.＿/＿＿＿＿，Attorney Docket No.1551.2002-001，其名称为“’Doping′in Walk-through Mutagenesis”以及与该申请同时提交的文件中有更详细的描述；在此引入这些专利申请的全文作为参考。

在另一个实施方案中，可以使用固相-氰乙基亚磷酰胺化学方法代替自动DNA合成方法产生上述的寡核苷酸(参见美国专利4,725,677)。

可选择地，在另一个实施方案中，可以使用核糖体表达方法(参见，例如，Hanes和Pluckthun，″In vitro selection and evolutionof functional proteins by using ribosome display″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：4937-4942(1997)；Roberts和Szostak，″RNA-peptidefusions for the in vitro selection of peptides andproteins″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：12297-12302(1997)；Hanes等，″Picomolaraffinity antibodies from a fully synthetic naive library elected andevolved by ribosome display″，Nature Biochemistry 18：1287-1292(2000))。

如上所述，可以用这些寡核苷酸制备含有编码突变免疫球蛋白的核苷酸的文库，然后可以用标准方法从这些核苷酸产生含有突变免疫球蛋白的文库。例如，可以将编码突变免疫球蛋白的核苷酸引入宿主细胞进行表达(参见，例如，Huse，W.D.等，Science246：1275(1989)；Viera，J.等，Meula.Eyizynaol.153：3(1987))。例如，核苷酸可以在大肠杆菌表达系统中进行表达(参见，例如，Pluckthun，A.等Skerra，A.，Meth.Enzymol.178：476-515(1989)；Skerra，A.等，Biotechnology 9：23-278(1991))它们可以通过在培养基中和/或在细菌细胞质中分泌来进行表达(参见，例如，Better，M.等Horwitz，A.，Meth.Enzymol.178：476(1989))；可选择地，它们可以在别的组织例如酵母或哺乳动物细胞(例如骨髓瘤或杂交瘤细胞)中表达。

本领域普通技术人员应当了解，可以使用多种表达方法生成本文所述的文库。通过将所述基因(文库)与其它遗传元件，例如启动子，终止子，和其它有助于转录和翻译的合适序列融合，可以在体外进行表达(核糖体展示技术)，如Pluckthun等所述(Pluckthun，A.和Skerra，A.，Meth.Enzymol.178：476-515(1989))。类似地，可以进行噬菌体展示，细菌表达，杆状病毒感染的昆虫细胞，真菌(酵母)，植物和哺乳动物细胞表达(AntibodyEngineering.R.Konterman，S.Dubel(Eds.).Springer Lab manual.Spriger-Verlag.Berlin，Heidelberg(2001)，Chapter 1，″RecombinantAntibodies by S.Dubel和R.E.Kontennan.pp.4-16)。scFV文库也可以和其它基因融合以产生具有结合分子(Fv)和其它功能，例如催化，细胞毒性等等的嵌合蛋白(Antibody Engineering.R.KONTERMAN，S.Dubel(Eds.).Springer Lab manual.Spriger-Verlag.Berlin，Heidelberg(2001)，Chapter 41.StabilizationStrategies and Application of recombinant Fvs and Fv Fusionproteins.By U.Brinkmann，pp.593-615)。

                 通用文库的制备

要产生所感兴趣免疫球蛋白的文库，对原型免疫球蛋白进行单个预定氨基酸的步移法突变，得到含有编码突变免疫球蛋白(以及编码原型免疫球蛋白)的单个核苷酸文库。可以翻译核苷酸文库以生成含有突变免疫球蛋白的氨基酸文库(这里称为“单个预定氨基酸文库”)。每个单个预定氨基酸文库都含有64个子文库，其中预定的氨基酸在所感兴趣免疫球蛋白的每个高度可变环(CDR)(也就是重链可变区的三个高度可变环(VH1，VH2和VH3)，以及轻链可变区的三个高度可变环(VL1，VL2和VL3))上“步移”。所得到的免疫球蛋白包括在每个CDR的一个或多个位点具有预定氨基酸，总体上在每个CDR的每个位点都具有预定氨基酸的突变免疫球蛋白。单个预定氨基酸在六个高度可变环(CDR)的每一个上“步移”；然后在每种可能的CDR的组合变体(两个，三个，四个等等)上步移。可能的组合变化如表2所示。

