CN1571680A - Pacap组合物及用于肿瘤成像与治疗的方法 - Google Patents

Abstract

表达VPAC受体的肿瘤可以用含PACAP的化合物或生物活性的PACAP类似物片段进行造影或治疗。

Description

PACAP组合物及用于肿瘤成像与治疗的方法

与相关申请的相互关系

本申请要求2001年10月19日提交的美国临时专利申请第60/344,511号之权益，其公开的全部内容在此作为参考文献引入。

发明领域

本发明总体上涉及核医学及分子肿瘤造影剂或治疗剂，更具体地说，涉及表达VPAC受体的肿瘤的成像或治疗用的放射标记组合物。

发明背景

癌症是一种严重的细胞增殖性疾病，每年都在夺去无数的生命。仅乳腺癌一项，美国每年都有5万多妇女罹患。传统的检查乳腺肿瘤的方法是超声、MRI或乳房造影术加组织学方法，至于治疗，则是外科手术切除后进行化疗和/或放疗。乳腺(以及其他)癌症的死亡率可以通过肿瘤的早期诊断和治疗而降低(Kelsey JL，Epidemiol.Rev.1：74-109，1989)。肿瘤早期检测的一个有效方法是用肿瘤特异性的放射性造影剂进行闪烁造影。

已经有很多种放射性肿瘤造影剂用于乳腺癌的检测，取得了不同程度的成功。例如，受体特异性的生物分子，如神经肽在纳摩尔浓度水平与受体结合，在治疗及诊断领域都引起了极大的关注和兴趣(Fischman AJ et al.，J Nucl.Med.34：2253-2263，1993；HokfeltT Neuron 7：867-879，1991)。

然而，唯一的商业化了的神经肽造影剂¹¹¹In-[DTPA-D-Phe¹]奥曲肽(Octreotide)在检测乳腺肿瘤方面并不是非常成功(van Eijck CHJet al.Lancet 343：640-643，1994；McCready VR et al.Lancet 343：617，1994)。上述van Eijck等人1994的文献报道52例原发性乳腺癌中，用此造影剂仅有75％得到了阳性闪烁造影结果。进而，van Eijck等人报道，在13例组织学上已确定的转移病例中，用¹¹¹In-[DTPA-D-Phe¹]奥曲肽进行腋窝造影只在4例中检测到了不可触知的含癌淋巴结。[DTPA-D-Phe¹]奥曲肽用于乳腺肿瘤造影的低效能归因于乳腺肿瘤细胞表达的造影剂靶向的癌基因受体密度过低。因而¹¹¹In-[DTPA-D-Phe¹]奥曲肽在乳腺肿瘤造影中的应用大大受限。

¹²³I-Tyr3-奥曲肽也用于放射诊断造影，但没有此剂在乳腺肿瘤造影中的评价(Krenning EP et al.，Eur.J Nucl.Med.20：716-731，1993)。然而，基于¹¹¹In-[DTPA-D-Phe¹]奥曲肽对乳腺肿瘤的较差能力，预计¹²³I-Tyr3-奥曲肽也不会是一种有用的乳腺肿瘤造影剂。

总的来说，任何情况下放射性碘组合物都不适合用作造影或治疗剂，因为已批准的放射性碘标记的放射性药物通常不能在临床条件下制备。放射性碘标记的造影剂还有一些特别的局限，例如，¹²⁵I标记的组合物通常不用于造影，因其半衰期过长(约59天)且核素的发射能量过低。¹²³I标记的组合物也不是首选，因为¹²³I是回旋加速器里产生的核素，制造成本高且核素的半衰期(13.3小时)太短，无商业用途。¹²³I标记剂的发射能量也过高，不适于产生高质量的造影图。

锝-99(^99mTc)是一种广泛使用的诊断用造影剂，因为它发出能量为140KeV的γ辐射，物理半衰期为6小时，易于用钼-99/^99mTc发生器现场制造。^99mTc的短半衰期减少了对正常器官的辐射剂量，而其发射能量足以被γ照相机有效探测到。因而在90％的临床核医学应用中^99mTc都是首选。

造影剂一般是通过一个金属螯合部分标记上^99mTc的。螯合^99mTc的金属螯合部分通常也能络合¹⁸⁶Re和¹⁸⁸Re等治疗用核素。因此，一个含金属螯合剂的试剂可以根据使用核素的不同而作诊断或治疗用。

M.Thakur的U.S.6,395,255披露了一个方法，用^99mTc螯合剂标记基于血管活性肠肽(VIP)的试剂。U.S.6,395,255中揭示的螯合剂和标记化学过程也适用于以^99mTc或放射性铼标记VIP试剂。然而，U.S.6,395,255中揭示的VIP试剂只与表达VIP受体的肿瘤细胞结合。由于某些肿瘤高密度地表达其他类型的受体，能结合这些肿瘤细胞中更宽范围受体的造影剂或治疗剂将有明显的优势。

垂体腺苷环化酶激活肽(PACAP)是一个38个氨基酸的肽，最初分离于牛下丘脑(Miyata A et al，Biochem.Biophys.Res.Commun.164：567-574，1989)。此肽刺激单层培养的大鼠垂体前叶细胞的细胞间和细胞内cAMP的积累(Gottschall PE et al.，Endocrinology 127：272-277，1990)。前述之Gottschall et al.，1990从牛下丘脑中分离到了一个27个氨基酸的PACAP(PACAP₂₇)，并得出结论PACAP₃₈和PACAP₂₇有同等效力，来自同一个176个氨基酸的前体。

PACAP₂₇比28个氨基酸的血管活性肠肽VIP₂₈刺激垂体细胞腺苷酸环化酶的能力要强10倍(前述Gottschall et al.，1990)。¹²⁵I-PACAP₂₇也能够置换结合于正常肺膜上的VIP₂₈。VIP₂₈的IC₅₀值约为15nM，而PACAP₂₇的IC₅₀值约为1.5nM。

PACAP₂₇高亲和力地与PACAP、VIP-R1和VIP-R2的受体结合，而VIP₂₈仅与VIP-R1和VIP-R2的受体高亲合力结合(Zia F et al.，Cancer.Res.55：4886-4891，1995)。PACAP、VIP-R1和VIP-R2受体统称为VPAC受体(Reubi JC，J.Nucl.Med.36：1846-1853，1995；Reubi JC et al.，Cancer Res.60：1305-1312，2000)，它们高水平地表达于乳腺肿瘤(Zia H et al.，Cancer Res.56：3486-3489，1996)和其他肿瘤细胞中(Harmar T et al.，TiPs15：97-98，10 1994；Reubi JC et al.，Eur.J.Nucl.Med.24：1058，1997；Le Meuth Vet al.，Amer.J.Physio.260：G265-74，1991；Basille M et al.Brain Res.82：1-2，1994；Vertrongen P et al.，Neuropeptides30：491-496，1996；Olianas MC et al.，J Neurochem.67：1292-1300，1996；Lelievre V et al.，Neuropeptides 30：313-322，1996和Parkman HP et al.，Regulatory Peptides 71：185-190，1998)。例如，表达VPAC受体的肿瘤(乳腺肿瘤以外)有：卵巢、子宫内膜、前列腺、膀胱、肺、食道、结肠、胰腺的肿瘤以及神经内分泌系统和脑部肿瘤。

然而，用PACAP制造导向的放射药物却很不成功。参见，例如，Reubi JC et al.，Eur.J Nucl.Med.24：1058，1997显示以N端结合DTPA后PACAP₂₇的生物活性由100下降到了＜0.01。

因此，需要的是一种基于受体特异性生物分子如PACAP的放射标记的肿瘤造影剂或治疗剂，其能高亲合力地结合于特定肿瘤细胞上的一类或几类受体。该造影剂或治疗剂理想是通过金属螯合剂标记上诊断或治疗用的核素。

