CN1650008A

CN1650008A - 源于藻类的启动子,内含和终止子

Info

Publication number: CN1650008A
Application number: CNA038095807A
Authority: CN
Inventors: 福田觉; 嵯峨直恒; 大场利治; 长岛佐和子; 高桥秀一; 浅田起代藏; 加藤郁之进
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2002-02-28
Filing date: 2003-02-26
Publication date: 2005-08-03
Anticipated expiration: 2023-02-26
Also published as: DE60320382D1; WO2003072775A1; EP1477560A4; EP1477560B1; EP1477560A1; KR20040089604A; US20060234368A1; CN100430475C; AU2003211719A1; JPWO2003072775A1; ATE392472T1; US7449568B2

Abstract

能够利用其在藻类中有效表达有用的外源基因，并因此能够利用遗传工程技术用于藻类育种的启动子，内含子和终止子。

Description

源于藻类的启动子，内含子和终止子

技术领域

本发明涉及用于基因表达的启动子和载体，所述启动子和载体被用于通过遗传工程技术进行藻类育种，并且利用藻类细胞进行工业生产。

背景技术

传统上，具有工业用途的藻类的获得取决于藻类的采集和筛选。另外，业已尝试过通过杂交育种技术将藻类变得更有用。不过，杂交和选择需要长的培养时间和大量劳动力，并且没有产生显著效果。

业已经常利用遗传工程技术对陆生植物进行修饰，并且产生了某些成功的结果。另一方面，对于海洋巨藻类(macroalgae)，尚没有利用遗传工程技术或甚至转移的基因的表达进行修饰的成功例子。

适合要使用的宿主的启动子，对于基因的体内表达来说是必不可少的。因此，如果要在藻类中表达基因，能在所述藻类中起作用的启动子是必不可少的。不过，迄今为止还没有源于藻类的已知启动子。因此，一直不能在藻类中表达基因。

发明目的

本发明是鉴于上述现有技术完成的。本发明的主要目的是提供可用于在藻类中有效表达有用的外源基因，并且可用于通过遗传工程技术进行藻类育种的启动子，内含子和终止子。

发明概述

深入研究的结果是，本发明人业已发现两种延伸因子(EF)基因是以高水平在其生命周期的所有阶段表达的，这一结论是对来自通常被用作食品的条斑紫菜(Porphyra yezoensis Ueda)的基因进行分析的结果。然后，本发明人业已分离了所述基因的5′上游区，并且发现它们具有启动子活性。另外，本发明人业已揭示了所述EF基因之一的以前未知的基因组序列。本发明人业已在所述基因组序列中发现了内含子序列和终止子序列，并且表明这些序列具有提高转移的基因的表达效率的活性。因此，完成了本发明。

本发明说明如下。本发明的第一方面涉及在藻类中具有启动子活性的分离的DNA，它选自下面的(a)-(c)：

(a)具有SEQ ID NO：9或它的一部分的核苷酸序列的DNA；

(b)能够在严格条件下与(a)的DNA或它的互补链杂交的DNA；和

(c)具有这样的核苷酸序列的DNA：其中，在(a)的DNA上取代，缺失，插入或添加了一个或多个核苷酸。

本发明的第二方面涉及具有在藻类中提高基因的转录效率的活性的分离的DNA，它选自下面的(d)-(f)：

(d)具有SEQ ID NO：10或它的一部分的核苷酸序列的DNA；

(e)能够在严格条件下与(d)的DNA或它的互补链杂交的DNA；和

(f)具有这样的核苷酸序列的DNA：其中，在(d)的DNA上取代，缺失，插入或添加了一个或多个核苷酸。

本发明的第三方面涉及在藻类中具有启动子活性的分离的DNA，它具有第一方面的分离的DNA和第二方面的DNA，所述第二方面的DNA位于第一方面的分离的DNA下游，与其相邻或与其相隔一个1-10000个核苷酸的DNA片段。根据第三方面，所述分离的DNA的例子是具有SEQ ID NO：3的87-1367号位置上的核苷酸序列的DNA。

本发明的第四方面涉及在藻类中具有终止子活性的分离的DNA，它选自下面的(g)-(i)：：

(g)具有SEQ ID NO：11或它的一部分的核苷酸序列的DNA；

(h)能够在严格条件下与(g)的DNA或它的互补链杂交的DNA；和

(i)具有这样的核苷酸序列的DNA：其中，在(g)的DNA上取代，缺失，插入或添加了一个或多个核苷酸。

本发明的第五方面涉及在其中将目的基因与所述第一-第四方面的任意一种DNAs连接，以便所述基因能够表达的重组DNA。根据第五方面，所述目的基因的例子有蛋白一编码核酸，反义核酸-编码核酸，诱饵(decoy)-编码核酸或核糖酶-编码核酸。

本发明的第六方面涉及包括所述第一-第五方面的DNAs中任意一个的载体。根据第六方面，所述载体可以是质粒载体或病毒载体。

本发明的第七方面涉及转入了第五方面DNA的，或用第六方面的载体转化过的藻类。

本发明的第八方面涉及编码具有延伸因子活性的多肽的分离的DNA，它选自下面的(j)-(l)：

(j)具有SEQ ID NO：1或它的一部分的核苷酸序列的DNA；

(k)能够在严格条件下与(j)的DNA或它的互补链杂交的DNA；和

(l)具有这样的核苷酸序列的DNA：其中，在(j)的DNA上取代，缺失，插入或添加了一个或多个核苷酸。

本发明的第九方面涉及编码具有延伸因子活性的多肽的分离的DNA，它选自下面的(m)-(o)：

(m)具有SEQ ID NO：2或它的一部分的核苷酸序列的DNA；

(n)能够在严格条件下与(m)的DNA或它的互补链杂交的DNA；和

(o)具有这样的核苷酸序列的DNA：其中，在(m)的DNA上取代，缺失，插入或添加了一个或多个核苷酸。

使用本发明的具有启动子活性的DNA，具有提高转录效率的活性的DNA和/或具有终止子活性的DNA，提供了用于遗传工程藻类的载体。藻类的遗传工程开启了一条藻类育种的途径，并因此可以提供具有工业用途的新型藻类。

另外，本发明能够利用遗传工程技术生产来自藻类的具有延伸因子活性的多肽。

附图简述

图1表示A1基因的琼脂糖凝胶电泳的结果。

图2表示A2基因的琼脂糖凝胶电泳的结果。

图3表示20号克隆和47号克隆的Southern杂交的放射自显影图的结果

图4表示在载体p47GUS转移一周之后靛蓝染料在细胞中的积累，A：脱色之前；B：脱色七天之后。

本发明的详细说明

下面，将对本发明进行详细说明。

在本文中，″启动子″表示具有转录基因的功能，即，利用DNA作模板启动mRNA合成的功能的DNA。本发明的启动子不局限于上述功能。它可以包括位于转录起始位点(+1)上游20-30个碱基对，并且负责通过RNA酶启动从精确位点开始转录的功能的TATA盒或TATA盒-样区，或表达控制所必须的其他区。

在本文中，″启动子活性″表示在将连接在启动子下游的目的基因转入宿主，以便表达所述基因之后，在所述宿主(藻类)里面或外面生产目的基因产物的能力和功能。

启动子的存在或强度通常是通过启动子活性表示的，所述活性是这样测定的：将编码能方便地定量的蛋白的基因(报导基因)连接在所述启动子下游，以便所述基因能够表达，将所述构建体转入宿主，并且测定所述表达蛋白的量。如果人们观察到连接在所述启动子下游的目的基因的表达，就可以说所述启动子在它所转入的宿主内有活性。

在本文中，″内含子″表示存在于基因或它的转录物中的，并且不包括在该基因的最终的RNA产物中的序列。

内含子的核苷酸序列没有关于氨基酸序列的信息。如果将包含内含子序列的外源基因转入宿主，在某些场合下，可能提高转录效率，并且由所转入的基因编码的目的蛋白能够以高水平生产。例如，一种高等植物的例子是已知的(Tanaka，A.等，Nucleic Acids Res.，18(23)：6767-6770(1990))。

可以测定转录效率，例如，根据公知的方法测定转录的RNA的量，如Northern杂交方法或RT-PCR方法。

在本文中，″终止子″表示具有终止RNA转录的活性的因子。例如，可以通过诸如Northern杂交方法的公知方法测定转录的RNA的大小检查终止子的存在。

本发明的″藻类″没有具体限制。其例子包括任何属于真核生物的藻类，如红藻(例如，条斑紫菜)，褐藻(例如，海带(海带科的藻类)，裙带菜或Hizikia fusiforme)以及绿藻(例如，石莼(浒苔属的藻类))。

本发明的″目的基因″没有具体限制。其例子包括能够在藻类在表达的蛋白-编码核酸，反义RNA-编码核酸，诱饵-编码核酸和核糖酶-编码核酸。

″外源基因″不是与具有启动子活性的DNA天然功能性连接的，可以将本发明的具有提高转录效率的活性的DNA或具有终止子活性的DNA用于本发明。

可以在藻类中表达的蛋白-编码核酸的例子包括源于藻类的核酸，不过，并不局限于此。本发明的目的基因包括源于微生物(例如，细菌，酵母，放线菌，丝状真菌，子囊菌和担子菌类)，植物和动物，以及病毒的核酸，只要它们能够在藻类中表达。所述蛋白-编码核酸包括编码酶、受体、细胞因子、生长因子、参与基因表达或其控制的因子、以及结构蛋白的核酸，不过，这不是对本发明的限定。

本发明的具有启动子活性的DNA(以下称之为启动子)在藻类中具有启动子活性。其例子包括源于条斑紫菜的EF1-αA2基因的启动子，如具有SEQ ID NO：3的87-859号位置的核苷酸序列的DNA(即，SEQ ID NO：9的核苷酸序列)或包括它的一部分的DNA。本发明的启动子可以是SEQ ID NO：9的核苷酸序列上的任何DNA，只要它在藻类中具有启动子活性。

本发明的启动子还包括能够在严格条件下与所述DNA或它的互补链杂交，并且在藻类中具有启动子活性的DNA。杂交可以按照公知方法进行，如披露于以下文献中的方法T.Maniatis等(eds.)，Molecular cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，1989，Cold SpringHarbor Laboratory。所述严格条件的例子是，在65°℃下，在含有6xSSC(1xSSC：150mM氯化钠，15mM二水合柠檬酸三钠，pH 7.0)，0.5％SDS，5xDenhardt′s和100mg/ml鲱鱼精子DNA的溶液中，温育探针过夜。

另外，本发明的启动子包括具有这样的核苷酸序列的DNA，在所述DNA上取代、缺失、插入或添加了一个或多个核苷酸，并且在藻类中具有启动子活性。

可以在藻类中表达目的基因，包括将重组DNA转入所述藻类，其中，所述目的基因连接在本发明的启动子的下游，以便所述基因可以表达。这样能够利用遗传工程技术进行藻类育种，和利用藻类作宿主生产有用物质等。

在藻类中具有提高转录效率的活性的本发明的DNA的例子是来自条斑紫菜的EF1-αA2基因的内含子，如具有SEQ ID NO：3的878-1331号位置的核苷酸序列的DNA(即，SEQ ID NO：10的核苷酸序列)或包括它的一部分的DNA。本发明的DNA可以是SEQ ID NO：10的核苷酸序列上的任何DNA，只要它在藻类中具有提高转录效率的活性。

本发明的DNA还包括能够在严格条件下与所述DNA片段或它的互补链杂交，并且在藻类中具有提高转录效率的活性的DNA。杂交条件的例子如上文所述。

另外，本发明的具有提高转录效率的活性的DNAs包括具有这样的核苷酸序列的DNA：在所述DNA上取代、缺失、插入或添加了一个或多个核苷酸，并且在藻类中具有提高转录效率的活性。

可以进一步将在本发明的藻类中具有提高转录效率的活性的DNA插入重组DNA的合适位点，其中，所述目的基因与本发明的具有启动子活性的上述DNA连接，以便所述基因能够表达。例如，所述合适的位点位于具有启动子活性的DNA下游，与其相邻或者与其间隔具有1-10000个核苷酸的DNA片段。

本发明的具有终止子活性的DNA(以下称之为终止子)是在藻类中具有终止子活性的DNA。其例子包括来自条斑紫菜的EF1-αA2基因的终止子，如具有SEQ ID NO：3的2718-3764号位置的核苷酸序列的DNA(即，SEQ ID NO：11的核苷酸序列)或包括它的一部分的DNA。本发明的启动子可以是SEQ ID NO：11的核苷酸序列上的任何DNA。

本发明的终止子还包括能够在严格条件下与所述DNA片段或它的互补链杂交，并且在藻类中具有启动子活性的DNA。杂交条件以上述条件为例。

另外，本发明的终止子包括具有这样的核苷酸序列的DNA：在所述DNA上取代、缺失、插入或添加了一个或多个核苷酸，并且在藻类中具有终止子活性。

还可以通过进一步将本发明的具有终止子活性的片段连接在重组DNA下游而提高目的基因的表达效率，其中，所述目的基因与本发明具有启动子活性的上述DNA连接，以便所述基因能够表达。还可以通过任选进一步将基因的具有提高转录效率的活性的DNA整合到本发明的藻类中，进一步提高所述目的基因的表达效率。

本发明的编码具有延伸因子活性的多肽的DNA(以下称之为EF基因)的例子是具有SEQ ID NO：1或它的一部分的核苷酸序列的DNA，具有SEQ ID NO：2或它的一部分的核苷酸序列的DNA，具有SEQ ID NO：3或它的一部分的核苷酸序列的DNA，或编码具有SEQ ID NO：8或它的一部分的氨基酸序列的多肽的DNA。本发明的EF基因的优选例子包括，具有SEQ ID NO：1的79-1425号位置的核苷酸序列DNA，和具有SEQ ID NO：2的65-1401号位置的核苷酸序列DNA，以及具有SEQ IDNO：3的1368-2714号位置的核苷酸序列DNA。另外，它可以是编码SEQ ID NO：8的氨基酸序列上的任何多肽的DNA。

