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CN1592748A - 金属酞菁区域异构体的分离 - Google Patents

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CN1592748A
CN1592748A CNA028217381A CN02821738A CN1592748A CN 1592748 A CN1592748 A CN 1592748A CN A028217381 A CNA028217381 A CN A028217381A CN 02821738 A CN02821738 A CN 02821738A CN 1592748 A CN1592748 A CN 1592748A
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Abstract

本发明涉及式(I)金属酞菁的区域异构体混合物的分离方法，涉及这种方法获得的区域异构体，和它们作为光治疗和光诊断试剂的用途。

Description

金属酞菁区域异构体的分离
发明领域
本发明涉及下文报道的式(I)金属酞菁区域异构体的分离方法，它是光敏剂，特征在于在可见光谱的红区有吸收和荧光。
发明背景
已知酞菁有色荧光团大环通过与可见光相互作用而产生氧的反应性物质，特别是单极态氧或基团。具有碱性酞菁结构的化合物在光动力学治疗(PDT)和/或为了诊断目的以及为了涉及各行各业技术领域的其他很多令人感兴趣的应用中的有前途的应用处于开发之中。特别地，最近在本申请人的美国专利No.5,965,598，欧洲专利申请No.00112654.9和欧洲专利申请No.01106411.0中描述了Zn(II)-酞菁和它们的偶联物。
即使将讨论限于PDT，酞菁代表最令人感兴趣的一种光敏剂类型，适合多种应用，还适合用于抗肿瘤和增殖性疾病的治疗性应用以及为了抗微生物和杀生物目的的“第二代光敏剂”的制备。
科学文献最近报道不仅光敏剂部分上存在的取代基的数目和电荷影响化合物的体外和体内的光毒性(N.Brasseur等，J.Med.Chem.1994，37，415-420)，而且第一代光敏剂不理想的分布和差的选择性也与光敏剂的物理-化学性质相关，因此也涉及它们的化学结构。
根据本领域已知的方法能制备酞菁光敏剂，例如C.C.Leznoff在酞菁-性质和应用(Phtha locyanines.Properties and Applications)，Vols.I-III(编著：A.B.P.Lever)，VCH出版社，纽约，1989中描述的那些方法。
对于一些非中心对称酞菁或者对于四取代酞菁，传统统计学有机合成导致制备区域异构体的混合物，据报道，其组成依赖取代基和配位金属。
四取代酞菁合成中统计学缩合作用在不存在其他驱动因素下有利于较少对称异构体的形成，并且预期是12.5％的D2h，25％的C2v，50％的Cs，12.5％的C4h构成的混合物。
为了产生反应性氧物质的目的，在异构体混合物方面没有问题，但是在很多其他情况下，即在其中位点或配体识别，与有效应用有关的分子亲水性/疏水性特征或者最后在治疗进程情况下，具有单一表征的异构体是基本的。
对于先前报道的例子，为了获得单一区域异构体，总是需要选择性纯化。几个研究小组致力于通过区域选择性合成直接获得纯的异构体，但是用这种方法只获得了具有位阻基团的1(4)，8(11)，15(18)，22(25)四取代酞菁的C4h异构体(C.C.Leznoff等，Can.J.Chem.1994，72，1990-1998；同上，化学通讯(Chem.Commun.)1996，1245)。
最近也进行了纯化金属酞菁衍生物的尝试，但是只有很少的几篇涉及该方面的文章公布。利用二氧化硅HPLC和MPLC富集了2(3)，9(10)，16(17)，23(24)四-叔丁基酞菁-Ni(II)的C2v和Cs异构体(M.Hanack等，J.Chem.Soc.，Chem.Commun.1993，58-60)。
分别使用硝基苯基和二氧化硅固定相通过HPLC和MPLC实现了1(4)，8(11)，15(18)，22(25)烷氧基取代的Ni(II)酞菁的完全分离(M.Hanack等，Angew.Chem.1993，32，1422-1424)。
