CN1514244A - 一种对样品中的目标物进行定性和/或定量分析的方法及其检测装置 - Google Patents
一种对样品中的目标物进行定性和/或定量分析的方法及其检测装置 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种使用有色生物芯片对样品、特别是生物样品中的目标物进行定性和/或定量分析的方法及装置。由于利用芯片上有色背景与有色目标之间形成信号光线色别或/和饱和度或/和亮度的明显反差、优选方案形成最大化反差，增加了提高分析灵敏度的可能，及大大扩大了片基选择的自由度和扫描仪选择的自由度，可以在较低检测成本条件下实现较高的检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种对样品中、特别是生物样品中的目标物进行定性和/或定量分析的检测方法及其检测装置。
背景技术
对样品中、特别是生物样品中的目标物进行定性和/或定量分析的方法，其范围很广，其中基于探针-目标物特异性反应的一类的基本原理为：使探针与样品中的目标分子进行特异反应，再分析此一特异反应的结果。此类分析方法的基本步骤为：准备一种含探针反应器的装置、使样品与所述反应器接触并进行相关反应、分析所述反应结果。由于所用的探针反应器装置的不同，衍生出很多定性和/或定量分析的方法，例如，生物芯片法、PCR法、快速检测试剂条法、ELISA法、免疫荧光法、等等。
在本发明中，定性和/或定量分析方法中的“检测装置”，是指定性和/或定量分析方法中包含有反应器的相关装置，其中反应器中固定有用以同样品中的目标分子发生特异反应的探针，例如生物芯片或生物芯片试剂盒、快速检测试剂条或快速检测试剂盒、酶标板或酶标板试剂盒、等等；“生物芯片”是指定性和/或定量分析方法中的一种检测装置，其反应器中探针同样品中的目标分子发生特异反应的结果可以以可寻址的方式进行识别；“生物芯片法”是指利用生物芯片对样品中、特别是生物样品中的目标物进行定性和/或定量分析的方法。
最常用的生物芯片是多肽芯片和基因芯片。多肽芯片是以多个氨基酸的序列结构(包括蛋白质)作为探针固定在基板上制备的生物芯片。基因芯片是用待检标本中核酸、核苷酸与互补核酸、核苷酸探针杂交，形成杂交体，或与特异性抗体结合，再用呈色反应显示检测结果的芯片。生物芯片有着广泛的应用范围，包括基因表达检测、基因筛选、药物筛选、疾病诊断治疗、环境监测和治理、司法鉴定等领域。生物芯片的核心是其中固定的探针。生物芯片的探针，包括所有可以固定在固相载体上的具有生物活性的物质，例如抗原、抗体、单链和多链DNA、RNA、核苷酸、配体、配基、多肽、细胞、组织成分等生物成分。
下面简单地说明现有以生物芯片为基础的定性和/或定量分析方法及检测装置尚待解决的问题。
现有的生物芯片法，包括发光检测方法和非发光捡测方法两类。非发光捡测方法的例子有SELDI-TOF-MS方法(表面增强的激光解离和激光离子化的飞时质谱Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight-MassSpectra，例如包含金属片基的美国Ciphergen公司的ProteinChip Array系统)。然而，目前最广泛应用的生物芯片检测方法仍为发光检测方法。发光检测方法主要包括荧光检测法、化学发光检测法和复合光照射检测法。目前，荧光检测法中所用的片基基本上是透明玻片(例如，氨基化、醛基化、多聚赖氨酸片基)，化学发光检测法中所用片基基本上是透明的玻片、塑料板或金属膜(例如银薄膜)，复合光照射检测法中所用片基基本上可扩散的聚合物膜(例如PVDF膜、尼龙膜、硝酸纤维膜、醋酸纤维膜等)。然而，目前以可扩散的聚合物膜片基为基础的复合光照射检测法，其灵敏度不高；目前的化学发光检测法灵敏度也不很高；目前的荧光检测法，虽然灵敏度比前两者高，但仍存在玻片片基的背景噪声不低、活化片基成本高、检测仪器昂贵等不足之处，影响了生物芯片法的大规模应用。总之，目前的生物芯片法及生物芯片，尚待提高灵敏度和降低检测成本。
发明内容
本发明以降低生物芯片发光检测法的成本而不降低其灵敏度、甚至提高其灵敏度为主要目标。因而，本发明的研究选择了“以着色剂与片基的光学反差最大化来保证或提高检测灵敏度，降低片基技术要求扩大片基选择范围，以及降低发光检测仪器的技术要求从而扩大仪器选择范围”的技术路线来实现此一目标。