      表2：每个单个预定氨基酸文库的子文库

子文库	高度可变区(CDR)的数目	文库的数目
			A	1	6(VH1，VH2，VH3，VL1，VL2或VL3)
B	2	15(所有可能的2个的组合)
			C	3	20(所有可能的3个的组合)
D	4	15(所有可能的4个的组合)
			E	5	6(所有可能的5个的组合)
F	6	1(VHI，VH2，VH3，VL1，VL2和VL3)

总共63个子文库。第64个子文库包括原型免疫球蛋白。

要制备所感兴趣原型免疫球蛋白的“通用”文库，对于二十个天然氨基酸中的每一个都要对原型免疫球蛋白进行单个预定氨基酸的步移法突变，得到20个“单个预定氨基酸文库”，如上所述。这些20个“单个预定氨基酸文库”总体形成所感兴趣免疫球蛋白的通用文库。

因此，总体上，所感兴趣免疫球蛋白通用文库包含20个(单个预定氨基酸)文库，其中每个文库都包含64个子文库，一共有1208个文库。

                   文库的使用

这里所说的文库含有可以对原型免疫球蛋白的结合区域，特别是可以对特定的预定氨基酸对结合区域影响进行系统分析和全面分析。所述文库避免了与任意突变所产生的突变体性质的控制和预测相关的问题；它可以为能改变所感兴趣免疫球蛋白与其抗体之间的相互作用的特定突变提供特定的信息，其中所述相互作用包括不同的互补决定区的氨基酸之间的多种相互作用。

可以用合适的方法对所述文库进行筛选以得到具有特定性质的特定免疫球蛋白。例如，可以通过合适的底物转换检测确定催化活性，可以通过标准免疫检测和/或亲和层析确定结合活性。也可以利用细胞需要所需的活性才能够生长的特点来设计这些活性的检测方法。例如，在筛选具有特定活性的免疫球蛋白，如降解毒性物质的能力的时候，将致死量的毒性物质加入到营养层中，使得只有表达出降解毒性化合物的活性的细胞才能够生长(Wasserfallen，A.，Rekik，M.，和Harayama，S.，Biotechnology 9：296-298(1991))。文库也可以用于筛选其它活性，例如靶定或破坏病原体的能力。这些活性的检测可以通过将所感兴趣的病原体暴露于抗体中，选择能证明所需性质(例如杀死病原体)的抗体。

与CDR区域中的特定氨基酸的效果相关的信息，不管是单个还是多个氨基酸取代，都可以提供有关给定氨基酸的特定效果，如和抗体和抗原之间的亲合力和特异性(抗体的成熟和最优化)的独特信息。

除此之外，在抗体(免疫球蛋白)分子的结合区域的特定氨基酸的富集提供了新的能够和各种新抗原相互作用的新序列(氨基酸域)，以便于发现抗体。

下述实施例之目的是举例说明本发明，而并非限制本发明的保护范围。在此引入所有引用文献的全文作为参考。

实施例

A材料与方法

下述实施例举例说明了通过步移法突变(WTM)进行的基因文库的合成，包括设计和合成通用氨基酸文库。这些文库的构建是基于人抗HIV GP120单克隆抗体的氨基酸序列，特别是它的Fv(VL和VH)区域，设计为单链(scFV)。GP-120单克隆抗体的VL和VH区域的氨基酸序列得自出版物公开的序列(AntibodyEngineering.R.KONTERMAN，S.Dubel(Eds.).Springer Labmanual.Spriger-Verlag.Berlin，Heidelberg(2001)，Chapter 1，″Recombinant Antibodies″by S.Dubel and R.E.Konterman.pp.4-16)。