本发明的DNA还包括能够在严格条件下与所述DNA片段或它的互补链杂交，并且编码具有EF活性的多肽的DNA。杂交条件以上述条件为例。

另外，本发明的编码具有EF活性的多肽的DNAs包括具有这样的核苷酸序列的DNA：在所述DNA上取代、缺失、插入或添加了一个或多个核苷酸，并且编码具有EF活性的多肽。

能够在严格条件下与上述DNA片段或它的互补链杂交的DNA，或具有这样的核苷酸序列的DNA：在上述DNA序列上取代、缺失、插入或添加了一个或多个核苷酸的例子是与上述DNA具有例如90％或更高，优选95％或更高，更优选超过97％的同源性的DNA。

例如，EF活性可以按照披露于以下文献中的方法进行：Shalak，V.F.等，Ukr.Biokhim.Zh.，69：104-109(1997)。

本发明的在其中将目的基因与所述启动子连接的重组DNA，在藻类中具有提高转录效率的活性的DNA，或具有终止子活性的DNA或它们的组合，可以在有或者没有载体的介导作用下转入藻类，以便所述基因能够表达。可以优选将质粒载体或病毒载体用作载体。

对于要转入DNA的藻类的形态学没有特定限制。可以使用具有任何形态学的藻类，如丝状原植体，孢子，叶状原植体，培养的细胞或原生质体。

对于用于将DNA转入藻类的方法没有具体限制。可以使用诸如粒子枪介导的转移方法的公知方法。

例如，本发明的启动子可以按照以下方法从条斑紫菜中分离。

条斑紫菜是属于红藻门，红藻纲，Protoflorideophycidae亚纲，红毛菜目，红毛菜科的藻类。它天然生长在日本的北海道西南部和本州的北部，以及朝鲜半岛周围。

条斑紫菜是通常被作为食品食用、大量养殖、并且普遍投放的市场上的藻类。可以将从海洋中收获的天然生长的藻类，养殖的藻类或通过商业渠道获得的藻类用于本发明。还可以按照公知方法建立的品系用于本发明(Kuwano，K.等，Plant Sci.，116(1)：117-124(1996))。

<选择用于分离启动子的侯选基因>

为了寻找用于高水平表达外源基因的启动子，必须寻找能够在作为宿主的藻类中高水平表达的基，分离它的基因组序列，并且分析其结构。

条斑紫菜的表达序列标记(ESTs)的序列由Kazusa DNA ResearchInstitute的主页向公众提供( http： //www.kazusa.or.jp/en/plant/porphyra/EST/)。

为了获得序列信息，进行EST簇分析，例如，使用PARACELCLUSTERING PACKAGE软件(Paracel)。作为簇分析的结果，确定大量EST序列属于相同簇的基因被认为可能以高水平表达。因此，所述基因的启动子可以作为要分离的侯选序列。

例如，可以选择两个这样的基因，条斑紫菜延伸因子EF1-αA1基因和条斑紫菜延伸因子EF1-αA2基因(以下分别称之为A1基因A2基因)，并且，用作分离本发明启动子的材料。

侯选基因的cDNA可以克隆，用通过簇分析选择的侯选基因簇中所包含的EST序列，通过组装获得的共有序列，或它的一部分作探针。例如，可以根据通过组装属于A1基因的EST序列获得的共有序列设计引物，可以利用所述引物提高PCR扩增A1基因的片段，并且将所述片段用作探针。

用SEQ ID NO：1表示的A1基因的cDNA是按照上述本发明方法分离的新型侯选基因cDNAs的一个例子。

<检查基因是否能在藻类的生命周期中高水平表达>

可以检查基因是否能在藻类的生命周期中高水平表达，包括利用侯选基因的DNA序列作探针，通过Northern杂交，在藻类生命周期的各个阶段测定表达的mRNAs的量。

可以利用公知方法(例如，硫氰酸胍方法或苯酚/氯仿方法)从藻类组织中提取总RNA。可以将所提取的总RNA用于测定感兴趣的所表达的mRNA的量。

例如，可以利用改进的苯酚/氯仿方法，在其生命周期的以下阶段从藻类条斑紫菜中提取总RNAs，并且进行琼脂糖凝胶电泳，然后用侯选基因DNA作探针进行Northern杂交：

(1)具有未形成的单孢子的配子体阶段；

(2)具有形成的单孢子的配子体阶段；

(3)在单孢子形成之后配子体营养生长阶段；和

(4)丝状孢子体阶段。

另外，可以通过RT-PCR分析表达方式。在这种情况下，通过设计特异性引物，可以进行对家族基因进行更严格的区分的分析。

例如，侯选基因在上述阶段的表达水平，可以利用所述基因的cDNA的翻译区和非翻译区的引物进行RT-PCRs而测定，其中利用在各个阶段通过硫氰酸胍方法提取的总RNAs作模板，并且使用TaKaRa RNA PCR试剂盒Ver.2.1(Takara Shuzo)等。

因此，可以发现能够在藻类的各个阶段高水平表达的基因。

<克隆含有启动子的区>

可以分离按照上述方法筛选的在各个阶段高水平表达的基因的含有启动子的区，例如，通过筛选所述基因的基因组DNA的基因组文库。

可以利用使用基因组文库的噬斑杂交方法，使用基于公知序列的基因组DNA扩增未知序列的PCR方法等，克隆在藻类中以高水平表达的基因的启动子，不过，本发明不局限于此。

按照本发明方法分离的，含有如SEQ ID NO：3所示的新的延伸因子EF1-αA2基因的基因组DNA片段，是能够在所述各个阶段高水平表达的基因的例子。通过将A2基因(SEQ ID NO：3)与cDNA序列(SEQ ID NO：1)和通过簇分析获得的EST序列进行比较，以及转录因子检索，编码区检索和内含子-外显子检索，证实了所述序列包括启动子序列，内含子序列和终止子序列。

具体地讲，SEQ ID NO：3的核苷酸序列包括延伸因子EF1-αA2基因的完整的基因组序列。在所述序列上，从1368-2717号位置的核苷酸序列是A2多肽编码序列(包括所述终止密码子)，从878-1331号位置的核苷酸序列是第一个内含子的序列，从1-859号位置的核苷酸序列是启动子序列，从2718-3764号位置的核苷酸序列是终止子序列。

将SEQ ID NO：3的核苷酸序列与所述cDNA序列(SEQ ID NO：1)和通过簇分析获得的EST序列进行比较，揭示了A2基因的cDNA序列。该序列如SEQ ID NO：2所示。在该序列上，SEQ ID NO：3的核苷酸序列上所包含的区是EF1-αA2基因的外显子区。

按照本发明方法分离的启动子，是在藻类中具有启动子活性的DNA，并且可用于在藻类中表达目的基因。也可以将具有启动子活性并且能够在严格条件下与所述序列杂交的DNA，或者在序列上具有核苷酸的取代、缺失、插入或添加，以便不会破坏启动子活性的DNA用于上述目的。

按照本发明方法分离的终止子，是在藻类中具有终止子活性的DNA，并且可用于提高目的基因在藻类中的表达效率。另外，可以将具有终止子活性并且能够在严格条件下与所述序列杂交的DNA，或者在所述序列上具有核苷酸的取代、缺失、插入或添加，以便不会破坏终止子活性的DNA用于上述目的。

在高等植物中，已知通过使用包含用于转移的内含子序列的基因，能够提高转录效率，并且，在某些场合下，目的蛋白是由所述转移的基因高水平表达的。按照本发明方法分离的第一种内含子可用于提高要在藻类中表达的目的基因的转录效率。可以将能够在严格条件下与所述序列杂交的DNA，或者在所述序列上具有核苷酸的取代、缺失、插入或添加的DNA用于上述目的，只要它具有提高转录效率的活性。

按照本发明方法分离的外显子区，是编码来自藻类的新的延伸因子(EF)，EF1-αA2多肽的序列。可以利用遗传工程技术将该序列用于生产EF1-αA2多肽。另外，可以将所述序列用作筛选其他新的EF基因，特别是从藻类中筛选新的EF基因的探针或引物。

本文所披露的本发明的DNA可以按照上述方法分离。另外，可以根据本文所披露的序列信息通过化学方法合成。

根据本发明业已首次分离了在藻类中具有启动子活性的DNA。然后，所述分离使得能够在藻类中人工表达目的基因，迄今为止，这种表达是不可形的。另外，业已首次从藻类中分离了具有终止子活性和内含子的DNA。这样，现在可以提高目的基因在藻类中的表达效率。上述成果使得能够利用遗传工程技术在藻类中生产有用物质。另外，它使得能以利用遗传工程技术的效率进行藻类育种，而传统上必须依赖于效率很低的杂交。

根据本发明，业已首次从藻类中分离了新的延伸因子。因此，现在可以利用遗传工程技术，从藻类生产延伸因子，所述延伸因子只能从收获的或培养的藻类中获得。

实施例

以下实施例对本发明作进一步详细说明，但是，这种说明并不构成对本发明的限定。

实施例1：用各个阶段的条斑紫菜制备mRNAs

1.材料

使用来自条斑紫菜TU-1叶状配子体和丝状孢子体，所述条斑紫菜是由Kuwano，K.等建立的条斑紫菜纯系(Kuwano，K.等，Plant Sci.，116(1)：117-124(1996))。

2.培养条件

在15℃下，以光照10小时(光照体积为80μE/(m²·s)；冷白色荧光灯)和黑暗14小时的循环对叶状配子体进行培养，在装有ESL培养基(3.5％(w/v)SEALIFE粉末(Marine Tech)，1％(v/v)ESS₂)的1-1侧面分支的平底玻璃烧瓶(PYREX)中通气(通过过滤对空气进行消毒，0.12l/分钟)培养。

在25℃下，在装有ESL培养基的500-ml玻璃锥形烧瓶中，在光照条件下(光照体积为17μE/(m²·s)；冷白色荧光灯)，将丝状孢子体静止培养24小时。

3.提取总RNA

总RNAs是从以下阶段的条斑紫菜TU-1中提取的：在单孢子形成之前的1至2mm长的叶状配子体，2mm长的叶状配子体，业已对它进行了30分钟的单孢子释放诱导，1至2cm长的叶状配子体，和丝状孢子体。

总RNAs是按照披露于以下文献中的苯酚/氯仿方法提取的：Apt，K.E.等，Mol.Gen.Genet.，246(4)：455-464(1995)，对该方法进行了部分改进。

下面披露了用于从藻类中提取总RNA的方法。

在用纸巾除去水分之后，对培养的藻类进行称重。在液氮中用研钵和研棒将1.2g藻类研碎。用在液氮中预冷的勺子将研碎的藻类转移到装有16.8ml提取缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 8.0)，1.5MNaCl，20mM EDTA，20mM DTT(二硫苏糖醇)和2％CTAB(溴化十六烷基三甲基铵))的50-ml离心管中。在室温下使用摇床NR-1(TAITEC)以110rpm/分钟的速度混合该混合物15分钟。然后，添加等体积的氯仿，并且搅拌该混合物。

对该混合物进行离心，以便收集上层。将1/3体积的乙醇缓慢滴加到它里面，并且混合。对该混合物进行离心，以便除去主要由多糖组成的沉淀物。将等体积的氯仿添加到上清液中，并且搅拌。对该混合物进行离心，以便收集上清液。重复这一过程，直到上清液脱色。

收集上清液。将1/2体积的9M LiCl和1/100体积的β-巯基乙醇添加到上清液中。在-20℃下放置该混合物过夜。通过离心收集所得到的沉淀物，溶解在50μl的DEPC(焦碳酸二乙酯)-处理过的水中，并且用等体积的苯酚/氯仿(1∶1)提取。重复该提取方法，直到中间层消失。

收集上层。将1/10体积的3M乙酸钠和2体积的乙醇添加到所述上层中，并且混合。通过离心收集所得到的沉淀物，用75％乙醇漂洗，并且风干。

将所述沉淀物溶解在901的DEPC-处理过的水中。将1ml的ISOGEN(Wako Pure Chemical Industries)添加到其中。将该混合物在室温下静置5分钟。将0.2ml的氯仿添加到其中。在搅拌之后，将该混合物在室温下静置2-3分钟。

对该混合物进行离心，以便获得上清液。将0.5ml的异丙醇添加到其中。通过离心收集得到的沉淀物，用75％乙醇漂洗，风干，并且溶解在400μl的DEPC-处理过的水中。

另外，为了除去残余的多糖，将200μl的高盐沉淀溶液(1.2MNaCl，0.8M二水合柠檬酸三钠，pH不进行调整)和200μl的异丙醇添加到其中，并且对该混合物进行离心。得到的沉淀物用75％乙醇漂洗，风干，并且溶解在100μl的DEPC-处理过的水中。

用分光光度计UV-2002(Shimadzu)测定按照上述方法提取的总RNA的浓度和纯度。另外，在1.0％琼脂糖凝胶上对所述总RNA进行电泳，以便证实它没有被降解。

利用Oligotex^TM-dT30 super(Roche)，按照所附带的说明书的说明，从上面提取的总RNA中分离mRNA。

实施例2：条斑紫菜EST序列的簇分析

用于分析的条斑紫菜EST序列是从Kazusa DNA ResearchInstitute(http：//www.kazusa.or.jp/en/plant/porphyra/EST/)的主页上下载的。使用PARACEL CLUSTING PACKAGE(Paracel)，对所下载的共计10154种条斑紫菜EST序列进行序列簇分析。

结果，将8243种序列分成了1140个簇，而1911种序列不属于任何簇。

在下面的表1-4中示出了最大数量的序列所属的50个簇的簇IDs。人们认为，如果基因以越高的水平表达，属于该簇的序列数量(序列计数)就越大。

另外，利用BLAST程序，用通过组装属于各个簇的序列产生的重叠群的共有序列进行NCBI(国家生物技术信心中心)的核苷酸数据库(非冗余核酸的数据库)的同源性检索(http：//www.ncbi.nih.go/)(Altschul，S.F.等，Nucleic Acids Res.，25(17)：3389-3402(1997))。