实际上，本发明的目标是与目前的隐身技术的目标相关的，隐身技术致力于使目标与背景有最小化的反差，本发明的技术致力于使目标与背景有最大化的反差。本发明的技术可称为显身技术，本发明的检测方法可称为显身技术检测方法。隐身技术的一些方法、甚至使用的一些材料(例如超黑材料等)对于达到我们的目的是特别有用的。例如，对红外隐身技术而言，Maclean等人用反差比幅射C的大小来表示热像仪的可探测性：C＝Eo-Eb。式中Eo为目标比辐射率，Eb为背景比幅射率，Eo和Eb分别与目标材料和背景材料的吸收率有正比关系。对红外隐身而言，C越大，热像仪分辨率越高、可探测性越大。反之，C趋于零时处于隐身最佳状态。同理，生物芯片法的灵敏度也是与目标(例如着色剂)材料和背景(片基)材料的光学性质的反差有关的。在我们的研究中，我们发现，使用反差大的片基-着色剂系统，可以提高目标物-样品反应的可探测性，从而引入更多的生物芯片或生物芯片试剂盒新类型，增加生物芯片检测方法的选择自由度，以达到本发明目标(见实施例)。
从而，本发明提供一种对样品、特别是生物样品中的目标物进行定性和/或定量分析的方法，其包括下列基本步骤：
a、将目标物或含目标物的物质与有色生物芯片的反应器接触并在其中反应，所述有色芯片反应器含有提供有色背景的有色片基，所述反应器中有色片基上的探针或探针-微粒的密度大于2点/cm2、优选方案大于10点/cm2、更优选方案大于20点/cm2；
b、将着色剂或含有着色剂的物质固着在a所述反应器中反应处，以形成有色目标；
c、将波长在200-780nm之间的单色或复合照射光线、或可使着色剂发光的其它条件应用到b所述反应器中；
d、对c所述反应器中光线、有色背景与有色目标及有时还有信号检出装置之间的相互作用产生的信号光线进行检出；
e、根据d所述检出结果分析a所述反应结果。
在本发明中，“芯片反应器”或简称“反应器”是指生物芯片中固定有探针阵列，在检测时与目标物发生特异性反应的场所及与其连通的其它相关结构，“片基”是指用以固定探针或探针-微粒的固相载体，“探针”是指固定在反应器中同目标物发生选择性反应以对目标物进行定性和/或定量分析的物质，“探针-微粒”是指固定有探针的微米或纳米尺寸的载体，探针密度单位中的一个“点”是指探针或/和探针-微粒固定在片基上形成的一个可区别的有边界的区域。
在本发明中，“有色片基”是指不透明、无镜面反光的非多孔膜片基。本发明中的有色片基除用作固相载体外，还独立提供有色背景，因而不同于现在广泛使用的无机或有机透明片基、镜面反光的金属箔片片基及表面粗糙度过高的多孔膜片基。在本发明中，“着色剂”是指可将目标物在反应器中的反应结果以波长在200-780nm之间的光线的色别或/和饱和度或/和亮度的方式进行标记的标记物质，“自主发光物质”是指不需外部提供照射光线而由化学或电化学反应产生信号光线的物质。
又一方面，本发明提供的定性和/或定量分析的方法，其中有色背景与有色目标之间在所述相互作用中形成色别或/和饱和度或/和亮度的明显反差、优选方案形成最大化反差。
在本发明中，“色别”是指光谱反射中占比例最高的波长(主波长)不同形成的颜色区别，“饱和度”是指颜色的纯度(含消色百分比愈大的颜色愈不饱和)，“亮度”是指颜色的明亮程度。
另一方面，本发明提供的定性和/或定量分析方法，当其中主要由着色剂提供所述有色目标上的信号光线时，所述片基有色背景对信号光线的光反射率小于10％。由着色剂提供所述有色目标上的信号光线，是指着色剂自主发光(例如自主化学发光)，或在照射光线作用下发光(例如着色剂为荧光物质)，或在其它外来作用下发光(例如电化学发光)，等等。在这些情况下，有色背景的光反射率越小，则有色背景上的有色目标的可观测性越高。
本发明提供的定性和/或定量分析方法，其中着色剂为可提供所述有色目标上的信号光线的物质(例如荧光物质和化学发光物质)，片基为其有色背景在白光下为深色(例如深红色、深绿色、等等)、优选方案为黑色的片基。
又一方面，本发明提供的定性和/或定量分析方法，当其中主要由着色剂的选择性反射提供所述有色目标上的信号光线时，所述片基有色背景对信号光线的选择性反射率小于10％或其非选择性反射率大于50％。在此情况下，着色剂的选择性反射率越大、有色背景的选择性反射率越小或非选择性反射率越大，则有色背景上的有色目标的可观测性越高。
本发明提供的定性和/或定量分析方法，其中所述着色剂为单色或接近单色的着色剂，优选方案为在白光下主波长为红色、绿色、蓝色、青色或紫色的着色剂；所述片基为其有色背景在白光下为浅色、优选方案为白色的片基。
又一方面，本发明提供的定性和/或定量分析方法，其中当主要由着色剂的非选择性反射提供所述有色目标上的信号光线时，所述基片有色背景非选择性反射率大于50％或者小于10％。在此情况下，着色剂的非选择性反射率越大、有色背景的非选择性反射率越小，或者着色剂的非选择性反射率越小、有色背景的非选择性反射率越大，则有色背景上的有色目标的可观测性越高。
本发明提供的定性和/或定量分析方法，其中所述着色剂为黑色或深色的着色剂，所述片基为其有色背景在白光下为浅色(例如浅黄色片基、浅灰色片基、等等)、优选方案为白色的片基；或者所述着色剂为浅色或白色的着色剂，所述片基为其有色背景在白光下为深色(例如深红色、深绿色、等等)、优选方案为黑色的片基。特征在于：所述着色剂为黑色或深色(例如深红色、深绿色、等等)，所述片基有色背景在白光下为浅色(例如浅黄色片基、浅灰色片基、等等)、优选方案为白色。