图1A-1B显示了单链GP-120 Fv(scFv)的全序列。通过将VL基因的C末端至VH基因的N末端的序列人为地与编码合成肽(G4S)3(Huston，JS，Levinson D，Mudgett-Hunter M，Tai MS，Novotny J，Margulis MN，Ridge RJ，Bruccoleri RE，Haber EC，CreaR，和Opperman H，Protein engineering of antibody binding site：recovery of specinc activity in an anti-digioxin single-chain Fvanalogue produced in E.Coli.Proc Nat Acad Sci USA 85，5879-5883，1988；Bird RE，Hardman KD，Jacobson JW，Jonnson S，Kaufman BM，Lee SM，Pope SH，Riordan GS和Witlow M，Single-chain antigen binding proteins.Science 242，423-426，1988.)的DNA序列连接起来得到完整的DNA序列。用Kabat等所述的方法计算VL和VH氨基酸序列(Kabat EA，Wu TT，Reid-Miller M，Perry HM，Gottesman KS，Foeller C，(1991)Sequences of proteinsof Immunological Interest.5th Edition.US Department Of Healthand Human Services，Public Service，NIH.)。CDR区域(L1，L2，L3和H1，H2，H3)用大写表示。

将VL和VH的DNA序列重新设计为使用大肠杆菌中最常用的氨基酸密码子。而且，序列中包含有几种限制性酶切位点，以方便地进行限制性酶切分析。scFV基因序列中还含有5-粘性末端(Xbal，Hindis，和Sal I)和末端的两个密码子(TAA，TAG)以方便地用商业可获得的质粒进行克隆，测序和表达。

GP-120 scFV基因的总体装配方案由合成的寡核苷酸确定，显示在图2中。完整的装配包括独立装配的VL和VH基因的融合(连接)。这是通过使适当重叠的合成寡核苷酸进行酶催化反应(T4连接酶)得到的，如图4所示。通过制备性凝胶电泳分离VL和VH基因，并且进一步在存在连接酶的条件下在编码连接子(G4S)3的合成寡核苷酸(#174，175，177和189)的辅助下将它们连接起来，得到scFV构建体。

根据供应商提供的操作手册在Eppendorf D-300合成仪上进行寡核苷酸合成。每种寡核苷酸都通过凝胶电泳纯化，快速通过交联葡聚糖mini层析柱进行以脱盐，然后以5O.D./ml的浓度单独储存。

在标准条件下进行VL和VH基因的酶法连接(Maniatis等)，其中所有的VL和VH寡核苷酸，除了上链和下链的5’末端，首先用T4激酶磷酸化，然后在存在T4连接酶和ATP的条件下以等摩尔的浓度进行基因的装配。在存在过量(10x)的寡连接子的条件下将等摩尔的VL和VH连接起来以进行scFV的最终装配。最终的scFV首先在存在NTP和片段#201和#103的条件下用DNA聚合酶进行扩增，然后用制备性凝胶电泳纯化。

scFV基因的正确性通过DNA测序分析来证实，使用AppliedBiosystems自动DNA测序仪，根据供应商提供的标准方法操作。

要生成在scFV蛋白的某些CDR区域含有选定氨基酸的GP-120 scFv基因文库，应设计相应于靶CDR区域的合成寡核苷酸库，并且根据步移突变法的规则使用Eppendorf D300合成仪进行合成(如本文所述；参见美国专利5,830,650和5,798,208，在此引入其全文作为参考)。

图5显示了用于在Fv的单个CDR中以多种可能的组合引入三个靶核苷酸，SER，HIS和ASP的寡核苷酸库的示例。所述寡核苷酸库是通过在化学合成过程中将等量的活化核苷氨基磷酸酯混合起来得到的。图5中的库序列是用IUPAC混合碱基命名法给出的(用大写字母表示，R＝A或G，Y＝C或T，M＝A或C，K＝G或T，S＝C或G，W＝A或T；H＝A或C或T，B＝C或G或T，V＝A或C或G，D＝A或G或T)。

图6显示了为生成GP-120 scFV文库所采用的VL和VH基因装配策略，其中六个CDR区域中的三个(3)同时进行突变以生成多种(8)不同组合(L1到L8)的所选定的单个氨基酸(Ser，His和Asp)。

图3显示了通过上述策略获得的scFV基因文库，以及每个单个文库中基因变体的数目。

单个的scFV文库可以克隆到合适的测序和/或表达质粒中。相应地也可以进行测序分析和基因表达。在此实施例中，使用pFLAG作为测序质粒，用质粒pCANTAB 5E在大肠杆菌中表达scFV基因文库(胞质间间隙)。

