CN1500808A

CN1500808A - 重组人可溶性trail蛋白、其制备方法及其应用

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Publication number: CN1500808A
Application number: CNA021486727A
Authority: CN
Inventors: 宏李; 李宏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-11-15
Filing date: 2002-11-15
Publication date: 2004-06-02

Abstract

本发明公开了重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体及其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明以人扁桃体组织mRNA为模板，扩增了TRAIL编码序列，分别构建了表达rhsTRAIL蛋白的大肠肝菌工程菌和酵母菌工程菌，并分别建立了rhsTRAIL大肠肝菌工程菌发酵、包涵体洗涤、目的蛋白纯化工艺，及酵母工程菌发酵和目的蛋白纯化工艺。获得rhsTRAIL纯品。分子量为19.6－24KD，以单体和二聚体两种形式存在。在体外能诱导多种癌细胞凋亡，在体内能显著抑制荷瘤小鼠肝癌细胞的增殖，具有选择性杀伤肿瘤细胞作用。表明rhsTRAIL可以用作于制备抗肿瘤的有效药物。

Description

重组人可溶性TRAIL蛋白、其制备方法及其应用

发明领域

本发明涉及重组人可溶性TRAIL蛋白、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用，具体地说，本发明涉及肿瘤坏死因子相关的细胞凋亡配体(以下称TRAIL蛋白)其基因克隆、制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用，所述TRAIL蛋白具有体外诱导肿瘤细胞凋亡和体内抗肿瘤的作用，可用于多种肿瘤的治疗，在临床肿瘤的治疗中具有潜在的应用价值。

背景技术

目前恶性肿瘤的发病率和死亡率仍逐年上升，成为首位或第二位致死性疾病。肿瘤的治疗主要依赖于放疗、化疗和手术切除三大疗法。其中手术切除有其局限性，而放疗和化疗又有以下不足：1.对正常细胞有明显的杀伤作用；2.许多肿瘤细胞对治疗有抗性。因此，研制一种特异性强、有效、低毒的抗肿瘤药物是肿瘤治疗的主要研究目标。

肿瘤的生物治疗越来越受到专家和学者的重视。随着细胞凋亡机理的阐明及诱导细胞凋亡因子的不断发现，肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的研究倍受人们关注。它是继TNF、FasL之后发现的又一细胞凋亡诱导因子，广泛存在于机体多种正常组织中。由于其受体在正常细胞和肿瘤细胞上的结构和分布不同，从而使其具有选择性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒副作用的特性。

WO9701633公开了TRAIL的cDNA及单克隆抗体。

中国专利申请99111039公开了TRAIL的衍生物TRAILD及其抗肿瘤作用，是以中国人外周血淋巴细胞mRNA为模板，采用RT-PCR扩增TRAILD的cDNA，获得TRAILD的重组原核表达载体，转入大肠杆菌后，获得稳定表达TRAILD重组融合蛋白的工程菌，经传代筛选，使该蛋白以可溶形式在细菌胞浆中表达，经发酵、破碎、层析和分离，得到纯化的TRAILD蛋白。

现已经证明rhsTRAIL(recombinant human soluble tumor necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand，rhsTRAIL)在体外能诱导多种肿瘤细胞凋亡；在体内用于治疗裸鼠异种皮下移植的人肿瘤，能明显抑制肿瘤细胞的增殖和扩散，对正常组织、器官没有任何可测得的毒性，更不会引发TNF所引起的致命的血管炎症综合症及FasL所造成的严重肝损伤。因此，TRAIL作为新一代抗肿瘤生物制剂具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组人可溶性TRAIL蛋白，所述蛋白可有效地诱导多种肿瘤细胞凋亡，抑制小鼠体内移植瘤的增殖，具有良好的抗肿瘤生物活性。

本发明的另一目的在于提供一种重组人可溶性TRAIL蛋白的生产方法，所述方法中采用人TRAIL蛋白可溶性胞外区编码序列基因，可以通过原核表达系统——大肠肝菌、真核表达系统——毕赤酵母分别对其胞外区蛋白进行表达，原核表达系统可以达到高效表达，而酵母工程菌为分泌型表达，制备工艺简单。

本发明的再一目的在于提供TRAIL蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的重组人可溶性TRAIL蛋白，具有大肠肝菌表达的Seq1序列或酵母菌表达的Seq2序列。

Seq1序列：

＂MVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGF

YYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELK

ENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG＂

Seq2序列：

EAEAEFVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIH

EKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGI

FELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG

本发明的重组人可溶性TRAIL蛋白的生产方法是采用基因重组技术，从人扁桃体组织中提取mRNA为模板，经RT-PCR扩增，得到人TRAIL蛋白编码序列基因和其可溶性胞外区蛋白编码序列基因，通过原核表达系统——大肠肝菌或真核表达系统——毕赤酵母分别对其胞外区蛋白进行表达；前者为非融合蛋白，主要以包涵体形式存在；后者经甲醇诱导，在培养液中高水平分泌表达。