又一方面，本发明提供一种生物芯片，其特征在于：其反应器中至少包含有色片基与探针或/和探针微粒，所述反应器中有色片基上的探针或探针-微粒的密度大于2点/cm2、优选方案大于10点/cm2、更优选方案大于20点/cm2。所述有色片基与本发明提供的定性和/或定量分析方法中上述有色片基相同。
本发明提供的生物芯片，其有色片基包括一元有色材料片基、有色涂层-结构片片基、有色膜片-结构片片基、最小化反射结构层-有色结构片片基、透过-有色材料片基和纳米有色材料片基。
在本发明中，“一元有色材料片基”是指由同一种有色材料形成所述有色背景和片基结构的片基，“有色涂层-结构片片基”是指由有色涂层形成所述有色背景而其它材料形成片基几何结构的片基，“有色膜片-结构片片基”是指由有色膜片形成所述有色背景而其它材料形成片基几何结构的片基，“最小化反射结构层-有色结构片片基”是指由反射结构层和有色结构片形成所述有色背景的片基，“透过-有色材料片基”是指由透明或滤光材料与有色材料共同形成所述有色背景的片基，“纳米有色材料片基”是指由纳米有色材料形成所述有色背景的片基。
本发明提供的生物芯片，其特征在于：其片基中形成所述有色背景的有色材料、透明材料和滤光材料中，含有下述一种或多种有机物：硝化纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯酸脂、聚砜、聚醚砜、聚氯乙烯、氨基树脂，等等。实际上，所有附合上述“显色技术”原理、可直接连接探针或间接连接探针(例如通过微粒或改性聚多糖作连接介质)而不丧失探针活性的有色物质均可制作有色片基。
本发明提供的生物芯片，其纳米有色材料片基中，所述纳米微粒平均粒径为1-500nm、分布于片基局部或全部表面、或分布于有色材料层中。实际上，纳米微粒在本发明的有色片基中，可控制有色片基与着色剂之间色别或/和饱和度或/和亮度反差，和/或片基顶面表面亲水性。很多文献巳证明，纳米微粒可以改变材料的光学性质(例如透光性、光吸收率、表面光泽度、等等)。纳米材料巳用于“隐身技术”。又一方面，加入具有亲水性的纳米微粒又可以改进疏水表面的疏水性(某些有色涂料片基往往具有疏水表面)，而适当的片基亲水性又是生物芯片稳定性等反应活性的重要控制基础之一。
本发明提供的生物芯片，其纳米有色材料片基中的一纳米微粒，包括金、钒、铅、银、铁及其氧化物微粒，氧化硅、氧化钛、氧化铝微粒，塑料、多糖、乳胶、树脂和其它高分子材料微粒，还包括上述微粒修饰结合有功能基团和/或功能物的微粒衍生物。
又一方面，本发明提供的生物芯片，其探针包括配体、配基、抗原、抗体、多肽、蛋白质和单链或多链DNA、RNA、核苷酸，其探针-微粒为平均粒径尺寸为0.1nm-10um、优选方案为1-100nm的微粒与探针的连接物。
又一方面，本发明提供的生物芯片，其有色片基上固定探针或/和探针微粒处及其周围区域，在白光下看上去是下列之一种颜色：黑色，主波长为红色、绿色、蓝色、青色或紫色的深色，白色，及主波长为红色、黄色、绿色、蓝色、青色或紫色的浅色。
另一方面，本发明提供的生物芯片，其特征在于：所述有色片基上提供有色背景的表面的粗糙度Ra在0.02-3.0um之间、优选方案在0.25-3.0um之间。在一些情况中，表面光洁度太高并不有利于提高所述有色背景与有色目标之间的色别或/和饱和度或/和亮度的反差。
又一方面，本发明提供一种生物芯片试剂盒，其特征在于：其含有有色生物芯片和着色剂或含着色剂的物质。本发明生物芯片试剂盒中的有色生物芯片，同于上述有色生物芯片。本发明生物芯片试剂盒中的着色剂或含着色剂的物质，同于本发明提供的定性和/或定量分析方法中上述着色剂或含着色剂的物质。
本发明提供的生物芯片试剂盒，其着色剂包括目前已用作生物芯片标记物质的荧光物质、化学发光催化剂、显色和发光底物、有色金属或有色金属盐，以及目前尚未用作生物芯片标记物质的有机及无机染料、颜料；其含有着色剂的物质包括着色标记物、纳米微粒着色标记物和分子载体着色标记物。
在本发明中，“着色标记物”是指含有着色剂和标记配基的标记物，“纳米微粒着色标记物”是指含有着色剂和标记配基的、用作标记物的纳米尺寸的微粒，“分子载体着色标记物”是指含有着色剂、标记配基与它们的分子载体的标记物。本发明中纳米微粒着色标记物的使用，使得着色剂的选择范围扩大。实际上，结合有抗体或DNA的功能化二、六族半导体纳米粒子，结合有抗体的稀土纳米微粒，可结合生物物质的不同颜色的有机物包被纳米粒子，等等新的标记物已有报道，都可以用在本发明方法中。
本发明提供的生物芯片试剂盒，其纳米微粒着色标记物中的纳米微粒，为可固定配基和/或着色剂而不损失其活性、平均粒径1-500nm的纳米微粒。