B.通用氨基酸文库的设计和合成。

使用上述方法，六个CDR的每一个都可以设计20个单个的寡核苷酸库，其中每个寡核苷酸库都相应于20个天然氨基酸中的一个，如图7-12所示。根据这些寡核苷酸库，相应于每个选定氨基酸(20个天然氨基酸中的任何一个)的六个(6)库都可以以任何可能的组合排布对进行scFV基因的相应CDR区域进行诱变。

图13显示了单个氨基酸的CDR库的分组。这六个库可以以任何组合方式使用，从单个的CDR替换(六个单个文库)到全饱和(全部六个CDR区域都进行了突变)，以及其中的任意组合，如上所述。

所得到文库中的每一个(全部文库加上一个野生型序列共63个)都可以仅仅含有用于提供选定氨基酸的寡核苷酸库，从而在scFv基因的六个CDR区域中形成系统的分布，如上所述。通过这种合成方案得到的基因文库普遍含有一个选定的氨基酸，所述氨基酸在六个CDR区域中以任意组合方式分布，该文库可以作为一个整体，也可以是分离的文库。

虽然本发明描述了具体细节，并且描述了优选的实施方案，但是本领域技术人员应当理解，形式上和细节上的变化都不背离由权利要求所定义的本发明的精神和保护范围。

Claims (20)

1.一种所感兴趣的原型免疫球蛋白文库，包括突变的所感兴趣免疫球蛋白，其中单个预定氨基酸在所感兴趣免疫球蛋白的一个或多个互补决定区的一个或多个位点被取代，所述文库包括子文库，所述文库包括：

a)含有所感兴趣原型球蛋白的子文库，

b)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中一个的一个或多个位点处被取代，六个互补决定区中的每个都有一个子文库，因而总共有6个子文库；

c)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中两个的一个或多个位点处被取代，每种可能的六个互补决定区中的两个的组合都有一个子文库，因而总共有15个子文库；

d)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中三个的一个或多个位点处被取代，每种可能的六个互补决定区中的三个的组合都有一个子文库，因而总共有20个子文库；

e)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中四个的一个或多个位点处被取代，每种可能的六个互补决定区中的四个的组合都有一个子文库，因而总共有15个子文库；

f)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中五个的一个或多个位点处被取代，每种可能的六个互补决定区中的五个的组合都有一个子文库，因而总共有6个子文库；

g)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的全部六个互补决定区的一个或多个位点处被取代，

其中每个含有突变免疫球蛋白的子文库，都含有其中预定氨基酸在所述预定氨基酸被引入的互补决定区的每个位点都存在至少一次的突变免疫球蛋白。

2.权利要求1的文库，其中所述所感兴趣免疫球蛋白是催化性抗体。

3.权利要求1的文库，其中所述所感兴趣免疫球蛋白是IgG。

4.权利要求1的文库，其中所述所感兴趣免疫球蛋白是IgM。

5.权利要求1的文库，其中所述所感兴趣免疫球蛋白是IgA。

6.权利要求1的文库，其中所述所感兴趣免疫球蛋白是IgD。

7.权利要求1的文库，其中所述所感兴趣免疫球蛋白是IgE。

8.权利要求1的文库，其中所述所感兴趣免疫球蛋白是免疫球蛋白的一个Fab片段。

9.权利要求1的文库，其中所述感兴趣免疫球蛋白是一种单链免疫球蛋白。

10.一种所感兴趣的原型免疫球蛋白的通用文库，包括：

二十个单个的预定氨基酸文库，该文库由二十个天然存在的氨基酸中每一个氨基酸的单个预定氨基酸文库组成，其中每个单个预定氨基酸文库都包括突变的所感兴趣免疫球蛋白，其中单个预定氨基酸用步移法突变引入到突变免疫球蛋白的一个或多个位点处，其中每个单个预定氨基酸文库都含有一组子文库，所述含有子文库的文库包括：

a)含有所感兴趣的原型球蛋白的子文库，

b)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中一个的一个或多个位点处被取代，六个互补决定区中的每个都有一个子文库，因而总共有6个子文库；

c)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中两个的一个或多个位点处被取代，每种可能的六个互补决定区中的两个的组合都有一个子文库，因而总共有15个子文库；

d)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中三个的一个或多个位点处被取代，每种可能的六个互补决定区中的三个的组合都有一个子文库，因而总共有20个子文库；

