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CN1649607A - 一种从黑稻中提取花色素苷的方法及其组合物 - Google Patents

一种从黑稻中提取花色素苷的方法及其组合物 Download PDF

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CN1649607A
CN1649607A CNA038094126A CN03809412A CN1649607A CN 1649607 A CN1649607 A CN 1649607A CN A038094126 A CNA038094126 A CN A038094126A CN 03809412 A CN03809412 A CN 03809412A CN 1649607 A CN1649607 A CN 1649607A
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耶日·扎维斯托夫斯基
胡春
戴维·D·基茨
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Abstract

一种从黑稻(Oryza sativa L)中提取含有花色素苷的组合物的方法，包括：分离脱壳黑稻的外层与淀粉胚乳；向分离的外层中添加至少一种有机溶剂和酸的溶液；从分离的外层中过滤并除去溶剂和酸，产生色素级分；分离色素级分的组分；从中收集花色素苷组合物。该组合物可用于提高和/或保持HDL－C和致动脉粥样硬化脂蛋白如LDL－C、VLDL－C和IDL－C对于氧化的稳定性，用于预防、减少、消除或改善氧化应激造成的损伤，以及用于预防、减少、消除或改善动脉粥样硬化病变和与之相关的炎症的发展。

Description

一种从黑稻中提取花色素苷的方法及其组合物
发明领域
本发明涉及治疗或预防动物、特别是人的心血管疾病及其基础疾病，包括动脉粥样硬化、氧化应激和异常脂血症等症状或疾病的方法。
发明背景
科学技术的最新进展有助于提高人类的生活质量并延长寿命，动脉粥样硬化是心血管疾病(“CVD”)的一个原因，它的预防还没有被充分解决，仍是美国、欧洲和亚洲部分地区第一位的致死原因(1)。动脉粥样硬化是一种由遗传因素和环境因素(如饮食和生活方式)相互影响所引起的变性过程。迄今为止的研究提示，胆固醇可能在动脉粥样硬化中起作用，它在血管中形成动脉粥样硬化斑块，最后阻断对心肌或对脑或四肢的血液供应，这取决于斑块在动脉树中的位置(2，3)。综述指出，个体的总血清胆固醇减少1％会使发生冠状动脉事件的危险减少2％(4)。在统计学上，平均血清胆固醇降低10％(例如从6.0mmol/L降低到5.3mmol/L)在美国每年可以防止100,000例死亡(5)。因此，与总胆固醇和低密度脂蛋白(LDL)胆固醇浓度升高有关的高脂血症是重要的危险因素。
研究也表明，高密度脂蛋白(HDL)胆固醇的血浆浓度低是动脉粥样硬化发展的一个重要危险因素(6)，而高水平具有保护性。
脂蛋白是脂类和蛋白质通过非共价键结合在一起的复合物。每种脂蛋白类型具有特有的质量、化学组成、密度和生理作用。与密度或颗粒大小无关，循环的脂类包含胆固醇酯和甘油三酯核心以及由磷脂、游离胆固醇和载脂蛋白构成的外壳。载脂蛋白与脂蛋白的装配和分泌有关，提供结构的完整性、激活脂蛋白修饰酶，并且是多类受体和膜蛋白的配体。在血浆中发现的脂蛋白类别包括HDL、LDL、中密度脂蛋白(IDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)。
每种类型的脂蛋白都具有特有的载脂蛋白组成或比例。HDL中最主要的载脂蛋白是载脂蛋白-A I(apoA-I)，占蛋白质质量的约70％，apoA-II占另外20％。apoA-I与apoA-II的比例可以决定HDL的功能和抗动脉粥样硬化性质。循环的 HDL颗粒包含圆盘形和球形颗粒的多相混合物，质量为200-400千道尔顿，直径为7-10nm。
HDL是在血浆脂类转运中起作用的主要脂蛋白类别之一，在体内有多种功能，包括反向转运胆固醇、为胆汁酸合成提供胆固醇分子底物、转运群集素(clusterin)、转运对氧磷酶、预防脂蛋白氧化和肾上腺细胞对胆固醇的选择性摄取。与DHL结合的主要脂类包括胆固醇、胆固醇酯、甘油三酯、磷脂和脂肪酸。
为了更好地理解HDL是如何抗动脉粥样硬化的，简要解释 动脉 粥样硬化过程是必要的。当LDL被捕获到血管壁内时动脉粥样硬化过程开始。该LDL的氧化导致 单核细胞与血管壁的内皮细胞层结合。这些单核细胞被激活，迁移到内皮间隙，在那里它们转化为巨噬细胞，使LDL进一步氧化。氧化的LDL通过巨噬细胞上的清除剂 受体被摄取，导致 泡沫细胞的形成。通过动脉平滑肌细胞的增殖和迁移产生一个纤维帽，从而产生动脉粥样硬化斑块。
HDL是胆固醇从肝外组织向肝脏转运所必需的，在肝脏中它作为游离胆固醇或由胆固醇形成的胆汁酸分泌到胆汁中。该过程需要几个步骤。第一步是在肝脏和肠中形成新生的或前βHDL颗粒。过量的胆固醇通过ABCA I转运蛋白的作用穿过细胞膜移动至新生的HDL内。卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)将胆固醇转化为胆固醇酯，随后将新生的HDL转化为成熟的HDL。酯化的胆固醇然后被胆固醇酯转移蛋白(CETP)从HDL转移给含有脂蛋白的载脂蛋白-B，后者被肝脏中的大量受体摄取。新生的HDL通过肝脏甘油三酯脂肪酶和磷脂转移蛋白再生，并继续循环。除了来自外周细胞的胆固醇以外，HDL也接受来自LDL和红细胞膜的胆固醇。胆固醇反向转运的另外一个机制可能涉及胆固醇在胆固醇较少的膜与HDL或其它受体分子之间的被动扩散。
HDL通过胆固醇反向转运的作用以及可能通过阻止LDL氧化来防止动脉粥样硬化。有几种HDL结合酶参与这一过程。对氧磷酶(PON1)、LCAT和血小板活化因子乙酰水解酶(PAFAH)均通过水解LDL氧化过程中产生的磷脂氢过氧化物来参与，并且依次作用，阻止LDL中氧化脂类的积累。这些酶负责HDL的抗氧化和抗炎症性质。
尽管高胆固醇血症是CVD患者的一个重要危险因素，但是也必须考虑其它危险因素，如氧化应激和血清同型半胱氨酸增加(7)。动脉中这些有害成分的修饰将有利于形成治疗已发展或具有发展CVD危险、但未患高胆固醇血症的患者的新方法(8)。
已经证实，氧化应激在包括动脉粥样硬化在内的多种慢性病的启动和发展中具有重要作用(9)。活性氧成分(ROS)在所有需氧物种中普遍且天然存在，来自于内源性代谢生成和环境来源衍生的外源性来源。ROS是几乎不可区分的反应性分子，它们容易损伤生物大分子，包括DNA、蛋白质、碳水化合物和脂类(10)。过量或不受控制的ROS生成与不同阶段的动脉粥样硬化和CVD的发展有关，包括血管内皮细胞损伤、泡沫细胞形成、血管平滑肌增生、基因表达、血管舒缩的反应性损伤和斑块不稳定性(11，12a)。
在没有足够的内源抗氧化剂保护的情况下，自由基的增加能够导致亲核细胞组分的共氧化以及次级脂类自氧化产物与亲核大分子的反应。靶组织和血液中氧化应激指示剂的实例包括8-羟基脱氧鸟苷、丙二醛、4-羟基壬醛和脂类过氧化物，不仅包括脂肪酸氧化产物，而且包括胆固醇氧化产物。通过从特异性酶和非酶的细胞抗氧化系统全面去除并解毒ROS来实现对氧化应激的控制。例如，与脂类和氧自由基的解毒有关的酶抗氧化剂包括Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD；细胞质)、过氧化氢酶(过氧化物酶体)硒-谷胱甘肽过氧化物酶/还原酶氧化还原反应循环酶(细胞质和线粒体中的GSH-Px和GSHG-Red)和非硒谷胱甘肽-S-转移酶(细胞质)。非酶细胞抗氧化剂包括α-生育酚、抗坏血酸和β-胡萝卜素。
