CN1594284A

CN1594284A - 酶标记克伦特罗及其制备方法

Info

Publication number: CN1594284A
Application number: CN 200410025228
Authority: CN
Inventors: 陈宇光; 戴小峰
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2004-06-17
Filing date: 2004-06-17
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2024-06-17
Also published as: CN1272312C

Abstract

本发明涉及一种酶标记克伦特罗及其制备方法。本发明的一种酶标记克伦特罗，其结构(如图)：其中，E的结构为：其中，本发明的制备方法包括：1.克伦特罗衍生物半戊二酸克伦特罗的合成；2.克伦特罗衍生物长臂克伦特罗的合成，3.长臂克伦特罗与辣根过氧化物酶的交联。采用本发明制备的酶标记克伦特罗，通过其与β₂－肾上腺素能受体的亲和力，可以快速、准确的检测出β₂－兴奋剂，而且该方法操作简单、成本低、使用方便。

Description

酶标记克伦特罗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种酶标记克伦特罗及其制备方法，特别是一种辣根过氧化物酶标记的长臂克伦特罗及其制备方法。

背景技术

β₂-肾上腺素能兴奋剂(简称β₂-兴奋剂)中有一类人工合成激素类药物，如Clenbuterol(克伦特罗)、Salbutamol(沙丁胺醇)等，临床上用于治疗哮喘和支气管痉挛等相关疾病。但如提高使用剂量5-10倍，并长期使用，还具有增强肌肉，减少脂肪的副作用。这一特点使它们常被用作为生长促进剂而添加于饲料中，提高家畜的瘦肉率(俗称瘦肉精)。这些药物的滥用对消费者健康造成危害。

目前检测β₂-肾上腺素能兴奋剂的方法较多，较常用的方法主要有二类：一类为仪器分析，包括HPLC、GC/MS等，第二类为免疫分析，包括RIA、ELISA等，这些方法都还不能令人满意，各有缺点。免疫分析是基于免疫学原理的抗原-抗体结合方法，存在一些固有的弱点，一种抗体只能检测一种或具有共同抗原决定簇的几种药物，无法检出所有β₂-兴奋剂；仪器分析准确灵敏，但操作烦琐，无法进行常规筛选工作。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种辣根过氧化物酶标记的长臂克伦特罗，利用其与β₂-肾上腺素能受体的亲和力，即通过受体与配体检测系统，来达到检测β₂-兴奋剂的目的。

本发明的目的之二在于提供上述的酶标记克伦特罗的制备方法。

本发明的技术方案为：首先合成克伦特罗衍生物半戊二酸克伦特罗；再合成克伦特罗衍生物长臂克伦特罗，最后长臂克伦特罗与辣根过氧化物酶的交联。其具体的反应机理如下：

1.克伦特罗衍生物半戊二酸克伦特罗的合成：

(下同)

2.克伦特罗衍生物长臂克伦特罗的合成

3.长臂克伦特罗与辣根过氧化物酶的交联

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种酶标记克伦特罗，其特征在于，该化合物的结构为：

E-NH-HRP

其中，E的结构为：

其中，

一种用于制备权利要求1所述的酶标记克伦特罗的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

a.半戊二酸克伦特罗A的制备：在克伦特罗的吡啶中，在不断搅拌下，缓慢滴加戊二酐的吡啶溶液，其中克伦特罗与戊二酐的摩尔比为1∶1-1.5，反应时间为24小时，反应完毕后用减压蒸馏，除去溶剂吡啶；将蒸余物溶于乙醇中，再加入上述溶液的20倍体积的正己烷于-20℃温度下重结晶，如此反复数次，直至薄层层析分析显示样品中不含克伦特罗，所用展开剂为：乙酸乙酯和甲醇，其体积比为6∶4，克伦特罗的Rf为0.82，A的Rf为0.32；最终获得白色粉末状的A，产率约为80％；