此外，2(3)，9(10)，16(17)，23(24)烷氧基取代的(Ni(II)，Cu(II)或Zn(II))酞菁的分离需要目的展开HPLC相，根据M.Sommerauer等J.Am.Chem.Soc.1996，118，10085-10093。B.Gorlach等，ICPP-12000，Post 413，其不能定量化；事实上为了向二氧化硅上引入特定间隔基团链，从商售硅胶开始之后进行至少两个反应来制备这种固定相，先与4-氨基丁基-二甲基methossisilane反应然后与2-苯基喹啉-4-羧酸反应。这样的方法除了昂贵之外，确实不能使这种固定相再生。
硝基苯氧基四取代酞菁的Cu(II)络合物的异构体通过使用RP-C18柱也已经得以分离(M.I.Uvarova等，J.Anal.Chem.2000，55，910-925)。
结论是，迄今为止，为了分离金属酞菁的区域异构体需要合适设计的色谱相，但是还没有发现适合小规模或大规模分离的条件，特别是对于带有氨基的Zn酞菁。
因此仍然需要研发适合实验室和大规模制备的区域异构体分离方法。
发明概述
不管上述文献关于对酞菁区域异构体分离的先前研究报道过什么，本申请人出人意料地发现对标准固定相利用色谱柱分离法，例如商购的二氧化硅和氧化铝，并且使用合适的吸脱相，使用各种氨基取代的酞菁，特别是Zn(II)氨基取代的酞菁，能进行自酞菁大环的特定位置取代作用衍生的区域异构体混合物的最佳拆分。
尽管酞菁构架外周位置上存在锌和氨基，其通常在色谱行为中引起严重的脱尾效应，经证明本发明方法即使在标准固定相上在式(I)酞菁的分离中也是有效的。
本发明人还发现测定洗出顺序从而还获得富集较少对称异构体(C2v和Cs)的区域异构体混合物是可能的。
因此，本发明的目的是通式(I)金属-酞菁及其药学可接受盐的区域异构体混合物的分离方法
其中
Me选自Zn，Si(OR4)2，Ge(OR4)2和AlOR4，
其中R4选自H和C1-C15烷基；
n＝0，1；
R和R1选自通式(II)取代基
Figure A0282173800091
其中
X选自O，S，NHCO，-CH2-，C＝C和C≡C；
Z选自苯基，芳基，芳烷基和脂环族基团；和
Y和Y’，彼此是相同或不同的，选自C1-C15烷基；
q＝0，1；
R2和R3选自H和如上定义的通式(II)取代基，条件是：
R2和R3至少之一总不是H；和
当n＝0时：
a)R2和R3，彼此相同或不同，两者都不同于H，或者
b)R2＝H并且R3与R1相同或不同；
所述方法包括色谱分离，其包括下面的步骤：
i)将混合物上样到含有包括固体载体的固定相的分离柱上；
ii)通过用含有有机溶剂的流动相洗脱所述柱子来分离所述混合物。
本发明的另一个主题是基本上纯形式的分离的式(I)金属酞菁区域异构体C4h，D2h，C2v和Cs，以及基本上纯形式的式(I)金属酞菁区域异构体C2v和Cs的混合物。
本发明的另一个主题是新的式(I)金属酞菁，其中n＝0并且R2和R3两者均不同于H。
本发明分离式(I)酞菁的区域异构体混合物的方法的特征和优点将在下面的描述中详细说明。
附图的简要说明
图1代表实施例1中描述的操作条件下获得的四取代的Zn(II)酞菁化合物1(异构体混合物)的分离MPLC色谱图。
图2代表实施例1中描述的操作条件下获得的化合物1(异构体混合物)的HPLC色谱图。
图3给出如实施例1所述化合物1(异构体混合物)的和通过实施例1 MPLC分离的异构体的1H-NMR谱(特别是芳香质子的共振范围)；通过应用Bruker Spectrometer 200MHz分析在大约1毫克/毫升[d6]DMSO溶液中记录的图谱。
图4给出用下面的洗脱剂在Alugram Sil G/UV254(厚度0.20毫米)上的化合物1(A道(lane))，2(B道)和3(C道)的TLC：
洗脱剂1：60％正己烷-THF40％。
洗脱剂2：71％CH2Cl2，24％正己烷，4％THF和1％MeOH。
洗脱剂3：66％CH2Cl2，25％正己烷，6.5％THF和2.5％MeOH。
洗脱剂4：65.5％CH2Cl2，25％正己烷，8％THF和1.5％MeOH。
洗脱剂5：60％CH2Cl2，25％正己烷，12.5％THF和2.5％MeOH。
图5给出用下面的洗脱剂在Alugram Sil G/UV254(厚度0.20毫米)上的化合物1(A道)和4(B道)的TLC：