本发明提供的生物芯片试剂盒，其特征在于：其所含纳米微粒着色标记物中的微粒，包括金、钒、铅、银、铁及其氧化物微粒；氧化硅、氧化钛、氧化铝微粒；塑料(例如：聚苯乙烯类、聚氯乙烯类、聚丙烯类、聚丙烯酰胺类、聚酰亚胺类、聚醚酮类)、多糖(例如：葡聚糖、琼脂糖、淀粉、及它们的改性物)、乳胶、树脂和其它高分子材料(例如：尼龙)微粒，还包括上述微粒修饰结合有功能基团和/或功能物的微粒衍生物。实际上，可固定配基和/或着色剂而不损失其生物活性的微粒很多，例如已用于生化和免疫检测方法中的纳米微球、用作药物缓释载体的某些纳米载体，等等。
本发明提供的生物芯片试剂盒，其特征在于：所述功能基团包括氨基、酰基、羧基、羟基、醛基和环氧基，等等。
本发明还提供一种生物芯片分析装置或生物芯片试剂盒的制备方法，其具体步骤为：
A、提供上述有色片基、探针或/和探针-微粒，制成有所述有色背景的有色芯片；
B、提供上述着色剂、配基或/和纳米颗粒，制成所述有色标记物或/和有色标记纳米微粒。
本发明生物芯片分析方法与装置的优点是：就生物芯片而言，与目前占主流的透明片基比较，本发明中的有色探针板的供给范围是非常之大，为不同分析检测的不同需要提供了很大的自由度，为降低片基成本提供高得多的可行性；就标记系统而言，由于可以使用范围广阔的着色剂，为利用更便利的扫描仪检出有色背景与有色目标之间最大化色别或/和饱和度或/和亮度反差提供了高的选择自由度；总之，本发明生物芯片分析方法，可以在较低检测成本条件下实现较高的检测灵敏度。
具体实施例
实施例1：荧光显身检测方法和黑色生物芯片
在本例中，所用生物芯片为含有黑色片基的黑色生物芯片，所用着色剂为罗丹明，所用含着色剂的标记物为罗丹明标记的羊抗人二抗(美国JacksonImmunoRresearch Laboratories公司)，所用参照片基为尺寸75×25×1mm的透明氨基改性玻片(美国Telechem International公司，以下记作片基0)。
本实施例步骤如下：
-黑色片基的制备：
本实施例所制备的黑色背景片基为：一元黑色材料片基、黑色涂层-结构片片基、黑色膜片-结构片片基和透明-黑色材料复合片基。
本实施例所制备的一元黑色材料片基为黑色塑料片基，其为热塑性聚氯乙烯在加入槽法碳黑等填充剂后，经模压成型制得，尺寸为75×25×1mm，以下记作片基1。
本实施例所制备的涂层-结构片片基为黑色有机涂层片基，涂层由自制黑色高聚物溶液形成，结构片为尺寸75×25×1mm的透明载玻片(美国Erie Scientific公司)。本实施例所用黑色高聚物溶液，为以槽法炭黑(泸卅天然气化工厂)为色料、以苯为溶剂、含适量胶粘剂(胶粘剂555，成都晨光化工设计院)的聚氯乙烯黑色溶液。将聚氯乙烯黑色溶液喷涂在载玻片上，干燥后形成黑色涂层。所形成的黑膜层厚度在30um左右。尽管涂层-结构片片基中，在结构片的顶面和底面上都可以形成黑色涂层，本实施例中只在结构片的顶面上形成黑色涂层。以上制备的黑色多元材料片基记作片基2。
本实施例所制备的黑色膜片-结构片片基，其有色膜片为压塑成型后剪裁成平面尺寸75×25mm的黑色聚氯乙烯薄膜(膜厚80um)，其结构片为75×25×1.0mm的透明载玻片(Erie Scientific公司)。黑色聚氯乙烯薄膜通过热贴合工艺结合在透明载玻片上顶面。所制得的片基记作片基3。
本实施例所制备的透明-黑色材料复合片基，其透明材料为75mm×25mm×15um(长×宽×厚)的聚氯乙烯薄膜，其有色材料为上述制备的黑色塑料片基。聚氯乙烯薄膜热塑贴合在黑色塑料片基的顶面。制得的片基记作片基4。
-黑色生物芯片的制备：
本实施例的黑色生物芯片，是通在上述黑色片基的顶面上形成反应器隔离结构制得片基池，然后在片基池内固定探针并用封闭液封闭片基池内裸露的片基而成。
生物芯片反应器的隔离结构，是用高疏水有机硅涂料(成都晨光化工设计院)涂抹在上述制备的4种片基和参照片基(片基0)上，然后干燥成膜(膜厚小于0.05mm)后在片基上形成的(参考我们的另一项发明：《一种反应器隔离结构高度最小化的生物芯片及制备方法》，专利申请号03117397.7)。每1个片基形成8个片基池，每个片基池尺寸为4.5mm×4.5mm，片基池间隔离结构宽度为4.5mm。片基0上的片基池隔离结构直接形成于氨基化玻片的顶面上，片基1的反应器隔离结构直接形成于黑色塑料片基顶面上，片基2上的反应器隔离结构直接形成于片基顶部黑色涂层表面上，片基3上的反应器隔离结构直接形成于片基顶部黑色聚氯乙烯薄膜表面上、片基4上的反应器隔离结构直接形成于片基顶部透明薄膜表面上。
本实施例所用探针为HCV抗原(中国北京人民医院肝病研究所)和HIV1+2抗原(中国北京人民医院肝病研究所)。在每一个上述制备的片基池中，分别将HCV抗原(1.5mg/ml)和HIV1+2抗原溶液(1.5mg/ml)点样固定形成反应器。在一个反应器中，两种抗原各点2个直径为200um的点，形成2×2阵列。包被完成后，用封闭液封闭备用。所制备的芯片，根据所使用的片基编号，分别记做芯片0、芯片1、芯片2、芯片3、芯片4。