体外和体内研究的证据提示，LDL的氧化修饰与动脉粥样硬化的发生有关，并且加重其临床表现。动脉粥样硬化斑块中胆固醇氧化的具体产物已经被鉴定(12b)。因此，能够影响酶抗氧化剂活性或补体非酶抗氧化剂活性提高的抗氧化剂，特别是那些饮食来源的那些，作为能够防止产生ROS、从而防止发展为动脉粥样硬化和CVD的可能药物，已经受到相当的关注。
几十年前就有人建议以稻米饮食治疗CVD。在50年以前，已经报道食用白稻米可降低血压，并且减少人类的高胆固醇血症(13)。然而，有许多不同种类的稻米。到目前为止，人类食用的最常见的稻米是白稻(85％以上)，其次是红稻和黑稻。后两者主要在南亚、希腊、意大利和美国种植。欧洲比南亚食用更多的有色稻米(14)，有色稻米在中国已经有很长的食用历史，被认为是一种增强体力的健康食物。因此，通常称其为“血液增强米”或“药米”。
黑稻的色素水平为每100g稻米1mg，每100g含有3mg维生素C和0.2mg核黄素，与不含色素的稻米相比含有更多的铁、钙和磷。在印度的喀拉拉，品种Navara被认为具有医药特性，用来恢复瘫痪病人的神经；oridine是稻米中存在的一种生物碱，当不纯时具有一定的抗神经官能症特性。
黑稻领域以前的研究集中于黑稻色素作为着色剂(中国专利号93109627.8)、添加黑稻色素的饮料和食品(中国专利号93109627.8)的制备和用途，以及全黑稻和红稻饮食对血清脂类和主动脉斑块的作用(15)。
本发明的一个目的在于消除或减少本领域已知的化合物和组合物在治疗和预防CVD及其所有基础疾病(包括动脉粥样硬化、氧化应激和血脂障碍疾病)方面的缺点和不足。本发明的另外一个目的是处理黑稻，以优化其各种疗效。
发明概述
本发明一方面提供一种从黑稻(Oryza sativa L)中提取含有花色素苷的组合物的方法，包括：
a)分离脱壳黑稻的外层与淀粉胚乳；
b)向分离的外层中添加至少一种有机溶剂和酸的溶液；
c)从分离的外层中过滤并除去溶剂和酸，产生色素级分(fraction)；
d)分离色素级分的组分；和
e)从中收集花色素苷组合物。
本发明还包括含有来自黑稻的花青素-3-O-葡糖苷和甲基花青素-3-O-葡糖苷的组合物。
本发明还提供一种治疗或预防动物的心血管疾病及其基础疾病(包括动脉粥样硬化、炎症、高脂血症、低α脂蛋白血症、高胆固醇血症和氧化应激)的方法，包括施用通过本发明提取方法制备的组合物。
本发明还提供一种治疗或预防动物心血管疾病及其基础疾病(包括动脉粥样硬化、炎症、高脂血症、低α脂蛋白血症、高胆固醇血症和氧化应激)的方法，包括施用含有来自黑稻的花青素-3-O-葡糖苷和甲基花青素-3-O-葡糖苷的组合物。
本发明方法的一个关键是发现黑稻的治疗活性成分花色素苷可以最方便地从分离的稻米颗粒外层中提取。花色素苷的分布显然与颗粒的深度有关，最外层含有最高水平的花色素苷。以前已知的从黑稻中提取花色素苷的方法没有认识到这个重要的优点。
这些效果和其它一些显著优点在下文更详细地描述。
附图简述
本发明通过下列非限制性附图进行说明，其中：
图1是显示水稻颗粒横切面上成分的图；
图2是黑稻提取物的Bio-Gel P-2洗脱色谱图，峰1和峰2随后分别通过LC/MS鉴定为甲基花青素-3-葡糖苷和花青素-3-葡糖苷；
图3是黑稻提取物的Bio-Gel P-2冼脱色谱图；
图4是黑稻提取物的Bio-Gel P-2洗脱色谱图，一个峰随后被LC/MS鉴定为甲基花青素-3-葡糖苷；
图5是黑稻提取物的Bio-Gel P-2洗脱色谱图，一个峰随后被LC/MS鉴定为花青素-3-葡糖苷；
图6是显示黑稻提取物对DPPH自由基抑制作用的图；
图7的曲线图显示37℃下黑稻提取物对过氧化氢自由基诱导的脂质体过氧化反应中共轭二烯形成的影响；
图8显示黑稻提取物在抑制被氧化修饰LDL之负电荷方面作用的琼脂糖凝胶电泳结果，其中第1道＝天然LDL，第2道＝LDL+二价铜离子，第3-7道＝LDL+二价铜离子与黑稻提取物，第8道＝LDL+二价铜离子和EDTA；
图9的柱形图显示人LDL的体外LDL氧化修饰抑制(CD和TBARS)；
图10显示黑稻提取物在预防过氧化氢自由基诱导的超螺旋DNA断裂方面作用的琼脂糖凝胶电泳结果，其中S＝超螺旋DNA，第1道＝DNA+PBS，第2道＝DNA+AAPH，第3、4、5和6道分别＝DNA+AAPH+1、10、25、100μg/ml黑稻提取物，第7、8道分别＝DNA+AAPH+1、10μg/ml TroloxTM；
图11显示甲基花青素-3-葡糖苷与花青素-3-葡糖苷(10μg/ml)组合在减少过氧化氢自由基诱导的DNA断裂损伤方面作用的琼脂糖凝胶电泳结果，其中第1、2道分别＝天然和氧化的DNA，第3、4、5、6和7道分别＝DNA+AAPH及9/1、4/1、1/1、1/4和1/9的花青素-3-葡糖苷和甲基花青素-3-葡糖苷，第8道＝DNA+AAPH及10μg/mlTroloxTM；
图12显示黑稻提取物在防止过氧化氢自由基(非位点特异性)诱导DNA产生切口方面的作用的琼脂糖凝胶电泳结果，其中第1道＝DNA+PBS，第2道＝DNA+羟基自由基引发剂，第3、4道分别＝DNA+羟基自由基引发剂+1.7、17mg/ml黑稻提取物(第一层)，第5、6道分别＝DNA+羟基自由基引发剂+1.7、170mg/ml整个黑稻颗粒的提取物，第7、8道分别＝DNA+羟基自由基引发剂+0.17、1.7mg/ml TroloxTM；
图13显示黑稻提取物在防止羟基自由基(位点特异性)诱导DNA产生切口方面作用的琼脂糖凝胶电泳结果，其中第1道＝DNA+PBS，第2道＝DNA+羟基自由基引发剂，第3、4道分别＝DNA+羟基自由基引发剂+1.7、17mg/ml黑稻提取物(第一层)，第5、6道分别＝DNA+羟基自由基引发剂+1.7、170mg/ml整个黑稻颗粒的提取物，第7、8道分别＝DNA+羟基自由基引发剂+0.17、1.7mg/ml TroloxTM；
图14的柱形图显示用黑稻提取物进行的细胞生存力实验；
图15的柱形图显示黑稻提取物对肝脂肪酶活性的抑制；
图16显示不同处理组小鼠随时间变化的体重；
图17显示不同组的动脉粥样硬化斑块面积。在16周后进行动脉粥样硬化程度的定量。通过用油红O染色病变部分来测量窦中粥样硬化病变的面积。数值是平均值±SD，n＝15。没有共同字母的柱具有显著差异，P＜0.01；
图18显示本发明黑稻级分对小鼠巨噬细胞RAW264.7中细菌脂多糖刺激的一氧化氮抑制的影响；和
图19显示本发明黑稻提取物对诱导型一氧化氮合酶表达影响的琼脂糖凝胶电泳结果。
本发明的优选实施方案
以下详述旨在帮助本领域技术人员实施本发明。然而，此详述不应被视为不适当地限制本发明的范围。在不背离本发明精神或范围的条件下，本领域技术人员可以对此处所述实施方案进行修饰和改变。
提取方法
本发明提供了一种从黑稻(Oryza sativa L)中提取含有花色素苷的组合物的方法，包括分离脱壳黑稻的外层与淀粉胚乳；向分离的外层中添加至少一种有机溶剂和酸的溶液；从分离的外层中过滤并除去溶剂和酸，产生色素级分；分离色素级分的组分；从中收集花色素苷组合物。
用于本发明方法的原材料是脱壳的黑稻。稻谷的脱壳可以用本领域公知的多种方法进行。通常为手工(手工捣碎)或机械脱壳。机械脱壳机有3种主要类型：Engelberg磨、石头脱壳机和橡胶脱壳机。石头脱壳机在热带亚洲仍然常见。橡胶脱壳机在日本常见，在日本贮存脱壳的稻米而不是稻谷，从而节省空间。