洗脱剂1：73％CH2Cl2，24％正己烷，2％THF和0.5％MeOH。
洗脱剂2：71％CH2Cl2，24％正己烷，4％THF和1％MeOH。
图6给出用下面的洗脱剂在Alugram Sil G/UV254(厚度0.20毫米)上的化合物1(A道)和5(B道)的TLC：
洗脱剂1：60％正己烷-THF40％。
洗脱剂2：71％CH2Cl2，24％正己烷，4％THF和1％MeOH。
洗脱剂3：73％CH2Cl2，24％正己烷，2％THF和0.5％MeOH。
图7给出实施例5中描述的操作条件下获得的四取代的Zn(II)酞菁化合物1(异构体混合物)的分离RP-HPLC色谱图，其中：(A)是通过MPLC纯化的D2h异构体(60ng/μl)，(B)是通过MPLC纯化的异构体Cs+C2v(47.5ng/μl)，(C)是通过MPLC纯化的C4h异构体(50ng/μl)，和(D)是以DMF作为溶剂获得的混合物。
图8给出Phenyl-Hexyl柱子上四取代的Zn(II)酞菁化合物1(异构体混合物)的分离RP-HPLC色谱图。
图9给出四取代的Zn(II)酞菁化合物1(异构体混合物)的分离的离子对RP-HPLC色谱图。
图10给出四取代的Zn(II)酞菁化合物6(异构体混合物)的分离的离子对RP-HPLC色谱图。
本发明的详细描述
本发明涉及通过在含有作为固定相的固体载体的柱子上进行的色谱分离方法的上述通式(I)的金属-酞菁区域异构体混合物的色谱分离。
根据本发明的色谱分离方法优选选自高压液相色谱(HPLC)和制备中压液相色谱(MPLC)。根据本发明的可能应用的HPLC方法可以选自，例如，正相HPLC(NP-HPLC)，反相HPLC(RP-HPLC)和离子对反相HPLC(ION PAIR RP-HPLC)。
根据本发明优选的实施方案，要用作固定相的固体载体选自氧化铝，二氧化硅和其上键合脂肪族和/或芳香族基团例如辛基，十八烷基和等摩尔量的苯基和己基的二氧化硅，通常称作C8键合的二氧化硅相，C18键合的二氧化硅相，和苯基/己基键合的二氧化硅相。
用包括有机溶剂的流动相洗脱分离柱，优选选自二氯甲烷，四氢呋喃，水，甲醇，正己烷，乙腈及其混合物。
当根据本发明使用离子对RP-HPLC方法时，向流动相中加入离子对试剂，例如戊烷磺酸钠。
根据本发明的特殊实施方案，首先将式(I)的本发明酞菁的异构体混合物溶解于初始洗脱剂，优选由混合物CH2Cl2∶THF∶MeOH＝94∶5∶1构成；然后将这样获得的溶液上柱并且通过用具有优选随着色谱分离过程而变化的组成的流动相洗脱柱子进行分离；例如，可以使用包括两种洗脱剂A和B并且具有下面洗脱梯度的下面的洗脱系统：
洗脱剂A＝CH2Cl2∶THF∶MeOH＝94∶5∶1；
洗脱剂B＝正己烷；
梯度时间(洗脱剂B％)：60-30％15分钟，30-0％5分钟，0％10分钟。
根据本发明，商售正相或反相固定相，HPLC级或者无水溶剂可以用来实施使用HPLC和MPLC的本发明的分离方法。
优选使用Zn(II)-酞菁的区域异构体混合物实施本发明分离方法。
根据本发明方法的优选实施方案，使用式(I)的1(4)，8(11)，15(18)，22(25)氨基和铵四取代的Zn(II)酞菁的区域异构体混合物实施本发明分离方法，其中X优选选自O和S，Z优选是苯基，并且Y和Y’优选选自甲基和乙基。
通过实施本发明的方法，获得式(I)的金属酞菁的异构体混合物，基本上纯形式的相应的分离的异构体C4h和D2h和其他分离的异构体C2v和Cs，或者这些异构体C2v和Cs的混合物。
在根据本发明的方法中使用的区域异构体混合物形式的式(I)的中心对称金属酞菁，即其中当n＝1，R＝R2和R1＝R3时的式(I)的化合物，和其中当n＝0，R2是氢和R3＝R1时的式(I)的化合物，可以根据美国专利No.5,965,598中所述制备，该篇专利文献在此引作参考；而本发明的式(I)的非中心对称金属酞菁，即不包括上面提到的中心对称化合物的本发明式(I)的化合物，可以根据欧洲专利申请No.01106411.0中所述制备，该篇专利文献在此引作参考。
以TLC、质谱、UV-Vis谱和1H-NMR为基础表征并且明确鉴定分离的异构体。
实施例1
1(4)，8(11)，15(18)，22(25)-四[(3-(二甲基氨基)苯氧基)酞菁] 锌(II)(化合物1)的区域异构体分离