其中Seq1的制备方法包括如下步骤：

(1)克隆人可溶性TRAIL蛋白基因；

从人扁桃体组织中提取mRNA为模板，经RT-PCR扩增，得到人TRAIL蛋白编码序列基因和其可溶性胞外区蛋白编码序列基因，

(2)在原核表达系统——大肠肝菌中表达和生产人可溶性TRAIL蛋白，

首先构建工程菌并诱导表达，然后高密度发酵工程菌并诱导表达，包涵体分离和洗涤后，将目的蛋白质复性、纯化。

具体地说，本发明的Seq1的制备方法为：

(1)将上游引物：

①——AG GAATTC TGAC AGG ATC ATG GCT ATG ATG——

②——AG GAATTC TATG GTG AGA GAA AGA GGT CCTC——

和下游引物：

--AC GGATCC AGG TCAG TTA GCC AACT——相组合，经逆转录聚合酶链式反应分别扩增人TRAIL蛋白编码序列和其可溶性胞外区蛋白的编码序列cDNA，该cDNA编码TRAIL蛋白的第114-281位氨基酸，经过酶切、电泳回收DNA片段后用连接酶与载体连接，产物转化大肠肝菌感受态细胞，挑取阳性克隆，获得了TRAIL蛋白编码序列基因(trail)和其可溶性胞外区蛋白编码序列基因(strail)；

(2)strail和表达载体质粒经酶切，回收对应DNA片段，经连接酶连接后转化大肠肝菌感受态细胞，挑取阳性转化克隆，抽提质粒进行酶切鉴定，得到阳性重组表达载体质粒pBV220-hstrail，转化宿主菌DH5α，获得表达非融合rhsTRAIL的大肠肝菌基因工程菌。

(3)表达非融合rhsTRAIL的大肠肝菌基因工程菌种子液接种于培养基中培养，发酵液pH为6.9±0.1，培养至OD₆₀₀＝1.5时，升温诱导表达4小时，收集菌体；

(4)加入裂解缓冲液冻存，融化后在冰浴下采用超声波破碎，离心收集包涵体。以洗涤液洗涤提取的包涵体，去除杂质、脂质和杂蛋白，得到精制包涵体；

(5)将精制包涵体溶解在变性剂中，离心、透析复性后再离心，上清即为复性的rhsTRAIL样品；

(6)用阴离子交换柱纯化复性的rhsTRAIL，目的蛋白峰经超滤浓缩后用分子筛柱进一步纯化，得到大肠肝菌表达的rhsTRAIL纯品。

进一步，本发明的Seq1的制备方法还包括单克隆抗体的制备，其方法为：

用大肠肝菌表达的rhsTRAIL纯品免疫BALB/C雌性小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤在聚乙二醇条件下进行细胞融合、克隆，经检测得到5株抗rhsTRAIL的单克隆抗体细胞株。

本发明Seq2的制备方法包括如下步骤：

(1)基因克隆人可溶性TRAIL蛋白

从人扁桃体组织中提取mRNA为模板，经RT-PCR扩增，得到人TRAIL蛋白编码序列基因和其可溶性胞外区蛋白编码序列基因；

(2)在真核表达系统—毕赤酵母中诱导表达和生产人可溶性TRAIL蛋白

包括构建rhsTRAIL酵母表达工程菌，发酵和诱导表达及纯化目的蛋白质。

具体地说，本发明的Seq2的制备方法为：

(1)基因克隆人可溶性TRAIL蛋白

将上游引物：

①——AG GAATTC TGAC AGG ATC ATG GCT ATG ATG——

②——AG GAATTC TATG GTG AGA GAA AGA GGT CCTC——

和下游引物：

--AC GGATCC AGG TCAG TTA GCC AACT——相组合，经逆转录聚合酶链式反应分别扩增人TRAIL蛋白编码序列和其可溶性胞外区蛋白的编码序列cDNA，该cDNA编码TRAIL蛋白的第114-281位氨基酸，经过酶切、电泳回收DNA片段与载体连接，产物转化大肠肝菌感受态细胞，挑取阳性克隆，获得了TRAIL蛋白编码序列基因(trail)和其可溶性胞外区蛋白编码序列基因(strail)；