本发明方法的第一步是关键步骤，包括分离脱壳黑稻的外层与淀粉胚乳。为了更好的理解，图1显示了水稻颗粒横切面上的基本成分。在脱壳过程中除去外壳成分，例如纤维素和半纤维素后，通常保留的是位于淀粉胚乳之外的果皮、内种皮和糊粉层。在本发明范围内，希望分离该外“糊粉”层，并从中提取花色素苷组合物。迄今为止，整个水稻颗粒已经在花色素苷提取方法中使用，但是该外层从未使用过。
外层与淀粉胚乳的分离优选通过物理分离、最优选通过碾磨实现。在有色稻的生产和精制过程中已经使用的多种类型碾磨，在此也可以使用。在这些当前已知的生产中，通常弃去外层，因为消费者购买脱壳、碾磨、然后磨光的稻米颗粒。在本发明范围内，回收碾磨的材料，并且最后从中提取花色素苷组合物。
有许多常用的碾米机，从单通道Engelberg磨到多通道系统。在本发明范围内，可以使用包括手工捣碎的手工技术，以及利用研磨和摩擦的机器碾磨。最优选地，使用一种利用物理刮摩的磨。Satake USAInc.和Buhler AG提供了合适磨的实例。
细长谷粒比粗大(厚)谷粒需要较低的碾磨压力，因为它们的糊粉层较薄。进行碾磨，直到基本上所有外层(包括糊粉层)都被除去。该层通常包含水稻颗粒的5-15％。在一个优选形式中，作为确定碾磨过程终止的一个指标，人们可以测量大约水稻颗粒的10％。此外，人们也可以评价颗粒颜色的改变，在颗粒相对于原材料变得轻度着色时终止该碾磨过程。可以根据需要的颗粒深度调整加工。
在本发明范围内可以利用日本稻米工业引入的创新，包括根据所需碾磨和胚芽稻米碾磨的程度，微型计算机控制碾磨。在1976年引入的一种胚芽碾米机在极低压力下使用以轻柔地研磨辗压，使得80％以上谷粒的胚芽保持完整。这样，能够获得较高的经济效率，因为用外层来提取治疗上有用的花色素苷组合物，颗粒的其余部分可以作为商品出售。
表1显示完整黑稻和Shimzu磨碾磨的黑稻外层级分的大致分析，用于比较：
    黑稻(外层)   黑稻(完整颗粒)
    蛋白质g/100mg     17   10.0
    脂肪g/100mg     9.8   2.0
    水分g/100mg     8.3   11.0
    灰分g/100mg     7.6   1.4
    碳水化合物g/100mg     57.0   76.0
    能量千焦耳/100mg     1610   1510
显然，每100mg外层级分比完整颗粒含有更高浓度的养分。
表2  显示黑稻的完整颗粒及其各级分中花色素苷的比较性分布
    级分     Mg/kg
    完整颗粒     1645±25
    第一层     13,567±802
    第二层     3850±876
    内核     70±9
现发现，花色素苷(花青素-3-葡糖苷和甲基花青素-3-葡糖苷的组合)的分布与颗粒深度有关，从淀粉胚乳上分离的第一层含有最高含量的花色素苷。这一发现提供了优化花色素苷回收的独特机会。
本发明方法的第二步包括向分离的外层中添加至少一种有机溶剂和酸的溶液。该有机溶剂优选选自醇、酮、烃和水。
酮选自具有通式RCOR1的酮，其中R和R1是烷基。烷基优选是C1-C6基团。酮最优选是2-丙酮。烃可选自所有C5-C10烃。最优选烃是己烷。醇选自具有通式R-CHOHR、R-CH2OH和RCOH的醇，其中R是C1-C4烷基。最优选醇是甲醇或乙醇。
酸可以是任何无毒的、足以达到所需pH范围的食用酸。酸优选选自盐酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸和低浓度硫酸。优选加入足量的酸，使pH为1-4。优选将分离的外层浸入溶剂中1-10小时，温度为25-40℃。优选溶剂与稻米之比为30/1到100/1(体积/重量)。
本发明方法的第三步包括从分离的外层中过滤并除去溶剂和酸，产生色素级分。尽管其它一些方法显然也在本发明范围内，例如真空干燥和冷冻干燥，但优选通过滤液提取来除去溶剂，通过蒸发(例如旋转蒸发)除去酸。
本发明方法的第四步和第五步包括分离并收集色素级分的组分。优选通过分级来实现分离。最优选地，可以使用如柱层析的方法(例如聚酰胺凝胶过滤)。在此阶段，分级后收集两个主要级分，一个含有花青素-3-葡糖苷，另一个含甲基花青素-3-葡糖苷。
分离后根据需要可以用高压液相色谱(HPLC)、液相色谱/质谱法(LC/MS)确定级分。图2是黑稻提取物的Bio-Gel P-2洗脱色谱图，第1峰和第2峰随后用LC/MS分别鉴定为甲基花青素-3-葡糖苷和花青素-3-葡糖苷。
可以根据本发明使用的优选黑稻品种包括但不限于：Wu Gong、Shang-nong、Hei Xiang Geng Nuo、Zhen Xi Hei Mi、Dong Bei Nuo149、Ao Yu Nuo 349、Hong280、Hong 463和Xiang Xue Nuo。
花色素苷组合物
本发明包括含有来源于黑稻的花青素-3-O-葡糖苷和甲基花青素-3-O-葡糖苷的组合物。这些组合物包括此处所述的提取和纯化方法产生的组合物，以及从头合成的其中两种成分的比例如下文所述的组合物(即不一定来源于该方法)。
花青素-3-O-葡糖苷和甲基花青素-3-O-葡糖苷的结构如下：
Figure A0380941200141
花青素-3-葡糖苷                                        甲基花青素-3-葡糖苷
在一个优选实施方案中，本发明组合物含有花青素-3-葡糖苷和甲基花青素-3-葡糖苷，其比例为10∶1，更优选6∶1，更优选3.5∶1到6.5∶1。最优选地，该比例为4∶1。
在本发明范围内，用于制备这些组合物的花青素-3-葡糖苷和甲基花青素-3-葡糖苷可以从多种来源中提取或获得，包括但不限于黑稻、黑色水果来源(如黑莓和黑醋栗)、黑豆、黑色种子如芝麻，和黑色谷物如黑麦。另外，其它来源包括红醋栗和红稻。
在本发明的一个实施方案中，为了获得具有如上所述的优选花色素苷比例的组合物，一种最优选的方法是“混合”不同来源的花色素苷。这样，人们可以利用来自一个来源的特别高水平的一种成分，而另一个来源可以富含另一种需要的成分。
与抗氧化剂和/或植物甾醇组合
在另外一个实施方案中，本发明的组合物可以与一种或多种抗氧化剂在施用混合、共同施用或以一定时间间隔分开施用。合适的抗氧化剂包括但不限于：维生素E、β-胡萝卜素、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、茶儿茶素、螯合剂如柠檬酸、EDTA、苯丙氨酸、磷酸、酒石酸和色氨酸；优先氧化的化合物，如抗坏血酸、亚硫酸氢钠和亚硫酸钠；水溶性链终止剂如硫醇，和脂溶性链终止剂如没食子酸烷基酯、棕榈酸抗坏血酸酯、叔丁基氢醌、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、氢醌、去甲二氢愈创木酸和α-生育酚。可以认为，这些抗氧化剂与本发明花色素苷组合物的组合启动并保持有益的抗氧化作用。
在另外一个实施方案中，本发明组合物可以与一种或多种甾醇或甾烷醇在施用混合、共同施用或以一定时间间隔分开施用。
此处所用的术语“甾醇”非限制性地包括所有甾醇，例如：谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇(包括二氢菜子甾醇)、链甾醇、chalinosterol、多孔甾醇、穿贝海绵甾醇、麦角甾醇、粪甾醇、codisterol、异岩藻甾醇、岩藻甾醇、贞桐甾醇、nervisterol、7-烯胆甾烷醇、星鱼甾醇、菠菜甾醇、chondrillasterol、peposterol、燕麦甾醇(avenasterol)、异燕麦甾醇(isoavenasterol)、fecosterol、pollinastasterol、胆固醇，及其所有天然或合成形式和衍生物，包括异构体。术语“甾烷醇”是指饱和的或氢化的甾醇，包括它们的所有天然或合成形式和衍生物，以及异构体。可以认为，本发明范围也包括对甾醇和甾烷醇的修饰，例如使之包含侧链。例如，本发明范围内显然包括24β-乙基胆甾烷醇(24β-ethylchlostanol)、24-α-乙基-22-脱氢胆甾烷醇(24-α-ethyl-22-dehydrocholstanol)。也可以认为，当对本说明书有疑问时，除非另外说明，术语“甾醇”包括甾醇和甾烷醇。在一个最优选的形式中，甾醇是其饱和形式，并且是谷甾烷醇。