在所述同源性检索结果中，将所观察到的具有最高命中得分的簇的重叠群的重叠群IDs，序列数量(序列计数)和GenBank获取号，连同编号一起在表1-4中示出。

表1.条斑紫菜EST序列的簇分析

编号	簇ID	序列计数	重叠群ID	GenBank获取号	得分	E值
编号	簇ID	序列计数	重叠群ID	GenBank获取号	得分	E值	1	145	687	3	X60733.1	220	8.00E-55
2	13	500	5	L26199.1	3495	0	1	145	687	3	X60733.1	220	8.00E-55
2	13	500	5	L26199.1	3495	0	3	0	394	3	X57263.1	163	8.00E-38
4	40	131	1	U65510.1	42	0.041	3	0	394	3	X57263.1	163	8.00E-38
4	40	131	1	U65510.1	42	0.041	5	17	113	B1	D10167.1	42	0.21
6	72	90	1	AC003030.1	42	0.47	5	17	113	B1	D10167.1	42	0.21
6	72	90	1	AC003030.1	42	0.47	7	16	80	1	NM_003654.1	48	0.006
8	107	76	1	M72894.1	48	0.005	7	16	80	1	NM_003654.1	48	0.006
8	107	76	1	M72894.1	48	0.005	9	261	75	1	AC006214.1	44	0.075
10	25	60	1	Y00545.1	42	0.11	9	261	75	1	AC006214.1	44	0.075
10	25	60	1	Y00545.1	42	0.11	11	284	58	2	Z79601.1	40	0.94
12	459	57	1	U77477.1	46	0.019	11	284	58	2	Z79601.1	40	0.94
12	459	57	1	U77477.1	46	0.019	13	38	49	1	AL009198.1	42	0.28
14	4	47	1	AJ012146.1	38	4.3	13	38	49	1	AL009198.1	42	0.28

表2.条斑紫菜EST序列的簇分析(续表1)

编号	簇ID	序列计数	重叠群ID	GenBank获取号	得分	E值
编号	簇ID	序列计数	重叠群ID	GenBank获取号	得分	E值	15	189	47	1	X62072.1	46	0.027
16	74	46	1	AC004476.1	48	0.002	15	189	47	1	X62072.1	46	0.027
16	74	46	1	AC004476.1	48	0.002	17	334	41	1	AB025619.1	44	0.052
18	120	40	1	AL008728.1	44	0.037	17	334	41	1	AB025619.1	44	0.052
18	120	40	1	AL008728.1	44	0.037	19	291	38	1	AF080121.1	488	E-135
20	350	38	2	D86993.1	40	0.94	19	291	38	1	AF080121.1	488	E-135
20	350	38	2	D86993.1	40	0.94	21	508	38	1	AC006213.1	42	0.18
22	5	37	1	M11779.1	42	0.28	21	508	38	1	AC006213.1	42	0.18
22	5	37	1	M11779.1	42	0.28	23	114	37	1	AF03486 3.1	40	0.96
24	401	35	1	AB025615.1	42	0.33	23	114	37	1	AF03486 3.1	40	0.96
24	401	35	1	AB025615.1	42	0.33	25	97	32	1	M88684.1	551	E-155
26	515	32	1	AL021707.2	42	0.32	25	97	32	1	M88684.1	551	E-155
26	515	32	1	AL021707.2	42	0.32	27	56	31	1	X97257.1	44	0.047
28	676	31	1	Z98747.1	42	0.2	27	56	31	1	X97257.1	44	0.047
28	676	31	1	Z98747.1	42	0.2	29	320	30	1	Z79702.1	40	0.98
30	369	30	1	D86051.1	58	2.00E-06	29	320	30	1	Z79702.1	40	0.98

表3.条斑紫菜EST序列的簇分析(续表2)

编号	簇ID	序列计数	重叠群ID	GenBank获取号	得分	E值
编号	簇ID	序列计数	重叠群ID	GenBank获取号	得分	E值	31	700	30	1	AB005232.1	44	0.043
32	9	29	1	U08844.1	1889	0	31	700	30	1	AB005232.1	44	0.043
32	9	29	1	U08844.1	1889	0	33	348	29	1	U58679.1	74	5.00E-11
34	812	29	1	AF071752.1	50	8.00E-04	33	348	29	1	U58679.1	74	5.00E-11
34	812	29	1	AF071752.1	50	8.00E-04	35	14	28	1	AC005615.1	42	0.62
36	251	28	1	AF064842.1	46	0.024	35	14	28	1	AC005615.1	42	0.62
36	251	28	1	AF064842.1	46	0.024	37	383	28	1	AJ012478.1	220	4.00E-55
38	806	28	1	AF117660.1	40	0.75	37	383	28	1	AJ012478.1	220	4.00E-55
38	806	28	1	AF117660.1	40	0.75	39	122	27	1	NM_003330.1	40	1
40	321	26	1	X61361.1	42	0.19	39	122	27	1	NM_003330.1	40	1
40	321	26	1	X61361.1	42	0.19	41	564	26	1	AB022100.1	40	0.83
42	132	25	1	AF055296.1	64	9.00E-08	41	564	26	1	AB022100.1	40	0.83
42	132	25	1	AF055296.1	64	9.00E-08	43	279	25	1	U13168.1	86	2.00E-14
44	382	25	1	M74056.1	42	0.32	43	279	25	1	U13168.1	86	2.00E-14
44	382	25	1	M74056.1	42	0.32	45	140	24	1	D38516.1	188	2.00E-45
46	451	24	1	X80345.1	593	E-167	45	140	24	1	D38516.1	188	2.00E-45

表4.条斑紫菜EST序列的簇分析(续表3)

编号	簇ID	序列计数	重叠群ID	GenBank获取号	得分	E值
编号	簇ID	序列计数	重叠群ID	GenBank获取号	得分	E值	47	672	24	1	Z97055.1	44	0.056
48	662	23	1	AP000133.1	40	0.67	47	672	24	1	Z97055.1	44	0.056
48	662	23	1	AP000133.1	40	0.67	49	34	22	1	D12631.1	74	6.00E-11
50	399	22	1	AC005288.1	42	0.29	49	34	22	1	D12631.1	74	6.00E-11

命中物的Genbank获取号的标题在表5-8中的命中名称栏目下示出。

表5.命中获取号的标题。

编号*	命中名称
编号*	命中名称	1	O.cuniculus的编码γ-非肌肉肌动蛋白的mRNA。
2	Porphyra leucosticta DNA片段。	1	O.cuniculus的编码γ-非肌肉肌动蛋白的mRNA。
2	Porphyra leucosticta DNA片段。	3	编码组蛋白H2B-IV的鸡基因。
4	深红红螺菌CO-诱导的加氢酶操纵子(cooM，cook，cooL，cooX，cooU，cooH)基因，铁硫蛋白(cooF)基因，一氧化碳脱氢酶(cooS)基因，一氧化碳脱氢酶辅助蛋白(cooC，cooT，cooJ)基因，推测的转录激活物(cooA)基因，烟酸-核苷酸焦磷酸化酶(nadC)基因，完整的cds，L-天冬氨酸加氧酶(nadB)基因，和烷基过氧化氢还原酶(ahpC)基因，部分cds.	3	编码组蛋白H2B-IV的鸡基因。
4		5	编码核糖体蛋白S15的鸡rig基因
6	智人19号染色体，重叠的粘粒R29828和F25496，完整序列.	5	编码核糖体蛋白S15的鸡rig基因
6	智人19号染色体，重叠的粘粒R29828和F25496，完整序列.	7	智人碳水化物(软骨素6/keratan)磺基转移酶1(CHST1)，mRNA.
8	大豆铁蛋白(SOF-H2)mRNA，部分cds.	7	智人碳水化物(软骨素6/keratan)磺基转移酶1(CHST1)，mRNA.
8	大豆铁蛋白(SOF-H2)mRNA，部分cds.	9	果蝇，染色体2L，36A7-36A13区，P1克隆DS04680和DS00592，完整序列.
10	编码调钙蛋白-敏感性腺苷酸环化酶的百日咳博德特氏菌cya基因	9	果蝇，染色体2L，36A7-36A13区，P1克隆DS04680和DS00592，完整序列.
10	编码调钙蛋白-敏感性腺苷酸环化酶的百日咳博德特氏菌cya基因	11	新秀丽线虫粘粒K09A9，完整的序列.
12	Oryctolagus cuniculus凝固因子VII mRNA，完整的cds.	11	新秀丽线虫粘粒K09A9，完整的序列.
12	Oryctolagus cuniculus凝固因子VII mRNA，完整的cds.	13	结核分支杆菌H37Rv完整的基因组；片段144/162.
14	绵羊cyp19基因，外显子4.	13	结核分支杆菌H37Rv完整的基因组；片段144/162.

*：表5中的编号与表1中的编号相应

表6.命中获取号的标题(续1)

编号*	命中名称
编号*	命中名称	15	编码KdgR阻遏物的kdgR基因的菊欧文氏菌KdgR基因
16	智人染色体19，粘粒R29388，完整序列.	15	编码KdgR阻遏物的kdgR基因的菊欧文氏菌KdgR基因
16	智人染色体19，粘粒R29388，完整序列.	17	拟南芥基因组DNA，染色体5，P1克隆：MBA10.
18	来自染色体6q26-27上的克隆125N5的DNA序列。包括推测的新基因，ESTs，STSs和GSSs，完整序列.	17	拟南芥基因组DNA，染色体5，P1克隆：MBA10.
18	来自染色体6q26-27上的克隆125N5的DNA序列。包括推测的新基因，ESTs，STSs和GSSs，完整序列.	19	拟南芥BAC T25C13.
20	智人免疫球蛋白λ基因座DNA，克隆：23C6.	19	拟南芥BAC T25C13.
20	智人免疫球蛋白λ基因座DNA，克隆：23C6.	21	智人，克隆hRPK.15_A_1，完整序列.
22	猪钙蛋白酶I轻亚基mRNA，完整的cds.	21	智人，克隆hRPK.15_A_1，完整序列.
22	猪钙蛋白酶I轻亚基mRNA，完整的cds.	23	褐家鼠突触支架分子(S-SCAM)mRNA，完整的cds.
24	拟南芥基因组DNA，染色体3，TAC克隆：K5K13.	23	褐家鼠突触支架分子(S-SCAM)mRNA，完整的cds.
24	拟南芥基因组DNA，染色体3，TAC克隆：K5K13.	25	Aglaothamnion neglectum泛素mRNA，完整的cds.
26	来自染色体22q12-13上的克隆RP3-508115的DNA序列。包括编码GTPBP1(GTP结合蛋白1)的基因，两个新基因KIAA0063和KIAA0668，基于ESTs和cDNA的新基因，类似于AOP1(抗氧化剂蛋白1)的假基因，ESTs，STSs，GSSs，基因组标记D22S272，CA重复和CpG岛，完整序列.	25	Aglaothamnion neglectum泛素mRNA，完整的cds.
26		27	假狂犬病毒UL[5，6，7，8，8.5，9，10，11，12，13]基因.
28	来自染色体1p 36.2-36.3上的克隆37J18的人DNA序列。包括推测的新型基因，ESTs和GSSs，完整序列.	27	假狂犬病毒UL[5，6，7，8，8.5，9，10，11，12，13]基因.
28	来自染色体1p 36.2-36.3上的克隆37J18的人DNA序列。包括推测的新型基因，ESTs和GSSs，完整序列.	29	结核分支杆菌H37Rv的完整基因组；片段102/062.
30	编码碳酸酐酶的Porphyridium purpureum mRNA，完整的cds.	29	结核分支杆菌H37Rv的完整基因组；片段102/062.

*：表6中的编号与表2中的编号相应

表7.命中获取号的标题。(续2)

编号*	命中名称
编号*	命中名称	31	拟南芥基因组DNA，染色体5，P1克隆：MBG8.
32	紫菜延伸因子EF1-α(tef-c)mRNA.	31	拟南芥基因组DNA，染色体5，P1克隆：MBG8.
32	紫菜延伸因子EF1-α(tef-c)mRNA.	33	紫球藻捕获光能的复合体I多肽(Lhcal)mRNA，完整的cds.
34	粗糙链孢霉蛋白磷酸酶-Z-连接丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(pzl-1)mRNA，完整的cds.	33	紫球藻捕获光能的复合体I多肽(Lhcal)mRNA，完整的cds.
34	粗糙链孢霉蛋白磷酸酶-Z-连接丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(pzl-1)mRNA，完整的cds.	35	智人染色体19，粘粒R28058，完整序列。
36	来自顶部重复区的智人map 2q30-p32；202.6cR，完整序列。	35	智人染色体19，粘粒R28058，完整序列。
36	来自顶部重复区的智人map 2q30-p32；202.6cR，完整序列。	37	编码Ran蛋白的Salmo salar.
38	小麦S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶前体，mRNA，完整的cds.	37	编码Ran蛋白的Salmo salar.
38	小麦S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶前体，mRNA，完整的cds.	39	智人硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)，mRNA.
40	编码光合系统II的捕获光能的叶绿素a/b结合蛋白的E.gracilis基因	39	智人硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)，mRNA.
40	编码光合系统II的捕获光能的叶绿素a/b结合蛋白的E.gracilis基因	41	编码T-钙粘着蛋白的小鼠mRNA，完整的cds.
42	Zantedeschia aethiopica香叶基香叶基还原酶mRNA，部分cds.	41	编码T-钙粘着蛋白的小鼠mRNA，完整的cds.
42	Zantedeschia aethiopica香叶基香叶基还原酶mRNA，部分cds.	43	短杆菌肽YptC1(yptC1)基因，完整的cds.
44	黄色粘球菌蛋白U基因，完整的cds.	43	短杆菌肽YptC1(yptC1)基因，完整的cds.
44	黄色粘球菌蛋白U基因，完整的cds.	45	人Rab11B mRNA.
46	编码28S核糖体RNA的H.catenoides基因	45	人Rab11B mRNA.