发明概述

本发明的目的是放射标记的PACAP及生物活性PACAP片段与类似物在乳腺及其它表达PACAP、VIP-R1和VIP-R2受体的肿瘤的成像和治疗中的应用。PACAP、VIP-R1和VIP-R2的受体此后被总称为“VPAC受体”。

这样，本发明提供了一种检测能表达VPAC受体的肿瘤的方法，包括向患有或怀疑患有这类肿瘤的受试验者使用有效量的具有分子式A或B的造影化合物。使用造影化合物后，对受试验者的至少部分身体做闪烁造影。

分子式A和B为：

(A)M(I)-X₁-P-X₂

(B)X₁-P-X₂-M(I)

分子式A和B中：

M是螯合剂

(I)是一个联结于M的造影核素；

X₁是0到20个天然或合成的氨基酸；

P为PACAP，或其类似物或片断；和

X₂是0到20个天然或合成的氨基酸。

对患有能够表达VPAC受体的肿瘤的患者，本发明同时还提供了一种方法抑制或逆转肿瘤的生长。包括向患有或怀疑患有这类肿瘤的受试验者使用有效量的具有分子式C或D的治疗化合物。分子式C和D为：

(C)M(T)-X₁-P-X₂

(D)X₁-P-X₂-M(T)

分子式C和D中：

M是螯合剂

(T)是一个联结于M的治疗核素；

X₁是0到20个天然或合成的氨基酸；

P为PACAP，或其类似物或片断；和

X₂是0到20个天然或合成的氨基酸。

附图简述

图1A和1B分别是MAG3和Gly-(D)Ala-Gly-Gly的结构示意。

在MAG3中，R1＝R2＝R3＝R4＝H。在四肽中，R1＝R2＝R4＝H；R3＝CH3。

图2是本发明所述之造影剂^99mTc-TP 3475的制备与标记过程的示意图。

图3是^99mTc-TP 3475的HPLC洗脱图谱。100％的放射活性以单峰形式洗脱，保留时间(Rt)为12.5min。TP 3475的Rt(U.V.)也是12.5min。在此层析图谱中，U.V.峰不能测到，因为上样的TP 3475＜0.01μg。游离的^99mTc在Rt 3.2min时洗脱。X轴为洗脱时间，单位为分钟。斜线代表梯度构成。

图4是^99mTc-TP 3475的示意图。

图5显示增加PACAP₂₇和PACAP类似物TP 3475浓度对负鼠肛门内括约肌(IAS)平滑肌张力的影响。数据显示10^-5M浓度下，PACAP₂₇和TP 3475引起的IAS张力下降的百分数是相等的。

缩略语

Aba：4-氨基丁酸

ADP：腺苷酸-5’-二磷酸

cAMP：环腺苷酸单磷酸

CPTA：[4-(1，4，8，11-tetraazacyclotetradec-1-yl)甲基]苯甲酸HT-29：一个人结肠直肠肿瘤细胞株

IC₅₀：50％抑制浓度

％ID/g：每克组织百分注射剂量

Kd：解离常数

LS174T：一个人结肠直肠肿瘤细胞株

mCi：毫居里

MAG3：巯乙酰基三甘氨酸([N-[N[N-(benzylthio)acetyl]

      glycyl]glycyl]glycine)

MD MB 231：一株不依赖雌激素的人乳腺肿瘤细胞株

PACAP：垂体腺苷环化酶激活肽

RIA：放射免疫分析

Rt：保留时间

T47D：一株雌激素依赖的人乳腺肿瘤细胞株

TFA：三氟乙酸

VIP：血管活性肠肽

氨基酸简称

用于描述本发明中肽化合物的命名法遵循传统：每个氨基酸残基都是氨基在左、羧基在右。除特别说明外，在分子式中表示本发明的特别实施方案时，氨基端与羧基端的基团尽管没有特别显示，也将被当作其在正常生pH值下的形式。在氨基酸结构式中，每个残基通常用相应氨基酸的单字母或三字母缩写来代表，详列如下：

A丙氨酸Ala

C半胱氨酸Cys

D天冬氨酸Asp

E谷氨酸Glu

F苯丙氨酸Phe

G甘氨酸Gly

H组氨酸His

I异亮氨酸Ile

K赖氨酸Lys

L亮氨酸Leu

M蛋氨酸Met

N天冬酰胺Asn

P脯氨酸Pro

Q谷氨酰胺Gln

R精氨酸Arg

S丝氨酸Ser

T苏氨酸Thr

V缬氨酸Val

W色氨酸Trp

Y酪氨酸Tyr

定义

此处所述“氨基酸”一词意义包括了天然与合成的氨基酸，D型和L型均包括。“标准氨基酸”指自然产生的肽中通常见到的20种L型氨基酸中的任何一种。“非标准氨基酸”指标准氨基酸以外的氨基酸，不论是合成的还是自然来源的。此处“合成氨基酸”一词也包括了经化学修饰过的氨基酸，包括但不限于：盐、氨基酸衍生物(如酰氨)和取代产物。本发明的肽中所含的氨基酸，特别是氨基端和羧基端的，可以用甲基化、酰胺化、乙酰化或用其他化学基团取代进行修饰，其可以在不影响生物活性的前提下改变肽的循环半衰期。另外，本发明的肽中的一个二硫键联接可有可无。

氨基酸的一般结构如下：

根据侧链R的不同，氨基酸被分为7类：(1)脂肪族侧链，(2)含羟基(OH)侧链，(3)含硫原子的侧链，(4)含有一个酸性或氨基基团的侧链，(5)含碱性基团的侧链，(6)含芳香环的侧链，(7)脯氨酸，一种亚氨酸，其中侧链与氨基融合。

“有PACAP生物活性”的化合物：指在与VIP₂₈对不依赖雌激素的人乳腺癌细胞株(MDA MB 231)或雌激素依赖的人乳腺癌细胞株(T47D)作用的相当剂量下，至少能刺激腺苷酸环化酶活性提高十倍或提高核癌基因表达至少十倍的化合物，测定方法见下面的例3所述。

“分离的”指通过人的行为从自然状态改变的或移除的。例如，一个活动物中自然存在的一个核酸序列或肽不是“分离的”，但同一个核酸或肽一旦部分地或完全地与自然共存的其他物质分开来，就成了“分离的”。一个分离的核酸序列或蛋白质可以实质上纯的形式存在，也可以存在于一个非自然的环境中，例如一个宿主细胞中。

此处所述关于肽的末端氨基的“保护基团”指肽合成中传统使用的各种氨基末端保护基团的任一种。这些保护基团包括，例如酰基保护基团如甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、三氟乙酰基、琥珀酰基和甲氧琥珀酰基等；芳香氨脂基保护基团如苄氧羰基；以及脂肪族氨脂基保护基团例如叔丁氧羰基或金刚烷氧羰基。合适的保护基团参见Grossand Mienhofer，eds.，The Peptides，vol.3，pp.3-88(AcademicPress，New York，1981)。

此处所述关于肽的末端羧基的“保护基团”指肽合成中传统使用的各种羧基末端保护基团的任一种。此类保护基团包括，例如叔丁基、苯甲基或其他可接受的通过酯键或醚键与末端羧基基团相连的基团。

“类似物”包括任何自然产生的或特意制造的PACAP，其特征是有单个或多个氨基酸取代、缺失、增加或置换，但仍保留了PACAP的生物活性。此种类似物包括(a)PACAP的一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸取代(b)增加了一个或多个氨基酸(c)一个或多个氨基酸含有不在通常的氨基酸中出现的取代基团(d)PACAP或其一部分与另一个肽融合(e)一个或多个非标准氨基酸残基(即天然产生的蛋白质中出现的20种L-氨基酸以外的氨基酸)引入或取代PACAP序列(f)一个或多个非氨基酸连接基团引入或置换PACAP的一部分。