本发明使用的这些甾醇和甾烷醇可以来自多种天然来源。例如，可以从植物油(包括水生植物)加工中获得，如玉米油和其它植物油、麦胚油、大豆提取物、稻米提取物、稻糠、菜子油、向日葵油、芝麻油和鱼(和其它海产来源)油。它们也可以来源于真菌例如麦角甾醇，或动物例如胆固醇。因此，本发明不限于任何甾醇来源。美国专利系列号4,420,427描述了利用溶剂(如甲醇)由植物油浆制备甾醇。此外，如美国专利系列号5,770,749所述，植物甾醇和植物甾烷醇也可以获自妥尔油树脂或皂类、林业操作的副产物，该美国专利在此引用作为参考。
可以认为，这些甾醇和/或甾烷醇与本发明花色素苷组合物的组合至少产生加合作用，也可能是协同和补充治疗作用，特别是在脂类调节中。虽不受关于作用机制的任何一种理论所限制，这可能是由于每种成分的脂类靶标不同。例如，证明甾醇和甾烷醇是降低血清LDL-C的有效药物，而它们在提高血清HDL-C方面几乎没有功效。相反，发现本发明花色素苷和甾醇/甾烷醇组合物有效且相当充分地使HDL-C和LDL-C稳定免遭氧化。另外，花色素苷成分与甾醇/甾烷醇成分对动脉粥样硬化性病变发展的减少和基本停止具有补充作用。
疗效
在本发明的第一个实施方案中，提供了一种治疗或预防动物(优选人)的心血管疾病及其基础疾病(包括动脉粥样硬化和与之有关的炎症和氧化应激)的方法，包括对动物施用治疗有效量的来自黑稻的含有花青素-3-葡糖苷和甲基花青素-3-葡糖苷的组合物。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种治疗或预防动物(优选人)的心血管疾病及其基础疾病(包括动脉粥样硬化、炎症、高脂血症、低α脂蛋白血症、高胆固醇血症和氧化应激)的方法，包括对动物施用治疗有效量的来源于黑稻的含有花青素-3-葡糖苷和甲基花青素-3-葡糖苷的组合物，以及任选的一种或多种植物甾醇或植物甾烷醇和/或一种或多种抗氧化剂。
这些组合物包括这样的组合物，其中：
1)花色素苷成分来源于此处所述的提取和纯化方法；
2)花色素苷成分是从头合成的，两种花色素苷成分的比例如此处所述；和
3)花色素苷成分从一种以上的来源中提取并纯化，例如黑稻、黑豆、黑种子、黑莓，并且混合达到所需的花青素-3-葡糖苷与甲基花青素-3-葡糖苷的比例。
术语“治疗有效的”用来限定为了达到一个或多个下列目的而施用的组合物量：
a)提高和/或保持HDL对于氧化的稳定性；
b)提高和/或保持LDL、VLDL或IDL对于氧化的稳定性；
c)提高和/或保持甘油三酯(TG)对于氧化的稳定性；
d)预防、减少、消除或改善异常脂性疾病；
e)预防、减少、消除或改善高胆固醇血症、低α脂蛋白血症；
f)预防、减少、消除或改善粥样硬化病变的发展；
g)预防、减少、消除或改善与心血管疾病和冠状动脉病发展有关的炎症的发展；
h)预防、减少、消除或改善以血浆DHL缺乏或LDL、VLDL、Lp(a)、β-VLDL、IDL或其余脂蛋白过量为基础或使其加重的任何症状、疾病或紊乱；和
i)预防、减少、消除或改善氧化应激引起的损伤。
由下列实施例可以清楚地看出，通过大量检测证明，本发明的组合物显示强抗氧化剂作用，可有效减少动脉粥样硬化斑块的形成。
现发现，当治疗性施用时，本发明的花色素苷组合物可以：
1)增强和/或保持HDL-C和致动脉粥样硬化脂蛋白如LDL-C、VLDL-C和IDL-C对于氧化的稳定性；
2)预防、减少、消除或改善氧化应激引起的损伤；
3)预防、减少、消除或改善动脉粥样硬化病变的发展；和
4)预防、减少、消除或改善与动脉粥样硬化、冠状动脉疾病(CAD)和心血管疾病(CVD)有关的炎症。这是非常关键的，因为最近发现，由于炎症，CAD和CVD在明显低危人群中发生。最近的证据也提示，动脉的炎症可能是未来心脏病发作和中风的一个重要指征。当身体响应损伤或感染时，发生炎症。
现发现，当治疗施用时，本发明的花色素苷和植物甾醇/植物甾烷醇组合物可以：
1)预防、减少、消除或改善动脉粥样硬化病变的发展；
2)调节或控制血浆脂蛋白；
3)预防、减少、消除或改善多种症状和疾病，包括但不限于：心血管疾病及其基础疾病，包括动脉粥样硬化、血脂障碍症状或疾病、高胆固醇血症、低α脂蛋白血症、动脉粥样硬化病变和中毒性休克综合征的发展；和
4)预防、减少、消除或改善血浆DHL缺乏或LDL、VLDL或IDL过量为基础或使其加重的多种症状或疾病。
使用方法
本发明的组合物可以通过任何常规方法与药品、营养品、食物、饮料等联合施用。
不限制以上所述的普遍性，本发明的组合物可以与各种载体或佐剂混合，以有助于直接施用或向食品、饮料、营养品或药品中掺入该组合物。为了认识输送这些组合物的各种可能的载体，提供了下面的例子。组合物的剂量随输送方式、患者体重和病情、欲达到的结果以及食品添加剂和药用制剂领域技术人员公知的其它因素。
此处所述的所需效果可以通过多种不同方法获得。这些组合物可以通过任何可以使用的常规方法与药品、营养品、食品、饮料等联合施用。
获得所需效果需要的组合物的量当然取决于许多因素，如组合物的具体组成分布、施用方式和患者的病情。
1)药品剂型：
本发明的组合物可以直接施用于患者，或者与适当载体或赋形剂混合以药物组合物的形式施用。
本发明范围包括使用药物可接受载体将本发明组合物配制成适于全身施用的剂型。通过适当选择载体和适当的生产方法，本发明组合物，特别是配制为溶液的组合物，可以肠胃外施用，如静脉内注射。这些组合物能够用本领域公知的药物可接受载体容易地配制成适于口服的剂型。这些载体能使本发明组合物配制为片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬液等，以便被治疗的患者口服。
含有一种或多种本发明组合物的药物制剂包括含有达到预期目的的有效量活性成分的制剂。本领域技术人员，特别是根据此处提供的详细公开内容，能够确定有效的量。
除了活性成分之外，这些药物组合物还可含有适当的药物可接受载体，包括有利于将活性成分加工成药用制剂的赋形剂和助剂。为了口服，配制的制剂可以是片剂、锭剂、胶囊或溶液的形式。
本发明的药物组合物可以用已知方法生产，例如常规混合、溶解、颗粒化、锭剂形成、研细、乳化、包封、截留或真空冻干法。
用于肠胃外施用的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的悬液也可以被制成适当的油状注射悬液。合适的亲脂溶剂或载体包括脂肪油，如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水注射悬液可以含有提高悬液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬液也可以含有适当的稳定剂或提高化合物溶解性的试剂，以制备高度浓缩的溶液。
用于口服的药物制剂可以如下获得：将活性化合物与固体赋形剂混合，任选地研磨所得混合物，加工颗粒混合物，必要时加入适当的助剂，之后获得片剂或锭剂核。具体而言，适当的赋形剂有：填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素制品，如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。必要时可以加入崩解剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或褐藻酸或其盐，如褐藻酸钠。