将根据美国专利No.5,965,598所述制备的70毫克化合物1(4)，8(11)，15(18)，22(25)-四[(3-(二甲基氨基)苯氧基)酞菁]锌(II)(化合物1)溶解于CH2Cl2∶THF∶MeOH＝94∶5∶1混合物构成的15毫升初始洗脱剂中，并且加载到LiChroprep Si60(12-25微米)二氧化硅(Merck)柱(460×26毫米)上，然后应用MPLC系统以46毫升/分钟使用下面的洗脱梯度系统洗脱：
洗脱剂A＝CH2Cl2∶THF∶MeOH＝94∶5∶1；
洗脱剂B＝正己烷；
梯度时间(洗脱剂B％)：60-30％15分钟，30-0％5分钟，0％10分钟。
收集三个级分并且通过用稍微不同的洗脱程序进行MPLC进一步纯化：
第一级分(B％)：60-30％10分钟，30-0％5分钟，0％10分钟。
第二级分(B％)：50-30％5分钟，3 0-0％5分钟，0％10分钟。
第三级分(B％)：30％5分钟，30-0％5分钟，0％10分钟。
图1报道了化合物1的MPLC色谱图。
应用TLC，HPLC和ESI-MS系统在下面的操作条件下评价初始的异构体混合物以及本发明的纯化方法：
TLC：Alugram Sil G/UV254(厚度0.20毫米)；洗脱剂：71％CH2Cl2，24％正己烷，4％THF和1％MeOH。点Rf：0.75，0.70(D2h)，0.55，0.36(Cs+C2v)，0.24(C4h)，0.15。图5右侧部分报道了TLC(2A道)。
Zorbax RXSIL(4.6×25毫米)柱子上的HPLC；洗脱梯度时间(B％)：60-40％10分钟，40-0％5分钟(和上面MPLC分离使用相同的洗脱剂)；流速：1毫升/分钟；注射量：5微升0.2毫克/毫升化合物1的初始洗脱剂的溶液。图2给出化合物1(异构体混合物)的HPLC色谱图。
ESI-MS：API 365 PESCIEX质谱(5微升/分钟注入)。下面的表1中报道了化合物1的四种异构体的[M+H]+的m/z值：
表1
  异构体     D2h     Cs+C2v     C4h
  m/z     1119.5     1119.5     1119.5
对于化合物1的四种异构体在DMF溶液中也记录了UV-Vis谱；在下面的表2中，报道了Q-带的λmax(nm)值：
表2
  异构体     D2h     Cs+C2v     C4h
  λmax(nm)     691     697     702
通过应用Bruker Spectrometer 200MHz分析，在大约1毫克/毫升[d6]DMSO溶液中也报道了化合物1(异构体混合物)和MPLC分离的异构体的1H-NMR图谱。在图3中，报道了这些图谱中芳香质子的共振范围。
下面的表3中报道了合物1的四种异构体的1H-NMR数据，其中H′＝Cs异构体的质子，和H″＝C2v异构体的质子。
表3
异构体 D2h Cs+C2v C4h
δ(Hb/Hb’) 8.91(d，3J＝7.4Hz，4H) 9.30(d，3J＝7.4Hz，H’+2H”)9.16(d，3J＝7.4Hz，H’)8.91(d，3J＝7.4Hz，H’)8.75(d，3J＝7.4Hz，H’+2H”) 9.17(d，3J＝7.4Hz，4H)
δ(Ha’) 8.12(dd，3J＝7.4Hz，4H) 8.29-8.22(dd，3J＝7.4Hz，H’+2H”)8.17-8.07(m，2H’)8.01-7.93(dd，3J＝7.4Hz，H’+2H”) 8.13(dd，3J＝7.4Hz，4H)
δ(Ha) 7.78(d，3J＝7.4Hz，4H) 7.84-7.75(m，2H’+2H”)7.52-7.42(m，2H’+2H”) 7.51(d，3J＝7.4Hz，4H)
δ(He) 7.15(dd，3J＝8.1Hz，4H) 7.25-7.09(m，4H’+4H”) 7.21(dd，3J＝8.1Hz，4H)
δ(Hc) 7.03(s，4H) 7.09-7.01(m，2H’+2H”)6.62-6.50(m，2H’+2H”) 6.58(s，4H)
δ(Hd，Hf) 6.60-6.50(m，8H) 7.09-7.01(m，4H’+4H”)6.62-6.50(m，4H’+4H”) 6.66-6.56(m，8H)
δ(Hm) 3.05(s，24H) 3.07-2.85(m，24H’+24H”) 2.87(s，24H)
实施例2