“肽”和“蛋白质”可互换使用，指至少两个氨基酸由肽键或修饰的肽键(例如肽键的电子等排体)共价连接形成的化合物。对组成一个蛋白质或肽的氨基酸最大数目没有限定。此处及后附的权利要求中所指的构成肽或蛋白质的氨基酸既可是D型也可是L型，但优选是L型。此处所指的构成肽或蛋白质的氨基酸既可由天然过程如翻译后加工修饰，也可由现有技术公知的化学修饰技术进行修饰。可以理解，修饰可在肽的任何部位进行，包括肽骨架、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。在一个指定的肽中，同种类型的修饰可以在几处以相同或不同的程度出现。同样的，而一个肽中也可以有多种不同类型的修饰。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰氨化、黄素的共价结合、血红素部分的共价结合、核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合、脂及脂衍生物的共价结合、磷脂酰肌醇的共价结合、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚定的形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酸化、氧化、蛋白水解过程、磷酸化、异戊二烯基化、外消旋、硒代、硫化、tRNA介导的蛋白质的氨基酸加成，如精氨酸化和泛素化。例如，参见PROTEINS--STRUCTURE AND MOLECULARPROPERTIES，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993和Wold，F.，Posttranslational ProteinModifications：Perspectives and Prospects，pgs.1-12 inPOSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，1983；Seifter etal.，″Analysis for protein modifications and nonproteincofactors″，Meth Enzymol(1990)182：626-646和Rattan etal.，″Protein Synthesis：Posttranslational Modifications andAging″，Ann NY Acad Sci(1992)663：48-62，其公开的全部内容在此作为参考文献引入。

此处所述一个肽或其一部分与一个参照蛋白“有基本相似的氨基酸序列”意思是说，此肽或其部分的氨基酸序列与参考蛋白质序列的一致性或相似性超过80％。优选的序列的一致性是超过85％，更优选的是超过90％，特别优选超过95％，最优选的情况是超过98％。此处与参考肽的“序列一致性”指BLASTP和TBLASTN程序用BLAST(basiclocal alignment search tool)2.0.14算法得出的结果；计算中BLASTP和TBLASTN的设置见下面表1。BLASTP和TBLASTN程序中氨基酸序列一致性的报告在“Identities”下。计算氨基酸序列一致性的技术是本领域公知的，BLAST算法的使用见述于Altschul et al.(1990)，J.Mol.Biol.215：403-10和Altschul et al.(1997)，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，其公开的全部内容在此作为参考文献引入。BLASTP和TBLASTN程序使用BLAST 2.0.14算法。表1-BLASTP和TBLASTN程序用BLAST2.0.14算法计算氨基酸序列一 致性时的设置

预期值                                             10

过滤                                   低复杂度过滤用SEG程序*

取代Matrix                             BLOSUM62

Gap existence cost                     11

Per residue gap cost                   1

Lambda ratio                           0.85

Word size                              3

*SEG程序的描述见Wootton and Federhen，Comput.Chenu.17：

149-163，1993.

发明详述

含PACAP或其生物活性类似物或片段的肿瘤特异性诊断造影与治疗化合物应用于表达VPAC受体的肿瘤有明显优点。38氨基酸和27氨基酸形式的PACAP都已分离到，分别称为PACAP₃₈和PACAP₂₇。SEQ IDNO：1给出了PACAP₃₈的氨基酸一级序列；SEQ ID NO：2给出了PACAP₂₇的氨基酸一级序列。PACAP₃₈和PACAP₂₇来自同一个176氨基酸的PACAP前体蛋白，其序列由SEQ ID NO：3给出。此处“PACAP”一词包括PACAP₃₈(SEQ ID NO：1)、PACAP₂₇(SEQ ID NO：2)以及176氨基酸的PACAP前体蛋白(SEQ ID NO：3)。

PACAP可以用已知技术从牛下丘脑中分离，例见Miyata A etal，Biochena.Biophys.Res.Commun. 164：567-574，1989和Gottschall PE etal.，Endocrinology 127：272-277，1990，其公开的全部内容在此作为参考文献引入。PACAP也可以通过已知方法合成产生，包括用生物系统或化学方法合成。

肽的生物合成是现有技术公知的，包括一个自然发生的或合成的编码PACAP的核酸序列的转录和翻译。这些核酸序列可以亚克隆入合适的质粒表达载体以在适当的宿主细胞中增殖和表达。构建核酸序列与质粒表达载体、转染宿主细胞、表达感兴趣的核酸序列等技术都是现有技术广泛使用的，具有一般技术的专业人士均熟悉有关具体条件与操作步骤的标准资料来源。例如，重组分子克隆与表达的通用技术见于Sambrook et al.， Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratories，1982及Ausubel， Current Protocols in Molecular Biology，Wiley and Sons，1987，其公开的全部内容在此作为参考文献引入。

适合直接合成PACAP的化学肽合成技术(包括人工和自动化技术)也是本领域技术人员所熟知的。例如，PACAP可以用传统固相合成法从头合成。在此方法中，肽链由一系列偶联反应生成，取代氨基酸被按照需要的顺序依次加到生长的肽链上。下列也是一般专业人员所熟知的：各种不同的N保护基团的使用，如苄氧羰基或叔丁氧羰基；不同偶联剂的使用，如dicyclohexylcarbodiimide(二环己基碳二亚胺(DCCI))或1.1-碳酰二咪唑；各种活性酯的使用，如N-hydroxyphthalimide或N-羟基琥珀酰亚胺的酯；各种裂解剂的使用，如三氟乙酸(TFA)、盐酸加二氧杂环乙烷、borontris-(trifluoracetate)和溴化氰；中间产物分离与纯化的液相反应也是专业人员熟知的。较好的肽化学合成方法按照专业人员熟知的传统的Merrifield固相法进行。进一步的关于固相合成方法的资料可以参见Steward and Young， Solid Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，1969； Advances  in Enzymology 32：221-296，(Nold FF，ed.)，Interscience Publishers，New York，1969中Merrifield的综述；以及Erickson and Merrifield(1990)，The Proteins 2：61-64，其公开的全部内容在此作为参考文献引入。

现有的造影剂和治疗剂也有含生物活性PACAP片段的。本发明所述之生物活性PACAP片段可由化学或酶学手段裂解大的天然的或合成的PACAP得到，也可由上述的生物或化学合成方法得到。

现有的造影剂和治疗剂也有含生物活性PACAP类似物的。获得这些类似物的技术也是一般专业人员所熟知的，例如标准的重组核酸技术、固相肽合成技术及上述的化学合成技术。还可以用连接基团将PACAP的部分与其他肽连接或置换。连接基团包括，例如能够连接PACAP氨基端部分与羧基端的成环化合物。制造类似物的技术也可见于U.S.patent 6,030,942，其公开的全部内容在此作为参考文献引入(专利6,030,942中将类似物称为“类肽”(peptoids))。

PACAP类似物也包括一部分的氨基酸序列基本上类似PACAP的融合肽。这种融合肽的制造也可以用专业人员熟知的方法进行，例如将编码PACAP的核酸序列与一个异源肽的序列亚克隆进同一个表达载体，使PACAP与异源肽的序列表达在同一个蛋白质里。

本发明所述之造影剂与治疗剂是通过将PACAP或其生物活性片段或类似物与一个金属螯合剂连接而成的。此处所说的“连接”指共价键合。螯合剂则与造影或治疗核素联结。在不影响产物中PACAP生物活性的前提下，螯合剂可以与PACAP或其生物活性片段或类似物在肽结构的任意点相连接。优选的是螯合剂连接在PACAP或其生物活性片段或类似物肽的N末端或C末端，更优选的是C末端。

这样，本发明的造影或治疗化合物优选地包含一个由一个或多个天然或合成氨基酸构成的空间臂，连接到PACAP或其生物活性片段或类似物的N端或C端。然后螯合剂可以与这个空间臂相连。空间臂使核素或螯合剂产生的空间位阻最小化，利于保存造影剂与治疗剂中的PACAP活性。