锭剂核具有适当的包衣。为此，可以使用浓缩的糖溶液，其任选含有阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆用溶液和适当的有机溶剂或溶剂混合物。为了标识或表征活性化合物剂量的不同组合，可以向片剂或锭剂包衣中加入染料或色素。
能够口服的药物制剂包括由明胶制成的推入配合(push-fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨糖醇)制成的密封软胶囊。推入配合胶囊可以含有与下列成分混合的活性成分：填充剂如乳糖，粘合剂如淀粉，和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁，和任选地稳定剂。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮于适当的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外也可以添加稳定剂。
口服液体制剂可以是如下形式：例如乳剂、糖浆或酏剂，或者可以作为干燥产品，在使用前用水或其它适当的载体重建。这些液体制剂可含有常规添加剂，如悬浮剂，例如山梨糖醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶、氢化的食用脂；乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨糖醇单油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(可包括食用油)，例如杏仁油、分馏的椰子油、油酯，如甘油、丙二醇或乙醇的酯；防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸；需要时，常用的调味剂或着色剂。
在本发明的范围内可以预期，本发明的组合物可以与常用赋形剂和/或稀释剂和稳定剂一起掺入各种常规药物制剂和剂型中，如用于口服、含服或舌服的片剂(普通的和包衣的)，胶囊(明胶硬胶囊和软胶囊，有或没有另外的包衣)，粉剂，颗粒(包括泡腾颗粒剂)，小丸剂，微颗粒，溶液(如微团、糖浆、酏剂和滴剂)，锭剂，软锭剂，安瓿针剂，乳剂，微乳剂，软膏，膏剂，栓剂，凝胶，透皮贴剂和改良的释放剂型。
适合加到上述适当剂型中的本发明组合物，可以通过口服、注射(静脉内、皮下、腹膜内、皮内或肌肉内)、局部或其它方式，对动物(包括人)施用。
本发明组合物的具体施用方式在所有情况下都取决于施用方案的目的。对于已有症状和疾病，取决于疾病的严重性，以及如上所述个体的年龄、体重和性别。本领域技术人员可以确定适当的剂量和施用进度。
2)食物/饮料/营养品
在本发明的另一种形式中，本发明组合物可以被掺入食物、饮料和营养品中，用于持续的预防用途，包括但不限于下列：
1)乳制品—如乳酪、牛奶和其它牛奶饮料、涂抹食品和牛奶混合物、冰淇淋和酸乳酪；
2)基于谷物的产品—包括谷物(例如面包、食用面、饼干和压块干粮)，无论这些物品是烹煮、烘烤或以其它方法加工的；
3)甜食—如巧克力、糖块、口香糖、甜点、非奶制浇头(toppings)(例如Cool WhipTM)、果汁冰糕、糖衣和其它填充剂；
4)饮料—酒精或非酒精饮料，包括可乐和其它软饮料、果汁饮料、食品添加物和代餐饮料，如商标为BoostTM和EnsureTM的饮料；
5)其他产品—包括加工的食物，如汤、预制的意大利面食沙司、预制食物等。
本发明的组合物可以通过如混合、输注、注射、掺合、分散、乳化、浸没、喷射和揉捏等技术直接掺入食物、营养品或饮料中，不需要进一步修饰。此外，这些组合物也可以在食用前由消费者直接加到食物上或饮料中。这是简单、经济的施用模式。
实施例
本发明通过下列非限制性实施例描述：
实施例1：花色素苷的提取和分离
通过POS(Saskatchewan)中的Shimzu Mill从Wu Gong黑稻中分离出外层。黑稻级分在含1％HCl的甲醇中中浸泡过夜。使用4号Whatman滤纸过滤提取物。在40℃下通过旋转蒸发除去甲醇。获得的色素级分加到用乙酸酸化为pH2.5的水填充的Bio-Gel P-2柱(2.5×45cm)上。
该柱用酸化至pH2.5的水以1ml/min的流速洗脱，用分部收集器收集级分(5ml/管或5min/管)。在520nm下监测样品。收集两个主要级分，在真空下浓缩以备鉴定。
实施例2：花色素苷的定量和鉴定
进一步使用标准参照(花青素-3-葡糖苷和甲基花青素-3-葡糖苷)通过HPLC和LC/MS分析实施例1的两个主要级分。HPLC用配备有自动采样器和柱加热器的Waters Alliance 2690系统进行。HPLC的条件如下：在40℃下使用Waters Xterra MS C18柱(2.1×50mm，2.5μm)，注射5μl，溶剂A是100％甲醇，溶剂B是5％甲酸水溶液。A的浓度在5分钟内从20％降到4％。流速设置为0.4ml/min。使用Waters996 PDA检测器，波长设定为200-600nm。
利用与Waters 2690分离模块偶联的电喷射质谱法对黑稻级分进行LC/MS分析。PDA显示，利用这种Bio-Gel P-2层析，获得保留时间和光谱都能够区别的两段(图3、4、5)。图3显示Bio-Gel P-2分离后的级分I和级分II。
实施例3：抗氧化剂活性DPPH自由基清除试验
黑稻的第一层、第二层和整个颗粒的自由基清除活性在乙醇溶液中用稳定的自由基1，1-联苯-2-苦基(“DPPH”)评价。当与其它自由基清除剂，特别是基本抗氧化剂(氢供体)反应时，DPPH将改变为非自由基形式。利用光谱测定法测定醇溶液中DPPH的消失。
图6显示每层和整个颗粒对DPPH自由基抑制的影响。显然，在检测的每个浓度下，第一层是突出的。
实施例4：抗氧化剂活性脂质体模型
在脂质体模型中评价本发明花色素苷组合物的自由基清除活性，其中磷脂的氧化由2，2-偶氮二(∝-脒基丙烷)二盐酸盐(“AAPH”)的热分解作用诱导。通过连续监测37℃下共轭二烯氢过氧化物的形成，进行该试验。
图7显示不同浓度的花色素苷组合物防止共轭二烯氢过氧化物形成的效能，10μg/ml以上是最有效的。
实施例5：LDL氧化的抑制
对本发明花色素苷组合物防止LDL的氧化进行了评估。由于ox-LDL的下调修饰，LDL的氧化修饰是动脉粥样硬化发展中的一个关键步骤。LDL颗粒的修饰导致巨噬细胞形成泡沫细胞，随后在血管内皮上形成负载(laden)和斑块。因此，减少LDL被认为是心血管疾病预防中的一个重要步骤。通过透析除去过渡金属离子，与Cu2+离子在37℃下共温育一段时间启动LDL的氧化。用不同方法监测LDL氧化，包括琼脂糖凝胶电泳、共轭二烯和硫代巴比妥酸反应底物的形成。图8中的结果显示，添加本发明花色素苷组合物缩短了电泳迁移的距离，表明被氧化修饰LDL的负电荷增加受到抑制。
而且，共轭二烯和硫代巴比妥酸反应底物的形成也减少(图9)，提示初次和二次脂过氧化产物的产生也受到本发明的花色素苷组合物的抑制。另外也评估了HDL的氧化。如琼脂糖凝胶电泳所测定的，添加本发明花色素苷组合物阻止了过氧化氢自由基诱导的HDL修饰。
实施例7：DNA氧化的抑制
研究了花色素苷组合物对氧化性自由基(如过氧化氢自由基和羟自由基)诱导的DNA氧化(位点特异的和非位点特异的)的抑制作用。图10显示过氧化氢自由基导致超螺旋DNA链消失，添加花色素苷组合物或标准抗氧化剂Trolox使这种损伤部分恢复。以不同的比例联合添加花青素-3-葡糖苷和甲基花青素-3-葡糖苷得到类似的效果(图11)。