报道了下面化合物的异构体的TLC分离(在二氧化硅薄层(sheets)Alugram Sil G上)：
-1(4)，8(11)，15(18)，22(25)-四[(3-(二甲基氨基)苯氧基)酞菁(phthalocyaninato)]锌(II)(化合物1)；
-1(4)，8(11)，15(18)，22(25)-四[(4-(二甲基氨基)苯氧基)酞菁]锌(II)(化合物2)；
-1(4)，8(11)，15(18)，22(25)-四[(2-(二甲基氨基)苯氧基)酞菁]锌(II)(化合物3)；
根据美国专利No.5,965,598所述方法制备化合物1，2和3，并且外周苯氧基环上二甲基氨基的位置不同。四氢呋喃/正己烷和二氯甲烷/正己烷/四氢呋喃/甲醇的混合物用作流动相。根据实施例1报道的，化合物1的最佳洗脱剂由71％CH2Cl2，24％正己烷，4％THF和1％MeOH构成。观察到下面保留因子(Rf)的三个主要点：0.70(D2h)，0.36(Cs+C2v)，0.24(C4h)。
化合物2的最佳洗脱剂由60％CH2Cl2，25％正己烷，12.5％THF和2.5％MeOH构成。观察到下面保留因子(Rf)的三个主要点：0.85，0.58，和0.40。
使用60％正己烷-THF40％(Rf0.60，0.52，0.47)，以及使用60％CH2Cl2，37.5％正己烷，2％THF和0.5％MeOH，化合物3表现出分离的点。观察到下面保留因子(Rf)的三个主要点：0.30，0.21，和0.15。
实施例3
报道了下面化合物的异构体的TLC分离(在二氧化硅薄层AlugramSil G上)：
-1(4)，8(11)，15(18)，22(25)-四[(3-(二甲基氨基)苯氧基)酞菁]锌(II)(化合物1)；
-1(4)，8(11)，15(18)，22(25)-四[(4-(二乙基氨基)苯氧基)酞菁]锌(II)(化合物4)；
根据美国专利No.5,965,598所述方法制备化合物1和4，并且是氨基基团的烷基取代基变化的代表。二氯甲烷/正己烷/四氢呋喃/甲醇的混合物用作流动相。
根据实施例1报道的，化合物1的最佳洗脱剂由71％CH2Cl2，24％正己烷，4％THF和1％MeOH构成。观察到下面保留因子(Rf)的三个主要点：0.70(D2h)，0.36(Cs+C2v)，0.24(C4h)。
这种洗脱剂对于化合物4的分离也是最适宜的一种(Rf值：0.76，0.59，0.52)；但是使用73％CH2Cl2，24％正己烷，2％THF和0.3％MeOH的混合物也获得了好的色谱结果(Rf值：0.35，0.17，0.08)。
实施例4
报道了下面化合物的异构体的TLC分离(在二氧化硅薄层AlugramSil G上)：
-1(4)，8(11)，15(18)，22(25)-四[(3-(二甲基氨基)苯氧基)酞菁]锌(II)(化合物1)；
-1(4)，8(11)，15(18)，22(25)-四[((3-(二甲基氨基)苯基)硫烷基)酞菁]锌(II)(化合物5)；
根据美国专利No.5,965,598所述方法制备化合物1和5，并且是酞菁环和苯基取代基之间桥接原子变化的代表。四氢呋喃/正己烷和二氯甲烷/正己烷/四氢呋喃/甲醇的混合物用作流动相。
根据实施例1报道的，化合物1的最佳洗脱剂由71％CH2Cl2，24％正己烷，4％THF和1％MeOH构成。观察到下面保留因子(Rf)的三个主要点：0.70(D2h)，0.36(Cs+C2v)，0.24(C4h)。
化合物5的最佳洗脱剂由73％CH2Cl2，24％正己烷，2％THF和0.5％MeOH的混合物构成(Rf值：0.49，0.36，0.30)。
实施例5
利用RP-HPLC在C18柱子上1(4)，8(11)，15(18)，22(25)-四[(3-(二 甲基氨基)苯氧基)酞菁]锌(II)(化合物1)的区域异构体分离
利用具有下面特征的C18柱子通过RP-HPLC进行化合物1的区域异构体分离：Phenomenex LUNA C18柱子(4.6×150毫米，5微米粒径)；柱温，室温；流速，1毫升/分钟；使用MeOH等度洗脱；注入体积，10微升；样品溶解于MeOH/DMF(9-1，V/V)；对于异构体定量λ是695±20nm，对于纯度分析是254nm，对于定性分析λ范围是190-800nm。
洗出顺序和NP-HPLC观察到的相同，表明空间位阻决定分离：没有表面取代基并因此平面化更高的分子滞留时间更长。