(2)rhsTRAIL酵母表达工程菌的构建

设计如下引物对strail末端进行修饰：

上游引物：——GTA GAATTC GTG AGA GAA AGA GGT C——

下游引物：——TAC GC GGCCGC CAG TTA GCC AAC TAA——

应用PCR方法扩增stail基因，PCR产物经双酶解、电泳回收后定向克隆至表达载体质粒pPICZαA的α因子信号肽编码序列下游，构建sTRAIL的表达载体质粒pPICZαA-strail；

取重组表达质粒pPICZαA-strail经线性化，沉淀浓缩后转化甲醇营养型酵母GS115菌株(购自Invitrogen公司)，平板上筛选阳性克隆得到约500个转化菌；

将阳性克隆一一对应地接种在MDH和MMH平板上培养，筛选鉴定Mut表型，用诱导表达方法筛选高水平表达rhsTRAIL的重组酵母工程菌株，

(3)工程菌的发酵和诱导表达

将菌种接种于BMGY培养基中，振摇培养至OD₆₀₀＝5.0，收集菌体，重悬于BMMY培养基中，诱导表达4天后收集培养液上清；

采用高密度、分批补料发酵的方法。取种子液接种到分批发酵培养基中进行培养，并进行诱导表达，收获培养液上清；

(4)目的蛋白质的纯化

培养基上清去除杂蛋白后，用40％-80％饱和度硫酸铵可将80％的目的蛋白沉淀，用pH8.8的Tris-HCl缓冲液溶解上述沉淀，用SephadexG-50色谱柱纯化，收集目的蛋白峰。

进一步，本发明的Seq2的制备方法还包括将目的蛋白用强阴离子交换柱分离得到纯目的蛋白。

本发明由大肠杆菌表达的rhsTRAIL蛋白，具有与天然TRAIL蛋白一致的氨基酸序列和氨基酸组成；大肠杆菌的高效表达，使rhsTRAIL蛋白在胞内来不及折叠为天然的正确结构，而以无活性的包涵体形式存在，经过后期的目的蛋白变性、复性、纯化工艺，得到高纯度的rhsTRAIL蛋白。

酵母工程菌为真核表达系统，由于天然TRAIL蛋白是糖蛋白，酵母真核表达系统可对目的蛋白加工、修饰(如糖基化)，因此具有天然结构和生物活性，另外采用分泌型表达载体，目的蛋白分泌到培养基中，有利于分离纯化，因此，我们认为表达rhsTRAIL蛋白酵母工程菌的构建是重组人TRAIL蛋白研究的新起点。此外，相对于大肠杆菌表达的非融合蛋白而言，本发明酵母工程菌为分泌型表达，故目的蛋白序列的N端连接有酵母菌信号肽序列，两者之间有蛋白酶的氨基酸识别序列位点，目的蛋白被分泌到细胞外后，其N端还保留2-6个信号肽的氨基酸。

体外、体内实验证明，本发明的重组人可溶性TRAIL蛋白相对于其它目前应用的TRAIL蛋白可更有效地诱导多种肿瘤细胞凋亡，抑制小鼠体内移植瘤的增殖，具有更优越的抗肿瘤生物活性。

具体实施例

下面结合附图和具体实施例详细描述本发明，所述的实施例用于描述本发明，而不是限制本发明。

附图说明

附图1a、图1b分别是strail基因正、负链核苷酸序列分析结果；

附图2 大肠杆菌表达rhsTRAIL的SDS-PAGE分析结果

A、菌体裂解液；B、包涵体 C、纯化的rhsTRAIL

附图3 重组酵母表达载体质粒pPICZαA-strail的核苷酸序列分析结果

附图4 酵母工程菌表达rhsTRAIL的SDS-PAGE分析结果

附图5 酵母工程菌表达rhsTRAIL的Western blot检测结果。

本发明所述的重组人可溶性TRAIL蛋白，是其胞外区多肽部分(114-281位氨基酸)。大肠杆菌表达产物加上起始密码编码的甲硫氨酸，共计169个氨基酸组成，分子量为19.6KD。酵母菌表达产物由于蛋白酶的切点不同，具有N端不均一性，由170-174个氨基酸组成，但大部分产物为174个氨基酸，分子量约24KD，在约48KD处形成二聚体，等电点4.5-5.5。

本发明重组人可溶性TRAIL蛋白的制备方法包括人可溶性TRAIL蛋白的基因克隆、人可溶性TRAIL蛋白在原核表达系统——大肠肝菌或真核表达系统——毕赤酵母中的表达和生产，具体如下：