-荧光显身检测方法：
在本实施例中，1号样为HCV抗体阳性血清，2号样为HIV1+2抗体阳性人血清，3号样为阳性对照物(HCV抗体和HIV1+2抗体阳性血清对照物的混合物)，4号样品为阴性对照物(HCV抗体和HIV1+2抗体都为阴性的血清对照物)。所有的样品，均经使用经典的ELISA方法在血清20倍稀释反应条件下预先检测。
实验时4种样品分别加入上述芯片的反应器中。在每一个生物芯片的4个反应器中均分别加有1∶50稀释的样品。加样量均为5ul。反应30分钟后洗涤5次，洗涤液每次加入量为15ul。
所用着色剂为罗丹明，标记物为罗丹明标记的羊抗人二抗(JacksonImmunoRresearch Laboratories公司)，加入量为5ul，反应后洗涤5次，洗涤液每次加入量为15ul，干燥后进行扫描。扫描仪为共聚焦激光扫描仪(Afymetrix公司GMS418芯片扫描仪)，扫描激发光波长532nm，发射光波长570nm，读取的信号经处理软件(Afymetrix JAGUAR 2.0)处理，然后取平均值后得到结果如表1。
表1荧光显身生物芯片的检测结果
| 芯片 | 片基反射率(％) | HCV抗体阳性血清 | HIV抗体阳性血清 | 阳性对照物 | 阴性对照物 | ||||
| HCV抗体 | HIV抗体 | HCV抗体 | HIV抗体 | HCV抗体 | HIV抗体 | HCV抗体 | HIV抗体 | ||
| 芯片0 | 未作 | + | - | - | + | + | + | - | - |
| 芯片1 | 5.4 | + | - | - | + | + | + | - | - |
| 芯片2 | 5.6 | + | - | - | + | + | + | - | - |
| 芯片3 | 5.9 | + | - | - | + | + | + | - | - |
| 芯片4 | 6.1 | + | - | - | + | + | + | - | - |
注释：表中“+”为阳性结果，“-”为阴性结果。片基反射率(％)由成都市计量监督检定测试所检测。
实施例2：荧光显身检测方法和黑色“粗糙”生物芯片
在本实施例中，所用生物芯片为含有黑色“粗糙”片基的黑色“粗糙”生物芯片，所用着色剂、含着色剂的标记物和参照片基0与实施例1相同。
本实施例步骤如下：
本实施例所制备的黑色“粗糙”片基为涂层-结构片片基。涂层由黑漆形成，结构片为尺寸75×25×1mm的透明载玻片(美国Erie Scientific公司)。本实施例所用黑漆为汽车面漆(珍珠黑，上海启阜实业发展有限公司)。喷涂黑漆在载玻片顶面，干燥后形成黑色涂层(厚度在30um左右)，记作片基21。片基21的粗糙度为(由成都市计量监督检定测试所检测)。
黑色“粗糙”生物芯片的制备，除使用本实施例制备的黑色“粗糙”片基外，制备方法与例1中的制备方法相同。
本实施例荧光显身检测方法，除使用本实施例制备的黑色“粗糙”片基外，其它如荧光标记物、样品、检测步骤均与例1相同。
同例1，扫描仪为共聚焦激光扫描仪(Afymetrix公司GMS 418芯片扫描仪)，扫描激发光波长532nm，发射光波长570nm，读取的信号经处理软件(AfymetrixJAGUAR 2.0)处理。所得结果如表2。
表2荧光显身生物芯片的检测结果
| 芯片 | 片基粗糙度 | HCV抗体阳性血清 | HIV抗体阳性血清 | 阳性对照物 | 阴性对照物 | ||||
| HCV抗体 | HIV抗体 | HCV抗体 | HIV抗体 | HCV抗体 | HIV抗体 | HCV抗体 | HIV抗体 | ||
| 芯片0 | 未作 | + | - | - | + | + | + | - | - |
| 芯片21 | 0.47um | + | - | - | + | + | + | - | - |
注释：表中“+”为阳性结果，“-”为阴性结果。片基粗糙度由成都市计量监督检定测试所检测。
实施例3：复合光显身检测方法和白色生物芯片
在本实施例中，所制备及所用生物芯片为含有白色片基的白色生物芯片，所用参照片基0与实施例1相同。
本实施例步骤如下：
-白色片基的制备：
本实施例所制备的白色背景片基为：一元白色材料片基、白色涂层-结构片片基和透明-白色材料复合片基。
本实施例所制备的一元白色材料片基为白色塑料片基，其为热塑性聚氯乙烯在加入钛白粉等填充剂后，经模压成型制得，尺寸为75×25×1mm，以下记作片基31。
本实施例所制备的白色涂层-结构片片基，涂层由白色涂料形成，结构片为尺寸75×25×1mm的透明载玻片(美国Erie Scientific公司)。本实施例所用白漆为川洋自动喷漆(成都市红光油漆厂)。在透明载玻片顶面上喷涂白漆，干燥后形成白色涂层。所形成的白膜层厚度在30um左右。以上制备的白色片基记作片基32。