本发明的黑稻提取物或组合物抑制非位点特异性和位点特异性羟自由基诱导的DNA断裂(图12和13)。在羟自由基模型中，通过抗坏血酸介导的Fenton反应产生羟自由基。发现黑稻提取物可清除位点特异性模型中产生的羟基自由基，也证明其在位点特异性羟基自由基模型中螯合过渡金属离子。
实施例8：细胞存活力试验
该试验的目的在于确定本发明提取物是否对细胞培养物提供抗自由基诱导的细胞毒性的保护。THP-1是一种人白血病细胞系(ATCC)，其中添加亚铁离子(作为氧化刺激物)通过Fenton反应机制引起氧化应激导致细胞死亡(图14)。本发明黑稻提取物的添加以浓度依赖的方式减少细胞死亡。
实施例9：肝脂肪酶抑制
本发明的提取物(在图15中被称为第1层)抑制肝脂肪酶活性。肝脂肪酶水解HDL磷脂和甘油三酯，而肝素后血浆肝脂肪酶活性与血浆HDL-C水平成反比。因此，结果表明，富含花色素苷的本发明提取物可能增加体内HDL。
实施例10：防止DNA切口的产生
在该试验中使用过氧化氢自由基和羟自由基，通过使用TAE缓冲液(40mM Tris-乙酸酯，2mM EDTA，pH8.5)的含有0.5μg/ml溴化乙锭的0.7％琼脂糖凝胶电泳来评估本发明黑稻提取物在预防DNA断裂中的作用。用台式紫外线透照灯(UVP Inc.，Upland，CA)显示DNA带，用Lab Work软件(UVP Inc.，Upland，CA)分析带密度。按下式计算DNA切口产生的抑制：
％Inh＝(D天然-D样品)/(D天然-D氧化)×100
D天然、D氧化、D样品分别代表不含AAPH的DNA、含AAPH的DNA和含AAPH和待测样品的DNA的密度。
DNA的完整性对于细胞分裂和存活至关重要。已经显示DNA在体内易受氧化损伤，导致破坏转录、翻译和DNA复制，最终突变和细胞死亡。例如，Schneider等人[19]证明羟基自由基参与DNA损伤，提示早期羟基自由基与诱变和致癌过程有生物学关联。过渡金属-抗坏血酸-过氧化氢系统产生序列依赖性DNA损伤，鸟嘌呤优先氧化，提示活性氧成分的局部产生是金属与DNA特定区域结合的结果。以前的报道显示，DNA切口产生试验是一种可用于评价抗氧化剂对抗活性氧成分诱导DNA退化(包括羟自由基和过氧化氢自由基)之活性的有用手段[20](Kitts等人，1999)。
在本研究中，我们采用了非位点特异性和位点特异性羟自由基的概念，并将其用于DNA断裂分析中(图10和11)。显然，无论是位点特异的还是非位点特异的，羟基自由基都能破坏超螺旋DNA链的完整性(图10的第2道)。
在这种羟基自由基诱导的DNA切口产生试验中，黑稻提取物对非位点特异性自由基的预防高于位点特异性自由基(表3)。
表3.黑稻提取物对防止羟基自由基诱导DNA切口产生的抑制百分比
    μg/ml    花色素苷含量(％)1     非位点特异的     位点特异的
    完整稻米1001000级分10100Trolox0.171.7    1.36±0.010.16±0.02 65.783.954.482.844.080.8 51.474.149.069.525.761.0
1用花青素-3-葡糖苷和甲基花青素-3-葡糖苷作为外标准，通过LC-MS测定。
还需要注意的是，防止超螺旋DNA被羟基自由基诱导产生切口也与黑稻中的花色素苷分布有关，即含有较高含量花色素苷的黑稻外层与完整稻米相比抑制羟基自由基诱导DNA损伤的能力较高(表3)。标准抗氧化剂Trolox也显示类似的趋势，即对非位点特异性羟基自由基所诱导DNA损伤的抑制较高(表3)，证实序列特征与羟基自由基诱导的DNA链断裂有关。羟基自由基诱导DNA切口产生的意义在于，在细胞核中可能存在Fenton反应成分如过氧化氢和过渡金属离子，其诱导与DNA断裂有关的细胞毒性。
表4.黑稻和花色素苷在防止超螺旋DNA链遭受过氧化氢自由基诱导断裂方面的作用
样品  ％Inh
黑稻级分，1μg/ml10μg/ml25μg/ml100μg/ml  1.0±0.77.4±0.325.8±8.782.2±7.8
花青素-3-葡糖苷∶甲基花青素-3-葡糖苷9∶14∶11∶11∶49∶1 63.2±1.650.4±2.138.7±0.350.2±0.640.7±0.0
Trolox    10μg/ml  100
在我们的研究中，我们还发现，黑稻提取物以浓度依赖的方式抑制超螺旋DNA断裂(表4)，在低至10μg/ml时仍有显著的作用。如上所述，花青素-3-葡糖苷和甲基花青素-3-葡糖苷在黑稻中作为主要色素存在。在我们的研究中，我们发现花青素-3-葡糖苷和甲基花青素-3-葡糖苷在1μg/ml时分别显示11.5％和11.4％的对DNA链断裂的保护，而在5μg/ml水平时保护分别提高到45.3％和44.1％。在这种过氧化氢自由基诱导的DNA断裂模型中也评估了花青素-3-葡糖苷与甲基花青素-3-葡糖苷组合的作用。结果表明，随着花青素-3-葡糖苷百分比的降低，保护也降低(图10和表3)。使用黑稻提取物也观察到超螺旋DNA断裂的浓度依赖性抑制(图11和表4)。
实施例11：抗炎症试验
A)黑稻提取物在防止一氧化氮方面的作用
B)对iNOS的Western印迹分析
A)
小鼠巨噬细胞RAW 264.7(ATCC)在补充了10％胎牛血清和抗生素(100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)的DMEM培养基中在37℃和5％CO2中培养。将细胞以2×105细胞/孔的密度接种到96孔板中。过夜培养后，当细胞附着到孔底部时，加入不同含量溶于PBS的黑稻提取物和1μg/ml细菌脂多糖(LPS，大肠杆菌，血清型0111：B4)，继续24小时。将培养基等分(100μl)到另外一块96孔板中，然后加入100μl Greiss试剂(含1％磺胺的5％磷酸和0.1％萘基乙二胺二盐酸盐水溶液，1∶1 v/v)[18]。用ELISA读板器测量540nm的吸光度。根据用同一过程获得的标准曲线测定亚硝酸盐的浓度。根据下式计算一氧化氮的抑制：
％抑制＝(Abs阳性-Abs样品)/(Abs阳性-Abs阴性)×100
其中Abs阳性、Abs阴性、Abs样品分别代表含有LPS、不含LPS的培养基和含有LPS的样品的吸光度。
B)
将细胞收集到2×样品还原缓冲液中，在沸水中温育5分钟。将20μl样品加样到8％SDS-PAGE上，随后电转移到硝酸纤维素膜上(Bio-Rad Laboratory)。在含有150mM NaCl和0.05％Tween-20的50mM Tris缓冲液(pH7.5)中，用3％脱脂奶粉在室温下封闭膜1小时。然后膜与小鼠抗iNOS抗体(Pharmingen Transduction Laboratories)和小鼠抗α-微管蛋白抗体(Sigma)在含有150mM NaCl的50mM Tris缓冲液(pH7.5)中4℃温育过夜。然后膜与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG(Pharmingen Transduction Laboratories)在室温下温育1小时。用4-氯-1-萘酚和过氧化氢显示靶蛋白[19](Bollag等人，1996)。
除了活性氧成分之外，如一氧化氮及其代谢物过氧亚硝酸盐等活性氧成分被认为能诱导突变[21](Keefer和Wink，1996)。在哺乳动物细胞中有两种类型的一氧化氮合成(NOS)，即组成型NOS(cNOS)和诱导型NOS(iNOS)，后者最可能被内毒素如脂多糖(LPS)和细胞因子激活。iNOS在正常条件下在大多数细胞中不存在，然而，在适当刺激物如LPS和细胞因子作用后，能够快速诱导并且产生大量的一氧化氮。细菌脂多糖与巨噬细胞的温育是评价诱导型一氧化氮合酶产生一氧化氮的一种快速方法。Leeuwenburgh等人[22](1997)报道，来自主动脉动脉粥样硬化内膜的LDL比血浆LDL含有显著更多的3-硝基酪氨酸，表明活性氮成分参与主动脉LDL氧化和动脉粥样硬化。而且，已经证明，iNOS抑制剂N-亚氨基乙基-L-赖氨酸可限制高胆固醇血症兔中已有的动脉粥样硬化的进展，从而提示抑制iNOS可能有利于防止动脉粥样硬化的进展。