通过纯异构体(事先通过制备MPLC分离的)标准物加样和从色谱峰的UV-Vis谱进行HPLC峰的分配。在图7中给出了MPLC纯化的异构体和作为溶剂的DMF中合成的混合物的RP-HPLC色谱图。下面的表4中报道了LUNA C18柱子上色谱法参数，其中用n＝10计算平均滞留时间，并且通过DMF阳性峰测定柱死时间。
表4
  异构体   Rt(分钟)   K’   斜率(mAU·μl/ng)   截距(mAU)     R2
  D2h   15.7±0.2   8.29   50.9±0.4   -47±18     ＞0.999
  Cs+C2v   17.5±0.1   9.36   49.8±0.5   -30±20     ＞0.999
  C4h   17.8±0.1   9.53   48.4±0.3   -42±15     ＞0.999
在MeOH/DMF(9-1，V/V)中制备所有的注射液，除了由于其在MeOH中较低的溶解度而在MeOH/DMF(1-1，V/V)中制备D2h异构体。在0.5-100ng/微升范围内用六点校正对每一种异构体证实线性(每一种溶液试验三次)。分离的异构体展示非常类似的校正斜率；这表明收集全部酞菁Q-带(695±20nm)导致复杂混合物中可靠的异构体相对量。事实上，这种长波检测的应用，是具有非常高消光系数(ε＝3×105M/cm)的分子，降低了干扰并且提高了灵敏性(校正斜率比使用254nm检测发现的高2.49倍)。分别使用3∶1和10∶1的信号-比-噪音之比计算的LOD和LOQ是0.4ng/微升和1.2ng/微升。
上面报道的分离方法能容易地适合制备规模，即通过MPLC分离，利用本领域公知的方法。
实施例6
利用RP-HPLC在Phenyl-Hexyl柱子上1(4)，8(11)，15(18)，22(25)- 四[(3-(二甲基氨基)苯氧基)酞菁]锌(II)(化合物1)的区域异构 体分离
利用具有下面参数的Phenyl-Hexyl柱子通过RP-HPLC改进化合物1的异构体分离：Phenomenex LUNA Phenyl-Hexyl柱子(4.6×150毫米，5微米粒径)；柱温，15℃，20℃或30℃；流速，1毫升/分钟；使用混合物MeOH/CH3CN/CH2Cl2或MeOH/CH3CN/THF(见表4)等度洗脱；注入体积，10微升；样品溶解于洗脱液；λ对于异构体定量是695±20nm，对于纯度分析是254nm，对于定性分析λ范围是190-800nm。
洗出顺序还是和NP-HPLC观察到的相同，表明空间位阻决定分离。
通过纯异构体(事先通过制备MPLC分离的)标准物加样和从色谱峰的UV-Vis谱进行HPLC峰的分配。图8给出了作为溶剂的DMF中合成的化合物1的混合物的RP-HPLC色谱图。下面的表5中报道了LUNAPhenyl-Hexyl柱子上RP-HPLC色谱法参数。
表5
洗脱剂组成 T(℃) RT(分钟)D2h异构体 RT(分钟)Cs+C2v异构体 RT(分钟)C4h异构体
MeOH/CH3CN/THF(80/12.5/7.5，V/V/V) 20 16.3 17.8 18.5
MeOH/CH3CN/THF(67.5/25/7.5，V/V/V) 20 11.6 13.0 13.8
MeOH/CH3CN/THF(70/25/5，V/V/V) 20 14.8 16.6 17.8
MeOH/CH3CN/THF(70/25/5，V/V/V) 30 11.9 13.4 14.4
MeOH/CH3CN/THF(48/48/4，V/V/V) 30 9.9 11.9 13.4
MeOH/CH3CN/CH2Cl2(70/25/5，V/V/V) 30 13.6 15.7 16.9
MeOH/CH3CN/CH2Cl2(70/25/5，V/V/V) 15 19.4 22.2 23.9
实施例7
利用离子对RP-HPLC的1(4)，8(11)，15(18)，22(25)-四[(3-(二甲 基氨基)苯氧基)酞菁]锌(II)(化合物1)的区域异构体分离
利用具有下面参数的C18柱子也实现了通过RP-HPLC的化合物1的异构体分离：Phenomenex LUNA C18柱子(4.6×150毫米，5微米粒径)；柱温，25℃；流速，1毫升/分钟；使用含有离子对试剂的洗脱剂等度洗脱，例如水(用磷酸盐10mM调节至pH3)/MeOH/THF(20/48/32，v/v/v)中混合物戊烷磺酸钠60mM；注入体积，20微升；样品溶解于洗脱剂；检测λ，254±20nm e 695±20nm，对于定性分析λ范围是190-800nm。