上述的本发明之造影剂的分子式A和B以及治疗剂分子式C和D中，可选的空间臂用Z1、Z2表示，分别将X1、X2连接到M。带有可选空间臂的分子式如下：

(A)M(I)-Z₁-X₁-P-X₂

(B)X₁-P-X₂-Z₂-M(I)

(C)M(T)-Z₁-X₁-P-X₂

(D)X₁-P-X₂-Z₂-M(T)

分子式中其他变量见发明概述中的描述。

空间臂Z₁或Z₂可以含有，例如1到20个氨基酸，更好的是1到4个，最好是1个氨基酸。一个特别适合的空间臂是4-氨基丁酸，也叫“Aba”。作空间臂的Aba最好用D型。

螯合剂可以由大量不同的能络合一个金属离子或多原子离子(如TcO)的螯合化合物中的一种或多种的残基构成。此处所述之“螯合剂”指一种能与PACAP或其生物活性片段或类似物连接的化合物，同时还含有能结合金属原子的供体原子。螯合剂通过配位键与金属原子结合，形成环状结构称为“螯合复合物”或“螯合物”。

适于本发明使用的螯合剂包括NxSy螯合化合物。此处“NxSy螯合化合物”指能够配位结合金属核素且能与PACAP或其生物活性片段或类似物连接的，核心具有下面构造的螯合剂：N2S2(例见U.S.4,897,225、U.S.5,164,176或5,120,526)；N3(例见U.S.4,965,392)；N2S3(例见U.S.4,988,496)；N2S4(例见U.S.4,988,496)；N3S3(例见U.S.5,075,099)；N4(例见U.S.4,963,688和U.S.5,227,474)或NS3。优选的NxSy螯合化合物含N2S2，N3S或N4核心。NxSy螯合化合物的例子也可见于Fritzberg et al.，P.N.A.S.USA 85：4024-29，1988和Weber etal.，Bioconj.Chem.1：431-37，1990。此段提到的杂志文章和美国专利均以全文形式作为参考文献引入。

特别合适的N4螯合剂是[N-[N[N-(benzylthio)acetyl]glycyl]glycyl]glycine，也叫巯乙酰基三甘氨酸或MAG3，还有四肽Gly-(D)Ala-Gly-Gly(SEQ ID NO：4)，见Vanbilloen HP et al.，Nucl.Med.Biol.22：325-338，1995，其公开的全部内容在此作为参考文献引入。Gly-(D)Ala-Gly-Gly是MAG3的一个衍生物，其中巯基被更稳定的更易引入的氨基基团所替代。这两种N4螯合剂的结构示意于图1。

在肽合成过程中，可以把序列Gly-(D)Ala-Gly-Gly引入到PACAP或其生物活性片段或类似物的N端或C端，优选是C端。优选这一步骤是因为这样可以避免很多麻烦，如需要单独连接螯合剂到有可能含有保护基团和解封闭基团的肽上，HPLC纯化反应混合物、质谱分析鉴定所需的产物等。如上面所讨论的，Aba可以作Gly-(D)Ala-Gly-Gly与PACAP或其生物活性片段或类似物之间的空间臂。在肽合成过程中无需增加任何步骤就可以把Aba连接到PACAP或其生物活性片段或类似物上。用MAG3或Gly-(D)Ala-Gly-Gly螯合剂制造肽化合物、连接这些螯合剂到含Aba的肽上、以及将造影或治疗核素交联于螯合剂等过程都可在U.S.6,395,255见到描述，其公开的全部内容在此作为参考文献引入。

连接NxSy螯合剂与蛋白质的方法也是熟知的，比如揭示于U.S.5,175,257和U.S.6,171,577，其公开的全部内容在此作为参考文献引入。例如，NxSy螯合剂可以在非变性条件下通过活性的“连接基团”与PACAP或其生物活性片段或类似物连接，如不是这样的条件下可能会对蛋白有不良影响。连接基团与螯合剂可以是分开的也可以是整合的。具有整合的连接基团的螯合剂被称为“双功能螯合剂”。连接基团要与蛋白质上的功能基团有充分的反应活性以使反应能在水溶液中进行，且不需要用加热至高温等可能使蛋白质变性的方式强制进行。

合适的连接基团的例子有活性酯、异硫氰酸盐、胺、肼、马来酰亚胺或其他Michael型受体、硫醇和活化的卤化物。优选的活性酯有N-羟基琥珀酰酯、磺基琥珀酰酯、苯硫基酯、2，3，5，6-四氟苯基酯和2，3，5，6-四氟苯硫基酯。后三者形成了一组位于苯环的对位(即4位)或邻位时能增强水溶性的活性酯。这类基团的例子有CO₂H、SO₃ ^-、PO₃ ^2-、OPO₃ ^2-、OSO₃ ^-，和N⁺R₃，R代表H或烷基团。

其他适用于本发明的螯合剂包括线性、环状和分枝的多氨基多羧基酸及其含磷的含氧酸对等物，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；二乙三胺五乙酸(DTPA)；

1，4，7，10-tetraazocyclododecane-N，N’N″，N″’-tetraacetic acid

(DOTA)；1，4，7，10-tetraazo-cyclododecane-N，N’N″-triaceticacid(DO3A)；

1-oxa-4，7，10-triazacyclododecane-N，N’N″-triacetic acid(OTTA)；

trans(1，2)-cyclohexanodiethylene-triamine-pentaacetic acid

(CDTPA)；1-oxa-4，7，10-triazacyclododecantriaacetic acid

(DOXA)；1，4，7-triazacyclononanetriacetic acid(NOTA)和1，4，8，11-tetraazacyclotetradecanetetraacetic acid(TETA)。

这些螯合剂可以用已知的任何方法与PACAP相连。例如，螯合剂可以通过一个金属配位基团与PACAP相连，与PACAP上的氨基、巯基或羟基形成酯、氨基硫酯或硫代酰胺。而且，也可以将螯合剂通过一个直接连在螯合剂上的功能基团与PACAP相连，例如DOTA的碳环上连着一个CH₂-苯基-NCS基团，见Meares et al.，JACS 110：6266-6267，其公开的全部内容在此作为参考文献引入。螯合剂也可经过同质或异质的双功能连接子间接与PACAP相连，如二胺、二环氧化物、二醇、二酸或双功能的PEG。上述的具有内部连接基团的螯合剂被称作“双功能螯合剂”。最优选的是将多氨基多羧基酸类螯合剂连接到PACAP或其生物活性片段或类似物的C端。

将PACAP或其生物活性片段或类似物上相连的金属螯合剂与造影或治疗核素相连的方法也是专业人员熟知的，例如见于U.S.5,175,257和U.S.6,171,577，其公开的全部内容在此作为参考文献引入。举例说明，造影或治疗核素可以通过直接引入、模板合成和/或金属转移作用引入本发明之化合物。优选使用直接引入。

直接引入时，造影或治疗核素必须很容易被螯合剂络合，例如，在水溶液中将含有螯合剂的化合物与金属盐水溶液简单地暴露、混合。金属盐可以是任意的盐，但最好是金属的水溶性盐如卤素盐。该盐最好选择得使其不干扰金属离子与螯合剂的结合。含有螯合剂的化合物可以与缓冲性盐如柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐和/或硼酸盐混合以形成适宜直接引入的pH值。

对造影用途，造影核素选自^99mTc；⁸⁷Y；⁶⁷Ga；⁶⁴Cu和¹¹¹In。较好的造影核素是^99mTc。含有PACAP或其生物活性片段或类似物的本发明之化合物，加上一个造影核素即为“造影化合物”。

对治疗用途，“治疗核素”选自⁴⁷Sc、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、²¹²Pb、⁶⁸Ga、⁹⁰Y、¹¹¹In、¹⁵²Sm、²¹²Bi、²¹⁰At、²¹¹At、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re和¹⁸⁸Re。较好的治疗核素是⁹⁰Y、¹⁸⁶Re和¹⁸⁸Re。含有PACAP或其生物活性片段或类似物的本发明之化合物，加上一个治疗核素即为“治疗化合物”。