一、人可溶性TRAIL蛋白的基因克隆

取人扁桃体组织100mg，按mRNA分离试剂盒操作手册(Boehringer Mannheim公司)提取mRNA，以其为模板，分别以

上游引物：

①——AG GAATTC TGAC AGG ATC ATG GCT ATG ATG——

②——AG GAATTC TATG GTG AGA GAA AGA GGT CCTC——

下游引物：

--AC GGATCC AGG TCAG TTA GCC AACT——相组合，经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分别扩增人TRAIL蛋白编码序列和其可溶性胞外区蛋白的编码序列cDNA，后者编码TRAIL蛋白的第114-281位氨基酸。用引物两侧修饰酶切位点EcoRI/BamHI消化PCR产物和pBluscript KS(-)质粒，电泳回收DNA片段后经T₄连接酶连接，产物转化用CaCl₂致敏的大肠肝菌JM109(购自北京鼎国生物技术发展中心)感受态细胞，挑取阳性克隆，抽提质粒，经酶切鉴定和序列分析证实，获得了TRAIL蛋白编码序列基因(trail)和其可溶性胞外区蛋白编码序列基因(strail)如下：

trail基因序列：

tctga caggatcatg gctatgatgg aggtccaggg gggacccagc

ctgggacaga cctgcgtgct gatcgtgatc ttcacagtgc tcctgcagtc tctctgtgtg

gctgtaactt acgtgtactt taccaacgag ctgaagcaga tgcaggacaa gtactccaaa

agtggcattg cttgtttctt aaaagaagat gacagttatt gggaccccaa tgacgaagag

agtatgaaca gcccctgctg gcaagtcaag tggcaactcc gtcagctcgt tagaaagatg

attttgagaa cctctgagga aaccatttct acagttcaag aaaagcaaca aaatatttct

cccctagtga gagaaagagg tcctcagaga gtagcagctc acataactgg gaccagagga

agaagcaaca cattgtcttc tccaaactcc aagaatgaaa aggctctggg ccgcaaaata

aactcctggg aatcatcaag gagtgggcat tcattcctga gcaacttgca cttgaggaat

ggtgaactgg tcatccatga aaaagggttt tactacatct attcccaaac atactttcga

tttcaggagg aaataaaaga aaacacaaag aacgacaaac aaatggtcca atatatttac

aaatacacaa gttatcctga ccctatattg ttgatgaaaa gtgctagaaa tagttgttgg

tctaaagatg cagaatatgg actctattcc atctatcaag ggggaatatt tgagcttaag

gaaaatgaca gaatttttgt ttctgtaaca aatgagcact tgatagacat ggaccatgaa

gccagttttt tcggggcctt tttagttggc taactgacct gga

strail基因序列：

gtga gagaaagagg tcctcagaga gtagcagctc acataactgg gaccagagga

agaagcaaca cattgtcttc tccaaactcc aagaatgaaa aggctctggg ccgcaaaata

aactcctggg aatcatcaag gagtgggcat tcattcctga gcaacttgca cttgaggaat

ggtgaactgg tcatccatga aaaagggttt tactacatct attcccaaac atactttcga

tttcaggagg aaataaaaga aaacacaaag aacgacaaac aaatggtcca atatatttac

aaatacacaa gttatcctga ccctatattg ttgatgaaaa gtgctagaaa tagttgttgg

tctaaagatg cagaatatgg actctattcc atctatcaag ggggaatatt tgagcttaag

gaaaatgaca gaatttttgt ttctgtaaca aatgagcact tgatagacat ggaccatgaa

gccagttttt tcggggcctt tttagttggc taactgacct gga

参见附图1a、图1b所示的是strail基因正、负链核苷酸序列分析结果。

二、可溶性TRAIL蛋白在原核表达系统——大肠肝菌中的表达和生产

1.工程菌的构建和诱导表达

将pBluscript KS(-)-strail和表达载体质粒pBV220(病毒学报，1990，6(2)111-6)经EcoRI/BamHI消化，回收对应DNA片段，经T4连接酶连接后转化CaCl2致敏的大肠肝菌JM109(购自北京鼎国生物技术发展中心)感受态细胞，挑取阳性转化克隆，抽提质粒进行酶切鉴定，得到阳性重组表达载体质粒pBV220-strail，转化宿主菌DH5α(购自北京鼎国生物技术发展中心)，将阳性单克隆接种于5ml LB培养液中(每升胰化蛋白胨10g、酵母抽提物5g、NaCl 10g)，含氨苄青霉素(Amp)100μg/ml，在30℃，250rpm震摇培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0，提高培养温度至42℃进行诱导表达5小时，收集菌体。SDS-PAGE检测，与空白对照比较，可见明显的19.6KD目的蛋白表达带(参见附图2A)，与理论值相符，获得表达非融合rhsTRAIL的大肠肝菌基因工程菌。