e)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中四个的一个或多个位点处被替换，每种可能的六个互补决定区中的四个的组合都有一个子文库，因而总共有15个子文库；

f)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中五个的一个或多个位点处被取代，每种可能的六个互补决定区中的五个的组合都有一个子文库，因而总共有6个子文库；

g)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的所有六个互补决定区的一个或多个位点处被取代，

其中每个含有突变免疫球蛋白的子文库，都含有其中预定氨基酸在所述预定氨基酸被引入的互补决定区的每个位点都存在至少一次的突变免疫球蛋白。

11.一种所感兴趣的原型免疫球蛋白文库，包括编码突变的所感兴趣的免疫球蛋白的核苷酸，其中单个预定氨基酸在所感兴趣免疫球蛋白的一个或多个互补决定区的一个或多个位点被取代，所述文库含有子文库，所述文库包括：

a)含有所感兴趣的原型球蛋白的子文库，

b)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中一个的一个或多个位点处被取代，六个互补决定区中的每个都有一个子文库，因而总共有6个子文库；

c)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中两个的一个或多个位点处被取代，每种可能的六个互补决定区中的两个的组合都有一个子文库，因而总共有15个子文库；

d)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中三个的一个或多个位点处被取代，每种可能的六个互补决定区中的三个的组合都有一个子文库，因而总共有20个子文库；

e)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中四个的一个或多个位点处被取代，每种可能的六个互补决定区中的四个的组合都有一个子文库，因而总共有15个子文库；

f)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中五个的一个或多个位点处被取代，每种可能的六个互补决定区中的五个的组合都有一个子文库，因而总共有6个子文库；

g)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的所有六个互补决定区的一个或多个位点处被取代，

其中每个含有突变免疫球蛋白的子文库，都含有其中预定氨基酸在所述预定氨基酸被引入的互补决定区的每个位点都存在至少一次的突变免疫球蛋白。

12.权利要求11的文库，其中所述所感兴趣免疫球蛋白是一种催化性抗体。

13.权利要求11的文库，其中所述所感兴趣免疫球蛋白是IgG。

14.权利要求11的文库，其中所述所感兴趣免疫球蛋白是IgM。

15.权利要求11的文库，其中所述所感兴趣免疫球蛋白是IgA。

16.权利要求11的文库，其中所述所感兴趣免疫球蛋白是IgD。

17.权利要求11的文库，其中所述所感兴趣免疫球蛋白是IgE。

18.权利要求11的文库，其中所述所感兴趣免疫球蛋白是一种免疫球蛋白的一个Fab片段。

19.权利要求11的文库，其中所述所感兴趣免疫球蛋白是一种单链免疫球蛋白。

20.一种所感兴趣的原型免疫球蛋白的通用文库，包括：

二十个单个预定氨基酸文库，所述文库由二十个天然存在的氨基酸中每一个的单个预定氨基酸文库组成，其中每个单个预定氨基酸文库都含有编码突变的所感兴趣免疫球蛋白的核苷酸，其中单个预定氨基酸用步移法突变引入到突变免疫球蛋白的一个或多个位点处，其中每个单个预定氨基酸文库都含有一组子文库，所述含有子文库的文库包括：

a)含有所感兴趣的原型球蛋白的子文库，

b)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中一个的一个或多个位点处被取代，六个互补决定区中的每个都有一个子文库，因而总共有6个子文库；

c)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中两个的一个或多个位点处被取代，每种可能的六个互补决定区中的两个的组合都有一个子文库，因而总共有15个子文库；

d)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中三个的一个或多个位点处被取代，每种可能的六个互补决定区中的三个的组合都有一个子文库，因而总共有20个子文库；

e)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中四个的一个或多个位点处被取代，每种可能的六个互补决定区中的四个的组合都有一个子文库，因而总共有15个子文库；

f)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中五个的一个或多个位点处被取代，每种可能的六个互补决定区中的五个的组合都有一个子文库，因而总共有6个子文库；

g)含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的所有六个互补决定区的一个或多个位点处被取代，

其中每个含有突变免疫球蛋白的子文库，都含有其中预定氨基酸在所述预定氨基酸被引入的互补决定区的每个位点都存在至少一次的突变免疫球蛋白。

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