本发明之造影化合物可以用于检测作为患者或疑患者的受试验者表达VPAC的肿瘤。此处“受试验者”包括人和非人哺乳动物。非人哺乳动物包括牛、绵羊、猪、马、犬、猫和啮齿动物(如大鼠、小鼠、豚鼠和兔)。表达VPAC受体的肿瘤包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、睾丸癌、肝癌、腮腺癌、胆道癌、结肠癌、直肠癌、子宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、甲状腺癌；鳞状细胞癌；腺癌；小细胞癌；黑色素瘤以及脑肿瘤如神经胶质瘤和神经母细胞瘤。

在本发明的实施中，有效量的含PACAP或其生物活性片段或类似物的造影化合物可以通过任何肠道或肠道外方式递送到受试验者。优选使用肠道外递送。

适用的肠道外递送方法包括血管内递送(如静脉推注、静脉输注、动脉推注、动脉输注及对脉管系统的导管滴注)；组织外围和组织内注射(如肿瘤外围和肿瘤内注射)；皮下注射或埋藏包括皮下输注(例如用渗透泵)；以及直接应用于肿瘤或肿瘤外围组织，例如通过导管或其他内置物(含有多孔或非多孔的或凝胶状材料的栓剂或植入物；硅橡胶膜或纤维)。皮下注射或皮下输注优选接近肿瘤或怀疑肿瘤位点，尤其是当肿瘤或怀疑肿瘤就在皮肤上或接近皮肤时。造影化合物优选以单剂量单位做血管内注射，例如在传统的注射媒介如等渗盐水、血清或生物相容性等渗缓冲液(如磷酸盐、Hepes或Tyrode’s缓冲液)中。

做血管内注射时，现有的造影化合物很容易渗透到实体瘤中，在瘤体内分布相对均匀，肿瘤细胞间的紧密联结、纤维基质、间隙压力梯度及结合位点的屏障都不构成影响。相似地，本发明的造影化合物在进行肿瘤外围或肿瘤内递送时也很容易在瘤体内分布。

此处本发明之造影化合物的“有效量”指能够使受试验者的表达PACAP或VPAC的肿瘤产生闪烁影像的足够剂量。造影化合物的有效量用放射活性表示比较方便，如用mCi。一般地，造影化合物的有效量在每70kg体重约0.01mCi至约100mCi范围，推荐每70kg体重约0.1mCi至约50mCi。

当造影化合物递送到受试验者后，受试验者的至少一部分身体会产生闪烁影像。例如，期望在受试验者的有肿瘤或怀疑有肿瘤的身体部位得到影像。闪烁影像的产生需要足够的时间，以便被递送的造影化合物到达肿瘤并与肿瘤细胞表达的PACAP或VPAC受体相结合。造影化合物到达肿瘤并结合一般需要几分钟时间。然而，如果需要的话，肿瘤造影可以在注射造影化合物后数小时进行。肿瘤可以通过任何闪烁扫描造影技术进行造影，包括平面闪烁扫描、SPECT或PET。得到受试验者闪烁影像的技术和机器都是本领域人员熟知的。

放射标记药物通常会滞留在肾脏。因此有必要设法尽量减小肾脏对此类药物的保留，这样能减轻受试验者器官的放射负担也能增强肿瘤的对比度。已知预先或与放射药物同时递送一种氨基酸(如赖氨酸)能显著降低肾脏对放射药物的摄取。因此，现有的造影方法中都选择性地包括了预先或与放射药物同时使用一种氨基酸以降低肾脏对造影化合物的摄取。氨基酸可以通过前述的任何适当的肠道或肠道外途径递送，可以与造影化合物的递送途径相同或不同。

具有一般技术的专业人员很容易确定对于现有造影化合物预先或与放射药物同时使用的氨基酸的合适剂量，以抑制肾脏对造影化合物的摄取，例见Kobayashi H et al.，Cancer Res. 56：3788-3795，1996；Bernard BF et al.，J：Nucl.Med. 38：1929-1933，1997和Behr TM et al.，Eur.J.Nucl.Med. 25：201-212，1998，其公开的全部内容在此作为参考文献引入。

一般地，对于现有造影化合物预先或与放射药物同时使用的氨基酸的合适剂量为0.1-5g/kg体重，优选使用0.4-2g/kg体重。预先或同时使用的首选氨基酸是D-赖氨酸。

仅仅是表达VPAC肿瘤的疑患者，而实际上并没有患这类肿瘤的受试验者也可能做本发明所述的造影检查。当然结果会是阴性的。

本发明的治疗化合物可以用来治疗受试验者的表达VPAC的肿瘤。实施本发明时，有效量的含PACAP或其生物活性片段或类似物的治疗化合物可以通过任何肠道或肠道外方式递送到受试验者，同上述的造影化合物的方法。推荐使用血管内或瘤体内递送。现有的治疗化合物也很容易渗透到实体瘤和/或相对均匀地方分布于肿瘤块内，正如上面描述的造影化合物的情况。治疗化合物的有效量用放射活性表示比较方便，例如用mCi。此处本发明之治疗化合物的“有效量”指足以抑制或逆转受试验者表达VPAC的肿瘤生长的足够量。使用给一个特定受试验者的治疗化合物的有效量取决于很多因素，如递送方式、被治疗肿瘤的分期与严重程度、受试验者的体重与一般健康状况以及处方医师的判断等。

通常使用于一个受试验者的有效量是每70kg体重1mCi到1000mCi，优选使用每70kg体重10mCi到500mCi，更优选每70kg体重20mCi到100mCi。需要指出现有的治疗方法包括治疗化合物的多次用药。

现有治疗方法也可选择地包括预先或同时使用一种氨基酸以减少肾脏对治疗化合物的摄取，如上文所述。氨基酸的剂量和递送途径也如上文所述造影剂的方法。优选预先或同时使用的氨基酸是D-赖氨酸。

具有一般技术的专业人员很容易确定表达VPAC的肿瘤的生长是否被抑制或逆转，例如通过在治疗前后用上述造影方法直接检查肿瘤的尺寸大小。肿瘤的生长的抑制或逆转也可由治疗前后用物理方法估计肿瘤的大小来确定，如肿瘤组织的触诊或用卡尺等测量仪器测量组织块的大小。

在递送给受试验者前，本发明的造影化合物与治疗化合物优选依已知技术制成药物组合物。本发明之药物组合物的特征至少是无菌和无致热源的。此处“药物组合物”包括人用和畜用配方。

现有的药物组合物含本发明之造影化合物与治疗化合物及生理学上可接受的载体媒介。优选的生理性的载体媒介有水、缓冲水、普通盐水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。

本发明之药物组合物也可含有传统的药物赋形剂和/或添加剂。适合的制药赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、缓冲剂和pH调节剂。适合的添加剂包括生理性的生物相容性缓冲剂(如盐酸氨丁三醇tromethamine hydrochloride)，或钙或钠的盐(例如氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙)作添加剂(摩尔比1到50)。如果需要的话，药物组合物中也可含少量湿润剂、乳化剂或pH缓冲剂。口服配方可包括标准的载体如制药等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

本发明之药物组合物也可含有中性或盐形式的本发明之造影化合物与治疗化合物。药学上可接受的造影化合物与治疗化合物可用的盐包括与自由氨基形成的盐，如盐酸盐、磷酸盐、乙酸盐、酢浆草酸盐和酒石酸盐；以及与自由羧基形成的盐，如钠盐、钾盐、铵盐、钙盐、碱式铁盐和与异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸和普鲁卡因形成的盐。