*：No.表7中的编号与表3中的编号相应

表8.命中获取号的标题(续3)

编号*	命中名称
编号*	命中名称	47	来自染色体22上的克隆RP3-388M5的DNA序列。包括RPL4(60S核糖体蛋白4)假基因，编码高迁移型(非-组蛋白染色体)蛋白17-样1的HMG17L1基因，编码新型磺基转移酶(磺基激酶，EC 2.8.2.1)样蛋白的基因，编码GS2样蛋白的基因，ESTs，STSs，GSSs和4种推测的CpG岛，完整序列.
48	21q22.1的智人基因组DNA，GART和AML，f43D11-119B8区，片段8/10，完整序列.	47
48	21q22.1的智人基因组DNA，GART和AML，f43D11-119B8区，片段8/10，完整序列.	49	编码核糖体蛋白L7A的水稻mRNA，完整的cds.
50	智人染色体17，克隆hCIT.131_K_11，完整序列.	49	编码核糖体蛋白L7A的水稻mRNA，完整的cds.

*：No.表8中的编号与表4中的编号相应

对命中基因标题进行筛选，寻找对mRNA或cDNA(不是基因组序列或它的片段的克隆)的命中，或是包含紫菜属的命中。其结果是，发现了来自与条斑紫菜密切相关的生物的基因。

另外，通过筛选高水平表达的基因序列，在50个簇中发现了来自与条斑紫菜密切相关的生物的两种mRNA或cDNA序列，簇ID no.13(表1和5中的No.2)和簇ID no.9(表3和7中的No.32)。

两种mRNA或cDNA序列之一，簇ID no.13与18S rRNA高度同源。用簇ID no.9的重叠群1的共有序列进行同源性检索的结果是，发现了对紫菜延伸因子EF1-α(tef-c)mRNA(GenBank获取号.U08844)的命中。它被认为是最适合本发明目的的候选物之一。

另外，发现在组装簇ID no.9的重叠群1的结果中存在错配，将所述序列划分成两种类型，具体地说，位于5′末端的非翻译区的序列是明显不同的。

根据上述结果，将编码这两种类型的基因命名为条斑紫菜延伸因子EF1-αA1和延伸因子EF1-αA2基因(以下称之为A1和A2基因).

实施例3：A1基因的完整cDNA的克隆，测序和序列分析

1.材料

将条斑紫菜TU-1(由Kuwano，K.等，Plant Sci.，116(1)：117-124(1996)建立)的培养的单藻类叶状配子体用做cDNA克隆的材料。

2.培养条件

在15℃下，对条斑紫菜TU-1进行10小时光照的短目照条件(光照体积为80μE/(m²·s)；冷白色荧光灯)和14小时黑暗的循环培养，在装有ESL培养基的1-1侧面分支的平底玻璃烧瓶(PYREX)中通气(通过用0.2-μm过滤器(ADVANTEC)过滤对空气进行消毒，0.25l/分钟)培养。每隔7天更换培养基。

3.RNA提取

按照实施例1所披露的方法从1.2g培养的条斑紫菜TU-1的单藻类叶状配子体中提取总RNA。

4.制备用于cDNA文库筛选的探针

按照披露于以下文献中的方法，从条斑紫菜TU-1中提取DNA：Kitade等，J.Phycol.，32：496-498(1996)。

用所述DNA作模板，AmpliTaq Gold(Applied Biosystems)，和两种引物，PYEF1(SEQ ID NO：7)和PYEFR1(SEQ ID NO：5)进行PCR。所述引物是按照实施例2所披露的EST簇分析结果设计的，用于扩增包括延伸因子EF1-α基因基序的高度保守的序列。所述PCR是按照以下方法进行的：在94℃下预热2分钟；30轮94℃下1分钟，53℃1分钟，和72℃2分钟；以及最终在72℃下反应10分钟。

在1.5％琼脂糖凝胶上对所得到的大约170-bp的PCR产物进行电泳。使用Geneclean II试剂盒(Bio101)从所述凝胶上回收感兴趣的带，并且，使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)连接于用于TA克隆的载体pT7Blue(Novagen)。按照常规方法(Maniatis等(eds.)，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，1989)将连接混合物转入大肠杆菌JM109感受态细胞(TakaraShuzo)。大肠杆菌转化体的集落是通过在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养获得的。

随机挑选转化体集落。通过对利用具有载体pT7Blue T7上的序列的启动子引物(Novagen)和引物M4(Takara Shuzo)进行PCR扩增的产物进行电泳，测定所述集落中具有的质粒中插入片段的长度。选择具有预定长度的DNA片段的大肠杆菌集落。

对选择的大肠杆菌转化体集落进行液体培养。然后用QIAGEN质粒Mini Kit(Qiagen)提取质粒。

按照循环测序方法，用所述质粒作模板，并且使用dRhodamineTerminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction试剂盒(AppliedBiosystems)测定核苷酸序列。所述循环测序反应是按照一下方法进行的：在96℃下2分钟；25轮96℃10秒，50℃5秒和60℃4分钟。

按照简化方法，通过乙醇沉淀纯化得到的反应产物。然后，用ABIPRISM 310遗传分析仪(Applied Biosystems)测定核苷酸序列。质粒提取和核苷酸序列测定是按照所附带的说明书进行的。

在测定核苷酸序列之后，利用公众可以从NCBI(Altschul，S.F.等，Nucleic Acids Res.，25(17)：3389-3402(1997))获得的BLAST对核酸序列数据库进行同源性检索，以便证实所测定的序列是否是感兴趣的序列。检索的结果发现了所测定的序列与根据簇集和组装预测的A1基因的序列最匹配。

再次利用业已测定了其序列的质粒作模板，并且使用引物PYEF1(SEQ ID NO：7)和PYEFR1(SEQ ID NO：5)，在上述条件下进行PCR。利用PCR DIG Labeling Mix(Roche)，用洋地黄毒苷标记所述PCR产物。在所述标记反应之后，通过利用Quick Spin Columns^TM G-50(Roche)除去未反应的底物而纯化所述标记产物，获得了用于筛选的探针。标记和纯化是按照所附带的说明书进行的。

5.cDNA文库的构建

用于构建cDNA文库的cDNA，是利用TimeSaver cDNA合成试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)由在实施例3-4中制备的poly(A)⁺mRNA合成的。将EFLCpure^TM克隆的鼠逆转录酶(Amersham PharmaciaBiotech)用作cDNA合成的逆转录酶。反应温度为44℃。

将合成的cDNA连接在载体λZAPII(Strata基因)上。利用Gigapack III Gold包装提取物(Strata基因)对所述连接反应产物进行包装。将按照上述方法进行包装所获得的噬菌体悬浮液用作cDNA文库。

6.初次筛选

按照ZAP-cDNA合成试剂盒(Strata基因)所附带的说明书，以每个平板大约1×10⁵个噬斑的密度，将通过包装获得的噬菌体悬浮液分散到24×24-cm的方形陪替氏培养皿MS-12450(SumitomoBakelite)上，其中，底部平板业已制备过，并且业已事先温育过。按照常规方法，将在所述平板上形成的噬斑转移到硝酸纤维素膜NITROPLUS 2000(Funakoshi)上。

将所述膜在碱性变性溶液(0.9M NaOH，1.5M NaCl)中浸泡2-5分钟，然后在中和溶液(1.5M Tris-HCl(pH 7.5)，1.5M NaCl)中浸泡2-5分钟。然后在6xSSC中洗涤所述膜，在干热消毒器SP-650(ADVANTEC)中，在80℃下，干燥并且加热2小时。

预杂交是通过在含有最终浓度为100μg/ml的变性的鲑鱼精子DNA的杂交溶液(5xDenhardt′s，4.1mM EDTA，0.5％SDS，6xSSC)中，在65℃下培养所述膜2小时完成的。

然后，通过在含有最终浓度为100μg/ml的变性的鲑鱼精子DNA和最终浓度为10ng/ml的在实施例1-4中制备的、业已加热变性成单链的探针的杂交溶液中，在60℃下，温育所述膜过夜(12小时或更长时间)实现杂交。

在杂交之后，在室温下，在洗涤溶液(2xSSC，0.1％SDS)中温育所述膜5分钟，以便洗去未结合的探针，和杂交溶液等。重复所述洗涤过程两次。

然后，在洗涤溶液(0.5xSSC，0.1％SDS)中温育所述膜，所述膜事先业已在60℃下温育了20分钟，以便使非特异结合的探针解离。重复所述洗涤过程两次。

然后，在洗涤溶液(0.1xSSC，0.1％SDS)中温育所述膜，所述膜事先业已在60℃下温育了20分钟，以便使非特异结合的探针解离。重复所述洗涤过程两次。

洋地黄毒苷的检测，是按照DIG DNA标记和检测试剂盒(Roche)上所附带的说明书，通过颜色形成反应实现的。利用摄影LIGHT BOX NEW5000 INVERTER(Fuji Color)的光盒观察所述检测结果。按照上述方法进行初次筛选。

7.二次筛选

收集所述初次筛选中的阳性嗜菌体，并且按照披露于以下文献中的方法进行文库扩增：Manabe，K.，Bio Jikken Illustrated(4)：Kurou Nashi No Cloning，Shujunsha(1997).

通过以每个平板50-100个嗜斑的密度将扩增的嗜菌体悬浮液分散在9-cm陪替氏培养皿(高度：1.5cm，直径：9cm)上，对所获得的嗜斑进行二次筛选。其中，底部平板业已制备过，并且事先温育过。二次筛选是以类似于上文结合初次筛选所披露的方法类似的方式进行的。

按照上述方法，构建了来自叶状配子体的cDNA文库，进行初次筛选，并且扩增阳性克隆。通过筛选从扩增的嗜菌体悬浮液获得的1×10⁵个嗜斑，分离了5个阳性克隆。利用两种载体序列特异性引物(T3启动子引物(Novagen)和T7启动子引物(Novagen))，对在二次筛选中被确定为阳性的嗜斑进行PCRs。在1.0％的琼脂糖凝胶上对所述扩增产物进行电泳，以便确定插入片段的长度。

按照ZAP-cDNA合成试剂盒(Strata基因)所附带的说明书，通过体内切除，将插入嗜菌体载体的片段亚克隆到质粒载体上。

随机挑选通过体内切除产生的集落，并且利用上述引物对(T3启动子引物和T7启动子引物)进行PCRs。在1.0％的琼脂糖凝胶上对所述扩增产物进行电泳，以便测定所述插入片段的长度。

8.核苷酸序列分析

将具有最长的cDNA插入片段的质粒转入大肠杆菌。对所得到的转化体进行液体培养。用QIAGEN质粒微量试剂盒(Qiagen)提取所述质粒。按照引物步行方法，利用所述质粒测定所插入的cDNA区的核苷酸序列。

测定的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。在1644-bp的cDNA序列上发现了1350-bp的开放读框(ORF，从79到1428号位置，包括终止密码子)。所述ORF编码具有449个氨基酸的蛋白。由所述ORF编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。由所述ORF编码的蛋白的推测分子量和等电点分别为49.4kDa和9.18。

在包括起始密码子的从76到82号位置的片段上，发现了与符合Kozak规则(Kozak，M.，Cell，44：283-292(1986))的序列类似的序列(ATCATGG)。

尽管在所述cDNA序列上没有发现poly(A)添加信号(AATAAA)或poly(A)尾，在从1579到1585号位置的片段上，发现了与对来自芽殖酵母酿酒酵母的CYC1基因进行报道的poly(A)添加序列类似的(TACATA；Proudfoot，N.，Cell，64(4)：671-674(1991))序列(TACTATT)。

为了证实所获得的序列是否是编码EF-1α的基因，进行了同源性检索和基序检索。

利用公众可以从NCBI获得的BLAST 2.0 ADVANCED BLAST SEARCH中的BLASTX 2.0.10程序(Altschul，S.F.等，Nucleic Acids Res.，25(17)：3389-3402(1997)进行同源性检索。

利用公众可以从InterPro(http：//www.ebi.ac.uk/interpro/)获得的程序InterPro Release 4.0(Apweiler，R.等，J.Biosci.，26(2)：277-284(2001)对PROSITE基序数据库(http：//www.expasy.ch/prosite/)进行基序检索。

观察到紫菜EF-1α tef-c的利用BLASTX程序(利用核苷酸序列检索氨基酸序列数据库)进行的同源性检索中的第一次命中的同源性得分为887。明显低的E值(在对与目标数据库具有相同大小的任意序列文库进行随机筛选时得分高于相似性得分的命中次数的预期值)表明，所述命中不是偶然的。因此，可以看出，在本实施例中测定的上述序列与紫菜EF-1α tef-c同源。

利用InterPro进行氨基酸基序检索的结果如下。

对PROSITE数据库进行检索的结果是，在SEQ ID NO：8的氨基酸序列从14到21号位置的片段(GHVDSGKS)上，发现了ATP/GTP-结合位点基序A(P-环)(PROSITE获取号PS00017)，并且在SEQ ID NO：8的氨基酸序列的从61到76号位置的片段(DKLKAERERGITIDIA)上，发现了GTP-结合延伸因子标记(PROSITE获取号PS00301)。

根据以上结果，认为在本实施例中获得的DNA片段是编码发挥延伸因子作用的氨基酸的新DNA片段。

实施例4：通过RT-PCR分析A1和A2基因在条斑紫菜的各个生命周期中的表达模式。

1.A1基因

(1)引物合成

合成了用于检查A1基因的表达模式的RT-PCR的引物，PYEFRT1(SEQ ID NO：4)和PYEFR1(SEQ ID NO：5)。

引物PYEFRT1的序列是这样设计的：通过比较在实施例3中测定的用SEQ ID NO：1表示的A1基因的5′非翻译区的序列和序列AV435982而选择具有明显不同序列的片段。AV435982序列是在实施例2中进行簇分析的EST序列之一，并且属于A2基因类型，并且具有5′非翻译区的最长序列。

因此，引物PYEFRT1的序列包含在由SEQ ID NO：1表示的A1基因的5′非翻译区序列上，并且不与A2基因的5′非翻译区的序列同源。

引物PYEFRT1的序列是紫菜延伸因子EF1-α(tef-c)mRNA上的序列，它与在实施例2中通过簇分析确定属于A2基因类型的EST序列高度同源。

(2)RT-PCR

按照实施例1所披露的方法，在下列阶段从条斑紫菜TU-1中提取总RNAs：在单孢子形成之前的1至2mm长的叶状配子体，业已进行过30分钟单孢子释放诱导的2mm长的叶状配子体，1至2cm长的叶状配子体，和丝状孢子体。

