CN1565647A

CN1565647A - 一种组织工程化软骨的制造方法

Info

Publication number: CN1565647A
Application number: CNA031479502A
Authority: CN
Inventors: 郭希民; 王常勇; 段翠密; 赵强
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2003-06-30
Publication date: 2005-01-19

Abstract

本发明是一种组织工程化软骨的制造方法，包括所需的可降解多孔生物陶瓷材料，属组织工程领域。本发明采用一种无机生物支架材料(α－磷酸三钙多孔生物陶瓷)与组织细胞(软骨细胞)复合构建软骨组织，用于关节软骨损伤的修复。本发明可实现关节软骨损伤的功能性修复，具有明显的临床应用前景。

Description

一种组织工程化软骨的制造方法

发明领域

本发明涉及一种组织工程化软骨的制造方法，包括所需的可降解多孔生物陶瓷支架材料，属于组织工程领域。

背景技术

关节软骨创伤修复目前仍是临床医学的一个巨大挑战。现有的治疗方案包括软骨组织或骨-软骨组织移植和人工关节。自体软骨是最好的移植材料，但因工体有限，而且通常需要在第二个部位手术以获取足够的用于移植的软骨组织，因此就应用而言并不理想。而人工关节替代性修复迄今为止上难以达到功能性修复效果，并且常会伴有各种并发症的产生。尽管人们在这一领域进行了多年不懈的努力，但仍需寻找一种关节软骨损伤修复的有效治疗方法，提供适当的生理性修复，从而避免再从患者身上收集大量自体软骨组织，以一种创伤修复另外一种创伤。

组织工程技术的兴起为软骨组织的生理性修复带来了希望。国内外文献相继报道有采用该技术构建软骨，在裸鼠和具有免疫力的小鼠、大鼠、兔、猪等动物体内取得成功的例子。但这些研究所采用的支架材料均是聚合物或胶原等有机大分子。而聚合物在体内降解时会造成酸性产物堆积，给软骨组织新生带来不利的影响；胶原或凝胶类材料则遇水后容易形变，不足以对软骨细胞的新生提供持续有力的支撑。以上两种不足严重限制了软骨组织工程产品的开发和应用。

磷酸三钙多孔生物陶瓷是一种无机的可降解的生物材料，该材料除生物相容性和机械力学强度上的优点外，还由于优异的加工工艺具有特殊的微结构，孔型规则，孔隙率高，孔与孔之间连接径合理。该结构不仅可提高组织和细胞的长入性，还可以借此调节在体内的降解速率，以使其与组织的新生速度相协调。材料的大小和形状与新生组织的大小和形状一致，有利于对结果的控制。另外，材料的大小和形状也可预制，因此不受缺损大小和形状的限制。该材料在骨组织工程中得到了广泛而深入的研究和应用，并且表现出了卓越的骨再生潜能，究中完成，并且已获准进入临床。

发明内容

本发明的目的是为克服上述软骨组织工程研究中的不足，提供一种以生物可降解多孔陶瓷为支架的组织工程化软骨的制造方法。该多孔陶瓷作为支架材料可以是α-TCP(图1)，也可以是β-TCP。本发明以生物可降解多孔陶瓷为支架制造组织工程化软骨，其方法如下：

1)软骨细胞的分离、培养和扩增

局部麻醉下无菌切取关节面非负重区软骨组织(为减少手术取材创伤，对患者而言，损伤关节关节作为软骨工区首选)，放入装有含抗生素的培养基的小瓶中带回实验室，用剪刀剪碎成1mm³的小块，置于0.5~1.5％的II型胶原酶溶液中，4℃消化6~10小时，或37℃消化1~4小时，获得的单细胞用含10~15％胎牛血清的DMEM培养液制成悬液，以2~4×10⁶的密度接种到培养板或培养瓶中，在37℃，5％CO₂，饱和湿度的CO₂孵箱中培养扩增3代。