2.工程菌的高密度发酵和诱导表达

表达非融合rhsTRAIL的大肠肝菌基因工程菌种子液按1∶10比例接种于LB培养基(100μg/ml Amp)中，在30℃，100rpm条件下培养。按溶氧降10％，转速提高100rpm调整转速，最高不超过700rpm。以0.2mol/L NaOH调节发酵液pH为6.9±0.1，培养3小时后开始补加葡萄糖0.25g/L·h，LB培养基150ml/h。培养至OD₆₀₀＝1.5时，升温至42℃，诱导表达4小时，收集菌体，菌体湿重约30g/L，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的25％-30％(参见图2A)。

3.包涵体的分离与洗涤

每克湿菌加入裂解缓冲液10ml(裂解溶液组成为：50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA)，-30℃下冻存。融化后在冰浴下采用超声波破碎，镜检菌体破碎率90％以上，在12000rpm下离心20min，收集包涵体。

以组成为50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA的TE液洗涤提取的包涵体，去除杂质，以20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，pH8.0，0.5％TritonX-100，2mmol/Lβ-巯基乙醇洗涤包涵体1次以去除脂质，再用TE液洗涤一次；最后用2M脲，20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，pH8.0洗涤1次去除杂蛋白，最后得到精制包涵体(参见图2B)。

本发明大肠杆菌表达的非融合蛋白，由于其高效表达，使其在胞内来不及折叠为天然的正确结构，而以无活性的包涵体形式存在。

4.目的蛋白质的复性

取精制包涵体用50mmol/L NH₄AC(醋酸铵)、7mol/L盐酸胍，1％巯基乙醇充分溶解，8000rpm下离心10min，上清用2mol/L盐酸胍稀释使蛋白浓度低于500μg/ml，再用50mmol/L NH₄Ac做10倍稀释，对缓冲液1mmol/L NH₄Ac透析24h，离心，上清即为复性的rhsTRAIL样品。

5.复性蛋白质的柱层析纯化

以50mmol/L NH₄Ac平衡DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(Parmacia公司产品)，复性的rhsTRAIL上样，用50mmol/L NaCl，50mmol/L NH₄AC，pH8.0洗脱目的蛋白，经SDS-PAGE检测rhsTRAIL在主峰中。所收目的蛋白峰经超滤浓缩至2.0mg/ml，上SuperdeX 75分子筛柱，以生理盐水洗脱，收集目的蛋白峰，纯度为97％(图2C)。

6.单克隆抗体的制备

用大肠肝菌表达的rhsTRAIL纯品免疫BALB/C雌性小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在聚乙二醇条件下进行细胞融合、克隆，经检测得到5株抗rhsTRAIL的单克隆抗体细胞株。

三、人可溶性TRAIL蛋白在真核表达系统—毕赤酵母中的诱导表达和生产：

1.rhsTRAIL酵母表达工程菌的构建

设计如下引物对strail末端进行修饰：

上游引物：——GTA GAATTC GTG AGA GAA AGA GGT C——

下游引物：——TAC GC GGCCGC CAG TTA GCC AAC TAA——

应用PCR方法扩增stail基因，PCR产物经EcoRI/NotI双酶解，电泳回收后定向克隆至表达载体质粒pPICZαA的α因子信号肽编码序列下游，构建sTRAIL的表达载体质粒pPICZαA-strail，酶切鉴定。序列分析结果为：

--AAAAGAGAGG CTGAAGCT GAATTCgtga gagaaagagg tcctcagaga gtagcagctc

acataactgg gaccagagga agaagcaaca cattgtcttc tccaaactcc aagaatgaaa

aggctctggg ccgcaaaata aactcctggg aatcatcaag gagtgggcat tcattcctga

gcaacttgca cttgaggaat ggtgaactgg tcatccatga aaaagggttt tactacatct

attcccaaac atactttcga tttcaggagg aaataaaaga aaacacaaag aacgacaaac

aaatggtcca atatatttac aaatacacaa gttatcctga ccctatattg ttgatgaaaa

gtgctagaaa tagttgttgg tctaaagatg cagaatatgg actctattcc atctatcaag

ggggaatatt tgagcttaag gaaaatgaca gaatttttgt ttctgtaaca aatgagcact

tgatagacat ggaccatgaa gccagttttt tcggggcctt tttagttggc taactg

GCGGCCGC CAGCTTTCTA--

大写为载体pPICZαA部分序列，小写为strail序列。

参见图3，测定结果与设计一致。

取重组表达质粒pPICZαA-strail 10μg经SacII线性化，沉淀浓缩后用LiCl法转化甲醇营养型酵母GS115菌株(购自Invitrogen公司)，操作方法按invitrogen的Easy Select^TM Pichia Expression Kit说明书进行。含Zeocin(invitrogen公司产品)100mg/100ml的YPDS(1％酵母抽提物，2％胰化蛋白胨，2％葡萄糖，1M山梨醇)平板上筛选阳性克隆得到约500个转化菌。再用PCR方法检测strail基因，经鉴定得到20个阳性克隆。