用poly(A)⁺RNAs和RNA PCR试剂盒(AMV)Ver.2.1(Takara Shuzo)各200ng，合成cDNA。逆转录反应是利用Oligo dT-接头引物(TakaraShuzo)作引物，按照所附带的说明书的指导，在53℃进行的。

PCR是利用5ng所得到的cDNA作模板，用Gene Taq NT(WakoPure Chemical Industries)和两种合成引物PYEFRT1(SEQ ID NO：4)和PYEFR1(SEQ ID NO：5)进行的。所述PCR是按照以下方法进行的：在94℃下预热2分钟；30轮94℃ 30秒，53℃ 30秒，和72℃ 1分30秒；以及最终在72℃下反应7分钟。

作为负对照，在相同条件下进行PCRs，使用来自各个阶段的、没有进行过逆转录反应的poly(A)⁺RNAs作模板。在1.5％的琼脂糖凝胶上对PCR产物进行电泳。

在图1中示出了所述琼脂糖凝胶电泳的结果。

在图1中，业已进行过逆转录反应的样品的琼脂糖凝胶电泳的结果如图1(A)所示，而没有进行过逆转录反应的样品(负对照)的结果如图1(B)所示。

在图1(A)和(B)中，泳道表示以下成分：

M：100bp序列梯标记(Takara Shuzo)；

泳道1：利用由单孢子形成之前的1至2mm长的叶状配子体制备的mRNA作模板获得的结果；

泳道2：利用由单孢于形成之后的2mm长的叶状配子体制备的mRNA作模板获得的结果；

泳道3：利用由1至2mm长的叶状配子体制备的mRNA作模板获得的结果；和

泳道4：利用由丝状孢子体制备的mRNA作模板获得的结果。

观察到每个阶段的391-bp的扩增产物。因此，认为A1基因在条斑紫菜生命周期的相应阶段是高水平表达的。

2.A2基因

(1)引物合成

按照以下方法合成了用于检查A2基因的表达模式的RT-PCR的引物，PYEFRT4(SEQ ID NO：6)。

引物PYEFRT4的序列是这样设计的：通过比较属于A2基因类型并且具有5′非翻译区的最长序列的AV435982和在实施例3中测定的用SEQ ID NO：1表示的A1基因的5′非翻译区的序列，选择具有明显不同序列的区域。

因此，引物PYEFRT4的序列包含在A2基因的5′非翻译区的序列上，并且不与A1基因的5′非翻译区的序列同源。

将引物PYEFRT4和上述引物PYEFR1(SEQ ID NO：5)用于RT-PCR。

(2)RT-PCR

PCR是利用5ng所得到的cDNA作模板，用Gene Taq NT(WakoPure Chemical Industries)和两种合成引物PYEFRT4(SEQ ID NO：6)和PYEFR1(SEQ ID NO：5)进行的。所述PCR是按照以下方法进行的：在94℃下预热2分钟；30轮94℃ 30秒，53℃ 30秒，和72℃ 1分30秒；以及最终在72℃下反应7分钟。

作为负对照，在相同条件下进行PCRs，使用来自各个阶段的、没有进行过逆转录反应的poly(A)⁺RNAs作模板，在1.5％的琼脂糖凝胶上对PCR产物进行电泳。

在图2中示出了所述琼脂糖凝胶电泳的结果。

在图2中，业已进行过逆转录反应的样品的琼脂糖凝胶电泳的结果如图2(A)所示，而没有进行过逆转录反应的样品(负对照)的结果如图2(B)所示。

在图2(A)和(B)中，泳道表示以下成分：

M：100bp序列梯标记(Takara Shuzo)；

泳道2：利用由单孢子形成之后的2mm长的叶状配子体制备的mRNA作模板获得的结果；

泳道3：利用由1至2cm长的叶状配子体制备的mRNA作模板获得的结果；和

泳道4：利用由丝状孢子体制备的mRNA作模板获得的结果。

观察到每个阶段的369-bp的扩增产物。因此，认为A2基因在条斑紫菜生命周期的相应阶段是高水平表达的。

实施例5：从基因组文库中分离A2基因，测序和启动子序列分离

1.基因组DNA的制备

利用Nucleon PhytoPure，植物和真菌DNA提取试剂盒(AmershamPharmacia Biotech)，按照进行过部分改进的该试剂盒所附带的说明书，从条斑紫菜TU-1中提取基因组DNA。

下面示出了从原植体阶段的藻类提取基因组DNA的方法。

在用纸巾除去水之后，对培养的处在原植体阶段的藻类进行称重。在液氮中用研钵和研棒将2.5g藻类研碎。用在液氮中预冷的勺子，将研碎的藻类转移到装有11.5ml该试剂盒所附带的试剂1缓冲液的50-ml离心管中。以20μg/ml的最终浓度将RNase A添加到离心管里面。在37℃下温育所述混合物30分钟。然后将3.75ml的该试剂盒所附带的试剂2添加到其中。在搅拌均匀之后，在65℃下温育该混合物10分钟，在此期间，将所述离心管拔出，并且适当混合该混合物3次。然后，在冰上温育所述离心管20分钟。将2ml的氯仿添加到其中，并且在-20℃下温育所得到的混合物20分钟。将500μl的Nucleon PhytoPure DNA提取树脂(Amersham PharmaciaBiosystems)添加到其中，并且在室温下温育该混合物10分钟。

对该混合物进行离心，以便收集上层。以3.2g/3ml的最终浓度将氯化铯添加到其中，并且溶解。将1/10体积的溴化乙锭溶液(最终浓度为10mg/ml)再添加到其中。将该混合物分装到超速离心管(12PA密封试管，HITACHI)中，并且使用Hitachi超速离心机65P(HITACHI)，在15℃下以50,000rpm的速度离心20小时。

在离心之后，用装有注射针头(22Gx1，Terumo)的注射器(Terumo注射器2.5ml，Terumo)，将DNA层从超速离心管走取出，同时进行紫外线照射。将等体积的异丁醇添加到取出的DNA层中，搅拌该混合物，并且离心，然后收集下层(异丁醇处理)。重复所述异丁醇处理，直到看不见溴化乙锭的颜色(2-3次)。

将收集的下层放入透析膜Spectra/Por 7 Membrane(Spectrum)中，并且，在室温下，用11的TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5)透析过夜。透析之后，将1/10体积的3M乙酸钠和2体积的乙醇添加到其中，并且混合。通过离心收集所形成的沉淀物，用75％的乙醇漂洗，并且风干。

将由此获得的沉淀物溶解在100μl的TE缓冲液中。用分光光度计Gene Quant(Amersham Pharmacia Biotech)测定提取的基因组DNA的浓度和纯度。另外，在1.0％的琼脂糖凝胶上对所述基因组DNA进行电泳，以便证实它没有被降解。

2.探针的制备

根据实施例2中的分析可知，作为分离启动子的候选物的A1和A2基因是与紫菜延伸因子EF1-α(tef-c)mRNA(GenBank获取号U08844)高度同源的。

基于以上结果，对延伸因子EF1-α基因进行含有高度保守的基序的序列的检索，以便分离A1和A2基因的基因组序列。然后，设计正向引物PYEF1(SEQ ID NO：7)和反向引物PYEFR1(SEQ ID NO：5)以便所述基序位于所述引物之间。

用所述引物，Ampli Taq Gold(PerkinElmer)和来自条斑紫菜TU-1的基因组DNA作模板，在Gene Amp PCR System 9600(PerkinElmer)中进行PCR。所述PCR是按照以下方法进行的：在95℃下预热10分钟；30轮94℃ 1分钟，52℃ 1分钟，和72℃ 2分钟；以及在72℃下最终反应10分钟。在2.0％SeaKem GTG琼脂糖凝胶(Takara Shuzo)上对所述PCR产物进行电泳。将感兴趣的大约170-bp的DNA片段切除，并且从所述凝胶中回收。用Gene Clean II(Bio101)纯化所述DNA，并且利用连接试剂盒ver.1(Takara Shuzo)，连接到用于TA克隆的载体，pT7Blue(Novagen)上。在连接大约16小时之后，将所述连接产物用于转化大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Shuzo)。在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养转化过的JM109细胞，以便形成集落。

通过集落PCR，使用具有载体pT7Blue上的序列的T7启动子引物(Novagen)，和引物M4(Takara Shuzo)检查所述集落中具有的质粒上的插入片段。选择具有含有感兴趣的DNA片段的质粒的大肠杆菌集落。

使用Qiagen质粒微量试剂盒(Qiagen)，按照该试剂盒所附带的说明书，从所选择的大肠杆菌集落中提取并且纯化所述质粒。按照循环测序方法测定核苷酸序列，该方法采用了双脱氧方法，用所述质粒作模板，使用Dye Termination Cycle Sequencing FS Ready Reaction试剂盒(PerkinElmer)和ABI Prism 310遗传分析仪(PerkinElmer)，按照该试剂盒所附带的说明书进行。

按照该试剂盒所附带的说明书，用PCR DIG标记试剂盒(Roche)对业已进行过上述核苷酸序列测定的质粒进行标记，以便制备用于基因组文库筛选的探针。在标记反应之后，通过用Quick Spin Columns^TMG-50(Roche)除去多余的底物，获得了纯化的标记产物。将所述纯化的标记产物用作用于筛选的探针。

3.构建基因组文库

用λDASHII/BamHI载体试剂盒(Strata基因)，将按照实施例5-1所述方法提取的基因组DNA连接到载体λDASHII上，以便按照该试剂盒所附带的说明书构建基因组文库。用Gigapack III Gold包装提取物(Strata基因)对所述连接反应产物进行包装。以每个平板大约1×10⁴个嗜斑的密度，按照该包装所附带的说明书，将所述噬菌体悬浮液分散到90×20-mm无菌陪替氏培养皿(SH-20，Iwaki)上，其中，底部平板业已进行过制备，并且事先业已进行过温育。

4.初次筛选

按照常规方法，将在所述平板上形成的嗜菌体嗜斑转移到硝酸纤维素膜NITROPLUS 2000(Funakoshi)上。

将所述膜在碱性变性溶液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)中浸泡5分钟，然后在中和溶液(1.5M NaCl，1.5M Tris-HCl(pH 7.5))中浸泡5分钟。然后在6xSSC中洗涤所述膜，在干热消毒器SP-650(ADVANTEC)中，在80℃下，干燥并且加热2小时。

预杂交是通过在含有最终浓度为100μg/ml的鲑鱼精子DNA的杂交溶液(5xSSC，50％甲酰胺，50mM Church磷酸缓冲液(pH 7.0)，10％封闭试剂(Roche)，7％SDS和0.1％N-十二烷基肌酸钠)中，在65℃下温育所述膜2小时完成的。

然后，通过在含有最终浓度为100μg/ml的鲑鱼精子DNA和最终浓度为10ng/ml的在实施例1-4中制备的、业已加热变性成单链的探针的杂交溶液中，在50℃下，温育所述膜过夜(12小时或更长时间)实现杂交。

在杂交之后，在室温下，在洗涤溶液1(2xSSC，0.1％SDS)中温育所述膜5分钟，以便洗去未结合的探针，和杂交溶液等。重复所述洗涤过程两次。

然后，在洗涤溶液2(0.1xSSC，0.1％SDS)中温育所述膜，所述膜事先业已在68℃下加热了15分钟，以便使非特异结合的探针解离。重复所述洗涤过程两次。

洋地黄毒苷的检测，是按照DIG DNA标记和检测试剂盒(Roche)上所附带的说明书，通过颜色形成反应实现的。

5.二次筛选

收集所述初次筛选中的阳性嗜菌体，按照披露于以下文献中的常规方法制备噬菌体悬浮液，并且进行二次筛选。

以类似于上面结合初次筛选所披露的方法进行二次筛选，所不同的是通过以每个平板50-100个嗜斑的密度将扩增的嗜菌体分散在9×20-mm的消毒陪替氏培养皿上，对所获得的嗜斑进行二次筛选。其中，底部平板业已制备过，并且事先温育过。

结果，获得了两个阳性克隆No.20和No.47。对确定为阳性的嗜斑进行λ嗜菌体扩增，并且按照披露于以下文献中的方法提取λ嗜菌体DNA：Sugiura(Sugiura，M.，Cloning To Sequence，Nouson BunkaSha，Tokyo，pp.152-156(1989))。

6.λ嗜菌体DNA的Southern杂交

对通过二次筛选获得的阳性克隆No.20和No.47进行Southern杂交，使用被用于筛选基因组文库的探针。

Southern杂交是按照披露于以下文献中的方法进行的：Maniatis等(eds.)，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Chapter 9，pp.31-58，Cold Spring Harbor，1989。

具体地讲，用各种限制酶消化从阳性克隆No.20和No.47中提取的DNAs，并且在1％琼脂糖凝胶上进行电泳。在电泳之后，对所述凝胶进行碱性变性，然后进行中和。按照常规方法，将所述DNAs过夜吸印到尼龙膜Hybond-N(Amersham Pharmacia Biotech)上。在吸印之后，通过瞬变紫外线投射仪用紫外线(254nm)照射所述膜5分钟以便将所述DNAs固定在所述膜上。

通过在42℃下，在20ml的DIG-Easy-Hyb.Granules(Roche)中温育所述膜2小时进行预杂交。

然后，通过在4ml的杂交溶液中，在42℃下温育所述膜和加热变性成单链的探针过夜，实现杂交。

通过用DIG DNA标记和检测试剂盒(Roche)处理，对所述膜进行化学发光。干燥之后，通过在装有X-光胶片(Kodak)的盒子中曝光30秒，进行放射性自显影。

结果如图3所示。

在图3中，各个泳道表示以下成分。就泳道1-7而言，示出了用于处理克隆No.20或No.47的限制酶：

M：pHY标记(Takara Shuzo)；

泳道1：HindIII；

泳道2：HindIII和XbaI；

泳道3：XbaI；

泳道4：XbaI和SalI；

泳道5：SalI；

泳道6：SalI和EcoRI；以及

泳道7：EcoRI.