洗出顺序是C4h异构体，Cs+C2v异构体混合物和D2h异构体。这意味着具有更易受离子对试剂影响的氨基基团的异构体滞留时间更长。
通过纯异构体(事先通过制备MPLC分离的)标准物加样和从色谱峰的UV-Vis谱进行HPLC峰的分配。图9给出了作为溶剂的DMF中的合成的化合物1的异构体混合物的HPLC色谱图。
下面的表6中报道了对于化合物1异构体的C18柱子上离子对RP-HPLC色谱法参数。
表6
异构体 RT(分钟) RRT λMAX(nm)
C4h 30.1 0.91 702
Cs+C2v 33.1 1.00 694
D2h 36.0 1.08 690
实施例8
利用离子对RP-HPLC的1(4)，8(11)，15(18)，22(25)-四[(3-(三甲 基铵)苯氧基)酞菁]锌(II)(化合物6)的区域异构体分离
利用具有下面参数的C18柱子实现了通过RP-HPLC的根据US5965598所述方法制备的四阳离子酞菁衍生物化合物6的完全异构体分离：Phenomenex LUNA C18柱子(4.6×150毫米，5微米粒径)；柱温，35℃；流速，1毫升/分钟；使用含有离子对试剂的洗脱剂等度洗脱，例如水(用磷酸盐10mM调节至pH3)/MeOH(35/65，v/v)中混合物戊烷磺酸钠120mM；注入体积，10微升；样品溶解于洗脱剂；检测λ，254±20nm e 695±20nm，对于定性分析λ范围是190-800nm。
洗脱导致完全异构体分离，洗出顺序是C4h异构体，D2h异构体，Cs异构体和C2v异构体。
通过纯异构体(事先通过制备MPLC在非阳离子化合物1中分离并且用Mel烷基化)标准物加样，通过与1H-NMR谱比较和从色谱峰的UV-Vis谱进行HPLC峰的分配。图10给出了化合物6混合物的HPLC色谱图。
下面的表7中报道了对于化合物6异构体的C18柱子上离子对RP-HPLC色谱法参数。
表7
异构体 RT(分钟) RRT λMAX(nm)
C4h 10.6 0.54 696
D2h 17.5 0.90 684
Cs 19.5 1.00 688
C2v 29.2 1.50 688
上面报道的实施例表明合适的本发明的方法是多么适合不同取代的金属酞菁(I)异构体混合物的分离；事实上通过使用上面对于TLC分离使用的那些相同的溶剂或溶剂混合物，通过HPLC和制备MPLC也可以进行上述产物的有效分离。
除了具有在上文引述的本申请人的专利文献中已经报道的相应的异构体混合物的有益性质之外，式(I)金属酞菁的分离的异构体在某些情况下如实施例1的表2中指明的，也具有比先前所述的光敏剂高的摩尔吸收系数和/或波长；这代表有效治疗反应的重要需求。
关于宿主细胞和微生物之间不同的毒性的发现强调了权利要求要求的式(I)的产物的重要性。
因此本发明的式(I)酞菁的区域异构体可以用于对在上文提到的本申请人的专利文献中相应的异构体混合物已经描述的相同的用途，例如，用于制备药物组合物，可能使用药学可接受赋形剂和稀释剂，在光动力学治疗中使用，或者作为体内/体外诊断中的示踪剂，可能与药学可接受载体联合。

Claims (18)

1.一种通式(I)金属酞菁及其药学可接受盐的区域异构体混合物的分离方法
其中
Me选自Zn，Si(OR4)2，Ge(OR4)2和AlOR4，
其中R4选自H和C1-C15烷基；
n＝0，1；
R和R1选自通式(II)取代基
其中
X选自O，S，NHCO，-CH2-，C＝C和C≡C；
Z选自苯基，芳基，芳烷基和脂环族基团；和
Y和Y’，彼此是相同或不同的，选自C1-C15烷基；
q＝0，1；
R2和R3选自H和如上定义的通式(II)取代基，条件是：
R2和R3至少之一总不是H；和
当n＝0时：
a)R2和R3，彼此相同或不同，两者都不同于H，或者
R2＝H并且R3与R1相同或不同；
所述方法包括色谱分离，包括下面的步骤：
i)将混合物上样到含有包括固体载体的固定相的分离柱上；
ii)通过用含有有机溶剂的流动相洗脱所述柱子来分离所述混合物。
2.根据权利要求1的方法，其中通过选自高压液相色谱(HPLC)和中压力液相色谱(MPLC)的色谱法实施所述色谱分离.