用MDH[1.34％YNB(无过硫酸铵，无氨基酸的酵母氮碱)，4×10^-5％生物素，2％葡萄糖]和MMH(1.34％YNB，4×10^-5％生物素，0.5％甲醇)平板确定阳性克隆的Mut表型，将阳性克隆一一对应地接种在MDH和MMH平板上，28-30℃培养2天后，确定20株阳性克隆均为Mut^-s表型，即甲醇利用迟缓型。最后用诱导表达方法筛选高水平表达rhsTRAIL的重组酵母工程菌株，即将上述阳性克隆分别接种于10mlBMGY培养基(BMGY培养基的组成为：10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，100mmol/L磷酸钾pH6.0，13.4g/LYNB，4×10^-5g/L生物素和1％甘油)，在30℃，250rpm振摇培养至OD₆₀₀＝5.0。收集菌体，用2ml BMMY(BMGY中的1％甘油被1％甲醇取代)培养基重悬。相同条件下培养，每24小时取样用于电泳检验，同时补充甲醇至终浓度0.5％。电泳检测结果显示：甲醇诱导1天已开始表达目的蛋白，诱导第4天达高峰。表达量为50mg/L，目的蛋白占培养液上清总蛋白的80％以上，以单体和二聚体两种形式存在，分子量分别为20KD和40KD(参见图4)，用抗大肠杆菌表达的rhsTRAIL单克隆抗体做western blot检测，目的蛋白带有特异性反应，证实表达产物为rhsTRAIL蛋白(图5)，序列结构如下：

ekr↓ea↑ea↑ef

VRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKG

FYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGI

FELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG

小写为载体信号肽部分序列，大写为目的蛋白序列。

↓：为Kex2 signal cleavage；↑：为Ste13 signal cleavage

2.工程菌的发酵和诱导表达

1).摇瓶培养：菌种按2％浓度接种于500ml BMGY培养基中，30℃，300rpm振摇培养至OD₆₀₀＝5.0。收集菌体，重悬于100ml BMMY培养基中，每24h补加1％体积甲醇，诱导表达4天后收集培养液上清。SDS-PAGE电泳检测结果显示，表达量约50mg/L(图略)。

2).发酵罐发酵：B.Braun5L发酵罐，采用高密度、分批补料发酵的方法。取种子液，按1∶10比例接种到2.5L分批发酵培养基(FM21基础盐中含4％甘油和4ml/L PTM1微量元素溶液)(参见Molecular Cloning：A Laboratory Manual2^nd，1989)中进行分批培养，NH₄H₂O(氨水)调pH至约5.5，溶氧(DO)检测碳源。甘油耗尽时，流加补料生长培养基(50％甘油，12ml/L PTM1溶液)维持溶氧大于10％，当OD₆₀₀＝500左右时，停止补料。甘油耗尽后，补加诱导培养基(100％甲醇、12ml/L PTM1溶液)并将pH值控制在5.5-6.0进行诱导表达，调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度，使DO大于20％，甲醇浓度小于1％。诱导表达4天，收获培养液上清，目的蛋白表达量达400mg/L。

3.目的蛋白质的纯化

硫酸铵分级沉淀：用40％饱和度硫酸铵沉淀培养基上清，可去除绝大多数杂蛋白，40％-80％饱和度硫酸铵可将80％的目的蛋白沉淀。用20mmol/L，pH8.8的Tris-HCl缓冲液溶解上述沉淀2mg/ml，以4％柱体积上经20mmol/L，pH8.8的Tris-HCl缓冲液溶解平衡的SephadexG-50色谱柱，用同种缓冲液洗脱，收集目的蛋白峰，纯度可达90％。

样品继续经Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换柱分离，目的蛋白峰经非还原型SDS-PAG电泳检测，扫描结果显示目的蛋白纯度＞97％(图4)。

四、组人可溶性TRAIL蛋白的抗肿瘤生物学作用

重组人可溶性TRAIL蛋白体外诱导肿瘤细胞凋亡活性

采用MTT检测法，分别将SMMC7721、BEL7402肝癌细胞，G/C82肺腺癌细胞，SW480结肠癌细胞以1×10⁴/ml接种于96孔细胞培养板，常规培养24h，弃上清，用含1％小牛血清的1640(Sigma公司)培养液稀释本发明的重组人可溶性TRAIL蛋白分别至表1所示的浓度，加入培养板中(n＝8)，继续培养48小时。对照组为含1％小牛血清的1640培养液。加入10μl/孔1.5mg/ml的MTT[3，(4，5-methylthiozol-2-yl-2，5-diphenyltetrazolium brode assay)]培养5小时后，弃上清，每孔加入100μl DMSO(二甲基亚砜)，用ELX-800酶标仪测定其A值，测定波长570nm，参考波长630nm的吸收，结果见表1。