标有″a″的泳道表示克隆No.20的结果，而标有″b″的泳道表示克隆No.47的结果。

结果，认为很有可能的是所述基因和上游区包含在通过用限制酶HindIII和XbaI对克隆No.20进行双重消化产生的大约4-kbp的片段和通过用限制酶HindIII消化克隆No.47产生的大约5.5-kbp的片段上。

然后，用限制酶HindIII和XbaI彻底消化克隆No.20的DNA，并且，在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，切除大约4-kbp的带，并且从琼脂糖凝胶中回收。

另外，用限制酶HindIII彻底消化克隆No.47的DNA，并且，在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，切除大约5.5-kbp的带，并且从琼脂糖凝胶中回收。

利用TaKaRa连接试剂盒ver.1(Takara Shuzo)，连接回收的DNA片段和载体质粒pBluescriptII(ToYoBo)。在连接30分钟之后，将连接产物用于转化大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Shuzo)。在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养转化过的JM109细胞，以便形成集落。

通过用具有载体pBluescriptII上的序列的引物RV(TakaraShuzo)和引物M4(Takara Shuzo)进行集落PCR，检查所述集落具有的质粒上的插入片段。选择具有感兴趣的DNA片段的大肠杆菌集落。利用Qiagen质粒微量试剂盒(Qiagen)，按照该试剂盒所附带的说明书，从选择的大肠杆菌集落中提取和纯化所述质粒。所制备的质粒分别被命名为pEF20和pEF47。

将质粒pEF20和pEF47用于转化大肠杆菌JM109。将所得到的转化体命名并且表示为大肠杆菌JM109/pEF20和大肠杆菌JM109/pEF47(FERM P-19160)。将它们保藏在国际专利生物保藏机构，独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，AIST TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan保藏日期始于2002年12月18日(原始保藏日期)，保藏号FERMP-19160；以及保藏在国际专利生物保藏机构，独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏号FERM BP-8285(要求转给国际保藏机构的日期：2003年1月29日)。

按照循环测序方法测定所述核苷酸序列，该方法采用双脱氧方法，用质粒pEF20和pEF47作模板，使用Dye Termination CycleSequencing FS Ready Reaction试剂盒(PerkinElmer)和ABI Prism 310遗传分析仪(PerkinElmer)，按照该试剂盒所附带的说明书进行。

结果，发现克隆No.20的嗜菌体DNA包括始于A2基因翻译起始位点上游173bp的位置的序列。因此，可以说不包括所述启动子序列，因为不包括所述基因组DNA的上游序列。

对于克隆No.47来说，嗜菌体DNA包括始于A2基因翻译起始位点上游1.3kb的位置的序列。所述序列如SEQ ID NO：3所示。

比较测定的克隆No.47的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)和通过簇分析获得的cDNA序列(SEQ ID NO：1)和EST序列，以及检索转录因子，编码区和内含子/外显子，发现了克隆No.47包含的启动子序列，内含子序列和终止子序列。

具体地讲，业已发现，在3764-bp的DNA序列上，从87到859号位置的序列是5′侧翼区，从860到877号位置的序列是第一个外显子，从878到1331号位置的序列是第一个内含子，从1332到2961号位置的序列是第二个外显子，从2962到3764号位置的序列是3′侧翼区。另外，业已发现所述5′侧翼区包括启动子序列，而所述3′侧翼区包括终止子序列。

在从1356到1371号位置的包括所述起始密码子的区域中发现了类似于符合Kozak规则(Kozak，M.，Cell，44：283-292(1986))的序列(ATCATGG)。在从2951到2965号位置的区域中，发现了高等植物核基因CAYTG的poly(A)添加信号(Joshi，C.P.，Nucl.Acids Res.，15：9627-9640(1987))(CATTG)，而在从2897到2902号位置的区域中，发现了类似于另一种poly(A)添加信号AATAAA的序列(AATAGA)。

上述检索发现，SEQ ID NO：3上从860到877号位置的序列和SEQ ID NO：3上从1332到2961号位置上的序列相当于A2基因cDNA的序列。所述序列如SEQ ID NO：2所示。在所述序列上，从65到1404号位置的序列是A2多肽编码序列(包括终止密码子)。由所述序列编码的包括499个氨基酸的所述多肽的氨基酸序列，与由A1基因的ORF(SEQ ID NO：8)编码的多肽的氨基酸序列相同。基于以上结果，可以认为在本实施例中获得的DNA片段也是编码发挥延伸因子作用的氨基酸的DNA片段。

实施例6：启动子序列活性的检查

(1)构建用于测定启动子活性的质粒

按以下方法构建了用于测定启动子活性的质粒载体，以便能够通过检测β-葡糖苷酸酶基因瞬时表达时的GUS活性而确定启动子活性。

将pBI221(Clontech)用作用于比较的对照质粒载体。所述载体(从HindIII位点到XbaI位点的片段)的35S启动子部分，被pEF47上从HindIII位点到没有内含子的转录起始位点前面紧邻的EF-1αA2基因的启动子序列(SEQ ID NO：9)所取代，以便构件其中的启动子序列与β-葡糖苷酸酶基因连接的载体。具体地讲，SEQ ID NO：9的序列是按照以下方法获得的。用质粒pEF47作模板，以及使用合成的在5′末端具有XbaI位点的引物M13 RV(Takara Bio)和引物EF47X2(SEQ ID NO：12)，通过PCR扩增获得了大约0.8kbp的片段。用限制酶HindIII和XbaI彻底消化所述大约0.8-kbp的片段，在电泳之后，将大约0.8-kbp的片段切除，并且从琼脂糖凝胶上纯化。将所述DNA片段连接在载体片段上，其中，业已通过用限制酶HindIII和XbaI彻底消化，从pBI221上除去了35S启动子部分。将所述连接混合物用于转化大肠杆菌JM109。将所得到的质粒命名为p47GUS-IL，并且，将用p47GUS-IL转化过的大肠杆菌JM109命名为大肠杆菌JM109/p47GUS-IL。通过PCR和核苷酸序列分析证实，p47GUS-IL具有从HindIII位点到转录起始位点前面紧邻的位点的启动子序列(SEQID NO：9)。

用于比较pBI221的对照质粒载体的35S启动子部分(从HindIII位点到XbaI位点的片段)，被包括启动子序列，第一外显子，第一内含子和第二外显子的一部分到ATG前面紧邻的位置(从SEQ ID NO：3的87到1367号位置)的序列所取代，以便构建一种载体，其中，包括启动子序列(SEQ ID NO：9)和下游第一内含子(SHQ ID NO：10)的序列与β-葡糖苷酸酶基因连接。具体地讲，按照以下方法获得了包括启动子序列，第一外显子，第一内含子第二外显子的一部分到ATG前面紧邻的位置(从SEQ ID NO：3的87到1367号位置)的序列。用质粒pEF47作模板，以及使用合成的在5′末端具有XbaI位点的引物M13 RV(Takara Bio)和引物EF47X(SEQ ID NO：13)，通过PCR扩增获得了大约1.3kbp的片段。用限制酶HindIII和XbaI彻底消化所述大约1.3-kbp的片段，在电泳之后，将大约1.3-kbp的片段切除，并且从琼脂糖凝胶上纯化。将所述DNA片段连接在载体片段上，其中，业已通过用限制酶HindIII和XbaI彻底消化，从pBI221上除去了35S启动子部分。将所述连接混合物用于转化大肠杆菌JM109。将所得到的质粒命名为p47GUS，并且，将用p47GUS转化过的大肠杆菌JM109命名为大肠杆菌JM109/p47GUS。通过PCR和核苷酸序列分析证实，p47GUS具有从SEQ ID NO：3的87到1367号位置的序列。

(2)启动子活性测定

通过粒子枪将载体pBI221，p47GUS-IL和p47GUS转入条斑紫菜TU-1，测定启动子活性，并且对由于β-葡糖苷酸酶基因的瞬时表达而产生的GUS活性进行组织化学测定，其中，用正像显微镜观察在细胞中积累的靛蓝染料的存在。

下面披露了用DNA对金颗粒进行包被的方法，以便将所述载体转入细胞。在1.5ml的微型离心管中称取60mg金颗粒。将1ml新制备的70％乙醇添加到其中。用试管搅拌器VORTEX GENIE 2(ScientificIndustries)将所述试管搅拌5分钟，并且，在室温下放置15分钟。在台式离心机Chibitan(Millipore)上将所述试管离心5秒时间，并且取出上清液。将1ml的无菌水添加到其中。用试管搅拌器搅拌1分钟，将所述试管放置1分钟，以便使所述金颗粒沉淀。在台式离心机上将所述试管离心2秒时间，并且取出上清液。重复这一过程三次。将50％甘油添加到其中，以便金颗粒的最终浓度为60mg/ml。用所述试管搅拌器剧烈搅拌所述试管5分钟，以便将所述金颗粒悬浮在50％甘油中(60mg/ml)，并且破碎聚集物。将50μl的悬浮液(含有大约3mg的金颗粒)转移到1.5-ml微型离心管中。将10μl的DNA(1μg/μl)，50μl的2.5M CaCl₂和20μl的0.1M亚精胺添加到其中，同时，用所述试管搅拌器剧烈搅拌所述试管，并且，将所述搅拌再持续3分钟。将所述试管放置1分钟，以便使所述金颗粒沉淀，并且，在台式离心机上将所述试管离心2秒时间，并且取出上清液。将140μl的70％乙醇添加到其中，以便不扰动所述沉淀物，并且取出上清液。然后，将140μl的100％乙醇添加到其中，以便不扰动所述沉淀物，并且取出上清液。将48μl的100％乙醇添加到其中并且混合。将8μl的悬浮液用于一轮转移。

在15℃下，以10小时光照的短日照时间(光照体积为80μE/m²/s；冷白色荧光灯)和14小时的黑暗时间的循环培养条斑紫菜TU-1的单藻类叶状配子体，在装有ESL培养基的2L简单培养容器(Fujimori Kogyo)中通气(通过0.2-μm过滤器过滤对空气进行消毒，0.25l/分钟)培养。每7天更换一次培养基。将所述叶状配子体切成大约2cm²的碎片，并且放置在1/4片玻璃微纤维GF/C(47mm，Whatman)上，同时分散在ESL培养基中。将它们放置在布氏漏斗上(使用70-mm滤纸，MT)，漏斗上装有用ESL培养基湿润的滤纸(90mm，Whatman)，并且用吸引器进行抽吸，以便吸收并且出去多余的水。将吸附的叶状配子体碎片放置在ESL琼脂培养基上，并且用粒子枪GIE-III(Tanaka)，根据所附带的说明书，将DNA-包被的金颗粒转入其中。射击条件如下：出口和样品之间的距离：7-9cm；射击压力：0.5-6.0kgf/cm²；射击时间：0.015秒。在每一种条件下转移所述样品。

转移之后，将样品从玻璃微纤维上剥下来，按照转移载体和出口-样品距离条件分类，并且在15℃下，在简单的培养容器中培养2天时间，提供14小时光照的长日照时间，和10小时的黑暗时间。然后，用固定溶液(2％低聚甲醛，0.1M磷酸钠(pH 7.0)，1mM EDTA，1.5M D-山梨糖醇)固定1小时，并且在洗涤溶液(0.1M磷酸钠(pH7.0)，1.5M D-山梨糖醇)中进行三轮洗涤。将X-Gluc溶液(2mM X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸，50mM磷酸钠(pH 7.0)，10mMEDTA，0.5mM K₄Fe(CN)₆，0.5mM K₃Fe(CN)₆，1.5M D-山梨糖醇，0.5％Triton X-100)添加到其中，以便完全浸泡细胞或组织。在37℃下，在放入培养箱MIR-253(Sanyo)的密封的合适容器中温育所述混合物过夜。根据用正像显微镜观察到的在细胞中积累的靛蓝染料的存在，测定表示启动子活性的β-葡糖苷酸酶活性(GUS活性)。

结果，在业已转入了载体pBI221的样品中，在出口-样品距离为9cm时获得的两种样品中观察到了GUS活性。对于载体p47GUS-IL来说，观察到了两种样品的GUS活性，一种样品是在出口-样品距离为8cm时获得的，另一种样品是在出口-样品距离为9cm时获得的。因此，证实了该载体上的启动子(SEQ ID NO：9)具有启动子活性。

对于载体p47GUS来说，观察到了7种样品的GUS活性，一种样品是在出口-样品距离为7cm时获得的，三种样品是在出口-样品距离为8cm时获得的，三种样品是在出口-样品距离为9cm时获得的。

对观察到GUS活性的样品进行从细胞中除去染料的脱色处理。其结果是，即使在大约一周之后，积累的蓝色靛蓝染料仍然留在以9cm的出口-样品距离和用于瞬时转移载体p47GUS的12种压力条件之一(0.5-6.0Kg/cm²)获得的样品中(图4)。在图4中，″A″表示在脱色之前获得的结果，而″B″在脱色之后获得的结果。因此，认为通过在所述载体的启动子(SEQ ID NO：9)下游包括第一内含子(SEQ IDNO：10)，可以实现更有效的基因表达和很高的表达诱导。

工业适用性

根据本发明，首次提供了源于藻类的启动子。这样，使利用启动子在藻类中实现基因表达成为可能。根据本发明，首次提供了源于藻类的终止子和内含子。使利用它们在藻类中实现提高基因表达效率成为可能。因此，不仅能够利用遗传工程技术，在藻类中生产有用的物质，而且还能利用遗传工程技术进行藻类育种。

另外，本发明提供了源于藻类的编码新延伸因子的基因。使用所述基因，使利用遗传工程技术生产来自藻类的延伸因子成为可能。

序列表文字

SEQ ID No：1：A1基因的cDNA序列

SEQ ID No：2：A2基因的cDNA序列

SEQ ID No：3：A2基因的基因组DNA序列

SEQ ID No：4：引物PYEFRT1

SEQ ID No：5：引物PYEFR1

SEQ ID No：6：引物PYEFRT4

SEQ ID No：7：引物PYEF1

SEQ ID No：8：A1的氨基酸序列

SEQ ID No：9：A2基因的启动子区

SEQ ID No：10：A2基因的内含子1

SEQ ID No：11：A2基因的终止子区

SEQ ID No：12：引物EF47X2

SEQ ID No：13：引物EF47X

序列表

<110>TAKARA BIO INC.