2)支架材料预处理

可降解多孔生物陶瓷材料预制成各种规格的圆片状，或根据需要预制成其它形状，60gray⁶⁰Co照射，也可以是75％酒精浸泡10分钟～1小时消毒。用前用95％酒精浸泡以提高亲水性，然后用无血清培养基或PBS缓冲液将酒精置换出来，灭菌干纱布吸干液体。

3)组织工程化软骨的构建

将第3代软骨细胞制成1～2×10⁷/ml的软骨细胞悬液，轻轻滴加在支架材料上，并轻轻翻转材料，使细胞分布尽量均匀。将软骨细胞一多孔陶瓷复合体放入孵箱中，37℃，5％CO₂，饱和湿度下静置6～10小时，使细胞贴附在材料的孔洞内和表面。然后转移入旋转式生物反应器内进行三维立体培养。旋转速度15~50rpm。

4)体内植入

手术暴露损伤关节面，修整创面使之与构建的复合物大小和形状一致，小心将复合物嵌入缺损区，并使之与周围组织密合，关闭关节囊，缝合伤口。术后4周内关节制动。

有益效果

本发明组织工程化软骨的制造方法使用的可降解多孔生物陶瓷支架材料生物相容性好，机械强度高，微结构合理，适于软骨细胞的长入和细胞外基质沉积，其降解速率可以也软骨组织的新生速度相协调，最终在体内形成正常的有功能的软骨组织，实现功能性软骨的再生，再生的软骨组织可以与周围组织自然整合，且具有更大的最终强度和稳定性，对损伤或缺损实现生理性修复。由于可降解多孔生物陶瓷加工工艺成熟，可批量生产，自体软骨取材容易、不会有免疫排斥，因此本发明制造的组织工程化软骨具有广阔的临床应用前景。

具体实施方式

实施例羊自体关节软骨缺损的修复

1)组织工程化软骨的构建

所有步骤均参照3DA相关标准执行。将28只中国美丽奴绵羊(6月龄，雌雄不拘)随机分成三组：实验组(10只)、材料对照组(10只)、空白对照组(4只)，实验组在前肢肱骨远端关节面非负重区片取软骨组织，约3～5g。在0.5％的II型胶原酶中4℃过夜消化，收集细胞，置75ml塑料培养瓶中培养，培养基为DMEM+10％胎牛血清(FCS)，0.25％胰酶。收集第3代细胞，制备成1.5～2×10⁷/ml的细胞悬液，接种到圆柱状(直径10mm，厚4mm)α-TCP支架上，尽量使细胞分布均匀。α-TCP多孔生物陶瓷材料由上海贝奥路公司专利的方法和工艺生产，材料经60gray⁶⁰Co照射消毒后用于组织工程化关节软骨构建，在一个优选的方案中，其微结构为：孔径-100～300μm，孔隙率-52％，孔间连接径-30～100μm。静置6小时后，将复合物移入RCCS(旋转式生物反应器，Synthecom公司)，在含10％FCS的DMEM中培养48小时，转速为30rpm。

2)组织工程化软骨在羊关节软骨缺损修复中的应用

在各组动物的前肢肱骨远端关节面制备一个10mm直径，4mm深的圆形缺损，将上述构建的复合物植入对应的对照组动物缺损区；将未接种细胞的支架材料植入材料对照组动物缺损区；空白对照不做修复。关闭关节腔，缝合切口，通过组织学和组织化学分级标准来评估移植物和周围组织。T检验评估结果。

3)结果：术后24周取材，可见实验组术区关节表面呈乳白色，有连续的新生软骨组织形成，与周围软骨组织无明显分界；单纯材料组可见材料周围有软骨样组织长入，中心略有萎陷，植入的多孔支架材料大部分已经吸收(图2)；空白对照组缺损区仍然为凹陷，未见有软骨样组织充填。组织学和免疫组织化学染色显示实验组在植入区内新生软骨组织逐渐融合成片，番红“0”、甲苯胺兰及II型胶原染色阳性，关节软骨缺损得到完整修复，多孔陶瓷支架材料基本吸收完全(图3)；单纯材料组在植入区内亦可见部分新生软骨组织从材料周边区域向中心区域生长，支架材料基本吸收完全，关节软骨缺损未得到完全修复；空白对照组在缺损区边缘和底部可见少量软骨向中心部位生长，缺损未得到修复。统计学分析表明，实验组与对照组(P＜0.001)和材料组(P＜0.01)之间均具有显著的统计学差异。