表1 rhsTRAIL对培养肿瘤细胞的作用 (n＝8)

分组浓度(μg/ml) SMMC7721 BEL7402 G/C82 SW480

对照 - 0.485±0.031 0.375±0.024 0.431±0.011 0.532±0.021

rhsTRAIL 0.1 0.491±0.035 0.365±0.018 0.440±0.043 0.533±0.031

1.0 0.452±0.021* 0.338±0.021* 0.401±0.032* 0.501±0.025*

5.0 0.317±0.017** 0.281±0.016** 0.347±0.024** 0.413±0.018**

10 0.301±0.020** 0.254±0.020** 0.315±0.014** 0.415±0.013**

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

由表1可见，1μg/ml纯品即可诱导上述肿瘤细胞产生不同程度的凋亡。随着浓度提高，对肿瘤细胞产生凋亡的作用提高。

相同方法检测rhsTRAIL对正常大鼠原代肝细胞的作用，结果显示，没有明显的诱导凋亡作用。(见表2)

表2 rhsTRAIL对大鼠原代培养肝细胞的影响(n＝8)

分组剂量(μg/ml) OD

对照 -- 0.345±0.018

rhsTRAIL 0.1 0.351±0.022*

1.0 0.347±0.016*

5.0 0.344±0.015*

10 0.357±0.025*

注：与对照组比较*P＞0.05

1.重组人可溶性TRAIL蛋白体内抑制肿瘤细胞增殖活性

采用2X10⁵BEL-7402肝癌细胞，0.1ml体积接种于小鼠(18-24g)腰背部皮下，制作荷BEL-7402肝癌细胞小鼠肿瘤动物模型，腹腔内给药，重组人可溶性TRAIL蛋白的剂量分别为0.1、0.5、1.0mg/kg/天，以生理盐水做阴性对照。给药10天后，测量瘤决大小，结果表明，rhsTRAIL能显著抑制BEL-7402肝癌细胞在小鼠体内的增殖。结果见表3。

表3 rhsTRAIL对小鼠荷瘤的抑制作用(n＝10)

分组剂量(mg/kg) 荷瘤重量(g) 肿瘤抑制率(％)

对照 -- 0.832±0.25

rhsTRAIL 0.1 0.854±0.27 -

0.5 0.5 35±0.25* 35.7

1.0 0.467±0.18** 43.9

注：与对照组比较*P＜O.05，**P＜0.01

总之，本发明构建了表达rhsTRAIL蛋白的大肠杆菌工程菌和酵母工程菌，并建立了一整套生产方法。其特点是大肠杆菌表达的rhsTRAIL是非融合蛋白，具有与天然TRAIL蛋白一致的氨基酸序列和氨基酸组成；由于天然TRAIL蛋白是糖蛋白，所以我们采用了酵母真核表达系统，其优点在于：①表达的目的蛋白可被加工、修饰糖基化，具有天然结构和生物活性，②采用分泌型表达载体，目的蛋白分泌到培养基中，有利于分离纯化。因此，我们认为表达rhsTRAIL蛋白酵母工程菌的构建是重组人TRAIL蛋白研究的新起点。

Claims

1.一种重组人可溶性TRAIL蛋白，其序列为：

Seq1：

＂MVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGF

YYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELK

ENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG＂，

或者Seq2：

EAEAEFVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIH

EKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGI

FELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG

2.根据权利要求1所述的一种重组人可溶性TRAIL蛋白，其特征在于所述Seq1序列为人可溶性TRAIL蛋白胞外区多肽部分的114-281位氨基酸，起始密码编码为甲硫氨酸，分子量为19.6KD；所述Seq2序列由170-174个氨基酸组成。

3.根据权利要求3所述的一种重组人可溶性TRAIL蛋白，其特征在于所述Seq2序列由174个氨基酸组成，分子量约24KD，在约48KD处形成二聚体，等电点4.5-5.5。

4.权利要求1所述的重组人可溶性TRAIL蛋白的制备方法，其特征在于具有Seq1序列的TRAIL蛋白的制备包括如下步骤：

(1)基因克隆人可溶性TRAIL蛋白编码序列；

(2)在原核表达系统——大肠肝菌中表达和生产人可溶性TRAIL蛋白；

5.根据权利要求4所述的重组人可溶性TRAIL蛋白的制备方法，其特征在于

(1)基因克隆人可溶性TRAIL蛋白

将上游引物：

①——AG GAATTC TGAC AGG ATC ATG GCT ATG ATG——

②——AG GAATTC TATG GTG AGA GAA AGA GGT CCTC——

和下游引物：

--AC GGATCC AGG TCAG TTA GCC AACT——相组合，经逆转录聚合酶链式反应分别扩增人TRAIL蛋白编码序列和其可溶性胞外区蛋白的编码序列cDNA，该cDNA编码TRAIL蛋白的第114-281位氨基酸，经过酶切、电泳回收DNA片段和连接酶连接，产物转化大肠肝菌感受态细胞，挑取阳性克隆，获得了TRAIL蛋白编码序列基因(trail)和其可溶性胞外区蛋白编码序列基因(strail)；