b.乙二氨丁二酰胺酸B的制备：采用常规的胺与酸酐的反应方法制备乙二氨丁二酰胺酸B；

c.长臂克伦特罗D的制备：以二甲基甲酰胺为溶剂，加入等摩尔量的A、N-羟基琥珀酰亚胺及二环己基碳二亚胺，搅拌反应24小时，至薄层层析分析显示A已转化为其活性酯形式C；再向上述反应产物中加入1.1-1.2倍的B及三乙胺，继续反应24小时，减压蒸馏，除去溶剂二甲基甲酰胺，再用四氢呋喃萃取反应混合物，保留四氢呋喃层，将该萃取液减压蒸馏，除去溶剂四氢呋喃，即得长臂克伦特罗D；最后将D用二甲基甲酰胺溶解，并用分光光度法定出克伦特罗的浓度，采用的展开剂为乙酸乙酯和甲醇，其体积比为6∶4，其中反应物A的Rf为0.32，C的Rf为为0.84，D的Rf为0.52；

d.酶标记克伦特罗的制备：将D的二甲基甲酰胺溶液置于eppendorf管中，冰浴下加入等摩尔量的三乙胺及氯甲酸异丁酯，于0℃振荡反应5-10分钟，得D的混合酸酐E，待用，然后在eppendorf管中加入辣根过氧化物酶，再加入PH值为7.4的磷酸缓冲溶液，再按辣根过氧化物酶与E的摩尔比为1∶10-20的比例缓缓滴加E的二甲基甲酰胺溶液，在0℃温度下振荡反应15-30分钟，反应混合物用Sephadex G-50分离，并用核酸蛋白检测仪监测，收集黄色流分，即为所制备的辣根过氧化物酶标记的克伦特罗。

与现有技术相比，本发明具有如下显而易见的特点和显著的优点：通过本发明制备的酶标记克伦特罗与β₂-肾上腺素能受体的亲和力，采用受体与配体检测系统，可以快速、准确的检测出β₂-兴奋剂，该方法操作简单、成本低、使用方便。

具体实施方式

实施例一：本发明的一个优选实施例为：

1)半戊二酸克伦特罗(A)的制备

取100mg克伦特罗溶于2ml吡啶中，在不断搅拌下，缓慢滴加1.84ml 20mg/ml的戊二酐的吡啶溶液，搅拌反应24小时，反应完毕后用水泵减压蒸馏，除去溶剂吡啶，加入200μl乙醇使反应物溶解后，再加入4ml正己烷于-20℃结晶。如此结晶数次，直至薄层层析分析显示样品中已不含有克伦特罗，最终获得白色粉末状物质，产率约为80％。克伦特罗的Rf为0.82，半戊二酸克伦特罗(A)的Rf为0.32(展开剂：乙酸乙酯∶甲醇＝6∶4)。

2)乙二氨丁二酰胺酸(B)的制备

取1.68ml乙二胺溶于25ml水中，用5M硫酸调pH为6.0，冰浴(0℃)剧烈搅拌下，慢慢滴加80ml 0.5g/ml丁二酸酐的二氧六环溶液，并不断用5M NaOH调pH为6.0。此反应液于0℃反应2h，4℃反应16小时后，过滤除去无机盐，滤液减压浓缩至约12ml后，用5M H₂SO₄调pH为3.0后加入60ml的甲醇，过滤除去无机盐，滤液于-20℃析出晶体，过滤烘干后得粗品。粗品溶于3ml水后，加入15ml甲醇于-20℃重结晶，得白色晶体。乙二氨丁二酰胺酸(B)的Rf为0.56，(展开剂：异丙醇∶冰醋酸∶水＝3∶1∶1，显色剂：0.25％的茚三酮乙醇溶液)。