本实施例所制备的透明-白色材料复合片基，其透明材料分别为75mm×25mm×15um(长×宽×厚)的聚氯乙烯薄膜和参照基片0，其白色材料分别为白色塑料片基31和白色涂层(川洋自动白色喷漆，成都市红光油漆厂)。聚氯乙烯薄膜热塑贴合在白色塑料片基的顶面，制得的片基记作片基33。白色自动喷漆喷涂在透明载玻片的底面，干燥成白色膜，制得的片基记作片基34。
-白色生物芯片的制备：
本实施例的白色生物芯片的制备，除使用本实施例制备的白色片基外，制备方法与例1中的制备方法相同。其中的反应器，在31上是形成于白色塑料片基顶面上，在片基32上是形成于片基顶部白色涂层表面上，在片基33上是形成于片基顶部透明薄膜表面上，在片基34上是形成于片基顶部氨基化玻片表面上。
在本例中，所用探针为HCV抗原(中国北京人民医院肝病研究所)和HIV1+2抗原(中国北京人民医院肝病研究所)。在每一个上述制备的反应器中，分别将HCV抗原(1.5mg/ml)和HIV1+2抗原溶液(1.5mg/ml)点样固定。在一个反应池中，两种抗原各点2个直径为200um的点，形成2×2阵列。包被完成后，用封闭液封闭备用。所制备的芯片，根据所使用的片基编号，分别记做芯片31、芯片32、芯片33、芯片34。
-复合光显身检测方法：
在本实施例中，所用有色标记物为胶体金标记的羊抗人二抗(福建泉州长立生化有限公司)，所用信号放大剂为银增强剂(Sigma公司)，所用样品同实施例1。
实验时4种样品分别加入上述芯片的反应器中。在每一个生物芯片的4个反应器中均分别加有1∶50稀释的样品。加样量均为5ul。反应5分钟后洗涤5次，洗涤液每次加入量为15ul。
有色标记物加入量为5ul，反应后洗涤5次，洗涤液每次加入量为15ul，干燥后进行扫描。扫描仪为EPSON 1260扫描仪(EPSON公司)，扫描照射光线为白光，信号光线亦为白光，读取的信号经处理软件(Afymetrix JAGUAR 2.0)处理，然后取平均值后得到反应结果(表3)：
表3，白光显身检测芯片的检测结果
| 芯片 | 片基反射率(％) | HCV抗体阳性血清 | HIV抗体阳性血清 | 阳性对照物 | 阴性对照物 | ||||
| HCV抗体 | HIV抗体 | HCV抗体 | HIV抗体 | HCV抗体 | HIV抗体 | HCV抗体 | HIV抗体 | ||
| 芯片0 | 未作 | + | - | - | + | + | + | - | - |
| 芯片31 | 61 | + | - | - | + | + | + | - | - |
| 芯片32 | 57 | + | - | - | + | + | + | - | - |
| 芯片33 | 55 | + | - | - | + | + | + | - | - |
| 芯片34 | 56 | + | - | - | + | + | + | - | - |
注释：表中“+”为阳性结果，“-”为阴性结果。
实施例4：应用纳米有色材料生物芯片的生物芯片检测方法及纳米有色材料生物芯片试剂盒
在本实施例中，所制备及所用生物芯片为含有白色片基的白色生物芯片，所用参照片基0与实施例1相同。
本实施例步骤如下：
-纳米有色材料片基的制备：
本实施例中所制备的片基为纳米白色材料片基，包括纳米颗粒在片基顶面表层的片基和纳米颗粒在片基整个有色层中的片基。
本实施例所制备的纳米颗粒在片基顶面表层的片基，所使用的白色基底为实施例3中制备的白色涂层片基(片基32)，所使用的纳米材料为己高度分散的氧化硅纳米粒子液(平均粒径40nm，Sigma-Aldrich公司)。本实施例所制备的片基41，是将预先稀释的氧化硅纳米粒子液涂覆在基片32的白色有机涂层表面上制得的。
本实施例所制备的片基42，是将预先稀释的氧化硅纳米粒子液涂覆在基片32的白色有机涂层表面上局部区域内制得的。氧化硅纳米粒子液涂覆处形成片基池，隔离结构则为末涂覆的相对疏水的白漆涂层表面。每1个片基形成8个片基池，每个片基池尺寸为4.5mm×4.5mm，片基池间隔离结构宽度为4.5mm。
本实施例所制备的纳米颗粒固定在片基整个白色层中的片基，是用己高度分散的氧化硅纳米粒子液(平均粒径40nm，Sigma-Aldchi公司)，以已选定的比例与川洋自动喷漆(成都市红光油漆厂)混合后，涂覆在透明载玻片(美国ErieScientific公司)的顶面，再干燥制得。所制得的片基记作片基43。
-纳米有色材料生物芯片的制备：
本实施例中的基片42以经具有隔离结构。本实施例中的基片41和43，如同例1中的片基一样，是通在片基顶面上用高疏水有机硅涂料(成都晨光化工设计院)形成反应器隔离结构的。每个片基上形成8个池，每个池的尺寸为4.5mm×4.5mm，池间隔离结构宽度为4.5mm。