3.根据权利要求2的方法，其中所述高压液相色谱选自正相HPLC，反相HPLC和离子对反相HPLC。
4.根据权利要求1的方法，其中所述固体载体选自氧化铝，二氧化硅和其上键合脂肪族和/或芳香族基团的二氧化硅。
5.根据权利要求4的方法，其中所述脂肪族和/或芳香族基团选自辛基，十八烷基和等摩尔量的苯基和己基。
6.根据权利要求1的方法，其中所述有机溶剂选自二氯甲烷，四氢呋喃，水，甲醇，正己烷，乙腈及其混合物。
7.根据权利要求1的方法，其中所述式(I)金属酞菁中的Me是Zn。
8.根据权利要求1的方法，其中在所述的式(I)金属酞菁中，n＝0，R2＝H和R3＝R1，X选自O和S，Z是苯基，并且Y和Y’选自甲基或乙基。
9.根据权利要求1的方法，其中所述的式(I)金属酞菁是1(4)，8(11)，15(18)，22(25)-四[(3-(二甲基氨基)苯氧基)酞菁]锌(II)(化合物1)。
10.根据权利要求1的方法，其中所述的式(I)金属酞菁是1(4)，8(11)，15(18)，22(25)-四[(4-(二甲基氨基)苯氧基)酞菁]锌(II)(化合物2)。
11.根据权利要求1的方法，其中所述的式(I)金属酞菁是1(4)，8(11)，15(18)，22(25)-四[(2-(二甲基氨基)苯氧基)酞菁]锌(II)(化合物3)。
12.根据权利要求1的方法，其中所述的式(I)金属酞菁是1(4)，8(11)，15(18)，22(25)-四[(4-(二乙基氨基)苯氧基)酞菁]锌(II)(化合物4)。
13.根据权利要求1的方法，其中所述的式(I)金属酞菁是1(4)，8(11)，15(18)，22(25)-四[((3-(二甲基氨基)苯基)硫烷基)酞菁]锌(II)(化合物5)。
14.根据权利要求1的方法，其中所述的式(I)金属酞菁是1(4)，8(11)，15(18)，22(25)-四[(3-(三甲基铵)苯氧基)酞菁]锌(II)(化合物6)。
15.下面代表的基本上纯形式的根据权利要求1的式(I)金属酞菁的区域异构体：
-区域异构体C4h；
-区域异构体D2h；
-区域异构体C2v；
-区域异构体Cs；
-区域异构体C2v和Cs的混合物。
16.根据权利要求15的式(I)金属酞菁的区域异构体用于制备用于光动力治疗的药物组合物的用途。
17.根据权利要求15的式(I)金属酞菁的区域异构体作为体内/体外诊断剂的用途。
18.式(I)金属酞菁
其中
Me选自Zn，Si(OR4)2，Ge(OR4)2和AlOR4，
其中R4选自H和C1-C15烷基；
n＝0，1；
R和R1选自通式(II)取代基
Figure A028217380005C1
其中
X选自O，S，NHCO，-CH2-，C＝C和C≡C；
Z选自苯基，芳基，芳烷基和脂环族基团；和
Y和Y’，彼此是相同或不同的，选自C1-C15烷基；
q＝0，1；
R2和R3选自H和如上定义的通式(II)取代基，条件是n＝0并且R2和R3两者都不同于H。
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