现用以下非限制性的实例阐述本发明。

实施例1、TP 3475的制备

一个PACAP₂₇的类似物，称为TP 3475，根据上述之U.S.6,395,255的技术制造。TP 3475由PACAP₂₇在C末端连接螯合剂Gly-(D)Ala-Gly-Gly而成。螯合剂与PACAP₂₇之间有一个Aba空间臂。

简要地说，PACAP₂₇是用标准的固相合成法合成的。C末端的Aba空间臂和螯合剂Gly-(D)Ala-Gly-Gly都是通过延续固相合成反应，将适当的氨基酸残基连续地向PACAP₂₇的C末端加成连上去的。此类似物根据其分子量命名(预测3475.17，实测3475.18)。TP 3475的一级序列见图2及SEQ ID NO：5。

实施例2、用 ^99m Tc放射标记TP 3475

TP 3475按照前述U.S.6,395,255中的方法用^99mTc金属化。

如下述进行的金属化反应产生了一个基于本发明的造影化合物，称为^99mTc-TP 3475。

向一个干净的、充氮的、10毫升硅化过的小玻璃瓶中加入10ug的TP 3475在10μl pH4.6的乙酸盐缓冲液中(100μg SnCl₂.2H₂O在10μl 0.005M HCl和300μl 0.067M Na₃PO₄，pH12中)。小瓶内容物在丙酮干冰浴中速冻。然后将小瓶放在GeneVac冷冻干燥机中冻干2小时，充氮，密封，保存于-20℃备金属化反应用。

准备做金属化反应时，将小瓶放在室温中。将10-40mCi ^99mTc在200μl 0.9％NaCl中注入小瓶。混合物在100℃保温30min，加入1ml 0.1M Na₂HPO₄把pH升至6-6.5。加125毫克抗坏血酸钠作稳定剂。在Rainin HPLC系统用反相C-18microbond柱做金属化造影化合物^99mTc-TP 3475的HPLC分析，0.1％TFA水溶液为溶剂A，0.1％TFA的乙腈溶液为溶剂B。梯度为溶剂B在0min时为10％，在28min时为90％。^99mTc-TP 3475在22℃、24小时是稳定的。HPLC测出22℃时的得率是定量的，在保留时间12.5分钟处得到一个单峰。^99mTc-TP3475的HPLC洗脱图谱见图3，^99mTc-TP 3475的结构见图4。

^99mTc-TP 3475的稳定性在37℃，100mM过量半胱氨酸、DTPA和HAS存在下进行24小时。相似的研究也在人血清中进行。HPLC分析显示^99mTc-TP 3475在测试的介质中都有优异的稳定性。

实施例3TP 3475与乳腺肿瘤结合的评测

^99mTc-TP 3475和VIP₂₈与人结肠癌细胞株LS 174T和HT-29、以及人乳腺癌细胞株MDA MB 231(不依赖雌激素)和T47D(依赖雌激素)的结合照下述方法评测。¹²⁵I-PACAP₂₇作为对照细胞的培养与分析方法见前述的U.S.6,395,255。TP 3475、VIP₂₈和¹²⁵I-PACAP₂₇的IC₅₀和Kd值用标准方法确定。

cAMP活性与剂量函数关系的测定

依赖雌激素细胞T47D和不依赖雌激素细胞MDA MB 231各约5×10⁶个，分别用SIT培养基洗两次，重悬于含1％BSA、1mg/ml杆菌肽和100μm异丁基甲基黄嘌呤的SIT培养基中。将浓度系列增加的TP3475、VIP₂₈和¹²⁵I-PACAP₂₇加入细胞中，5分钟后加入等体积乙醇终止反应。样品振荡混匀后冻存于-80℃以备用RIA法检测cAMP，方法见Moody TW，Peptides 17：545-555，1995，其公开的全部内容在此作为参考文献引入。数据以cAMP对肽浓度作图。

测定核癌基因c-fos与c-myc mRNA的诱导

我们测定了TP 3475在人乳腺肿瘤细胞中刺激c-fos与c-myc基因表达的能力。上述的依赖雌激素细胞T47D和不依赖雌激素细胞MDA MB231各约5×10⁶个，分别培养于15cm培养皿中，用含0.5％胎牛血清的SIT培养基处理4小时。将TP 3475、PACAP₂₇和VIP₂₈分别加入培养细胞中，孵育60分钟。孵育后移去培养基用异硫氰酸胍分离被处理细胞的总RNA，方法见Chirgwin et al.，Biochemistry 18：5294-5299，1979，其公开的全部内容在此作为参考文献引入。

将10μg从处理细胞中分离到的总RNA变性，于0.66M甲醛-1％琼脂糖凝胶中分离。凝胶用溴化乙锭染色以评判RNA的完整性。然后用标准方法将RNA印迹到Nytran膜上过夜，此膜用c-fos和c-myccDNA探针在标准的Northern印迹杂交条件下杂交。c-fos和c-myccDNA探针用[³²P]dCTP标记，用Bethesda Research Laboratories的随机引物试剂盒按照厂商说明进行。杂交后洗膜，对Kodak XAR-2胶片曝光，冲洗后得到放射自显影。处理细胞与对照细胞的c-fos与c-myc mRNA表达水平用密度扫描仪定量。

实施例4、TP 3475对负鼠肛门内括约肌(IAS)平滑肌组织的基础张 力的影响

已知PACAP₂₇能引起IAS基础张力的浓度依赖性下降，测定见Rattan S et al.，J Pha-mcol.Exper.Theta. 263：722-728，1997，其公开的全部内容在此作为参考文献引入。这里的IAS测试用依次增加的TP 3475浓度，直至达到最大下降，如下述。对照为PACAP₂₇。平滑肌条的准备

两种性别的成年负鼠(Didelphis virginiana)在腹膜内注射戊巴比妥(40mg/kg)后处死。将大血管及外部组织包括外括约肌去除，把肛管打开钉平于有充氧Krebs’液(NaCI，118.07；KCl，4.69；CaCl₂，2.52；MgSO₄，1.16；NaH₂PO₄，1.01；NaHCO₃，25和glucose，11.10)的解剖盘上，粘膜面向上。移除粘膜，从肛管最底端制备肛门内括约肌环状平滑肌小条(约2mm×1cm)。

等长张力的测定

将IAS平滑肌条转入控温的装有Krebs’液的2ml“肌肉池(muscle bath)”中，持续用95％O₂-5％CO₂混合气体鼓泡。肌肉条的下端用丝缝合线绑在肌肉池底部，另一端固定在等长力传感器上(型号FTO3；Grass Instruments Co，Quincy，MA)。用Beckman Dynograph记录仪(Beckman Instruments，Schiller Park，IL)记录等长张力。开始给肌肉条加1g张力，让其平衡1小时，不时冲洗。只有产生稳定张力且在电场刺激下松弛的肌肉条是可用的。最佳长度与基线的确定见前述之Rattan S等人，1997。

图5所示的结果说明10^-5 M的PACAP₂₇和TP 3475引起IAS张力相等的下降。这些数据表明TP 3475的生物活性没有因向PACAP₂₇的C端加空间臂和螯合剂而受损。

实施例5、 ^99m Tc-TP 3475在裸鼠种植的人乳腺肿瘤细胞中的组织分布 和药代物动力学

研究在荷有依赖雌激素的T47D和不依赖雌激素的MDA MB 231肿瘤的裸鼠中按下述方法进行。

将两种肿瘤细胞各约5×10⁶个种植于小鼠右股，待肿瘤块形成。每个实验组有5只荷瘤小鼠，均通过尾侧静脉注射了200-700μCi剂量的^99mTc-TP 3475，含有少于1μg的造影化合物(比活性1400-2500Ci/mmol或更高)。注射后15min、1hr、2hr、4hr和24hr将动物处死，测定各种组织中的％ID/g组织。荷瘤小鼠对照组注射¹²⁵I单碘化的PACAP₂₇。注射对照动物前将¹²⁵I-PACAP₂₇调整到与^99mTc-TP 3475相同的比活性。所有动物的造影均用配有专用计算机和低能量平行孔准直器的GE STARCAM γ照相机进行。