附图说明

图1为α-TCP材料的扫描电镜照片。显示材料孔型规则、孔隙率高、孔的内表面光滑一致、孔与孔之间连接同畅。

图2为羊关节软骨修复24周的大体照片。显示缺损关节表面已经完全被新生软骨组织取代，新生软骨与周围组织过渡自然连续。

图3为羊关节软骨修复24周的组织学(番红O染色×40)照片。显示材料孔洞内和孔洞间被新生的番红O染色阳性的软骨细胞所充满，细胞外基质丰富。

Claims

1.一种组织工程化软骨的制造方法。取自体软骨组织分离软骨细胞，体外培养扩增后与可降解多孔生物陶瓷支架材料复合构建组织工程化软骨。

2.权利要求1中所述的多孔生物陶瓷支架材料，其特征是可以是α-磷酸三钙(α-TCP)，也可以是β-磷酸三钙(β-TCP)。其组成成分磷酸三钙与机体骨骼的无机成分相同，因而具有良好的生物相容性和机械力学特性，可以为组织新生提供适宜的环境和有力的支撑。

3.权利要求1中所述的多孔陶瓷生物材料，其特征是具有可控的特殊微结构，孔型规则，孔隙率高，孔与孔之间有管状连接。该特殊微结构的特征是孔径可以在100～300μm之间，孔隙率可以在45％～52％之间，孔间连接径可以在30～100μm之间。该结构不仅可提高组织和细胞的长入性，还可以借此调节在体内的降解速率，以使其与软骨组织的新生速度相协调。

4.权利要求1中所述多孔陶瓷材料的消毒可以是60gray ⁶⁰Co照射，也可以是75％酒精浸泡10分钟～1小时。用前用95％酒精浸泡以提高亲水性，然后用无血清培养基或PBS缓冲液将酒精置换出来，灭菌干纱布吸干液体。

5.权利要求1中所述的制造方法其特征是采用组织工程技术。即将软骨细胞与多孔陶瓷支架材料复合，先静置使细胞爬入材料内部贴附在材料孔洞内表面，再在生物反应器内孵育。

6.权利要求8中所述的软骨细胞与多孔陶瓷支架材料复合，其方法是将1～2×10⁷/ml的软骨细胞悬液轻轻滴加在支架材料上，并轻轻翻转材料，使细胞分布尽量均匀。

7.权利要求8中所述的孵育，其条件是在37℃，5％CO₂，饱和湿度的生物反应器内转动24~72小时，转动速度为15~50rpm。

8.权利要求8中所述的生物反应器，其特征是可以是旋转式生物反应器，也可以是其它类似的动态立体培养装置，有利于软骨细胞在材料内的生长和分泌细胞外基质。

9.权利要求9中所述的软骨细胞，其特征是可以是患者自体软骨细胞，也可以是动物的关节软骨细胞。可以是取自关节面非负重区软骨组织，也可以取自肋软骨等非关节部位的软骨组织。将获得的软骨组织剪碎后，用0.5～1.5％的II型胶原酶4℃消化6~10小时，或37℃消化1~4小时，获得的单细胞用含10~15％胎牛血清的DMEM培养液制成悬液，以2~4×10⁶的密度接种到培养板或培养瓶中，在37℃，5％CO₂，饱和湿度的CO₂孵箱中培养扩增3代。

10.权利要求1所述的组织工程化软骨，其特征是可以用于创伤、炎症、肿瘤等原因造成的各种关节软骨损伤的生理性修复，也可以用于美容、整形外科等需要软骨组织提供组织替代或制成的治疗。