在本例中，所用探针同实施例1，为HCV抗原(中国北京人民医院肝病研究所)和HIV1+2抗原(中国北京人民医院肝病研究所)。在每一个上述制备的反应器中，分别将HCV抗原(1.5mg/ml)和HIV1+2抗原溶液(1.5mg/ml)点样固定。在一个反应池中，两种抗原各点2个直径为200um的点，形成2×2阵列。包被完成后，用封闭液封闭备用。所制备的芯片，根据所使用的片基编号，分别记做芯片41、芯片42和芯片43。
-复合光显身检测方法：
在本实施例中，所用标记物和样品同实施例3。在本实施例中，样品适当稀释，其它检测方法同实施例3。
在本实施例中，扫描仪为EPSON 1260扫描仪(EPSON公司)，扫描照射光线为白光，信号光线亦为白光，读取的信号经处理软件(Afymetrix JAGUAR 2.0)处理，然后取平均值后得到反应结果(表4)：
表4纳米白色材料生物芯片的检测结果
| 芯片 | 片基反射率(％) | HCV抗体阳性血清 | HIV抗体阳性血清 | 阳性对照物 | 阴性对照物 | ||||
| HCV抗体 | HIV抗体 | HCV抗体 | HIV抗体 | HCV抗体 | HIV抗体 | HCV抗体 | HIV抗体 | ||
| 芯片0 | 未作 | + | - | - | + | + | + | - | - |
| 芯片41 | 56 | + | - | - | + | + | + | - | - |
| 芯片42 | 56 | + | - | - | + | + | + | - | - |
| 芯片43 | 56 | + | - | - | + | + | + | - | - |
注释：表中“+”为阳性结果，“-”为阴性结果。
实施例5：应用纳米微粒着色标记物的生物芯片检测方法及含有纳米微粒着色标记物的生物芯片试剂盒
在本实施例中，所所用参照片基0与实施例1相同，制备及所用生物芯片为纳米白色材料生物芯片41。
本实施例步骤如下：
-纳米微粒着色标记物的制备：
本实施例纳米微粒着色标记物中，标记配基为羊抗人二抗(天坛生物制品股份有限公司)，着色剂为结晶紫(成都科龙化工试剂厂)，纳米微粒为平均粒径为35nm的胶体金(福建泉州长立生化有限公司)。
本实施例着色标记微粒的制备，是将着色剂、标记配基与纳米微粒按照预先确定的浓度和比例混合，在室温下反应18小时。然后，在5000r/min下离心5分钟，去上清。再用PBS洗涤，再离心，反复三次，最后在PBS中备用。
-复合光显身检测方法：
本实施例中使用的生物芯片是固定有HCV抗原和HIV1+2抗原探针的纳米白色材料生物芯片41，所加入的纳米微粒着色标记物为结晶紫纳米微粒。
在本实施例中，所用样品及检测方法同于实施例3。
在本实施例中，扫描仪为EPSON 1260扫描仪(EPSON公司)，扫描照射光线为白光，信号光线亦为白光，读取的信号经处理软件(Afymetrix JAGUAR 2.0)处理，然后取平均值后得到反应结果(表5)。
表5， 纳米微粒着色标记物生物芯片试剂盒的检测结果
| 芯片 | 片基反射率(％) | HCV抗体阳性血清 | HIV抗体阳性血清 | 阳性对照物 | 阴性对照物 | ||||
| HCV抗体 | HIV抗体 | HCV抗体 | HIV抗体 | HCV抗体 | HIV抗体 | HCV抗体 | HIV抗体 | ||
| 芯片0 | 未作 | + | - | - | + | + | + | - | - |
| 芯片41 | 56 | + | - | - | + | + | + | - | - |
注释：表中“+”为阳性结果，“-”为阴性结果。
Claims (22)
1、一种对样品、特别是生物样品中的目标物进行定性和/或定量分析的方法，其包括下列基本步骤：
a、将目标物或含目标物的物质与有色生物芯片的反应器接触并在其中反应，所述有色芯片反应器含有提供有色背景的有色片基，所述反应器中有色片基上的探针或探针-微粒的密度大于2点/cm2、优选方案大于10点/cm2、更优选方案大于20点/cm2；
b、将着色剂或含有着色剂的物质固着在a所述反应器中反应处，以形成有色目标；
c、将波长在200-780nm之间的单色或复合照射光线、或可使着色剂发光的其它条件应用到b所述反应器中；
d、对c所述反应器中光线、有色背景与有色目标及有时还有信号检出装置之间的相互作用产生的信号光线进行检出；
e、根据d所述检出结果分析a所述反应结果。
2、根据权利要求1所述的一种对样品、特别是生物样品中的目标物进行定性和/或定量分析的方法，其特征在于：所述有色背景与有色目标之间在所述相互作用中形成色别或/和饱和度或/和亮度的明显反差、优选方案形成最大化反差。
3、根据权利要求2所述的一种对样品、特别是生物样品中的目标物进行定性和/或定量分析的方法，其特征在于：当主要由着色剂提供所述有色目标上的信号光线时，所述片基有色背景对信号光线的光反射率小于10％。