与细菌LPS共温育的小鼠巨噬细胞系RAW264.7可以大量表达一氧化氮。利用Griess试剂，根据细胞培养基上清液中的代谢物亚硝酸盐间接测定一氧化氮。发现培养基中亚硝酸盐为25μM，高于未经LPS处理的巨噬细胞，表明当用细菌脂多糖刺激RAW264.7细胞时促进了一氧化氮的形成。
添加黑稻提取物显著减少了亚硝酸盐的产生，表明抑制了活化巨噬细胞中一氧化氮的产生(图18)。还值得注意的是，一氧化氮产生的抑制不是由于任何细胞毒性，因为添加黑稻提取物后细胞存活力正常(图18)。对于花青素-3-葡糖苷和甲基花青素-3-葡糖苷也发现了一氧化氮的抑制。在相同的工作条件下，花青素-3-葡糖苷和甲基花青素-3-葡糖苷对LPS活化的RAW264.7细胞中一氧化氮的抑制在表5中显示。
表5.对LPS活化的小鼠巨噬细胞RAW264.7中产生的一氧化氮的抑制百分比(平均值±SD)
   花青素-3-葡糖苷    甲基花青素-3-葡糖苷
    1μM    12.7±2.7    14.4±0.6
    10μM    23.1±0.9    22.3±3.7
    100μM    72.9±4.8    35.0±2.5
值得注意的是，在100μM时，花青素-3-葡糖苷显示对一氧化氮形成的抑制高于甲基花青素-3-葡糖苷。
在我们的研究中，显然向RAW264.7细胞中添加LPS可显著诱导iNOS蛋白质的表达，这经过western印迹法证实(图19)。在该细胞培养模型中添加黑稻提取物显示iNOS蛋白质(MW130kDa)的表达以浓度依赖的方式受到抑制(图19)。另外，与抗α-微管蛋白抗体印迹的细胞裂解物显示，经过或不经过LPS和样品处理，这种看家蛋白质都保持不变，因此提示黑稻特异性抑制诱导型一氧化氮合酶在巨噬细胞中的表达，从而减少该条件下一氧化氮的产生。
实施例12：Apo-E小鼠中动脉粥样硬化发展的减少
C57BL/6J背景的ApoE缺陷小鼠购自Jackson Laboratories(BarHarbor，Maine U.S.A)，在常规饲养条件下饲养。C57BL/6J小鼠来自Sun-Yat Sen医科大学动物中心。
总共45只4周龄雄性apoE缺陷小鼠被随机分为3组，每组15只，体重匹配。小鼠接受以AIN-93G制品为基础的合成食物(总结于表6中)，每组饲以下列饮食之一：AIN-93G合成食物(阳性组)；AIN-93G合成食物，其含有5g/100g本发明的提取物：黑稻级分(BRF组)；AIN-93G合成食物，其含有5g/100g白稻级分(WRF组)。作为对照的15只雄性4周龄C57BL/6J鼠(对照组)饲以AIN-93G合成食物。
通过添加酪蛋白和豆油将不同饮食中的蛋白质、脂肪和能量水平调节为同一水平(表7)。BRF和WRF的成分在表5中列出。所有组都饲养在具有不锈钢格网顶部的塑料笼中。无限制地给予食物和蒸馏水。实验持续16周。在4个组中，每只小鼠的平均饮食摄入量≈2.8g/d。小鼠在实验过程中每周称重两次。
在实验结束时，所有小鼠都不给食物过夜，在麻醉下从眶后丛取血，将其仁慈地杀死。在4℃下以2800×g低速离心血清20分钟，用来测定血清脂类水平。
表6
用于实验室啮齿类动物的AIN-93合成食物
    成分     g/kg食物
    玉米淀粉     397.486
    酪蛋白     200
    糊精化的玉米淀粉     132
    蔗糖     100
    豆油(不含添加剂)     70
    纤维     50
    无机物混合物(AIN-93G-MX)1     35
    维生素混合物(AIN-93-MX)2     10
    L-半胱氨酸     3
    酒石酸氢胆碱(41.1％胆碱)3     2.5
    叔丁基氢醌     0.014
1，2ICN Company，U.S.A
3基于游离碱的分子量
表7
不同饮食组的主要营养物
成分     对照组     阳性组   BRF组   WRF组
能量(kcal/kg食物)     3766.0     3766.0   3766.0   3766.0
碳水化合物(g/kg食物)     629.486     629.486   629.486   629.486
蛋白质(g/kg食物)     200     200   200   200
总脂肪(g/kg食物)     70     70   70   70
*对照组：饲以AIN-93 G合成食物的C57BL/6J小鼠
阳性组：饲以AIN-93G合成食物的apoE缺陷小鼠
BRF组：饲以含有5g/100g黑稻级分的AIN-93G合成食物的apoE缺陷小鼠
WRF组：饲以含有5g/100g白稻级分的AIN-93G合成食物的apoE缺陷小鼠
表8
黑稻和白稻级分的成分
    成分     黑稻级分单位/100g     白稻级分单位/100g
    蛋白质，g     13.90     12.20
    脂肪，g     13.20     14.10
    碳水化合物，g     47.36     50.95
    水分，g     9.80     7.96
    纤维，g     8.32     7.04
    盐混合物，mg     7420     7750
    P     1694.10     1542.50
    Ca     60.20     45.30
    K     673.70     624.60
    Mg     79.40     80.40
    Na     2.11     4.35
    Fe     16.46     6.30
    Zn     8.96     4.92
    Mn     11.67     7.93
    Mo     0.33     0.28
    Cu     1.49     0.91
    Se     0.15     0.06
    维生素，mg
    维生素B1     2.30     1.20
    维生素B2     0.40     0.14
    维生素E     0.60     0.03
    烟酸     21.00     13.00
    总黄酮，mg     6.4     1.2
血清脂类分布
利用Hitachi自动分析仪(日本东京)测定血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。利用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶试验来测定血清TC。用同一方法测定HDL-C的血清浓度。根据Friedwald公式计算血清LDL浓度。
动脉粥样硬化的评估
动脉粥样硬化脂条的定量如前所述通过计算主动脉窦中的病变大小来进行(18)。简言之，从动物中取出心脏和主动脉的上段，仔细清除周围的脂肪。将上段包埋于O.C.T化合物中，冻存于-20℃。取主动脉窦(400um)切片，每隔一片(10um厚)取出分析。主动脉窦的远侧部分根据三尖瓣辨别，这是主动脉和心脏的连接处。冷冻切片用油红O染色，并用苏木精复染。利用与Olympus BX-50光学显微镜连接的RGB相机直接拍摄图像，并将其显示在TrinitronTM RGB监视器上，评价每个主动脉瓣切片的油红O染色区域。利用OptimaTM 4.1软件(Image Processing Solutions)进行图像分析。结果表示为被油红O染色的总横切面血管壁面积的百分比(正常+疾病区/切片，不包括内腔)。