结果作为时间的函数以数字形式和直方图形式展示。同时计算了注射化合物的肿瘤/肌肉比和肌肉/血管比。注射后15min处死的动物中，以15秒一帧进行了动态造影研究。对不同区域作了动力学曲线图，包括肿瘤、心、肝、肾和膀胱。根据这些数据结合其它数据点可以得出重要器官中放射活性的摄取与清除的概况，包括肿瘤组织的。动物均置于代谢笼中以便确定尿中分泌的放射活性的化学本质和量。尿中的放射活性定期测定，尿样用HPLC分析。

实施例6、 ^99m Tc-TP 3475在大鼠血液中的清除

^99mTc-TP 3475在血液中的清除在Sprague-Dawley大鼠中按下述方法进行。三只Sprague-Dawley大鼠，体重均为约250克，从一侧尾静脉注射1mCi的^99mTc-TP 3475，注射后1、5、10、15和30分钟和1、2、4、6、18和24小时从另一侧尾静脉取三份系列血样。血样称重，用标准闪烁计数方法测定放射活性，以注射时制备的^99mTc溶液为标准。％ID/g对时间作图。

^99mTc-TP 3475的血液清除是两相的，α-t_1/2和β-t_1/2分别为约6分钟和90分钟。这些数据表明75％的^99mTc-TP 3475放射活性在注射后12分钟从循环中清除。

实施例7、肿瘤大小与 ^99m Tc-TP 3475比活性对肿瘤摄取的影响 肿瘤大小对 ^99m Tc-TP 3475摄取的影响

用实施例5中的荷瘤小鼠研究了肿瘤大小对造影化合物摄取的影响，方法如下述。将^99mTc-TP 3475和¹²⁵I-PACAP₂₇(作为对照)注射到荷瘤小鼠。肿瘤直径用游标卡尺度量。在注射后的最佳造影时间进行实验，时间点依据来自实施例5。数据以％ID/g对肿瘤绝对重量作图。实验中，化合物比活性与注射量保持恒定，以保证递送的受体特异性的肽分子数量一致。

注射的^99mTC-TP 3475的比活性对肿瘤摄取的影响

受体特异性的造影剂或治疗剂的肿瘤摄取会与注射的受体特异性的化合物的量成函数关系。用实施例5中的荷瘤小鼠研究了^99mTc-TP3475注射量的影响，方法如下述，注射量用比活性代表。制备5份比活性在1000-25,000Ci/mmol范围的^99mTc-TP 3475。5组每组5只荷瘤小鼠每只注射固定的放射活性剂量(~700μCi)，分别含0.1、0.5、1、1.5或2μg的^99mTc-TP 3475。注射后24小时测定组织分布。比较肿瘤和其他组织对化合物的摄取以及放射活性从组织中的清除。

实施例8、减少肾脏对 ^99m Tc-TP 3475的摄取

5只小鼠组成的治疗组注射少于1微克，200-700μCi剂量^99mTc-TP3475(比活性为1400-2500Ci/mmol或更高)的同时注射50毫克D-赖氨酸。对照组5只小鼠只接受^99mTc-TP 3475。治疗组和对照组动物在注射后15分钟、1、2、4和24小时处死，测定肾组织的％ID/g。

实施例9、 ^99m Tc-TP 3475的受体特异性

为确定^99mTc-TP 3475在任乳腺肿瘤中的受体特异性，用PACAP进行受体阻断实验。在荷有T47D移植片的裸鼠上，^99mTc-TP 3475的肿瘤摄取在预先注射PACAP的情况下下降了约50％。

另一个受体阻断实验如下进行。静脉内注射^99mTc-TP 3475之前30分钟，上述的荷瘤小鼠静脉内注射多至50μg的TP 3475在100μlPBS中。依据实施例5得到的最佳造影时间对动物进行造影，然后处死定量测定组织分布。用这些数据可以确定^99mTc-TP 3475的受体特异性，反映为肿瘤组织摄取放射活性的下降，以及可能的其他组织中，如肺、肝、肾。

实施例10、 ^99m Tc-TP 3475与人肿瘤的结合

用下述方法测定^99mTc-TP 3475和^99mTc-VIP₂₈与鳞状上皮细胞癌、腺癌、小细胞癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤以及肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、睾丸癌、肝癌、腮腺癌、胆道癌、结肠癌、直肠癌、子宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、脑瘤、前列腺癌、甲状腺癌的结合。^99mTc-VIP₂₈的制备见上述的U.S.6,395,255。

将每种肿瘤的样品在恒冷切片机上切片成10-20μm厚度，封装为显微玻片。封好的玻片在-20℃储存至少3天，以增强组织对玻片的粘附。玻片复温至室温，于22℃在50mM Tris HCl，pH7.4；2％BSA；2mM EGTA；1mM杆菌肽和5mm MgCl₂中与30pM ^99mTc-TP 3475或^99mTc-VIP₂₈在存在或不存在单碘化的¹²⁵I-PACAP₂₇或¹²⁵I-VIP₂₈的情况下孵育90分钟。

孵育后，玻片用冰冷的50mM Tris HCl，pH-7.4，0.25％BSA洗四次，水洗一次，用干燥空气流干燥。玻片对³H Ultra胶片(Amersham，England)曝光一周。放射自显影图用计算机辅助的图像分析系统定量。胶片同时对¹²⁵I放射自显影标准曝光。在每种肿瘤中测定^99mTc-TP3475或^99mTc-VIP₂₈的Kd值和抑制放射碘标记的对应物的IC₅₀值。

实施例11、 ^99m Tc-TP 3475与 ^99m Tc-Sesta-MIBI和In-111-DTPA-D-Phe ¹ - 奥曲肽的功效比较

我们比较了^99mTc-TP 3475、^99mTc-Sesta-MIBI和In-111-DTPA-D-Phe¹-奥曲肽用于乳腺肿瘤造影的功效。¹²⁵I-PACAP作为对照。^99mTc-Sesta-MIBI尽管不是受体特异性试剂但还是被FDA批准可能会成为最常用的乳腺造影剂。¹¹¹In-DTPA-D-Phe¹-奥曲肽是一个商业化的造影剂，针对乳腺肿瘤细胞上一类受体(SSTR受体)。

¹¹¹In-DTPA-D-Phe¹-奥曲肽和^99mTc-Sesta-MIBI来自放射制药厂商。^99mTc-TP 3475用上述方法制备，¹²⁵I-PACAP用标准技术制备。所有药物的药代动力学和组织分布均在荷瘤小鼠上用实施例5方法进行。由于SSTR和VPAC受体是不同的，^99mTc-TP 3475和¹¹¹In-DTPA-D-Phe¹-奥曲肽共同注射给荷瘤小鼠。共注射的^99mTc-TP3475和¹¹¹In-DTPA-D-Phe¹-奥曲肽在鼠组织中的计量用各自相应核素的特征能量窗口进行(±15或20％)；即140 KeV计^99mTc、173KeV和247 KeV计¹¹¹In。待^99mTc完全衰变(10-12个半衰期)后对¹¹¹In再进行一次组织计量。

第24小时点上，肿瘤对^99mTc-TP 3475的24小时摄取约为0.2％ID/g。这与肿瘤对¹²⁵I-PACAP的摄取(0.23±0.03％I.D./g)相当，高于对¹¹¹In-DTPA-D-Phe¹-奥曲肽的摄取(0.09±0.01％ID/g)和对^99mTc-Sesta-MIBI的摄取(0.18±0.0％I.D/g)。

这里所引用的文献均以全文形式作为参考引用。本发明是通过特定的实施方案及各种附图进行描述的，但应当知晓可以用其他类似的实例或对上述的实例进行修饰和添加，在未偏离本发明的情况下而实现与本发明样的功能。因此，本发明不应被局限于任何单独的实施方案，而是应该根据后附的权利要求的广度和范围进行解释。