<120>源于藻类的启动子，内含子和终止子

<130>663658

<150>JP 2002-52885

<151>2002-02-28

<150>JP 2002-374188

<151>2002-12-25

<160>13

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>1644

<212>DNA

<213>条斑紫菜(Porphyra yezoensis Ueda)

<220>

<223>A1基因的cDNA序列

<400>1

caccatcccg ctcgacctac cggttgttgc ccagtcccgt cccgcgcgga gtgagagcag 60

cccacctagt ctctcatcat ggggaaggag aagcagcatg tgtccattgt ggtcattggc 120

cacgtcgact ctggcaagtc gacgaccacc ggccatctga tctacaagtg cgggggtatc 180

gagaagcgcg cgattgagaa gttcgagaag gaggctgctg agatgggcaa gggctcgttc 240

aagtacgcgt gggtgctgga caaactgaag gccgagcgcg agcgcggtat caccattgac 300

attgctctgt ggaagttcga gacggagaag tacagcttca ctatcattga cgccccgggt 360

caccgtgact tcatcaagaa catgatcacg ggcacgtcgc aggcggatct ggccatcctg 420

gtcattgctt cgccgccggg cgagtttgag gcgggtatct cccagaacgg gcagacccgc 480

gagcacgcgc tgctggccta caccctgggc gtcaagcaga tgattgtggc ttgcaacaag 540

atggacgaca agaacgtcaa ctggtcgcag gaccgctacg aggaggtgtc caaggagatg 600

gacctgtacc tgaagaaggt cgggtacaac cccgccaagg tgcccaaggt gccgacgtcg 660

ggctggacgg gtgagaacct gttcgagagg accgataaga cgcacgccct cggcaagtgg 720

tacaagggcc cgtgcctgct ggaggctctg gacaactgcg acccgccgaa gcgcccggtt 780

gacaagccgc tgcgcctgcc cctccaggac gtctacaaga tcggcggcat tggcacagtg 840

ccggtgggcc gtgtggagac tgggctcatc aagcccggca tggtcgtgac gtttgcgccc 900

tcgggcctgt cgactgaggt gaagtcggtc gagatgcacc acgaggcgct gccccaggcc 960

ggccccggcg acaacgttgg cttcaacgtc aagaacgtgt cggtcaagga cctgaagcgc 1020

ggctacgtgt gcggtgactc gaagaacgac ccgccgaagg ggtgcgcttc gttcaacgcc 1080

caggtcatca tcctgaacca ccctggtgag atccacgctg gctacgcgcc ggtgctggat 1140

tgccacacgg cgcacattgc gtgcaagttc tcggagctga tcctgaagat ggaccgccgc 1200

tcgggcaaga agctggagga cacgcccaag atgatcaagt ccggtgacgc tgctatggtg 1260

aagatggttg cctccaagcc gatgtgcgtg gaggccttca cccagtaccc gccgctgggc 1320

cgctttgccg tgcgtgacat gcgccagacg gtcgctgttg gtgtcatcaa gtcggtggag 1380

aagaaggagg ttgagggcaa gatgaccaag tcggcggcca agaaatagca gccaattgtg 1440

ctcgcttcgg cgtcgtgtat ggcatcgtgg gtggacttgt tttttgcggt gcgatctagt 1500

cacgcgctct tacgcctcgc gtgtggggtc ctggcggtgg tgcgtggcga ctgtcggtct 1560

cccgtgatgg accgtttgta ctattcgacc cttgcgaagg ggagaatagg agtgtagttt 1620

accctcttgt tttgtatctt tttg 1644

<210>2

<211>1648

<212>DNA

<213>条斑紫菜

<220>

<223>A2基因的cDNA序列

<400>2

ccgtcttccc cgccgattac gtcttgagtt tacctgttca cctagccttt catcatgggg 60

aaggagaagc agcatgtgtc cattgtggtc attggccacg tcgactctgg caagtcgacg 120

accaccggcc atctgatcta caagtgcggg ggtatcgaga agcgcgcgat tgagaagttc 180

gagaaggagg ctgctgagat gggcaagggc tcgttcaagt acgcgtgggt gctggacaaa 240

ctgaaggccg agcgcgagcg cggtatcacc attgatattg ctctgtggaa gttcgagacg 300

gagaagtaca gcttcactat cattgacgcc ccgggtcacc gtgacttcat caagaacatg 360

atcacgggca cgtcgcaggc ggatctggcc atcctggtca ttgcttcgcc gccgggcgag 420

tttgaggcgg gtatctccca gaacgggcag acccgcgagc acgcgctgct ggcctacacc 480

ctgggcgtca agcagatgat tgtggcttgc aacaagatgg acgacaagaa cgtcaactgg 540

tcgcaggacc gctacgagga ggtgtccaag gagatggacc tgtacctgaa gaaggtcggg 600

tacaaccccg ccaaggtgcc caaggtgccg acgtcgggct ggacgggtga gaacctgttc 660

gagaggaccg ataagacgca cgccctcggt aagtggtaca agggcccgtg cctgctggag 720

gctctggaca actgcgaccc gccgaagcgc ccggttgaca agccgctgcg cttgcccctc 780

caggatgtct ataagatcgg cggcattggc acagtgccgg tgggccgtgt ggagactggg 840

ctcatcaagc ccggcatggt cgtgacgttt gcgccctcgg gcctgtcgac tgaggtgaag 900

tcggtcgaga tgcaccacga ggcgctgccc caggccggcc ccggcgacaa cgttggcttc 960

aacgtcaaga acgtgtcggt caaggacctg aagcgcggct acgtgtgcgg tgactcgaag 1020

aacgacccgc cgaaggggtg cgcttcgttc aacgcccagg tcatcatcct gaaccaccct 1080

ggtgagatcc acgccggcta cgcgccggtg ctggactgcc acacggcgca cattgcgtgc 1140

aagttctcgg agctgatcct gaagatggac cgccgctcag gcaagaagct ggaggacacg 1200

cccaagatga tcaagtccgg tgacgctgct atggtgaaga tggttgcctc caagccgatg 1260

tgcgtggagg ccttcaccca gtacccgccg ctgggccgct ttgccgtgcg tgacatgcgc 1320

cagacggtcg ctgttggtgt catcaagtcg gtggagaaga aggaggttga gggcaagatg 1380

accaagtcgg cggccaagaa atagcagcca acccatccgg ctgtgaggtc gctggtggcc 1440

tcgctcgctg cagaccagat gcgagtcaac caggagcgcg ttatcgcgct cttcgttgtc 1500

aacgctgtca tgactgtcgc gaaggatggg tgccggtccg cagcagtcga ccgcctctac 1560

tactcgacgc tcgcgaaagg gagaatagaa atgtagcgtg cttgtcttgc ttttgctagg 1620

gtgtttcttg aggcttgcat tgtctcgc 1648

<210>3

<211>3764

<212>DNA

<213>条斑紫菜

<220>

<223>A2基因的基因组序列

<400>3

gactgattcg ccagcgcgca attaaccctc actaaaggga acaaaagctg ggtaccgggc 60

cccccctcga ggtcgacggt atcgataagc ttcgctgcca ggctctccat cagcgacttg 120

cggtcggtgc tgtttgggga ccggcgggaa gcgcaccaga atgtgggggg agacaggcag 180

ggctcagaga cacgagtgga gagcattgat cagtaacagt cgcacgtcag actgggtctg 240

cgtggggcca cgaaagcgca aaaatgggcc tagcaggcgc cgtcaacctt ctcaagctca 300

gagcgccgcc aggctgcaca cccccgaggc gacggccagt agcacctgcg ccacggagac 360

accgtctcct gctaacatac ggttgttcgt ccgccatcga gaacagctag gtacagaata 420

ccacgaggaa gggaagaaaa gccttgaatg gcaaagggtg gtcgaaggca agccagagag 480

ggacgttcta catgcaccaa agccagtagg agcgcactac gcggtaagcg gtcgccgaaa 540

gagggggggc gacccacgct cgtcactgca ggttgtattg tgccggtccg caactgccac 600

tggcggtgtt tgtcaagcgg ccaccacgag tctcgagggc tcagcaattg caccgctggc 660

acgcagaatg tggccttccc cgagtttaca gtggtccttt tccccgaaag catccctaaa 720

aaaaggaatt gagcgacggc gacgccgacc gacgtccgcg gcggcggcca caggcgaggg 780

acggaggacc accggccttt taaatgggcg tcgaagacca cgtgctcggc acaccacccc 840

gtcgacatcg ctatcgtacc cgtcttcccc gccgattgta cgtttttttt atcctcccgc 900

cgctcagcct cccgttactc ccgcgcatac gtgtgggcgt gggtgacctg ggtgcgcgca 960

tgggcgtttc cttccctgcc ggtgtgccga gtaacggctg gctggtttgg gtggctcaac 1020

ctttgtggga gagggtcgca cctttgcacc agctggggtg gtttgccgta tgaccaacag 1080

gctcggcaat acggatcatt gtccgactac tggcgtcggg gtgcattcag gcatgcggac 1140

actggaagaa gatcagtggt ggcgccccgg cagttgtcgt tggtcctctg gtatatgcgt 1200

tcgacagttg atcatctctt ctggtgaaga ttgctgacgc tctccggtct cttgcactgt 1260

tgtggtgatt gtttgggcgc atgttctatt cttctgatct gatcgttcct actgtcgacg 1320

gcggatcaca gacgtcttga gtttacctgt tcacctagcc tttcatcatg gggaaggaga 1380

agcagcatgt gtccattgtg gtcattggcc acgtcgactc tggcaagtcg acgaccaccg 1440

gccatctgat ctacaagtgc gggggtatcg agaagcgcgc gattgagaag ttcgagaagg 1500

aggctgctga gatgggcaag ggctcgttca agtacgcgtg ggtgctggac aaactgaagg 1560

ccgagcgcga gcgcggtatc accattgata ttgctctgtg gaagttcgag acggagaagt 1620

acagcttcac tatcattgac gccccgggtc accgtgactt catcaagaac atgatcacgg 1680

gcacgtcgca ggcggatctg gccatcctgg tcattgcttc gccgccgggc gagtttgagg 1740

cgggtatctc ccagaacggg cagacccgcg agcacgcgct gctggcctac accctgggcg 1800

tcaagcagat gattgtggct tgcaacaaga tggacgacaa gaacgtcaac tggtcgcagg 1860

accgctacga ggaggtgtcc aaggagatgg acctgtacct gaagaaggtc gggtacaacc 1920

ccgccaaggt gcccaaggtg ccgacgtcgg gctggacggg tgagaacctg ttcgagagga 1980

ccgataagac gcacgccctc ggtaagtggt acaagggccc gtgcctgctg gaggctctgg 2040

acaactgcga cccgccgaag cgcccggttg acaagccgct gcgcttgccc ctccaggatg 2100

tctataagat cggcggcatt ggcacagtgc cggtgggccg tgtggagact gggctcatca 2160

agcccggcat ggtcgtgacg tttgcgccct cgggcctgtc gactgaggtg aagtcggtcg 2220

agatgcacca cgaggcgctg ccccaggccg gccccggcga caacgttggc ttcaacgtca 2280

agaacgtgtc ggtcaaggac ctgaagcgcg gctacgtgtg cggtgactcg aagaacgacc 2340

cgccgaaggg gtgcgcttcg ttcaacgccc aggtcatcat cctgaaccac cctggtgaga 2400

tccacgccgg ctacgcgccg gtgctggact gccacacggc gcacattgcg tgcaagttct 2460

cggagctgat cctgaagatg gaccgccgct caggcaagaa gctggaggac acgcccaaga 2520

tgatcaagtc cggtgacgct gctatggtga agatggttgc ctccaagccg atgtgcgtgg 2580

aggccttcac ccagtacccg ccgctgggcc gctttgccgt gcgtgacatg cgccagacgg 2640

tcgctgttgg tgtcatcaag tcggtggaga agaaggaggt tgagggcaag atgaccaagt 2700

cggcggccaa gaaatagcag ccaacccatc cggctgtgag gtcgctggtg gcctcgctcg 2760

ctgcagacca gatgcgagtc aaccaggagc gcgttatcgc gctcttcgtt gtcaacgctg 2820

tcatgactgt cgcgaaggat gggtgccggt ccgcagcagt cgaccgcctc tactactcga 2880

cgctcgcgaa agggagaata gaaatgtagc gtgcttgtct tgcttttgct agggtgtttc 2940

ttgaggcttg cattgtctcg cgaaaaaaac attgctttcg tacgccactg gtcaacatgg 3000

atattgaacg aggacggtga agactccgtg gggcgccagg aatgcgtgat cagactttct 3060

tgacagctta gctgctttgc aagaggggcg cccatcctgc cccagagccg gtcaagagac 3120

ttaccgctgg cgccgcgcat gaccagcagc gacgcgttaa gacgaggaca cgtccagcca 3180

catggacaag aaaacaaaaa aacaaaacca agaaacgttt gggcaactgg acaaaaacgt 3240

ggccacagca gtccaagatg atcgctccgc aacagacgtc catcgcggca atcttgccgg 3300

agcggccacc ccaaacgtgc catgagaaac aaatcaccac cacaaaaaag agaattccaa 3360