3)长臂克伦特罗(D)的制备

取15mg半戊二酸克伦特罗(A)溶于2ml二甲基甲酰胺中，加入4.1mg的N-羟基琥珀酰亚胺及7.3mg二环己基碳二亚胺(DCC)于室温搅拌反应至少24小时，薄层层析分析显示半戊二酸克伦特罗(A)已转化为其活性酯形式(C)。向上述反应产物中加入8mg的B及14.75ml的三乙胺，于室温下继续反应至少24小时，用水泵减压蒸馏，除去溶剂二甲基甲酰胺，再用四氢呋喃溶出最终反应产物(D)，过量未反应的乙二氨丁二酰胺酸(B)由极性较大不溶于四氢呋喃而被除去。反应产物的溶液用水泵减压蒸馏，除去溶剂四氢呋喃，即得长臂克伦特罗(D)。将长臂克伦特罗(D)用二甲基甲酰胺溶解，并用分光光度法定出克伦特罗的浓度。反应物半戊二酸克伦特罗(A)的Rf为0.32，其活性酯形式(C)的Rf为为0.84，长臂克伦特罗(D)的Rf为0.52(展开剂：乙酸乙酯∶甲醇＝6∶4)。

4)酶标记克伦特罗的制备

取16.8μl 18.9mg/ml长臂克伦特罗(D)的二甲基甲酰胺溶液于eppendorf管中，冰浴下加入1μl 10％的三乙胺的二甲基甲酰胺溶液及1.1μl 10％的氯甲酸异丁酯的二甲基甲酰胺溶液，于0℃振荡反应5至10分钟，得长臂克伦特罗(D)的混合酸酐(E)。长臂克伦特罗(D)的Rf为0.52，混合酸酐(E)的Rf为0.82(展开剂：乙酸乙酯∶甲醇＝6∶4)。

取1mg辣根过氧化物酶(HRP)于eppendorf管中，加入100μl 0.01M磷酸缓冲液(7.4)溶解后，置于冰浴中，缓缓滴加上述10倍至20倍摩尔数的混合酸酐(E)的二甲基甲酰胺溶液，0℃振荡反应15至30分钟，反应混合物用Sephadex G-50分离，并用核酸蛋白检测仪监测，收集黄色流分，即为所制备的辣根过氧化物酶标记的克伦特罗。

酶标记克伦特罗的鉴定

i)光学鉴定

用0.01M磷酸缓冲液(7.4)配置浓度分别为0.1mg/ml、0.2mg/ml的克伦特罗和辣根过氧化物酶的溶液，并用岛津分光光度计对这两个溶液分别在180nm-700nm之间进行扫描，结果显示它们分别在295nm和403nm处有最大特征吸收峰，然后分别测0.1mg/ml的克伦特罗溶液，0.2mg/ml辣根过氧化物酶溶液在295nm和403nm处的吸光度如下：

	浓度	A_295nm	A_403nm
	浓度	A_295nm	A_403nm	克伦特罗	0.1mg/ml	0.796	0
辣根过氧化物酶	0.2mg/ml	0.164	0.492	克伦特罗	0.1mg/ml	0.796	0
辣根过氧化物酶	0.2mg/ml	0.164	0.492	酶标记克伦特罗	m mol/l	0.179	0.576

克伦特罗：KAam＝0.796/(0.1/313)＝2491/mol/l 295nm

KAbm＝0/mol/l 403nm

辣根过氧化物酶：KBam＝0.114/(0.2/40000)＝22725/mol/l 295nm

KBbm＝0.492/(0.2/40000)＝98400/mol/l 403nm

其中，KAam，KAbm分别表示克伦特罗在295nm和403nm处的摩尔吸光系数，KBam，KBbm分别表示辣根过氧化物酶在295nm和403nm处的摩尔吸光系数，n代表一个酶上所接克伦特罗的数量，m代表酶标配体的摩尔浓度(无需知其具体浓度)。列出下列方程式，即交联的克伦特罗的摩尔浓度×其摩尔吸光系数+标记酶的摩尔浓度×其摩尔吸光系数＝酶标记克伦特罗的吸光系数(两个波长列出两个方程式)