4、根据权利要求3所述的一种对样品、特别是生物样品中的目标物进行定性和/或定量分析的方法，其特征在于：所述着色剂为可提供所述有色目标上的信号光线的物质，所述片基为其有色背景在白光下为深色、优选方案为黑色的片基。
5、根据权利要求2所述的一种对样品、特别是生物样品中的目标物进行定性和/或定量分析的方法，其特征在于：当主要由着色剂的选择性反射提供所述有色目标上的信号光线时，所述片基有色背景对信号光线的选择性反射率小于10％或其非选择性反射率大于50％。
6、根据权利要求5所述的一种对样品、特别是生物样品中的目标物进行定性和/或定量分析的方法，其特征在于：所述着色剂为单色或接近单色的着色剂，优选方案为在白光下主波长为红色、绿色、蓝色、青色或紫色的着色剂；所述片基为其有色背景在白光下为浅色、优选方案为白色的片基。
7、根据权利要求2所述的一种对样品、特别是生物样品中的目标物进行定性和/或定量分析的方法，其特征在于：当主要由着色剂的非选择性反射提供所述有色目标上的信号光线时，所述基片有色背景非选择性反射率大于50％或者小于10％。
8、根据权利要求7所述的一种对样品、特别是生物样品中的目标物进行定性和/或定量分析的方法，其特征在于：所述着色剂为黑色或深色的着色剂，所述片基为其有色背景在白光下为浅色、优选方案为白色的片基；或者所述着色剂为浅色或白色的着色剂，所述片基为其有色背景在白光下为深色、优选方案为黑色的片基。
9、一种生物芯片，其特征在于：其反应器中至少包含有色片基与探针或/和探针微粒，所述反应器中有色片基上的探针或探针-微粒的密度大于2点/cm2、优选方案大于10点/cm2、更优选方案大于20点/cm2。
10、根据权利要求9所述的一种生物芯片，其特征在于：所述有色片基包括一元有色材料片基、有色涂层-结构片片基、有色膜片-结构片片基、最小化反射结构层-有色结构片片基、透过-有色材料片基和纳米有色材料片基。
11、根据权利要求10所述的一种生物芯片，其特征在于：其片基中形成所述有色背景的有色材料、透明材料和滤光材料中，含有下述一种或多种有机物：硝化纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯酸脂、聚砜、聚醚砜、聚氯乙烯、氨基树脂。
12、根据权利要求10所述的一种生物芯片，其特征在于：所述纳米有色材料片基中，所述纳米微粒平均粒径为1-500nm、分布于片基局部或全部表面、或分布于有色材料层中。
13、根据权利要求12所述的一种生物芯片，其特征在于：所述纳米微粒，包括金、钒、铅、银、铁及其氧化物微粒，氧化硅、氧化钛、氧化铝微粒，塑料、多糖、乳胶、树脂和其它高分子材料微粒，还包括上述微粒修饰结合有功能基团和/或功能物的微粒衍生物。
14、根据权利要求9所述的一种生物芯片，其特征在于：所述探针包括配体、配基、抗原、抗体、多肽、蛋白质和单链或多链DNA、RNA、核苷酸，所述探针-微粒为平均粒径尺寸为0.1nm-10um、优选方案为1-100nm的微粒与探针的连接物。
15、根据权利要求9-14之一所述的一种生物芯片，其特征在于：其有色片基上固定探针或/和探针微粒处及其周围区域，在白光下看上去是下列之一种颜色：黑色，主波长为红色、绿色、蓝色、青色或紫色的深色，白色，及主波长为红色、黄色、绿色、蓝色、青色或紫色的浅色。
16、根据权利要求9-15之一所述的一种生物芯片，其特征在于：所述有色片基上提供有色背景的表面的粗糙度Ra在0.02-3.0um之间、优选方案在0.25-3.0um之间。
17、一种生物芯片试剂盒，其特征在于：其含有有色生物芯片和着色剂或含着色剂的物质。
18、根据权利要求17所述的一种生物芯片试剂盒，其特征在于：所述着色剂包括荧光物质、化学发光催化剂、显色和发光底物、有色金属或有色金属盐、染料和颜料，所述含有着色剂的物质包括着色标记物、纳米微粒着色标记物和分子载体着色标记物。
19、根据权利要求18所述的一种生物芯片试剂盒，其特征在于：其着色剂为下述之一种或多种物质：荧光素、罗丹明、氨基黑、考马斯亮蓝、银盐、结晶紫、胶体或纳米金、胶体硒、改性炭黑、钛白粉、化学发光催化剂、水性染料、水油两性染料、印花涂料色浆。
20、根据权利要求18所述的一种生物芯片试剂盒，其特征在于：所述纳米微粒着色标记物，其中的纳米微粒平均粒径为1-500nm。
21、根据权利要求19所述的一种生物芯片试剂盒其特征在于：所述纳米微粒，包括金、钒、铅、银、铁及其氧化物微粒氧化硅、氧化钛、氧化铝微粒，塑料、多糖、乳胶、树脂和其它高分子材料微粒，还包括上述微粒修饰结合有功能基团和/或功能物的微粒衍生物。
22、根据权利要求20所述的一种生物芯片试剂盒，其特征在于：所述功能基团包括氨基、酰基、羧基、羟基、醛基和环氧基。
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