序列表

<110>马休卡(马休).L.塔可尔

<120>PACAP组合物及用于肿瘤成像与治疗的方法

<130>8321-121 PC

<150>60/344,511

<151>2001-10～19

<160>5

<170>Fast SEQ for Widows Version 4.0

<210>1

<211>38

<212>PRT

<213>人类

<400>1

His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln

 1               5                  10                  15

Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys

            20                  25                  30

Gln Arg Val Lys Asn Lys

        35

<210>2

<211>27

<212>PRT

<213>人类

<400>2

His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln

 1               5                  10                  15

Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu

            20                  25

<210>3

<211>176

<212>PRT

<213>人类

<400>3

Met Thr Met Cys Ser Gly Ala Arg Leu Ala Leu Leu Val Tyr Gly Ile

                                                 SEQUEN-1

 1               5                  10                  15

Ile Met His Ser Ser Val Tyr Ser Ser Pro Ala Ala Ala Gly Leu Arg

             20                  25                  30

Phe Pro Gly Ile Arg Pro Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Glu Asp Gly Asn

        35                  40                  45

Pro Leu Pro Asp Phe Gly Gly Ser Glu Pro Pro Gly Ala Gly Ser Pro

    50                  55                  60

Ala Ser Ala Pro Arg Ala Ala Ala Ala Trp Tyr Arg Pro Ala Gly Arg

65                  70                  75                  80

Arg Asp Val Ala His Gly Ile Leu Asn Glu Ala Tyr Arg Lys Val Leu

                85                  90                  95

Asp Gln Leu Ser Ala Gly Lys His Leu Gln Ser Leu Val Ala Arg Gly

            100                 105                 110

Val Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ala Gly Asp Asp Ala Glu Pro Leu

        115                 120                 125

Ser Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr

    130                 135                 140

Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys

145                 150                 155                 160

Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile Ala Tyr Leu

                165                 170                 175

<210>4

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>N4螯合剂

<221>变异体

<222>2

<223>D-型

<400>4

Gly Ala Gly Gly

 1

<210>5

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PACAP类似物TP 3475

                                                       SEQUEN-1

<221>变异体

<222>28

<223>Xaa

＝4-氨基丁酸

<221>变异体

<222>30

<223>D-型

<400>5

His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln

 1               5                  100                 115

Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Xaa Gly Ala Gly Gly

            20                  25                  30

Claims (33)

1.一种检测受试验者中能够表达VPAC受体的肿瘤的方法，该受试验者为这种肿瘤的患者或疑似患者，包括：

(1)给受试验者使用有效量的具有分子式A或B的造影化合物；

和

(2)在受试验者的至少一部分身体产生闪烁影像，

其中分子式A和B是：

(A)M(I)-X₁-P-X₂

(B)X₁-P-X₂-M(I)

对于分子式A和B：

M为螯合剂，在分子式A中，当X₁为0且P为PACAP₂₇(SEQ IDNO：2)时，M不是多氨基-多羧基酸类螯合剂；

(I)是联结于M的造影核素；

X₁是从0到20的天然或合成的氨基酸；

P是PACAP，或具有PACAP生物活性的其类似物或片段；和

X₂是从0到20的天然或合成的氨基酸。

2.权利要求1的方法，其中M含有一个NxSy螯合化合物。

3.权利要求2的方法，其中的NxSy螯合化合物含有一个N2S2或N3S核心。

4.权利要求2的方法，其中的NxSy螯合化合物含有一个N4核心。

5.权利要求2的方法，其中的NxSy螯合化合物含有MAG3或Gly-(D)Ala-Gly-Gly。

6.权利要求1的方法，其中分子式B的螯合剂M含有一个多氨基-多羧基酸。

7.权利要求1的方法，其中I选自下列组：^99mTc、⁸⁷Y、⁶⁷Ga、⁶⁴Cu和¹¹¹In。

8.权利要求7的方法，其中I为^99mTc。

9.权利要求1的方法，其中分子式A的造影化合物还含有一个空间臂Z₁连接X₁和M，分子式B的造影化合物还含有一个空间臂Z₂连接X₂和M。

10.权利要求9的方法，其中空间臂Z₁和空间臂Z₂分别含4-氨基丁酸。

11.权利要求1的方法，其中P含有SEQ ID NO：2。

12.权利要求1的方法，其中造影化合物为^99mTc-TP 3475。

13.权利要求1的方法，其中能够表达VPAC的肿瘤选自下列组：肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、睾丸癌、肝癌、腮腺癌、胆道癌、结肠癌、直肠癌、子宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、脑瘤、前列腺癌、甲状腺癌；鳞状细胞癌；腺癌；小细胞癌；黑色素瘤、神经胶质瘤和神经母细胞瘤。

14.权利要求1的方法，其中受试验者为非人哺乳动物。

15.权利要求1的方法，其中受试验者使用的造影剂有效量从每70kg体重约0.01mCi至约100mCi。

16.权利要求1的方法，其中受试验者使用的造影剂有效量从每70kg体重约0.1mCi至约50mCi。

17.权利要求1的方法，进一步包括了使用赖氨酸的步骤，先于或与造影剂同时使用以减少肾脏对造影剂的摄取。

18.一种抑制或逆转患有肿瘤的受试验者内表达VPAC受体的肿瘤生长的方法，包括对受试验者使用有效量的分子式为C或D的组合物，分子式C和D为：

(C)M(T)-X₁-P-X₂

(D)X₁-P-X₂-M(T)

其中：

M为螯合剂；

(T)是联结于M的治疗核素；

X₁是从0到20的天然或合成氨基酸；

P是PACAP，或具有PACAP生物活性的其类似物或片段；和

X₂是从0到20的天然或合成氨基酸。

19.权利要求18的方法，其中M含有一个NxSy螯合化合物。

20.权利要求19的方法，其中的NxSy螯合化合物含有一个N2S2或N3S核心。

21.权利要求19的方法，其中的NxSy螯合化合物含有一个N4核心。

22.权利要求21的方法，其中的NxSy螯合化合物含有一个MAG3或Gly-(D)Ala-Gly-Gly。

23.权利要求18的方法，其中T选自下列组：⁴⁷Sc、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、²¹²Pb、⁶⁸Ga、⁹⁰Y、¹¹¹In、¹⁵³Sm、²¹²Bi、²¹⁰At、²¹¹At、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re和¹⁸⁸Re。

24.权利要求23的方法，其中T选自下列组：⁹⁰Y、¹⁸⁶Re或¹⁸⁸Re。

25.权利要求18的方法，其中分子式C的治疗化合物还含有一个空间臂Z₁连接X₁和M，分子式D的治疗化合物还含有一个空间臂Z₂连接X₂和M。

26.权利要求25的方法，其中空间臂Z₁和空间臂Z₂分别含4-氨基丁酸。

27.权利要求18的方法，其中P含有SEQ ID NO：2。

28.权利要求18的方法，其中表达VPAC的肿瘤选自下列组：肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、睾丸癌、肝癌、腮腺癌、胆道癌、结肠癌、直肠癌、子宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、脑瘤、前列腺癌、甲状腺癌；鳞状细胞癌；腺癌；小细胞癌；黑色素瘤、神经胶质瘤和神经母细胞瘤。

29.权利要求18的方法，其中受试验者为非人哺乳动物。

30.权利要求18的方法，其中受试验者使用的造影化合物有效量从每70kg体重约1mCi至约1000mCi。

31.权利要求18的方法，其中受试验者使用的造影化合物的有效量从每70kg体重约10mCi至约500mCi。

32.权利要求18的方法，其中受试验者使用的造影化合物的有效量从每70kg体重约20mCi至约100mCi。

33.权利要求18的方法，进一步包括了使用赖氨酸的步骤，先于或与治疗化合物同时使用，以减少肾脏对治疗化合物的摄取。

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