cagagcctga ccatcgacac gcgggggggg gggcagcaac gcgctcgttc ccgggggctc 3420

acccccgccc actgactcca gcacggagcc cgtgggccaa ccactacctg cgcagcggct 3480

ggaatggggg gtccatgttc acgcacaggc cctggccaag acccagctcc atcattggca 3540

aagccagccc caagtcaagg tcgacgtcgg cgttcgcgtt cgcgtctgcg tcggcgtcag 3600

catcagcgtc cgaattgtca gccatgccgg ccctgccccc gtagtccaca tcacgaatgc 3660

tcgtcgggct gtgcccaccc cactgtgcgc tgctctctcc ggattcatcc cgtgtccatg 3720

acgctgcctc cattcgagga nnagactgtc gccagcaaca ccgg 3764

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物PYEFRT1

<400>4

tcgacctacc ggttgttgc 19

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物PYEFR1

<400>5

ctgcgaggtg cccgtgatca t 21

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物PYEFRT4

<400>6

ccgccgatta cgtcttgag 19

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物PYEF1

<400>7

ggctccttca agtacgcgtg g 21

<210>8

<211>449

<212>PRT

<213>条斑紫菜

<220>

<223>A1的氨基酸序列

<400>8

Met Gly Lys Glu Lys Gln His Val Ser Ile Val Val Ile Gly His Val

1 5 10 15

Asp Ser Gly Lys Ser Thr Thr Thr Gly His Leu Ile Tyr Lys Cys Gly

20 25 30

Gly Ile Glu Lys Arg Ala Ile Glu Lys Phe Glu Lys Glu Ala Ala Glu

35 40 45

Met Gly Lys Gly Ser Phe Lys Tyr Ala Trp Val Leu Asp Lys Leu Lys

50 55 60

Ala Glu Arg Glu Arg Gly Ile Thr Ile Asp Ile Ala Leu Trp Lys Phe

65 70 75 80

Glu Thr Glu Lys Tyr Ser Phe Thr Ile Ile Asp Ala Pro Gly His Arg

85 90 95

Asp Phe Ile Lys Asn Met Ile Thr Gly Thr Ser Gln Ala Asp Leu Ala

100 105 110

Ile Leu Val Ile Ala Ser Pro Pro Gly Glu Phe Glu Ala Gly Ile Ser

115 120 125

Gln Asn Gly Gln Thr Arg Glu His Ala Leu Leu Ala Tyr Thr Leu Gly

130 135 140

Val Lys Gln Met Ile Val Ala Cys Asn Lys Met Asp Asp Lys Asn Val

145 150 155 160

Asn Trp Ser Gln Asp Arg Tyr Glu Glu Val Ser Lys Glu Met Asp Leu

165 170 175

Tyr Leu Lys Lys Val Gly Tyr Asn Pro Ala Lys Val Pro Lys Val Pro

180 185 190

Thr Ser Gly Trp Thr Gly Glu Asn Leu Phe Glu Arg Thr Asp Lys Thr

195 200 205

His Ala Leu Gly Lys Trp Tyr Lys Gly Pro Cys Leu Leu Glu Ala Leu

210 215 220

Asp Asn Cys Asp Pro Pro Lys Arg Pro Val Asp Lys Pro Leu Arg Leu

225 230 235 240

Pro Leu Gln Asp Val Tyr Lys Ile Gly Gly Ile Gly Thr Val Pro Val

245 250 255

Gly Arg Val Glu Thr Gly Leu Ile Lys Pro Gly Met Val Val Thr Phe

260 265 270

Ala Pro Ser Gly Leu Ser Thr Glu Val Lys Ser Val Glu Met His His

275 280 285

Glu Ala Leu Pro Gln Ala Gly Pro Gly Asp Asn Val Gly Phe Asn Val

290 295 300

Lys Asn Val Ser Val Lys Asp Leu Lys Arg Gly Tyr Val Cys Gly Asp

305 310 315 320

Ser Lys Asn Asp Pro Pro Lys Gly Cys Ala Ser Phe Asn Ala Gln Val

325 330 335

Ile Ile Leu Asn His Pro Gly Glu Ile His Ala Gly Tyr Ala Pro Val

340 345 350

Leu Asp Cys His Thr Ala His Ile Ala Cys Lys Phe Ser Glu Leu Ile

355 360 365

Leu Lys Met Asp Arg Arg Ser Gly Lys Lys Leu Glu Asp Thr Pro Lys

370 375 380

Met Ile Lys Ser Gly Asp Ala Ala Met Val Lys Met Val Ala Ser Lys

385 390 395 400

Pro Met Cys Val Glu Ala Phe Thr Gln Tyr Pro Pro Leu Gly Arg Phe

405 410 415

Ala Val Arg Asp Met Arg Gln Thr Val Ala Val Gly Val Ile Lys Ser

420 425 430

Val Glu Lys Lys Glu Val Glu Gly Lys Met Thr Lys Ser Ala Ala Lys

435 440 445

Lys

<210>9

<211>773

<212>DNA

<213>条斑紫菜

<220>

<223>A2基因的启动子区

<400>9

aagcttcgct gccaggctct ccatcagcga cttgcggtcg gtgctgtttg gggaccggcg 60

ggaagcgcac cagaatgtgg ggggagacag gcagggctca gagacacgag tggagagcat 120

tgatcagtaa cagtcgcacg tcagactggg tctgcgtggg gccacgaaag cgcaaaaatg 180

ggcctagcag gcgccgtcaa ccttctcaag ctcagagcgc cgccaggctg cacacccccg 240

aggcgacggc cagtagcacc tgcgccacgg agacaccgtc tcctgctaac atacggttgt 300

tcgtccgcca tcgagaacag ctaggtacag aataccacga ggaagggaag aaaagccttg 360

aatggcaaag ggtggtcgaa ggcaagccag agagggacgt tctacatgca ccaaagccag 420

taggagcgca ctacgcggta agcggtcgcc gaaagagggg gggcgaccca cgctcgtcac 480

tgcaggttgt attgtgccgg tccgcaactg ccactggcgg tgtttgtcaa gcggccacca 540

cgagtctcga gggctcagca attgcaccgc tggcacgcag aatgtggcct tccccgagtt 600

tacagtggtc cttttccccg aaagcatccc taaaaaaagg aattgagcga cggcgacgcc 660

gaccgacgtc cgcggcggcg gccacaggcg agggacggag gaccaccggc cttttaaatg 720

ggcgtcgaag accacgtgct cggcacacca ccccgtcgac atcgctatcg tac 773

<210>10

<211>454

<212>DNA

<213>条斑紫菜

<220>

<223>A2基因的内含子1

<400>10

gtacgttttt tttatcctcc cgccgctcag cctcccgtta ctcccgcgca tacgtgtggg 60

cgtgggtgac ctgggtgcgc gcatgggcgt ttccttccct gccggtgtgc cgagtaacgg 120

ctggctggtt tgggtggctc aacctttgtg ggagagggtc gcacctttgc accagctggg 180

gtggtttgcc gtatgaccaa caggctcggc aatacggatc attgtccgac tactggcgtc 240

ggggtgcatt caggcatgcg gacactggaa gaagatcagt ggtggcgccc cggcagttgt 300

cgttggtcct ctggtatatg cgttcgacag ttgatcatct cttctggtga agattgctga 360

cgctctccgg tctcttgcac tgttgtggtg attgtttggg cgcatgttct attcttctga 420

tctgatcgtt cctactgtcg acggcggatc acag 454

<210>11

<211>803

<212>DNA

<213>条斑紫菜

<220>

<223>A2基因的终止子区

<400>11

gaaaaaaaca ttgctttcgt acgccactgg tcaacatgga tattgaacga ggacggtgaa 60

gactccgtgg ggcgccagga atgcgtgatc agactttctt gacagcttag ctgctttgca 120

agaggggcgc ccatcctgcc ccagagccgg tcaagagact taccgctggc gccgcgcatg 180

accagcagcg acgcgttaag acgaggacac gtccagccac atggacaaga aaacaaaaaa 240

acaaaaccaa gaaacgtttg ggcaactgga caaaaacgtg gccacagcag tccaagatga 300

tcgctccgca acagacgtcc atcgcggcaa tcttgccgga gcggccaccc caaacgtgcc 360

atgagaaaca aatcaccacc acaaaaaaga gaattccaac agagcctgac catcgacacg 420

cggggggggg ggcagcaacg cgctcgttcc cgggggctca cccccgccca ctgactccag 480

cacggagccc gtgggccaac cactacctgc gcagcggctg gaatgggggg tccatgttca 540

cgcacaggcc ctggccaaga cccagctcca tcattggcaa agccagcccc aagtcaaggt 600

cgacgtcggc gttcgcgttc gcgtctgcgt cggcgtcagc atcagcgtcc gaattgtcag 660

ccatgccggc cctgcccccg tagtccacat cacgaatgct cgtcgggctg tgcccacccc 720

actgtgcgct gctctctccg gattcatccc gtgtccatga cgctgcctcc attcgaggan 780

nagactgtcg ccagcaacac cgg 803

<210>12

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物EF47X2

<400>12

ggtctagaaa gacgggtacg atagcga 27

<210>13

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物EF47X

<400>13

cctctagact tctccttccc catgatga 28

Claims

1.在藻类中具有启动子活性的分离的DNA，它选自下面的(a)-(c)：

(a)具有SEQ ID NO：9或它的一部分的核苷酸序列的DNA；

(b)能够在严格条件下与(a)的DNA或它的互补链杂交的DNA；和

2.在藻类中具有提高基因的转录效率的活性的分离的DNA，它选自下面的(d)-(f)：

(d)具有SEQ ID NO：10或它的一部分的核苷酸序列的DNA；

(e)能够在严格条件下与(d)的DNA或它的互补链杂交的DNA；和

3.在藻类中具有启动子活性的分离的DNA，它具有：

在藻类中具有启动子活性的第一种分离的DNA，它选自下面的(a)-(c)：

(a)具有SEQ ID NO：9或它的一部分的核苷酸序列的DNA；

(b)能够在严格条件下与(a)的DNA或它的互补链杂交的DNA；和

(c)具有这样的核苷酸序列的DNA：其中，在(a)的DNA上取代，缺失，插入或添加了一个或多个核苷酸，和

具有在藻类中提高基因的转录效率的活性的第二种分离的DNA，它选自下面的(d)-(f)，并且，位于所述第一种分离的DNA下游，与其相邻或与其相隔一个1-10000个核苷酸的DNA片段：

(d)具有SEQ ID NO：10或它的一部分的核苷酸序列的DNA；

(e)能够在严格条件下与(d)的DNA或它的互补链杂交的DNA；和

4.如权利要求3所述的分离的DNA，它具有SEQ ID NO：3的87-1367号位置上的核苷酸序列。

5.在藻类中具有终止子活性的分离的DNA，它选自下面的(g)-(i)：

(g)具有SEQ ID NO：11或它的一部分的核苷酸序列的DNA；

(h)能够在严格条件下与(g)的DNA或它的互补链杂交的DNA；和

6.重组DNA，其中，将目的基因与下面(1)-(3)中的任意一个连接，以便所述基因能够表达：

(1)在藻类中具有启动子活性的分离的DNA，它选自下面的(a)-(c)：

(a)具有SEQ ID NO：9或它的一部分的核苷酸序列的DNA；

(b)能够在严格条件下与(a)的DNA或它的互补链杂交的DNA；和

(c)具有这样的核苷酸序列的DNA：其中，在(a)的DNA上取代，缺失，插入或添加了一个或多个核苷酸；

(2)在藻类中具有提高基因的转录效率的活性的分离的DNA，它选自下面的(d)-(f)：

(d)具有SEQ ID NO：10或它的一部分的核苷酸序列的DNA；

(e)能够在严格条件下与(d)的DNA或它的互补链杂交的DNA；和

(f)具有这样的核苷酸序列的DNA：其中，在(d)的DNA上取代，缺失，插入或添加了一个或多个核苷酸；和

(3)在藻类中具有终止子活性的分离的DNA，它选自下面的(g)-(i)：

(g)具有SEQ ID NO：11或它的一部分的核苷酸序列的DNA；

(h)能够在严格条件下与(g)的DNA或它的互补链杂交的DNA；和

7.如权利要求6的重组DNA，其中，将目的基因与下面的分离的DNA连接，以便所述基因能够表达，所述分离的DNA具有(1)的DNA和位于(1)的DNA下游的(2)的DNA，它与(1)的DNA相邻或与其相隔一个1-10000个核苷酸的DNA片段。

8.如权利要求7的重组DNA，其中，将目的基因与具有SEQ ID NO：3上从87到1367号位置的核苷酸序列的分离的DNA连接，以便所述基因能够表达。

9.如权利要求6的重组DNA，其中，所述目的基因选自核酸蛋白-编码核酸，反义核酸-编码核酸，诱饵-编码核酸和核糖酶-编码核酸。

10.包括下面的(1)-(3)中任意一个的载体：

(a)具有SEQ ID NO：9或它的一部分的核苷酸序列的DNA；

(b)能够在严格条件下与(a)的DNA或它的互补链杂交的DNA；和

(d)具有SEQ ID NO：10或它的一部分的核苷酸序列的DNA；

(e)能够在严格条件下与(d)的DNA或它的互补链杂交的DNA；和

(g)具有SEQ ID NO：11或它的一部分的核苷酸序列的DNA；

(h)能够在严格条件下与(g)的DNA或它的互补链杂交的DNA；和

11.如权利要求10的载体，它含有分离的DNA，所述分离的DNA具有(1)的DNA和位于(1)的DNA下游的(2)的DNA，它与(1)的DNA相邻或与其相隔一个1-10000个核苷酸的DNA片段。

12.如权利要求11的载体，它包括具有SEQ ID NO：3上从87到1367号位置的核苷酸序列的分离的DNA。

13.如权利要求10的载体，它是质粒载体或病毒载体。

14.一种藻类，其中转入了如权利要求6-9中任意一项所限定的DNA，或者用权利要求10-13中任意一项所限定的载体转化过。

15.编码具有延伸因子活性的多肽的分离的DNA，它选自下面的(j)-(l)：

(j)具有SEQ ID NO：1或它的一部分的核苷酸序列的DNA；

(k)能够在严格条件下与(j)的DNA或它的互补链杂交的DNA；和

16.编码具有延伸因子活性的多肽的分离的DNA，它选自下面的(m)-(o)：

(m)具有SEQ ID NO：2或它的一部分的核苷酸序列的DNA；

(n)能够在严格条件下与(m)的DNA或它的互补链杂交的DNA；和

17.编码SEQ ID NO：8的氨基酸序列的DNA。

18.编码具有延伸因子活性的多肽，并且具有这样的核苷酸序列的DNA：其中，在权利要求17所限定的DNA上取代、缺失、插入或添加了一个或多个核苷酸。