即一个辣根过氧化物酶分子标记有1.53个克伦特罗分子。

ii)免疫学检测

原理：利用固定在酶标板上的克伦特罗抗体与酶标记克伦特罗中克伦特罗的亲和力来鉴定克伦特罗与辣根过氧化物酶的成功与否，即在包被有克伦特罗抗体的酶标板内加入用diluent buffer稀释的酶标记克伦特罗，经孵育反应再用washing buffer洗涤酶标板数次，若克伦特罗与辣根过氧化物酶交联成功，则辣根过氧化物酶由于标记了克伦特罗，将结合在酶标板上不被洗去，加入酶底物TMB会显色；若克伦特罗与辣根过氧化物酶交联成失败，则辣根过氧化物酶将不能在结合在酶标板上而被洗去，加入酶底物TMB不会显色，具体方法如下：

①配制diluent/washing buffer

②用diluent buffer分别稀释酶标记克伦特罗(0.114mg/ml)及辣根过氧化物酶(0.114mg/ml)(1∶200)

③取六块包被有克伦特罗抗体的酶标板，分成两组分别加入120μl 1∶200的酶标记克伦特罗及辣根过氧化物酶的稀释液，37℃孵育一小时

④倾去酶液用滤纸吸干

⑤用washing buffer洗涤酶标板4次，每次10分钟

⑥每孔加入125μl底物TMB反应20分钟

⑦加入50μl 5M硫酸终止反应

⑧用酶标仪进行读数如下：

	1号	2号	3号
	1号	2号	3号	酶标记克伦特罗	0.807	0.823	0.812

辣根过氧化物酶

0.033

0.027

0.031

上述实验中加入酶标记克伦特罗的实验组有显色反应，而加入辣根过氧化物酶的空白对照组没有显色反应，这表明辣根过氧化物酶与克伦特罗的交联是成功的。

HRP的序列为：

qltptfydns cpnvsnivrd tivnelrsdp riaasilrlh fhdcfvngcd asilldntts

frtekdafgn ansargfpvi drmkaavesa cprtvscadl ltiaaqqsvt laggpswrvp

lgrrdslqaf ldlananlpa pfftlpqlkd sfrnvglnrs sdlvalsggh tfgknqcrfi

mdrlynfsnt glpdptlntt ylqtlrglcp lngnlsalvd fdlrtptifd nkyyvnleeq

kgliqsdqel fsspnatdti plvrsfanst qtffnafvea mdrmgnitpl tgtqgqirln

crvvnsns

Claims

1.一种酶标记克伦特罗，其特征在于，该化合物的结构为：

E——NH——HRP

其中，E的结构为：

其中，

2.一种用于制备权利要求1所述的酶标记克伦特罗的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

a.半戊二酸克伦特罗A的制备：在克伦特罗的吡啶中，在不断搅拌下，缓慢滴加戊二酐的吡啶溶液，其中克伦特罗与戊二酐的摩尔比为1∶1-1.5，反应时间为24小时，反应完毕后用减压蒸馏，除去溶剂吡啶；将蒸余物溶于乙醇中，再加入上述溶液的20倍体积的正己烷于-20℃温度下重结晶，如此反复数次，直至薄层层析分析显示样品中不含克伦特罗，所用展开剂为：乙酸乙酯和甲醇，其体积比为6∶4，克伦特罗的Rf为0.82，A的Rf为0.32；最终获得白色粉末状的；

d.酶标记克伦特罗的制备：将D的二甲基甲酰胺溶液置于eppendorf管中，冰浴下加入等摩尔量的三乙胺及氯甲酸异丁酯，于0℃振荡反应5-10分钟，得D的混合酸酐E，待用，然后在eppendorf管中加入辣根过氧化物酶，再加入PH值为7.4的磷酸缓冲溶液，再按辣根过氧化物酶与E的摩尔比为1∶10-20的比例缓缓滴加混合酸酐E的二甲基甲酰胺溶液，在0℃温度下振荡反应15-30分钟，反应混合物用Sephadex G-50分离，并用核酸蛋白检测仪监测，收集黄色流分，即为所制备的辣根过氧化物酶标记的克伦特罗。