(2)strail和表达载体质粒经消化，回收对应DNA片段，经连接酶连接后转化大肠肝菌感受态细胞，挑取阳性转化克隆，抽提质粒进行酶切鉴定，得到阳性重组表达载体质粒pBV220-strail，转化宿主菌DH5α，将阳性单克隆接种于培养液中培养并诱导表达，收集菌体，获得表达非融合rhsTRAIL的大肠肝菌基因工程菌；

(3)表达非融合rhsTRAIL的大肠肝菌基因工程菌种子液接种于培养基中培养，发酵液pH为6.9±0.1，培养至OD600＝1.5时，升温诱导表达4小时，收集菌体；

6.根据权利要求5所述重组人可溶性TRAIL蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)取精制包涵体用50mmol/L NH₄AC、7mol/L盐酸胍、1％巯基乙醇充分溶解，8000rpm下离心10min，上清用2mol/L盐酸胍稀释使蛋白浓度低于500μg/ml，再用50mmol/L NH₄Ac做10倍稀释，对缓冲液1mmol/L NH₄Ac透析24h，离心，上清即为复性的rhsTRAIL样品。

(2)复性蛋白质的柱层析纯化

以50mmol/L NH₄Ac平衡DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，复性的rhsTRAIL上样，用50mmol/L NaCl，50mmol/L NH₄AC，pH8.0洗脱目的蛋白，经SDS-PAGE检测rhsTRAIL在主峰中。所收目的蛋白峰经超滤浓缩至2.0mg/ml，上SuperdeX 75分子筛柱，以生理盐水洗脱，收集目的蛋白峰，纯度为97％。

7.权利要求1所述重组人可溶性TRAIL蛋白的制备方法，其特征在于Seq2序列TRAIL蛋白的制备包括如下步骤：

(1)基因克隆人可溶性TRAIL蛋白编码序列

包括构建rhsTRAIL酵母表达工程菌，发酵、诱导表达和纯化目的蛋白质。

8.根据权利要求7所述的重组人可溶性TRAIL蛋白的制备方法，其特征在于Seq2序列TRAIL蛋白的制备包括如下步骤：

(1)基因克隆人可溶性TRAIL蛋白

将上游引物：

①——AG GAATTC TGAC AGG ATC ATG GCT ATG ATG——

②——AG GAATTC TATG GTG AGA GAA AGA GGT CCTC——

和下游引物：

--AC GGATCC AGG TCAG TTA GCC AACT——相组合，经逆转录聚合酶链式反应分别扩增人TRAIL蛋白编码序列和其可溶性胞外区蛋白的编码序列cDNA，该cDNA编码TRAIL蛋白的第114-281位氨基酸，经过酶切、电泳回收DNA片段与载体连接，产物转化大肠肝菌感受态细胞，挑取阳性克隆，获得了TRAIL蛋白编码序列基因和其可溶性胞外区蛋白编码序列基因；

(2)rhsTRAIL酵母表达工程菌的构建

设计如下引物对strail末端进行修饰：

上游引物：——GTA GAATTC GTG AGA GAA AGA GGT C——

下游引物：——TAC GC GGCCGC CAG TTA GCC AAC TAA——

取重组表达质粒pPICZαA-strail经线性化，沉淀浓缩后转化甲醇营养型酵母GS115菌株，平板上筛选阳性克隆得到约500个转化菌；

将阳性克隆一一对应地接种在MDH和MMH平板上培养，筛选鉴定其Mut表型，用诱导表达方法筛选高水平表达rhsTRAIL的重组酵母工程菌株；

(3)工程菌的发酵和诱导表达

将菌种接种于BMGY培养基中，振摇培养至OD₆₀₀＝5.0，收集菌体，并重悬于BMMY培养基中，诱导表达4天后收集培养液上清；

(4)目的蛋白质的纯化

9.根据权利要求8所述的一种重组人可溶性TRAIL蛋白的制备方法，其特征在于：将目的蛋白用强阴离子交换柱分离得到纯目的蛋白，强阴离子交换柱为Q-Sepharose Fast Flow。

10.如权利要求1至9任何一项所述重组人可溶性TRAIL蛋白在制备治疗肿瘤药物中的应用。