统计学分析
结果表示为平均值±SD，通过一步ANOVA联合Student-Newman-keuls(SNK)多重比较检验确定差异。P＜0.05的差异被认为是显著的。
结果
体重
实验方案以每组15只小鼠开始。实验开始时的小鼠体重为17±1g(平均值±SD)。最后的平均体重为25至27g。在实验过程中没有观察到体重的显著性差异(表9)(图16)。
表9
饲以AIN-93G饮食或含有WRF、BRF的AIN-93G饮食的不同组小鼠在16周中的体重
组别 N  4周  8周  12周  16周
对照组 15  17.07±1.08  22.41±2.13  25.67±2.34  26.45±2.63
阳性组 15  17.16±1.04  21.13±3.14  23.77±2.75  24.47±2.85
BRF组 15  17.11±1.05  21.35±3.31  24.73±3.24  25.90±3.13
WRF组 15  17.18±1.07  21.83±2.72  24.38±3.07  26.18±3.00
血清胆固醇水平
对照组中的血清TC、LDL-C、HDL-C和LDL/HDL不同于其它三组(P＜0.05)。BRF组中的TC、LDL-C和LDL/HDL水平低于阳性组和WRF组(P＜0.05)，阳性组与WRF组之间没有差异。尽管BRF与WRF组都具有高于阳性组的HDL-C水平，但是BRF组含有较低水平的LDL/HDL(表10)。
表10.饲以AIN-93G饮食或含有WRF、BRF的AIN-93G饮食的小鼠在16周中的血清脂类浓度*
  组别   n   TC(mmol/I)   LDL-C(mol/l)   HDL-C(mmol/I)  LDL/HDL
  对照组   10   2.881±0.758a   0.280±0.083a   1.776±0.439a  0.160±0.038a
  阳性组   10   15.682±2.644b   1.427±0.420b   2.546±0.442b  0.570±0.188b
  BRF组   10   12.118±1.833c   0.747±0.251c   2.659±0.398c  0.343±0.170c
  WRF组   10   17.240±3.646b   1.315±0.562b   2.645±0.663c  0.450±0.179b
*数值是平均值±S.D。列中没有共同字母的数值具有显著性差异，P＜0.05。所用缩写：TC，总胆固醇；LDL，低密度脂蛋白胆固醇；HDL，高密度脂蛋白胆固醇；C，胆固醇。
主动脉窦中动脉粥样硬化的发展
干预16周后，在饲以AIN-93G饮食的对照组主动脉窦中没有可见的动脉粥样硬化斑块。但是在其它三组的主动脉窦中可见不同程度的动脉粥样硬化斑块。斑块在阳性组和WRF组中比在BRF组中更严重(表11)(图17)。
BRF组小鼠的平均斑块面积低于阳性组和WRF组(P＜0.01)。饲以BRF的小鼠的主动脉窦的斑块面积比阳性组和WRF组分别低48.42％和46.08％。阳性组和WRF组小鼠的斑块面积没有显著性差异。
表11
16周后，在饲以AIN-93G饮食或含有WRF、BRF的AIN-93G饮食的小鼠中，主动脉窦的动脉粥样硬化斑块*
    组别     N   动脉粥样硬化面积(％)
    对照组     15   0a
    阳性组     15   26.25±9.2b
    BRF组     15   13.54±4.1c
    WRF组     15   25.11±7.15b
*列中没有共同字母的数值具有显著差异，p＜0.01。
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Claims (25)

1.一种从黑稻(Oryza sativa L)中提取含有花色素苷的组合物的方法，包括：
a)分离脱壳黑稻的外层与淀粉胚乳；
b)向分离的外层中添加至少一种有机溶剂和酸的溶液；
c)从分离的外层中过滤并除去溶剂和酸，产生色素级分；
d)分离色素级分的组分；和
e)从中收集花色素苷组合物。
2.权利要求1的方法，其中在步骤a)中物理性分离外层与淀粉胚乳。
3.权利要求1的方法，其中在步骤a)中通过碾磨脱壳的黑稻物理性分离外层与淀粉胚乳。
4.权利要求1的方法，其中有机溶剂选自醇、酮、烃和水。
5.权利要求1的方法，其中有机溶剂是具有结构RCOR1的酮，其中R和R1是C1-C6烷基。
6.权利要求1的方法，其中有机溶剂是C5-C10烃。
7.权利要求1的方法，其中有机溶剂是选自通式为R-CHOHR、R-CH2OH和RCOH的醇，其中R是C1-C4烷基。
8.权利要求1的方法，其中酸选自盐酸、乙酸、柠檬酸、低浓度硫酸和酒石酸。
9.权利要求1的方法，其中加入足量的酸，使pH为1-4。
10.权利要求1的方法，其中分离的外层被浸于溶剂中1-10小时。
11.权利要求1的方法，其中在步骤c)中通过蒸发除去溶剂和酸。
12.权利要求1的方法，其中在步骤d)中通过分级来分离色素级分的组分。
13.根据权利要求1-9任一项的方法制备的组合物。
14.一种组合物，其含有花青素-3-O-葡糖苷和甲基花青素-3-O-葡糖苷。
15.权利要求1 4的组合物，其中花青素-3-O-葡糖苷与甲基花青素-3-O-葡糖苷的比例为10∶1。
16.权利要求14的组合物，其中花青素-3-O-葡糖苷与甲基花青素-3-O-葡糖苷的比例为6∶1。
17.权利要求14的组合物，其中花青素-3-O-葡糖苷与甲基花青素-3-O-葡糖苷的比例为3.5∶1到6.5∶1。
18.权利要求14的组合物，其中花青素-3-O-葡糖苷与甲基花青素-3-O-葡糖苷的比例为4∶1。
19.权利要求11的组合物，其中还含有一种或多种抗氧化剂。
20.权利要求11的组合物，其中还含有一种或多种甾醇。
21.权利要求11的组合物，其中还含有一种或多种甾烷醇。
22.权利要求11的组合物，其中还含有一种或多种抗氧化剂，其选自：维生素E、β-胡萝卜素、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、茶儿茶素、螯合剂如柠檬酸、EDTA、苯丙氨酸、磷酸、酒石酸和色氨酸；优先氧化的化合物，如抗坏血酸、亚硫酸氢钠和亚硫酸钠；水溶性链终止剂如硫醇，和脂溶性链终止剂如没食子酸烷基酯、棕榈酸抗坏血酸酯、叔丁基氢醌、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、氢醌、去甲二氢愈创木酸和α-生育酚。
23.一种治疗或预防动物的包括动脉粥样硬化、炎症、高脂血症、低α脂蛋白血症、高胆固醇血症和氧化应激在内的心血管疾病及其基础疾病的方法，包括对动物施用根据权利要求1的方法制备的组合物。
24.一种治疗或预防动物的包括动脉粥样硬化、炎症、高脂血症、低α脂蛋白血症、高胆固醇血症和氧化应激在内的心血管疾病及其基础疾病的方法，包括对动物施用权利要求11的组合物。
25.一种治疗或预防动物的包括动脉粥样硬化、炎症、高脂血症、低α脂蛋白血症、高胆固醇血症和氧化应激在内的心血管疾病及其基础疾病的方法，包括对动物施用权利要求12的组合物。
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